Técnicas Básicas en Biología

Molecular
1 2 3 4
 1 2 3 4 5 6 7 8

12, 216
8, 144 8, 079
6, 108
5, 090
4, 072
3, 054

2, 036
1, 636

1, 018

506
Hibridación

• Se basa en la renaturalización de cadenas sencillas de DNA

previamente desnaturalizadas.

• Híbridos homodúplex:
• DNA-DNA
• RNA-RNA
• Híbridos heterodúplex:
• DNA-RNA
• La desnaturalización se debe a la ruptura de los puentes de
hidrógeno entre pares de bases pero no a la ruptura de enlaces
covalentes.

• La desnaturalización puede darse por ácidos y bases, agentes

químicos o temperatura.
• La desnaturalización con ácidos puede afectar la estructura primaria
del DNA por rompimiento de enlaces fosfodiéster y N-glicosídicos.

• Para DNA es más habitual utilizar desnaturalización alcalina.

Hibridación es la formación de
moléculas dúplex de DNA cuyas
hebras tienen origen distinto.
Ensayos de Hibridación

• Se basan en la gran especificidad de interacción entre bases

complementarias.

• Secuencia diana: Secuencia de interés en uno de los fragmentos,

generalmente obtenida por enzimas de restricción.

• Sonda: Fragmento corto de ácido nucleico de secuencia conocida y

complementario a la secuencia diana, marcado para permitir su detección.
• Astringencia: Grado de especificidad en el apareamiento de los
híbridos.

Normalmente se busca un apareamiento completo entre sonda y diana.

La astringencia no debe ser tan alta que impida la unión estable entre
sonda y diana, ni tan bajo que impida hibridación inespecífica.
• La astringencia depende de distintos factores:
• Temperatura y tiempo de renaturalización
• Longitud y concentración de las cadenas.
• Composición de bases.
• Ambiente químico (cationes, formamida, pH, etc).
Temperatura elevada, baja concentración de Na+ y aumento de
formamida, favorecen mayor especificidad (híbridos completamente
apareados).

Baja temperatura, alta concentración de Na+ y disminución de

formamida, favorecen menor especificidad (híbridos parcialmente
apareados)
Hibridación en Fase líquida
Hibridación en soporte sólido
 Dot-blot y Slot-blot
• Muestras sin purificar (sangre, heces, esputos).

• Se aplica la muestra en gotas o manchas alargadas en

una membrana de nylon o nitrocelulosa.
Southern-blot

• Detecta fragmentos de DNA separados por tamaño mediante

electroforesis. Se transfiere a un soporte sólido para hibridación.

• Es el método habitual de análisis de DNA en muestras.

• Implica 5 etapas: Separación electroforética, desnaturalización,

transferencia, hibridación y detección.
Northern blot

• Igual al Southern pero para RNA.

• No siempre se requiere fragmentación con endonucleasas.

• Hay que tener especial cuidado con la degradación por RNAsas.

• Permite determinar expresión génica en distintos tejidos celulares.

Hibridación in situ tisular

• Se realiza sobre cortes de tejido, células intactas, núcleos aislados o

sobre tejidos fijados con formalina, incluidos en parafina, congelados,
etc.

• Importante para detectar virus patógenos, diagnóstico de células

cancerosas o cambios en la expresión génica detectando secuencias
en el RNA celular.
• Se añaden sondas de DNA complementario (cDNA) de hebra sencilla.

• La detección se realiza por autorradiografía y examen de película bajo

microscopio, o bien por microscopía de fluorescencia.
 FISH
(Hibridación in situ por fluorescencia)
• Preparaciones de cromosomas metafásicos o prometafásicos.

• Se trata la muestra con enzimas proteolíticas y se desnaturaliza el DNA

para permitir su hibridación con la sonda.

• Las sondas son marcadas con fluorescencia.

• Potencial diagnóstico en cromosomopatías, genes tumorales, virología,

trasplantes, etc.
Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR)
 Componentes de la PCR
•DNA molde
•dNTPs
•Oligonucleótidos
•DNA polimerasa termoestable (Taq)
•Mg+
PCR anidada
PCR inversa
PCR con Adaptadores