TESIS Medina Rodríguez

Fisiología de los precursores de
oligodendrocitos murinos y humanos

durante el desarrollo y en el sistema
nervioso central adulto: implicación de la
fosfodiesterasa-7
Tesis Doctoral
Eva María Medina-Rodríguez

Toledo
2015
Tesis doctoral
Fisiología de los precursores de

oligodendrocitos murinos y humanos durante
el desarrollo y en el sistema nervioso central
adulto: implicación de la fosfodiesterasa-7
Universidad de Castilla la Mancha
Eva María Medina-Rodríguez

Hospital Nacional de Parapléjicos
Toledo, 2015
FERNANDO DE CASTRO SOUBRIET, Investigador Principal del Grupo de
Neurobiología del Desarrollo-GNDe del Hospital Nacional de Parapléjicos y Científico Titular del
Consejo Superior de Investigaciones Científicas (en excedencia voluntaria), y ANA
BRIBIÁN ARRUEGO, Investigadora Postdoctoral del Grupo de Neurobiología del
Desarrollo-GNDe del Hospital Nacional de Parapléjicos de Toledo y actualmente en el Dept.
de Neurobiología Molecular, Celular y Desarrollo del Instituto Cajal-CSIC.
CERTIFICAN que el presente trabajo, titulado “Fisiología de los precursores de

oligodendrocitos murinos y humanos durante el desarrollo y en el sistema nervioso
central adulto: implicación de la fosfodiesterasa-7”, ha sido realizado bajo nuestra
dirección por Eva María Medina-Rodríguez en el Grupo Neurobiología del Desarrollo-GNDe del
Hospital Nacional de Parapléjicos de Toledo. Dicho trabajo reúne todos los requisitos
científicos y formales para ser defendido como Tesis Doctoral y optar al grado de
Doctor por la Universidad de Castilla-La Mancha.
Para que así conste, lo firmamos en Toledo a 11 de Mayo de 2015.
Fdo.: Fernando de Castro Soubriet. Fdo.: Ana Bribián Arruego.

A mi marido, mis padres, mi hermana y mi sobrino Aritz.
“Imagina si no lo hubiera intentado…”
Valentino Rossi
Agradecimientos
Como dijo el gran Valentino Rossi: “Para sentirse fuerte, para obtener el máximo, hay que
formar parte de un equipo”. Por eso, quiero agradecer a todos los que han formado equipo
conmigo durante estos años de trabajo y han hecho posible que hoy esté escribiendo esta
tesis.
En primer lugar, a Fernando de Castro y Ana Bribián, al primero por confiar en mí y

darme la oportunidad de trabajar en este grupo con tan buenos profesionales y a ambos por
dirigirme y enseñarme en este camino.
A todos mis compañeros, los que siguen en el laboratorio y los que no, Diego
Clemente, Pedro Esteban, Diego García, Verónica Murcia, Cristina Ortega, Verónica Moliné y
Carolina Melero porque de todos he aprendido algo y siempre han estado dispuestos a
resolver mis dudas y a ayudarme. Además, especialmente, a Isa, Iris y Rafa que son los mejores
técnicos y sin su ayuda esto no hubiera sido posible y también a Jacinto, Laura y Meli.
Especialmente a Carol, Isa e Iris por ser más que compañeras de laboratorio amigas y, por
supuesto, a la persona que me acompañó al empezar mi carrera científica, Javier Arenzana,
por preocuparse por mí siempre y enseñarme tanto. Esta tesis también es vuestra. ¡Gracias
por todo!
A Jose Ángel, Javi Mazarío y Virginia por su apoyo y ayuda con la microscopía y la
citometría, a Lucía por compartir Máster conmigo, a Felipe por los Casus y por todo menos sus
ninjas y, en general, a toda la gente del HNP con la que he tenido contacto y me ha ayudado
directa o indirectamente.
A Ana Martínez y Carmen Gil por tratarnos tan bien y ofrecernos su ayuda siempre
que la hemos necesitado.
A Jesús Pastor y Rafael García de Sola por las muestras y su disposición a ayudar.
A Carlos Matute, Susana Mato, Ana Bernal, Anna Williams, Amanda Boyd y a todos
los demás miembros de sus laboratorios por darme la oportunidad de aprender junto a ellos y
hacerme las estancias tan agradables y a Elena y Alba que también hicieron que el tiempo que
pasé allí fuera tan bueno.
A todos mis amigos y mis compañeros de la uni, con quienes empezó esta aventura,
por los buenos ratos y los “gabinetes de crisis”. “Si no fuera por esos momentos… “.
A toda mi familia que siempre ha estado apoyándome, a mis tíos, a mis primos
(couuuss), a mis abuelos por creer que soy la mejor, aunque sea para ellos, y, muy
especialmente, a mis padres porque, aunque todo el mundo piense que los suyos son los
mejores, los míos lo son de verdad. Mil gracias porque sé que siempre habéis confiado en mí y
porque habéis hecho posible, con todo vuestro esfuerzo, que hoy este aquí. No hay palabras
para agradeceros todo lo que habéis hecho por mí en todos los sentidos, toda la vida. Os
quiero. Igualmente a mi hermana porque la quiero y a mi sobrino Aritz porque, aunque todavía
no es consciente, no me ha enseñado ciencia pero me ha enseñado cómo se puede querer
tanto a alguien tan pequeñito. También a mi familia política por tratarme tan bien y alegrarse
por todo lo bueno que me ha ido pasando en este tiempo.
Porque forman parte muy importante también de mi vida, me gustaría agradecer,
aunque no sea muy común, a mis perritos Kenia y Wido por alegrarme sólo con verles y darme
tanto cariño. Habéis sido un gran apoyo, de verdad.
Por último, quiero dar las gracias a mi marido Richard porque es lo mejor que tengo,
porque me ha ayudado siempre, incluso colaborando en lo que ha podido con mi trabajo, por
hacerme saber a cada paso de esta tesis lo orgulloso que estaba de mí y subirme el ánimo, por
hacerme siempre reír y porque le quiero muchísimo. Gracias por hacer que estos años hayan
sido los mejores de mi vida y por acompañarme y apoyarme siempre, tanto en los buenos
como en los malos momentos. ¡Un millón de gracias!
Espero no dejarme a nadie pero, por si acaso, ¡¡¡¡gracias a todos!!!!

Índice
INTRODUCCIÓN 1
1. Los oligodendrocitos y el linaje oligodendroglial 3
2. Los precursores de oligodendrocitos en el adulto 6
3. La Esclerosis Múltiple como paradigma de las enfermedades desmielinzantes 9
4. Remielinización 11
4.1. Métodos para el estudio de los precursores de oligodendrocitos y la

remielinización 14
4.2. Factores involucrados en la remielinización 20
5. El AMPc y su implicación en la diferenciación de los precursores de

oligodendrocitos, la mielinización y la remielinización 25
6. Las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos y sus inhibidores 27
6.1. Fosfodiesterasa-4 30
7. Características y antecedentes de los inhibidores de fosfodiesterasa-7 34
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 39
MATERIAL Y MÉTODOS 43
1. Animales 45
2. Biopsias humanas 45
3. Aislamiento de precursores de oligodendrocitos de corteza cerebral de ratón a

diferentes edades y de humano adulto 45
4. Inmunocitoquímica 47
5. Inhibidores de fosfodiesterasa-7 utilizados 47
6. Supervivencia celular 47
7. Ensayos de proliferación de precursores de oligodendrocitos 48
8. Estudios de diferenciación de precursores de oligodendrocitos 48
9. Estudio de la señalización intracelular en cultivos primarios de precursores de

oligodendrocitos 49
10. Cultivos organotípicos de cerebelo 49
11. Inmunohistoquímica y toma de imágenes 50
12. Desmielinización in vivo por inyección de lisolecitina en el cuerpo calloso y

tratamiento 50
13. Procesamiento del tejido para microscopía electrónica de transmisión 51
14. Toma y análisis de imágenes 52
15. Análisis estadístico 52
RESULTADOS 53
1. Desarrollo de un método mejorado para el aislamiento de precursores de

oligodendrocitos 55
1.1. Mejoras introducidas en el protocolo previamente descrito 55
1.2. Caracterización de los precursores de oligodendrocitos murinos aislados 57
1.3. Eficacia del nuevo protocolo descrito 58
1.4. Influencia de la estirpe en el rendimiento del proceso de aislamiento 61
1.5. Viabilidad y capacidad de diferenciación de los precursores de

oligodendrocitos aislados de ratones de diferentes edades 61
1.6. Aislamiento y caracterización de precursores de oligodendrocitos de corteza

cerebral de humano adulto 63
1.7. Eficacia del método en el aislamiento de precursores de oligodendrocitos

humanos 63
1.8. Estudio de la viabilidad y capacidad de diferenciación de los precursores de

oligodendrocitos aislados de corteza cerebral de humano adulto 65
2. Análisis de la expresión de la enzima fosfodiesterasa-7 y de los efectos de su

inhibición in vitro sobre los precursores de oligodendrocitos 65
2.1. Expresión de la fosfodiesterasa-7 en precursores de oligodendrocitos murinos 65
2.2. Efectos de la inhibición de la fosfodiesterasa-7 sobre la supervivencia y la

proliferación de los precursores de oligodendrocitos aislados de corteza cerebral de
67
ratones neonatales y postnatales
2.3. Efectos de la inhibición de la fosfodiesterasa-7 sobre la diferenciación de

precursores de oligodendrocitos murinos a diferentes edades 68
2.4. Vías intracelulares implicadas en la inhibición de la fosfodiesterasa-7 70

2.5. Expresión de la fosfodiesterasa-7 en los precursores de oligodendrocitos
humanos y efecto de su inhibición sobre la capacidad de diferenciación 72
2.6. Diferenciación de los precursores de oligodendrocitos murinos y humanos en

respuesta a VP3.15 72
3. Análisis de la inhibición de la fosfodiesterasa-7 en la remielinización 76
3.1. Estudio de la inhibición de la fosfodiesterasa-7 sobre la remielinización ex vivo 76
3.2. Efectos de la inhibición de la fosfodiesterasa-7 sobre la remielinización in vivo 76
DISCUSIÓN 81
1. El nuevo protocolo desarrollado permite aislar un mayor número de precursores de

oligodendrocitos viables tanto de la corteza cerebral de ratones como de humanos
adultos 83
2. La inhibición de la fosfodiesterasa-7 favorece la supervivencia y la diferenciación de

precursores de oligodendrocitos murinos y humanos hacia fenotipos mielinizantes 86
3. La inhibición de la fosfodiesterasa-7 favorece la remielinización in vitro e in vivo 89
CONCLUSIONES 93
BIBLIOGRAFÍA 97
SUMMARY 121
Introduction 123
Results 129
Discussion 149
Conclusions 157
References 158
INTRODUCCIÓN
2
Introducción 3
El sistema nervioso central (SNC) adulto, por norma general, no es capaz de

regenerarse eficientemente tras una enfermedad neurodegenerativa. Sin embargo, la
remielinización que ocurre tras la destrucción de la mielina central por parte de los
oligodendrocitos, supone una excepción a esta norma y proporciona un ejemplo de
regeneración. La remielinización comprende la formación de nuevas bandas de mielina
alrededor de los axones desnudos, restaurando la conducción saltatoria y confiriendo
protección axonal (Franklin y ffrench-Constant, 2008) y puede darse de forma fisiológica para
remodelar la mielina existente (Fuster, 2002; Wang y Young., 2014) o también tras la inducción
de la desmielinización en modelos animales o en enfermedades desmielinizantes como la
esclerosis múltiple (EM) aunque, en este caso, no siempre sucede de manera eficiente
(Wolswicjk, 1998; Chang et al., 2000; Solanky et al., 2001; Chang et al., 2002; Reynolds et al.,
2002; Patrikios et al., 2006;Chandran et al., 2008). Sin embargo, los oligodendrocitos maduros
que rodean las lesiones desmielinizantes no parecen contribuir a la remielinización (Keirstead y
Blakemore, 1997). Se piensa, por lo general, que la mayoría de los oligodendrocitos
remielinizantes derivan de precursores de oligodendrocitos (OPCs, del inglés: Oligodendrocyte
Precursor Cells) que se encuentran ampliamente distribuidos por el SNC tanto de ratones
como de humanos adultos (Prineas et al., 1989; Pringle et al., 1992; Nishiyama et al., 1996).
En el presente trabajo se ha estudiado la influencia de diferentes moléculas sobre la

biología de los OPCs aislados del SNC tanto de individuos jóvenes como de adultos, así como
sobre su capacidad de remielinización, con el fin de poder favorecer una reparación efectiva de
las lesiones producidas en enfermedades desmielinizantes como la EM, enfermedad para la
cual actualmente sólo existen tratamientos inmunomoduladores que pueden paliar los
síntomas pero no reparar las zonas lesionadas en los casos en que dicha reparación no
consigue darse de forma espontánea.
1. Los oligodendrocitos y el linaje oligodendroglial.
Los oligodendrocitos fueron descubiertos por Pío del Río-Hortega que se refirió a ellos
en 1921 como “glía de escasas radiaciones” (Río- Hortega, 1921, 1928; FIGURA 1a,b). Son las
células gliales responsables de la formación de las vainas de mielina que envuelven los axones
en el SNC, proporcionándoles aislamiento para una rápida conducción de las señales eléctricas.
Estas vainas son cruciales para la función neuronal proporcionando soporte metabólico directo
al axón vía lactato y previniendo su degeneración (Lee et al., 2012). La interrupción de estas
vainas en intervalos regulares a lo largo de los axones da lugar a la formación de los nódulos
de Ranvier, donde abundan los canales de sodio, que permiten la conducción saltatoria del
impulso nervioso a través de ellos, incrementándose así la velocidad de conducción nerviosa,
de una forma muy eficiente desde el punto de vista energético, sin tener que aumentar
significativamente el diámetro del axón (Keought y Yong, 2013). Esto ha desempeñado un
papel importante en la evolución de organismos complejos cuyos sistemas nerviosos necesitan
transmitir rápidamente potenciales de acción a largas distancias, lo que requeriría grandes
incrementos en el diámetro axonal, que podrían resultar en la formación de sistemas nerviosos
excesivamente grandes para los cuerpos que deben alojarlos (FIGURA 1c).
4
FIGURA 1. Los oligodendrocitos. (a) Imagen de Pío del Río-Hortega, quién describió por primera vez los
oligodendrocitos refiriendose a ellos en 1921 como “glia de escasa radiaciones”. (b) Imagen del trabajo
original de Río-Hortega «Tercera aportación al conocimiento morfológico e interpretación funcional de
la oligodendroglía», de 1928, en la que se muestran las variedades de oligodendrocitos en la sustancia
blanca cerebral de perro. (c) Imagen de los oligodendrocitos que forman las vainas de mielina que
recubren los axones en el SNC, cuyas interrupciones, conocidas como nódulos de Ranvier, permiten la
conducción saltatoria que asegura una transmisión rápida y eficaz del impulso nervioso.Imagen
adaptada de http://www.neurocirugiacontemporanea.com/doku.php?id=oligodendrocito.
Los oligodendrocitos maduros capaces de producir dicha mielina se generan a partir de

precursores de oligodendrocitos (OPCs) que se identificaron por primera vez en la década de
los 80 (Raff et al., 1983). Los OPCs son células indiferenciadas presentes en el SNC tanto de
roedores como de humanos que se originan a partir de progenitores indiferenciados y son las
primeras células específicas del linaje oligodendroglial.
Numerosos estudios han determinado la generación de OPCs durante el desarrollo

embrionario de roedores en distintas oleadas. En la médula espinal hay una población que
emerge del neuroepitelio ventral alrededor del día 12,5 (E12,5) y bajo el control de Sonic
Hedgehog (SHH) producido por la notocorda en la línea media ventral, seguida de otra
población de origen dorsal, independiente de SHH, que aparece sobre E15. En el telencéfalo,
los precursores mas ventrales son producidos en la eminencia ganglionar media a E12,5, unos
días después se genera otra oleada de precursores en la eminencia ganglionar lateral y por
último, principalmente después del nacimiento, se produce otra oleada de precursores
derivados de la corteza cerebral (Richardson et al., 1997; Rowitch, 2004; Cai et al., 2005;
Vallstedt et al., 2005; Richardson et al., 2006). En humanos, los pocos estudios existentes
muestran los primeros OPCs en el cerebro anterior a las 10 semanas de gestación y alrededor
de la semana 15 se observan en mayor número en las eminencias ganglionares y en las zonas
ventricular y subventricular (Jakovcevski et al., 2009; Barateiro y Fernandes, 2014). La
heterogeneidad durante el desarrollo de los OPCs ha llevado a pensar que pueden existir
varios subgrupos de oligodendrocitos funcionalmente distintos ya desde su generación, sin
embargo, no está claro aún si estas poblaciones podrían tener papeles diferentes en la
remielinización y el mantenimiento de la mielina y, por consiguiente, si se ven afectadas de
igual manera por la edad y en enfermedades neurodegenerativas.
Después de su generación en lugares concretos del SNC, los OPCs migran y se

distribuyen por todo el SNC y a partir de ellos, una vez que alcanzan su destino, se originan
Introducción 5
todas las demás células oligodendrogliales en las sucesivas etapas de diferenciación celular
(Bribián y de Castro, 2007; Barateiro y Fernandes 2014; FIGURA 2). Cada una de las etapas de
diferenciación del linaje oligodendroglial se caracteriza por cambios en la capacidad de
migración, proliferación y diferenciación, cambios en la morfología celular con un aumento de
la complejidad y por la expresión de ciertos marcadores inmunocitoquímicos (Almazán et al.,
2001; Liu et al., 2002; Rowitch, 2004; de Castro y Bribián, 2005). Las fases de maduración se
dividen en cuatro estadíos; OPCs, pre-oligodendrocitos, oligodendrocitos inmaduros y
oligodendrocitos maduros (FIGURA 2).
FIGURA 2. El linaje oligodendroglial. Existen cuatro fases de maduración de las células del linaje
oligodendroglial. Las primeras células específicas del linaje son los OPCs, que presentan una morfología
bipolar, capacidad de migración y proliferación y expresan marcadores característicos como PDGFRα,
A2B5 o NG2, entre otros. Estos precursores empiezan a diferenciarse y a perder su capacidad migratoria
y proliferativa en las siguientes etapas. A partir de ellos se forman primero los pre-oligodendrocitos que
presentan más ramificaciones pero cortas y se caracterizan por la expresión de marcadores nuevos
como O4 y GPR17. A continuación, estos pre-oligodendrocitos se diferencian a oligodendrocitos
inmaduros que pierden la expresión de PDGFRα, A2B5 y NG2, continúan expresando O4 y empiezan a
expresar GalC y CNPasa convirtiéndose en células postmitóticas con largas ramificaciones. Por último, se
forman los oligodendrocitos maduros que expresan componentes de la mielina como PLP, MBP, MAG y
MOG y que extienden sus membranas para formar envueltas compactas adquiriendo la capacidad de
mielinizar axones. Imagen tomada de Barateiro y Fernandes, 2014.
Los OPCs, se caracterizan por su morfología generalmente bipolar o con un árbol

sencillo de procesos finos, morfología que facilita su movimiento. Son células que muestran
una gran capacidad migratoria y mantienen, además, cierta capacidad proliferativa. Es
6
característica de los OPCs la expresión en membrana de distintos marcadores, entre otros, el

receptor de tipo α para el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα), el
gangliósido A2B5 o el neuroglicano condroitin sulfato NG2 (Raff et al., 1983; Hart et al., 1989;
Pringle et al., 1992; Richardson et al., 2011; FIGURA 2). Durante el proceso de diferenciación
los OPCs dan lugar a los pre-oligodendrocitos, extendiendo procesos multipolares pero cortos,
que empiezan a expresar, junto con los marcadores de OPCs, el sulfatido O4 y la proteína
GPR17, cuya expresión perdura hasta la formación del oligodendrocito inmaduro (FIGURA 2).
En una etapa posterior, estos pre-oligodendrocitos se diferencian a oligodendrocitos
inmaduros, células mucho más ramificadas que pierden la expresión de PDGFRα, A2B5 y NG2,
continúan expresando O4 y empiezan a expresar el galactocerebrósido C (GalC) y la 2´-3´-
fosfodiesterasa-cíclica (CNPasa; Pfeiffer et al., 1981; McMorris et al., 1984). En este punto, se
convierten en células postmitóticas con largas ramificaciones (FIGURA 2). En la última etapa de
diferenciación, los oligodendrocitos maduros expresan componentes de la mielina, como la
proteína proteolipídica (PLP) o la proteína básica de mielina (MBP), la glicoproteína asociada a
la mielina (MAG) y la glicoproteína oligodendrocítica de mielina (MOG; Kanfer y McCartney,
1989; Lubetzki et al., 1991; Liu et al., 2002), y extienden sus membranas para formar envueltas
compactas adquiriendo la capacidad de mielinizar axones (FIGURA 2).
La maduración de los oligodendrocitos se produce en roedores y humanos en

diferentes momentos. En lo que al desarrollo del linaje se refiere, podemos equiparar lo que
ocurre a P2 en roedor con las 18-28 semanas de gestación de un humano y un P7 con las
semanas 28-40 (Craig et al., 2003, Barateiro y Fernandes, 2014). La tasa mayor de mielinización
se observa en ratones P15-20 y en humanos durante la infancia, aunque la mielinización
continúa hasta el final de la tercera década de edad (Foran y Peterson, 1992; Furusho et al.,
2012; Miller et al., 2012).
Además de estos OPCs que se diferencian para formar la mielina en el SNC, existe otra
población de OPCs que permanecen en la forma inmadura en el parénquima (Dawson et al.,
2003; Rivers et al., 2008; Psachoulia et al., 2009; Crawford et al., 2014). Hasta la fecha, no hay
evidencias de que estos OPCs residentes tengan un origen distinto al de los OPCs que se
diferencian a oligodendrocitos (Psachoulia et al., 2009). Esta otra población de OPCs que
permanece como tal, sin diferenciar, en los individuos adultos (OPCs adultos), en los últimos
años ha despertado gran interés por su capacidad de diferenciarse en determinadas
condiciones y de reemplazar oligodendrocitos que mueren de forma fisiológica o como
consecuencia de alguna patología.
2. Los precursores de oligodendrocitos en el adulto
Los OPCs adultos son una población de OPCs que permanece indiferenciada tras la
mielinización del individuo y que se han llegado a considerar como la cuarta población glial en
el SNC de mamíferos (Nishiyama, 2007). Se encuentran distribuidos tanto en la sustancia gris
como en la blanca, representando aproximadamente el 8-9% de la población celular total de
la sustancia blanca de un cerebro maduro y el 2-3 % de la gris (Nishiyama 1998, 2007; Levine y
Reynolds., 1999; Levine et al., 2001; Dawson et al., 2003).
Estos OPCs adultos no son exactamente iguales a los OPCs perinatales ya que su ciclo
celular es más largo, su tasa de proliferación y su capacidad de migración y de diferenciación
Introducción 7
son menores y la respuesta a factores de crecimiento determinados puede variar (Brockes et

al., 1980; Wolswijk y Noble, 1989; Wolswijk et al., 1991; Wren et al., 1992; Marchionni et al.,
1993; Engel y Wolswijk, 1996; Canoll et al., 1996; Shi et al., 1998; Psachoulia et al., 2009; de
Castro et al., 2013; Young et al., 2013). Además, los oligodendrocitos que se forman a partir de
los OPCs adultos forman un número mayor de internodos que los formados a partir de OPCs
durante la etapa postnatal temprana (Young et al., 2013). Sin embargo, morfológicamente son
muy similares y expresan los mismos marcadores que durante el desarrollo (A2B5, NG2,
PDGFRα; Nishiyama et al., 1996, 1999; Dawson et al., 2000, 2003; Wilson et al., 2006; Franklin
y ffrench-Constant, 2008; Clemente et al., 2011; FIGURA 3) y la mayoría de los OPCs adultos, al
igual que los del desarrollo, expresan diferentes tipos de canales iónicos activados por voltaje y
receptores de glutamato y GABA y reciben señales de las neuronas (Fröhlich et al., 2011).
Además, en el ambiente adecuado, los OPCs adultos pueden diferenciarse hacia
oligodendrocitos maduros (Dimou et al, 2008; Rivers et al, 2008). Por tanto, mientras que la
actividad proliferativa de los OPCs disminuye con la edad (Levine et al., 1993; Woodruff et al.,
2004), no desaparece y continúan dividiéndose y dando lugar a oligodendrocitos capaces de
mielinizar axones a lo largo de la vida de un individuo (Richardson et al., 1988; Nishiyama et al.,
2002; Rivers et al., 2008; Zhu et al., 2008; Trotter et al., 2010; Crawford et al., 2014).
FIGURA 3. Los OPCs adultos presentan una morfología muy similar a la de los OPCs embrionarios y
perinatales y expresan marcadores moleculares comunes característicos. (A) Imagen de la expresión
de NG2 en OPCs de ratones adultos (P60). (B) Imagen de la expresión de PDGFRα en OPCs de ratones
adultos. (C) OPCs adultos co-expresando NG2 y PDGFRα junto con el marcador nuclear Hoechst. Imagen
adaptada de Clemente et al., 2011.
La función de estos OPCs adultos está estudiándose en profundidad pero aún no se ha

determinado. Una de las funciones que se les ha atribuido recientemente está relacionada con
la plasticidad de la sustancia blanca (Wang y Young, 2014), pudiendo participar tanto en la
mielinización de los axones no mielinizados como en la remodelación de las vainas de mielina
existentes. Se sabe que aproximadamente el 28% de los oligodendrocitos maduros que se
encuentran en el cerebro de un ratón adulto han sido generados en una avanzada edad
postnatal (Rivers et al., 2008) y algunas regiones cerebrales, como la sustancia gris cortical y la
blanca subcortical, contienen axones sin mielinizar en ratones de hasta 8 meses de edad,
indicando que los oligodendrocitos formados a partir de los OPCs adultos podrían mielinizar
los axones no mielinizados previamente en estas regiones, quizás cambiando la funcionalidad
8
de sus circuitos y contribuyendo, de alguna manera, a la plasticidad neural, por ejemplo, en el

aprendizaje de las habilidades motoras. Se sabe, por ejemplo, que los ratones que aprenden
una nueva actividad motora, como correr en una rueda compleja con irregularidades,
presentan una mayor tasa de formación de nuevos oligodendrocitos (Fields, 2008; Richardson
et al., 2011; Zatorre et al., 2012; Young et al., 2013; McKenzie et al., 2014). En humanos,
también se ha visto que tocar el piano o aprender malabares aumenta el volumen de la
sustancia blanca sugiriendo un mayor nivel de mielinización debido a esta plasticidad en el
adulto (Bengtsson et al., 2005; Scholz et al., 2009; Richardson et al., 2011; McKenzie et al.,
2014). Por otro lado, se cree que los OPCs adultos estarían implicados en otra forma de
plasticidad que es la remodelación de la mielina. En regiones como el nervio óptico, dónde
prácticamente todos los axones están mielinizados en ratones de 8 semanas, se ha observado
también la formación de nuevos oligodendrocitos a partir de OPCs adultos, sugiriendo su
implicación, no sólo en la formación de nuevas vainas alrededor de los axones sin mielinizar,
sino también en la remodelación de las vainas de mielina ya existentes, remplazando a los
oligodendrocitos que mueren o intercalándose entre las vainas de mielina existentes, lo que
implicaría la sustitución de internodos largos por dos o más internodos cortos modificando la
velocidad de los impulsos (Young et al., 2013; Pajevic et al., 2014; Seidl, 2014). Aunque la
remodelación de la mielina parece ser más abundante durante la maduración del cerebro y
con la edad (Bennett y Madden, 2014), parece también tener un papel fundamental en el
aprendizaje y la memoria a lo largo de la vida (Zatorre et al., 2012). Un estudio reciente ha
mostrado que la tasa de proliferación de los OPCs en ratones adultos aumenta durante el
sueño proporcionalmente a la duración del sueño REEM y su diferenciación ocurre,
principalmente, cuando los animales están despiertos (Bellesi et al., 2013), apoyando la idea
de que la plasticidad puede estar asociada con la consolidación de la memoria.
Por otra parte, en los últimos años los OPCs adultos han generado mucho interés como
reservorio de células con capacidad de diferenciarse y remielinizar el SNC, tomando gran
importancia en la búsqueda de terapias regenerativas para enfermedades desmielinizantes
(Gensert and Goldman, 1997; Keirstead et al 1998; Levison et al, 1999; Nishiyama et al, 1999;
Horner et al, 2000; Levine et al, 2001; Dawson et al, 2003; Windrem et al, 2004; Rivers et al,
2008).
En la actualidad, está generalmente aceptado que los nuevos oligodendrocitos

generados en el SNC adulto, sano o enfermo, derivan de estos OPCs adultos ya que los
oligodendrocitos maduros son postmitóticos y, aunque algunos sobreviven a la
desmielinización, no parece que contribuyan a la reparación de la mielina (Keirstead y
Blakemore, 1997). La tasa de proliferación y la de diferenciación de los OPCs aumenta en
respuesta a la desmielinización que se produce en enfermedades como la EM (Carroll y
Jennings, 1994; Keirstead et al., 1998; Redwine y Armstrong, 1998; Levine and Reynolds, 1999;
Sim et al., 2002; Watanabe et al., 2002). Se sabe que los OPCs que están fuera de las lesiones
desmielinizantes proliferan, entran en la lesión y disminuyen en número coincidiendo con un
aumento del número de oligodendrocitos nuevos (Watanabe et al., 2002). Los
oligodendrocitos maduros generados a partir de OPCs adultos son capaces de remielinizar
axones, remplazando oligodendrocitos que mueren de forma fisiológica o a consecuencia de
alguna patología (Dubois-Dalq et al., 2005; Franklin and ffrench-Constant, 2008; Peru et al.,
2008; Sher et al., 2008). Sin embargo, en enfermedades como la EM los OPCs endógenos no
Introducción 9
logran reparar eficazmente el daño en todas las lesiones (Wolswicjk, 1998; Chang et al., 2000;
Solanky et al., 2001; Chang et al., 2002; Reynolds et al., 2002; Chandran et al., 2008).
Por estar presentes de forma fisiológica y abundante en el SNC de personas sanas y

enfermas, los OPCs adultos, aunque por el momento en muchos casos no pueden evitar la
progresión de la enfermedad, podrían ser objeto de potenciación de sus capacidades
biológicas (de migración, supervivencia y diferenciación hacia oligodendrocitos mielinizantes)
para conseguir una remielinización efectiva en este tipo de enfermedades.
3. La Esclerosis Múltiple como paradigma de las enfermedades desmielinzantes.
La EM es la enfermedad neurológica más frecuente en adultos jóvenes (entre 20 y 40

años), y se calcula que afecta a más de 2,5 millones de personas en el mundo. Se trata de una
enfermedad crónica autoinmune y degenerativa del SNC.
Los primeros registros de EM se remontan a 1837, cuando Carswell y Cruveilhier

separadamente describieron las lesiones histológicas en el SNC (Carswell, 1837; Cruveilhier,
1837; Lublin, 2005; Murray, 2009). Frerichs fue el primero que hizo diagnóstico clínico de
pacientes de EM en 1849, recogiendo características como la afectación predominante en
sujetos jóvenes o su curso inicialmente remitente-recurrente y, finalmente, progresivo, y
síntomas como el nistagmo y los posibles cambios en el estado mental (Frerichs, 1849). En
1868, Charcot, uniendo la observaciones anteriores con las suyas propias, propuso unos
criterios diagnósticos para la EM (la tríada nistagmo, temblor intencional y habla escandida),
además de identificar otros muchos síntomas y signos presentes en ella (vértigo, fatiga,
lentitud en la asociación de ideas, debilidad de extremidades, alteraciones de la sensibilidad,
depresión…). Además, proporcionó una clara descripción de los cambios patológicos
observados en el tejido postmortem de los pacientes (lesiones típicas en placas, pérdida de
mielina, preservación del axón, proliferación de células de glía, acumulación de células
fagocitarias y engrosamiento de las paredes de vasos pequeños) (Charcot, 1868; Guerrero,
2009; Kumar et al., 2011). En 1916, Dawson recopiló todo lo que se sabía hasta la fecha y
propuso la primera clasificación histológica de la enfermedad hasta entonces (Dawson, 1916;
Compston y Coles, 2012; Inaloo y Haghbin, 2013) y, en 1965, la Sociedad Nacional de EM
estableció un grupo de profesionales para proporcionar unas pautas estándar para el
diagnóstico de la EM (Lublin, 2005).
A día de hoy, la etiología de la EM continúa siendo desconocida. Algunas evidencias

muestran que tanto la susceptibilidad genética como los factores ambientales son necesarios
para el inicio de la enfermedad. Se cree que el desarrollo de la EM se da en personas
genéticamente susceptibles y expuestas a desencadenantes ambientales durante el periodo de
vulnerabilidad (Inaloo y Haghbin, 2013).
En cuanto a la susceptibilidad genética, los estudios con gemelos monozigóticos

muestran un 25% de concordancia para el desarrollo de la EM (Willer et al., 2003; Oksenberg
et al., 2008). También se ha demostrado que ciertos genes para antígenos leucocitarios
humanos (HLA) como HLA-DRB1, 1501, DQA 0102 y DQB1 0602 están asociados con un
elevado riesgo de padecer la enfermedad y, en particular, el HLA DR15 está fuertemente
asociado con los brotes tempranos de EM (Oksenberg et al., 2008; Ramagopalan et al., 2009).
10
Por lo que se refiere a factores ambientales que podrían estar implicados, la exposición
a cientos de patógenos virales y bacterianos como por ejemplo el virus de Epstein Barr (EBV)
están asociados a EM. El antígeno nuclear del EBV es estructuralmente similar a la proteína
básica de mielina (MBP), el componente principal de la mielina del SNC y, por ello, los
linfocitos T activados por el antígeno del EBV pueden dañar dicha proteína. Existen estudios
que revelan que los adultos con EM eran casi todos seropositivos para la infección por EBV
(Banwell et al., 2007). Otro hecho que relaciona la enfermedad con el ambiente es que la
prevalencia de la enfermedad es mayor en latitudes más nórdicas, sin embargo, estudios de
migración han demostrado que personas que han inmigrado a zonas de alto riesgo durante la
niñez muestran el mismo riesgo del país nuevo y no el de su país original (Hammond et al.,
2000). Algunos estudios también han revelado una relación inversa entre los niveles de
vitamina D, que es sintetizada por la exposición cutánea al sol, y el riesgo de desarrollar EM
(Van Amerongen et al., 2004) aunque el papel exacto de este factor de riesgo todavía no se
conoce (Banwell et al., 2011). Otros factores como el tabaco o la obesidad femenina en la
juventud también pueden estar implicados (Munger et al., 2009; Disanto et al.2012).
En cuanto a los síntomas, los pacientes de EM pueden mostrar episodios de disfunción

neurológica, incluyendo problemas visuales debidos a la inflamación de nervio óptico, fatiga,
ataxia, déficits motores y sensitivos, incontinencia urinaria e intestinal y problemas cognitivos
(Miller, 2012). Estos fallos son atribuibles a ataques inflamatorios recurrentes en el SNC que
llevan a la acumulación de células inflamatorias perivasculares (Anderson et al., 2000). La EM
se caracteriza principalmente por la formación de áreas de desmielinización, debidas a la
pérdida de los oligodendrocitos que forman las vainas de mielina que envuelven los axones en
el SNC, y la consiguiente degeneración axonal (Noseworthy et al., 2000; Compston y Coles,
2008; Henderson et al., 2009; FIGURA 4a).
FIGURA 4. La Esclerosis Múltiple. (a) La EM se caracteriza por la muerte de los oligodendrocitos, las células
formadoras de la vaina de mielina que recubre los axones en el SNC, que conlleva a la desmielinización y al
consecuente daño axonal. Imagen adaptada de http://www.jorgevillacura.com/
images/esclerosismultiple_myelin.jpg. (b) La EM puede clasificarse, según su progresión, en tres tipos: recurrente-
remitente en la que se suceden episodios de exacerbación de los síntomas clínicos seguidos de la remisión de estos,
secundaria progresiva que aparece cuando, tras un periodo con curso remitente-recurrente, la evolución de los
síntomas se hace progresiva, y primaria progresiva en la que la degeneración es temprana y los síntomas avanzan
gradualmente desde el inicio de la enfermedad. Imagen adaptada de http://multiple-sclerosis-
research.blogspot.com.es/2013/11/blocking-relapses-is-good-thing.html?m=1.
Introducción 11
La EM presenta una progresión variable y se clasifica generalmente, según sea ésta, en

tres tipos: recurrente-remitente, primaria progresiva y secundaria progresiva (FIGURA 4b).
Inicialmente, más del 80% de los casos son de curso remitente-recurrente, definido por
exacerbaciones clínicas de síntomas neurológicos seguidas de una remisión parcial o completa.
Después, con la acumulación de déficits neurológicos irreversibles en ausencia de remisiones y
la aparición de nuevas lesiones en la sustancia blanca, algunos de estos pacientes llegan a la
fase conocida como secundaria progresiva presentando una evolución gradual de los síntomas.
El daño axonal es el responsable de la transición desde remitente-recurrente a la forma
progresiva de la enfermedad. El 20% restante de los pacientes presentan la forma primaria
progresiva que se caracteriza, por lo general, por menos inflamación pero una pérdida axonal
más temprana y sostenida que conlleva un deterioro clínico progresivo desde el inicio (Miller,
2012).
En todos los casos, la mielina que rodea los axones se convierte en el blanco de un
proceso de desmielinización mediado por el sistema inmune. Como en cualquier proceso
inflamatorio del SNC, la barrera hematoencefálica se ve comprometida y esto lleva a la
infiltración de macrófagos activados y linfocitos T al parénquima cerebral. Estas células
inmunes poseen antígenos específicos de mielina y comienzan a destruirla (Adams et al., 1989;
Prineas et al., 1989; Sririam y Rodríguez, 1997; Gold et al., 2006; Ransohoff, 2012). Sin
embargo, al mismo tiempo que ocurre este proceso destructivo, se inicia un mecanismo de
reparación en estas lesiones conocido como remielinización. El análisis de lesiones crónicas de
EM indica que, aunque la remielinización puede ser extensiva en alguna de ellas, está ausente
o limitada al borde de la placa de desmielinización en la mayoría de los casos (Prineas y
Connell, 1979; Barkhof et al, 2003; Patrikios et al, 2006; Patani et al, 2007).
Debido a la falta de conocimiento sobre la etiología de la EM, los tratamientos

existentes en la actualidad se centran en el aspecto inmunopatogénico de la misma,
disminuyendo la intensidad de los síntomas y espaciando la aparición de brotes (López-Diego y
Weiner, 2008). Son terapias basadas en inmunomoduladores dirigidas a disminuir la repuesta
inmune pero no a reparar el daño ocasionado por la pérdida de mielina. Por tanto, es
importante buscar nuevas terapias para la enfermedad identificando dianas que puedan hacer
efectivos estos mecanismos de reparación endógena, restaurando en lo posible la función de
los axones desnudos y, en cualquier caso, retrasando o incluso impidiendo su deterioro.
4. Remielinización.
De todos los sistemas del cuerpo, el SNC se considera, generalmente, uno de los
menos eficientes en lo que a regeneración se refiere. La neurogénesis en el SNC adulto está
limitada a unas zonas concretas (el giro dentado del hipocampo y la parte de la zona
subventricular que reviste los ventrículos laterales) y, por tanto, la pérdida neuronal no puede
ser reemplazada eficientemente (Crawford et al., 2013). Sin embargo, esto no ocurre así con
los oligodendrocitos, como ya se ha mencionado. Cuando la mielina resulta dañada por el
proceso de desmielinización, la velocidad del potencial de acción puede disminuir hasta 30
veces por debajo de lo normal (Felts et al., 1997). Sin la vaina de mielina, la función y la
supervivencia neuronal se ven comprometidas, produciéndose la degeneración axonal y el
deterioro progresivo de la función neurológica (Crawford et al., 2013). Como ya se ha visto, en
12
respuesta al daño y la muerte de oligodendrocitos, los OPCs endógenos pueden proliferar,

migrar hacia la zona lesionada, diferenciarse hacia oligodendrocitos maduros y reemplazar la
vaina de mielina dañada. Este proceso que se ha ido ya mencionando a lo largo de este trabajo
y que a continuación se ampliará se conoce como remielinización.
La consecuencia inmediata de la remielinización es la apropiada redistribución de los

canales iónicos en los nodos de Ranvier y la restauración de la conducción saltatoria (Smith et
al., 1979), aunque hay diferencias observables en la arquitectura de la nueva mielina formada.
Lo más obvio es la delgadez de las nuevas vainas y la longitud de los internodos (Gledhill et al.,
1973; Blakemore, 1974).
En circunstancias normales la remielinización puede llegar a ser completa,

dependiendo de diversos factores. Sin embargo, la capacidad regenerativa del SNC se ve
disminuida con la edad y puede fallar en enfermedades como la EM (Franklin y ffrench-
Constant, 2008; Crawford et al., 2013).
La remielinización en EM puede ser extensiva en algunos pacientes pero en la mayoría

de los casos la reparación se da solamente durante la fase aguda de la enfermedad y está
limitada a ciertos tipos de lesiones. Las lesiones en EM se clasifican en cuatro tipos
dependiendo de sus características histopatológicas y su capacidad de remielinización
espontánea: activas, en sombra, crónico-activas y crónico-inactivas. Las características
principales de cada una se recogen en la TABLA 1.
La remielinización extensiva ha sido mostrada en aproximadamente un 20% de los

casos con estudios histopatológicos postmortem, mientras que la mayoría de los casos
muestran una remielinización limitada al borde de las lesiones (Patrikios et al., 2006). La
remielinización extensiva no está limitada a los casos de EM remitente-recurrente, sino que
también se ha visto en algunos pacientes con un tipo más progresivo (Patrikios et al., 2006). Un
estudio más reciente ha demostrado que los pacientes con la variante primaria progresiva,
tienden a tener una mejor remielinización que los que padecen la forma secundaria progresiva
(Bramow et al., 2010) y hay estudios que demuestran que algunos pacientes muestran
remielinización parcial incluso en fases crónicas de la enfermedad aunque el grado de
remielinización depende de los pacientes (Patani et al., 2007) y también de la localización de
las lesiones (Patrikios et al., 2006; Goldschmidt et al., 2009). En general, la remielinización es
mayor en los estadios tempranos de la enfermedad (Goldschmidt et al., 2009). En las lesiones
tempranas los OPCs se encuentran en mayor número en la zona que rodea las lesiones que en
la sustancia blanca aparentemente normal y en menor número en las lesiones crónicas
(Kuhlmann et al., 2008) donde los pocos OPCs existentes no muestran signos de proliferación
y, por lo general, no parecen formar oligodendrocitos mielinizantes particularmente en el
centro de las lesiones (Wolswijk, 1998). Numerosas publicaciones demuestran que el número
de OPCs se ve reducido con el tiempo en las lesiones de EM (Chang et al., 2002; Reynolds et
al., 2002; Wolswijk, 2002; Wilson et al., 2006). Se cree que la remielinización en las lesiones
depende del reclutamiento y la diferenciación de OPCs, procesos que a veces fallan en la EM
(Targett et al., 1996; Keirstead y Blakemore, 1997; Sim et al., 2002; Kotter et al., 2011; FIGURA
5).
Introducción 13
ESTADO DE LA
CARACTERÍSTICAS OTRAS CÉLULAS
TIPO DE LESIÓN MIELINA Y LOS
TISULARES GLIALES E INMUNES
OPCs
ACTIVA
Astrocitos
Desmielinizada,
hipertróficos, fuerte
con
Margen difuso y activación microglial,
reclutamiento de
daño axonal presencia de
OPCs y
extendido. macrófagos e
remielinización
infiltración de
ocasional
linfocitos
EN SOMBRA
Remielinizada en
Borde bien Astrocitos y
más de un 60 %
delimitado y microglía no activos
del área, con
axones y ausencia de
vainas de mielina
relativamente macrófagos y otras
delgadas y poco
preservados. células inmunes
uniformes
CRÓNICO-ACTIVA En la placa astrocitos

Completamente fibrosos y escasa
desmielinizada y presencia de
Borde marcado y con ausencia de macrófagos y
axones desnudos remielinización en leucocitos y en la
en el interior la placa pero con periplaca astrocitos
(corazón de la reclutamiento de hipertróficos, fuerte
placa) y dañados el OPCs y activación microglial
exterior (periplaca) remielinización y presencia de
ocasional en la macrófagos y células
periplaca inmunes
perivasculares
CRÓNICO-INACTIVA
Cicatriz glial
astrocítica, sin
Desmielinización
Margen delimitado activación microglial
completa y
y axones y con reducidísimo
remielinización
desmielinizados. número de
ausente
macrófagos y
leucocitos
Macrófago Microglía OPC Axón Mielina Placa activa Placa crónica Área remielinizada
TABLA 1. Tipos de lesiones en EM. Las lesiones en EM se clasifican en cuatro tipos: lesiones activas, con
un margen difuso, daño axonal y desmielinización extendida en las que están presentes OPCs y puede
darse remielinización ocasional; lesiones en sombra, con el borde bien delimitado, los axones
relativamente preservados y parcialmente remielinizadas; lesiones crónico-activas, con el borde
14
marcado, axones desnudos en la placa y dañados en la periplaca donde se puede producir en ocasiones
la remielinización; lesiones crónico-inactivas con el borde delimitado, una desmielinización completa y
sin remielinización. Tabla e imágenes adaptadas de Clemente et al., 2013.
FIGURA 5. El proceso de
remielinización. La remielinización
del SNC comprende dos procesos
fundamentales: I. el reclutamiento
de los OPCs a la zona
desmielinizada; II. La diferenciación
de los OPCs hacia oligodendrocitos
mielinizantes que contactarán con
los axones y formarán las vainas de
mielina nuevas. Imagen tomada de
Kotter et al, 2011.
Dado que la remielinización puede ser un proceso altamente regenerativo, debe

potenciarse el desarrollo de terapias dirigidas a favorecer esta regeneración ya que pueden
prevenir el daño axonal y el declive neurológico en enfermedades desmielinizantes crónicas.
Para el desarrollo de estas terapias es necesario el conocimiento en detalle del proceso de
remielinización y de las células y los mecanismos implicados en su fallo. El conocimiento de los
factores que afectan a la migración, la proliferación, la supervivencia, la diferenciación y la
capacidad de remielinización de los OPCs presentes en SNC adulto podría resultar crucial para
potenciar la reparación de las zonas desmielinizadas en este tipo de patologías.
Para el estudio de estos procesos se han desarrollado numerosos métodos tanto in

vitro como in vivo que se resumen en el siguiente apartado.
4.1. Métodos para el estudio de los precursores de oligodendrocitos y la

remielinización.
De los numerosos métodos que existen para el estudio de la biología de los OPCs, así
como de su capacidad para remielinizar axones, a continuación se resumen los más
comúnmente usados.
Métodos in vitro:
El desarrollo de métodos in vitro de cultivo de OPCs han permitido la evaluación de

mecanismos relacionados con la supervivencia de los OPCs, y el conocimiento de factores que
favorecen su proliferación y migración, así como los que conducen a su diferenciación hacia
oligodendrocitos maduros mielinizantes (Barateiro y Fernandes 2014).
El método más utilizado es el de aislamiento por agitación (shake-off). El cultivo glial

mixto se siembra en flasks de cultivo y, una vez que está confluente, los OPCs quedan sobre
Introducción 15
una capa de astrocitos fuertemente adheridos al flask de cultivo. La agitación suave de los
flasks permite que se despeguen los OPCs y la microglia pero no los astrocitos. La microglia
será eliminada después por su adherencia a placas bacteriológicas y se obtendrá un cultivo
puro de OPCs (McCarthy y de Vellis, 1980; Chen et al., 2007). El aislamiento también se puede
realizar mediante una técnica conocida como immunopanning que consiste en la selección de
los OPCs a partir del cerebro disgregado mediante la unión a anticuerpos específicos unidos a
una placa de cultivo (Shi et al., 1998; Emery y Dugas, 2013). Otros métodos existentes son el
aislamiento por separación celular activada por fluorescencia (FACS), que permite la
separación de los OPCs en un citómetro de flujo por unión a anticuerpos fluorescentes (Le Bras
et al., 2005), o por separación celular activada magnéticamente (MACS), con la que los OPCs
son seleccionados mediante la unión a anticuerpos específicos que quedarán retenidos
magnéticamente en una columna y eluidos y recogidos posteriormente (Dincman et al., 2012).
Todos estos métodos permiten, por lo general, obtener un cultivo muy rico en OPCs,
además de un gran número de OPCs embrionarios o postnatales tempranos y estudiar así su
capacidad de diferenciarse y convertirse en oligodendrocitos maduros capaces de mielinizar
axones.
Para el estudio de la mielinización existen varios tipos de modelos in vitro. Los co-
cultivos con neuronas, muy útiles para conocer las interacciones entre ambos tipos celulares y
el efecto de diversos factores sobre la mielinización en ausencia de otros tipos celulares que
puedan intervenir (Laursen et al., 2009; FIGURA 6), o el uso de biomateriales, donde la
capacidad de mielinización se puede estudiar mediante nanofibras de poliestireno o
micropilares en placas alrededor de los cuales los oligodendrocitos pueden formar vainas (Lee
et al., 2012; Mei et al., 2014; FIGURA 7).
FIGURA 6. Co-cultivo in vitro de

oligodendrocitos con neuronas. (A)
Las neuronas del ganglio de la raíz
dorsal (DRG; rojo) se pueden cultivar
con OPCs (verde) y ver cómo éstos
se empiezan a diferenciar y a
contactar con los axones para iniciar
la mielinización. (B) Cuando los OPCs
se han diferenciado a
oligodendorcitos maduros (verde)
forman vainas de mielina compactas
alrededor de los axones (rojo).
Imagen tomada de Lee y Fields,
2009.
16
Estos métodos de cultivo in vitro tienen la ventaja de que, con un relativo bajo coste y
un bajo número de animales, permiten estudiar mecanismos celulares concretos y cómo
afectan diversos factores a los OPCs a nivel de migración, proliferación, supervivencia,
diferenciación e incluso su capacidad de formación de vainas. Sin embargo, se debe tener en
cuenta que estos métodos no reproducen el ambiente real y, además, no permiten el
aislamiento eficaz de grandes números de OPCs si se trabaja con animales o con humanos
adultos, cuyo estudio resulta también muy importante para realizar comparaciones, ya que se
sabe que no siempre se comportan de igual modo que los embrionarios o perinatales (Kessaris
et al., 2006; Richardson et al., 2006; Fröhlich et al., 2011; Young et al., 2013; Bribián*,Medina-
Rodríguez* et al., Enviado)
FIGURA 7. Biomateriales
para el estudio de la
mielinización in vitro. (a,
b) Nanofibras de
poliestireno utilizadas
para el estudio de la
mielinización por parte de
los oligodendrocitos
teñidos para la detección
de MBP. (c-g) Micropilares
cónicos fabricados con
silica en placas de 96
pocillos. Tras ser
recubiertos por los
oligodendrocitos, se
pueden tomar imágenes
que permiten la
visualización de las vainas
y su cuantificación.
Imagen tomada de Mei et
al., 2014.
Modelos ex vivo:
Para evaluar el desarrollo de los oligodendrocitos y la mielinización en condiciones lo

más similares a su ambiente original, también con un coste no muy elevado y usando un
número de ratones menor que con los experimentos in vivo, existen los cultivos organotípicos.
Se basan en la realización de rodajas de una determinada zona del SNC, donde haya tractos
mielinizados, como el cerebelo, el bulbo raquídeo o la médula espinal. Estos modelos
Introducción 17
preservan la organización tridimensional que incluye las interacciones célula-célula así como
con la matriz extracelular (Stoppini et al., 1991; Lossi, et al., 2009).
Este método permite lesionar el tejido sano mediante algún agente gliotóxico como la
lisofosfatidil colina (LPC; también conocido como lisolecitina) y observar como los OPCs
endógenos o bien OPCs añadidos al cultivo de formas exógena, remielinizan los axones tras la
lesión en respuesta a diferentes factores (Zhang et al., 2011; FIGURA 8). Se sabe que los
oligodendrocitos son especialmente sensibles a la acción de la LPC y, aunque el mecanismo de
acción de este agente tóxico no está claro, se piensa que puede actuar como detergente,
provocando la permeabilización de la membrana de los oligodendrocitos (Smith, 1982;
Vereyken et al., 2009).
Figura 8. Modelo ex vivo para el estudio de la remielinización. Los cultivos de rodajas de cerebelo,
bulbo raquídeo o médula espinal permiten estudiar la remielinización conservando la estructura
tridimensional del tejido y las interacciones celulares. La desmielinización se induce con LPC y después
se puede observar como los OPCs endógenos o añadidos de forma exógena al cultivo remielinizan los
axones tras la lesión, permitiendo el estudio del efecto de diferentes factores, que se pueden añadir al
medio de cultivo, sobre la remielinización. Figura adaptada de Zhang et al., 2011.
Estos protocolos de desmielinización ex vivo son relativamente sencillos y permiten

obtener información tanto del desarrollo de los oligodendrocitos como de su capacidad de
remielinización y pueden ser utilizados como un primer paso para el análisis de tratamientos
potenciales para enfermedades desmielinizantes. Sin embargo, la señalización espacial y
temporal que se da en los modelos in vivo es difícil de recrear con exactitud en este tipo de
modelos. La respuesta de la circulación sistémica y la infiltración de células inmunes que
ocurre en enfermedades como la EM es imposible de determinar por estas vías que no
consiguen recrear la complejidad de la biología in vivo. Por ello, siempre será necesaria la
utilización de modelos in vivo como paso final en estudios pre-clínicos para la búsqueda de
fármacos candidatos para el tratamiento de la EM.
18
Modelos in vivo:
La mayoría de lo que hoy se conoce acerca del proceso de remelinización ha sido

determinado usando diferentes modelos animales de desmielinización y, aunque ninguno
refleja de forma exacta las características de la EM en humanos por tratarse de una
enfermedad muy compleja, cada modelo mimetiza bastante bien ciertos aspectos específicos
de la enfermedad. La elección de un modelo u otro por tanto dependerá de la parte concreta
de la enfermedad que se quiera estudiar.
Por un lado, tenemos los modelos que mejor reflejan las características globales de la
enfermedad como el modelo de encefalomielis autoinmune experimental (EAE) o los modelos
virales en los que la desmielinización se induce a través del sistema inmune (Traugott et al.,
1986; Boyle y McGeer, 1990).
En el modelo de EAE los animales son inmunizados contra fragmentos de péptidos de

mielina como MOG. El sistema inmune adaptativo produce entonces linfocitos T reactivos
contra la mielina que invaden el SNC y producen la desmielinización, resultando en una
parálisis ascendente característica, cuyo grado se mide con una escala pre-establecida y es lo
que se conoce como “score clínico”. Este modelo reproduce la inflamación, la desmielinización
aunque sólo en pequeñas zonas perivasculares, la pérdida axonal y la gliosis de la EM pero no
la implicación de las células B. La enfermedad puede desarrollarse de forma remitente-
recurrente o de forma crónica dependiendo de la cepa de ratón que se utilice y del protocolo
que se siga.
Los modelos virales pueden proporcionar información relevante sobre las

interacciones entre el sistema inmune y nervioso. Los virus utilizados más comúnmente son el
virus de Theiler (TMEV) que va dirigido contra las neuronas y produce primero la pérdida
axonal con desmielinización secundaria, y el de la hepatitis murina (MHV) que infecta a los
oligodendrocitos produciéndose primero la desmielinización, que lleva a la pérdida axonal
secundaria, lo que resulta interesante para estudiar la controversia existente acerca de si es el
proceso de neurodegeneración o el de desmielinización el que ocurre de manera primaria en
pacientes de EM y cuál es el que se da de forma secundaria (Atkins et al., 2000; van der Star et
al., 2012; Stys et al., 2012).
Aunque en este tipo de modelos, tanto el de EAE como los virales, es posible estudiar
la remielinización, es difícil interpretar si el fármaco utilizado como tratamiento promueve
directamente la reparación por los OPCs o si la remielinización es una consecuencia del
tratamiento de la aberrante reacción inmune desencadenada (Barateiro y Fernandes 2014).
Como se verá en el siguiente apartado, no se descarta que el sistema inmune pueda tener
efectos positivos en la reparación, dado que la remielinización no se da en animales sin
linfocitos funcionales (Wang et al., 2007). Además, el estudio de la remielinización en estos
modelos resulta complicado porque las lesiones que se inducen son pequeñas, diseminadas y
con una localización poco predecible, especialmente en el cerebro, y la desmielinización y la
remielinización ocurren simultáneamente, lo que hace difícil el estudio de mecanismos de
reparación de las lesiones (El Waly et al., 2014).
Introducción 19
Debido a estas dificultades, se han desarrollado modelos para estudiar los mecanismos
de reparación de manera independiente de la respuesta inmune como los modelos de
desmielinización inducida por agentes tóxicos que, por lo general no producen inflamación o
no tanta como los modelos anteriores, y presentan la ventaja de generar lesiones
desmielinizantes extensas y reproducibles, con una clara separación temporal entre los
procesos de desmielinización y remielinización, permitiendo el estudio de la implicación de
moléculas en el proceso de reparación y el desarrollo de estrategias que promuevan la
remielinización.
Dentro de este grupo, un abordaje común es la inyección estereotáxica del detergente

LPC o el agente intercalante bromuro de etidio (Jakovcevski et al., 2009; Back et al., 2001) para
inducir una desmielinización focal. El daño axonal es pequeño en ambos modelos y en los dos
se producen lesiones grandes aunque las lesiones por bromuro de etidio normalmente
remielinizan de forma espontánea más lentamente que las del modelo de LPC y el bromuro de
etidio es tóxico, no sólo para oligodendrocitos, sino también para astrocitos y OPCs por lo que
no es un buen modelo para estudiar la remielinización llevada a cabo por los OPCs endógenos
(Woodruff y Franklin, 1999; Craig et al 2003). La desmielinización por LPC, por el contrario,
afecta a los oligodendrocitos pero no a los OPCs. El daño se observa tres días después de la
inyección alcanzando el punto máximo a los siete días con una remielinización completa
mediada por OPCs endógenos después de las tres semanas y, aunque se considera un modelo
no inflamatorio, se ha observado la secreción de algunas citoquinas y la aparición de linfocitos
y macrófagos en las zonas de lesión ya que se produce un aumento de la permeabilidad de la
barrera hematoencefálica (Ousman y David, 2000, 2001). Es un modelo muy utilizado
actualmente para el estudio de la remielinización.
Otra alternativa usada habitualmente es producir la desmielinización usando el

quelante de cobre cuprizona que se administra a los animales en la dieta. La toxicidad de este
agente afecta selectivamente a los oligodendrocitos y se cree que actúa desorganizando el
complejo mitocondrial IV en las células formadoras de mielina (Vereyken et al., 2009). El daño
axonal es mínimo también en este modelo (Lindner et al., 2009). La desmielinización ocurre de
forma menos focalizada, permanece durante la alimentación con cuprizona y se completa tras
cinco semanas aproximadamente dependiendo de la dosis (Mason et al., 2004; Hesse et al.,
2010). La remielinización empieza inmediatamente cuando deja de suministrarse la cuprizona
y se vuelve a la dieta normal. Dependiendo de la dosis y el tiempo de administración, la
remielinización puede completarse entre las dos y las doce semanas tras la retirada del agente
(Lindner et al., 2009; Mason et al., 2004). En este modelo no hay daño de la barrera
hematoencefálica y también permite estudiar la remielinización con escasa influencia del
sistema immune (Kondo et al., 1987; Bakker y Ludwin, 1987; Skripuletz et al., 2011).
No obstante, los modelos in vivo, si los comparamos con los modelos in vitro o ex vivo,
resultan más caros, conllevan procedimientos más largos e implican el uso de un mayor
número de animales. Por esta razón, para probar si un compuesto es tóxico o por el contrario
puede tener potencial terapéutico en lo que concierne al proceso de diferenciación de
oligodendrocitos y la mielinización, los investigadores deberíamos probar en los modelos in
vivo sólo aquellos compuestos que hayan mostrado primero resultados prometedores in vitro.
20
Los estudios llevados a cabo usando tanto modelos in vitro y ex vivo como in vivo, han
permitido avanzar en el conocimiento de los pasos necesarios para la remielinización de los
axones desnudos llevada a cabo por los OPCs y en el descubrimiento de muchas de las
moléculas que intervienen en este proceso y que se tratan en el siguiente punto.
4.2. Factores involucrados en la remielinización.
A pesar de que la mielinización durante el desarrollo y en adultos comparte muchas

características (Mitew et al., 2014), las diferencias que existen entre los OPCs adultos y los del
desarrollo así como el ambiente en el que se encuentran, que igualmente es diferente, hacen
que la mielinización en algunos aspectos también lo sea (Shi et al., 1998; Woodruff et al., 2004;
Boulanger y Messier., 2014). Además de estas diferencias de partida, en enfermedades como
la EM, los axones desnudos pueden haberse visto afectados durante la desmielinización y
estos cambios pueden afectar también a la eficiencia del envainamiento (Piaton et al., 2010).
El ambiente en las lesiones en muchos casos no es el apropiado por la presencia de factores
inmunes e inflamatorios y el debris de mielina, que se acumula y lleva a la activación de
macrófagos (Kotter et al., 2006). Las proteínas asociadas a la mielina inhiben la maduración de
los OPCs y su eliminación es un requisito fundamental para la regeneración (Robinson y Miller,
1999; Syed et al., 2008; Plemel et al., 2013).
Cuando se produce la desmielinización en el cerebro adulto, los OPCs responden en

tres pasos (Franklin, 2002; Zhao et al., 2005; Talbott et al., 2007). El proceso de reparación
comienza con la activación de los OPCs, el posterior reclutamiento hacia la zona lesionada y,
por último, la diferenciación hacia oligodendrocitos maduros (Boulanger y Messier., 2014) que
deben extender sus procesos, contactar con los axones y envolverlos con capas concéntricas
de mielina y, finalmente, compactarlas para que sea funcional (Coffey y McDermott, 1997;
TABLA 2).
Fase de activación de los OPCs
La fase de activación consiste en la salida de los OPCs del estado quiescente en el que
se encontraban y su entrada en el ciclo celular (TABLA 2). Se produce en respuesta a la
desmielinización y la respuesta inflamatoria (Prineas y Graham, 1981; Adams et al., 1989;
Sriram y Rodríguez, 1997; Glezer et al., 2006; Rhodes et al., 2006). La presencia de linfocitos T,
así como los factores secretados por los astrocitos y la microglía, activan a los OPCs cercanos a
la región desmielinizada (Reynolds et al., 2002; Kerschensteiner et al., 1999; Kotter et al., 2001,
2005; Bieber et al., 2003; Li et al., 2005; Chari et al., 2006). Los anticuerpos específicos de
mielina estimulan a los macrófagos para eliminar el debris, paso clave para la reparación
(Mosley y Cuzner, 1996). De este modo, las células que provocan la desmielinización también
de cierta manera promueven la reparación. Varios genes implicados en la diferenciación de
OPCs durante el desarrollo aumentan su expresión durante esta fase de activación como NG2
(Nishiyama et al., 1997; Levine y Reynolds, 1999; Levine et al., 2001) o los factores de
transcripción Olig1, Olig2 y Nkx2.2 (Fancy et al., 2004; Talbott et al., 2005; Glezer et al., 2006).
Además, la activación también puede estar mediada por la liberación de neurotransmisores
por las propias neuronas ya que los OPCs poseen receptores para glutamato y GABA y es
evidente que su activación lleva a los OPCs a entrar en las fases siguientes de reclutamiento y
Introducción 21
diferenciación (Bergles et al., 2000; Fancy et al., 2004; Lin y Bergles, 2004; Talbott et al., 2005;
Glezer et al., 2006; Luyt et al., 2007).
Desmielinización y fase de activación de Fase de reclutamiento de los OPCs

los OPCs
• Presencia de linfocitos T y factores secretados • Factores de crecimiento (PDGF, FGF2, BDNF,IGF-
por astrocitos y microglía 1)

• Anticuerpos específicos de mielina • Citoquinas (CXCL1, CTNF, IL6, TNFα)
• Aumento expresión NG2 • Metaloproteasas y proteínas de matriz

• Factores de transcripción: Olig1, Olig2 y Nkx2.2 extracelular (Vintegrina, osteopontina,
• Liberación de neurotransmisores por las propias Anosmina-1)
neuronas • Moléculas provenientes de las neuronas
(Semaforinas, PSA-NCAM)
• Quinasas dependientes de ciclinas (Cdk2)
Fase de diferenciación de los OPCs
• Hormona tiroidea (T3)
• Citoquinas (CXCL1, CXCL12) y sus receptores

OPCs
(CXCR4, CXCR7)
Microglía
• Factores de crecimiento (IGF-1)
Astrocitos
• Factores de transcripción (Olig1, Olig2, Nkx2.2,
Axones mielinizados
Notch y Wnt, Gtx)
• Estimulación neuronal
• FTY720 (fingolimod; Gilenya®)
• AMPc
TABLA 2. Fases de la remielinización y principales factores implicados en cada fase. Tras la

desmielinización en el cerebro adulto, los OPCs responden en tres pasos: activación de los OPCs,
reclutamiento hacia la zona lesionada y diferenciación hacia oligodendrocitos maduros que deben extender
sus procesos y envolver los axones formando mielina funcional. Son muchos los factores implicados en
estos procesos y su regulación resulta esencial para conseguir una remielinización efectiva en enfermedades
como la EM.
22
Fase de reclutamiento de los OPCs
La fase de reclutamiento consiste en la proliferación de los OPCs y su migración hacia

las áreas desmielinizadas (TABLA 2; Redwine y Armstrong, 1998; Hinks y Franklin, 1999; Levine
y Reynolds, 1999; Sim et al., 2002; Crawford et al., 2013). La respuesta inmune favorece la
liberación de factores de crecimiento (Hinks y Franklin, 1999), citoquinas (Nathan, 1987) y
metaloproteasas de matriz (MMPs; Larsen et al., 2003; Vos et al., 2003; Ulrich et al., 2006;
DaSilva y Yong, 2008; Skuljec et al., 2011) que hacen que los OPCs activados migren a las zonas
de lesión (Omari et al., 2006; Skuljec et al., 2011) o, los que están en ellas, aceleren su tasa de
proliferación (Redwine y Armstrong, 1998), aumentando su número hasta tres veces en unos
días tras la desmielinización (Cenci di Bello et al., 1999). Esta fase requiere de la actuación
regulada de numerosos factores que estén presentes en el entorno de la lesión para que la
reparación se pueda llevar a cabo. Se sabe que los OPCs activados se vuelven más sensibles y
proliferan más en respuesta a los factores de crecimiento secretados por los astrocitos
reactivos, los macrófagos y la microglía presentes en las lesiones (Franklin y Kotter, 2008). Por
ejemplo, la administración exógena de factores de crecimiento, como el PDGF y el factor de
crecimiento fibroblástico (FGF2), promueven la proliferación y la reparación (Kumar et al.,
2007). PDGF es un factor de crecimiento producido por los astrocitos reactivos después de la
desmielinización (Hinks y Franklin, 1999; Kotter et al., 2005). Tanto PDGF como su receptor,
que es expresado específicamente por los OPCs, tienen un papel fundamental en el
reclutamiento de estos precursores, según demuestran una gran cantidad de artículos (Noble
et al., 1988; Hart et al., 1989; Wolswijk y Noble, 1992; Calver et al., 1998; Redwine y
Armstrong, 1998; Hinks y Franklin, 1999; Sim et al., 2002; Woodruff et al., 2004; Murtie et al.,
2005; Asher et al., 2005; Vana et al., 2007). El receptor PDGFRα y NG2 interactúan para
controlar la proliferación de OPCs tanto en el desarrollo del cerebro como en respuesta a la
desmielinización inducida experimentalmente (Bogler et al., 1990; Mckinnon et al., 1990;
Wolswijk y Noble, 1992; Frost et al., 2003). También el incremento en la proliferación es mayor
cuando hay una combinación de PDGF y FGF2 (Wolswijk y Noble, 1992; Murtie et al., 2005).
Otros factores que intervienen en el reclutamiento son las neurotrofinas como la

derivada de cerebro (BDNF) o la neurotrofina 3 (NT3; Barres et al., 1993, 1994; McTigue et al.,
1998), o el factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1), que incrementa la proliferación de
OPCs in vitro (Cui y Almazán, 2007) e in vivo en respuesta a la desmielinización (Mason et al.,
2000; Ye et al., 2002), además de tener un efecto positivo sobre la supervivencia de los OPCs
(Barres et al., 1993; Ye y D’Ercole, 1999; Ness et al., 2002; Mason et al., 2003).
Además de factores de crecimiento, también intervienen en la movilización de los

OPCs las citoquinas secretadas por las propias células inmunes (Arnett et al., 2001; Mason et
al., 2001; Glezer et al., 2006). Una citoquina ampliamente estudiada es el TNFα que, como
muchas citoquinas pro-inflamatorias, tiene efectos positivos o negativos dependiendo del
receptor que active, induciendo la activación y el reclutamiento de OPCs a través del receptor
2 (TNFR2) o induciendo la muerte celular a través del TNFR1 (TNFR1; Akassoglou et al., 1998;
Declercq et al., 1998; Haridas et al., 1998; Weiss et al., 1998; Eugster et al., 1999; Suvannavejh
et al., 2000; Arnett et al., 2001). También la familia de la interleuquina 6 (IL6) que incluye el
factor inhibidor de leucemia (LIF) y el factor ciliar neurotrófico (CTNF) aumentan la
proliferación y la diferenciación de OPCs (Mayer et al., 1994; Talbott et al., 2007) y promueven
Introducción 23
su supervivencia (Barres et al., 1993; Mayer et al., 1994). La quimioquinas son citoquinas pro-
inflamatorias secretadas por los astrocitos reactivos que intervienen igualmente en esta fase
de reclutamiento (Glezer et al., 2006) como la CXCL1 que influencia a los OPCs a través del
receptor CXCR2 (Glabinski et al., 2000; Nguyen y Stangel, 2001; Tsai et al., 2002; Lindner et al.,
2008).
En cuanto a las MMPs y las proteínas de matriz extracelular, que también pueden ser
secretadas por la microglia activada y los macrófagos en respuesta a la desmielinización
(DaSilva y Yong, 2008; Skuljec et al., 2011), también pueden tener efectos negativos alterando
la barrera hematoencefálica o degradando proteínas de mielina (Skuljec et al., 2011), o
positivos creando un ambiente favorable para la remielinización facilitando la migración de
macrófagos fagocíticos y la consiguiente eliminación del debris de mielina y también
facilitando la migración de OPCs (Skuljec et al., 2011). Los principales receptores de estas
moléculas de matriz extracelular, las integrinas, que son expresadas por los OPCs, se
sobreexpresan en respuesta a la desmielinización y por ejemplo la sobreexpresión de la V-
integrina contribuye a la migración, proliferación y la diferenciación de OPCs (Blaschuket al.,
2000). La osteopontina que es una glicoproteína de matriz extracelular secretable promueve la
migración de OPCs hacia áreas desmielinizadas (Selvaraju et al., 2004). Otra proteína de matriz
extracelular como la Anosmina-1, participa en procesos de migración de los OPCs (Bribián et
al., 2006, 2008; Clemente et al., 2011; Murcia-Belmonte et al., 2014; Bribián*, Medina-
Rodríguez* et al., Enviado).
También intervienen en el reclutamiento señales procedentes de los propios axones

como las Semaforinas que, en principio, actúan como guías para el crecimiento del cono
axonal, pero también pueden tener correceptores en las células oligodendrogliales (Spassky et
al., 2002). Las semaforinas 3A y 3F están sobreexpresadas en las lesiones activas de EM
(Williams et al., 2007) y, mientras que la 3A inhibe la migración de OPCs (Spassky et al., 2002) y
su diferenciación (Syed et al., 2008), la 3F actúa atrayendo a los OPCs (Spassky et al., 2002;
Boyd et al., 2013) e incrementando la remielinización (Boyd et al., 2013). En el caso de la
forma polisializada de la molécula de adhesión neuronal (PSA-NCAM), que es expresada por
los axones desnudos durante el desarrollo y en respuesta a desmielinización (Charles et al.,
2002), durante el desarrollo se cree que actúa negativamente sobre la mielinización (Charles et
al., 2002), mientras que en adultos favorece la migración de OPCs hacia zonas desmielinizadas
(Picard-Riera et al., 2002).
Por último, las quinasas dependientes de ciclinas (Cdk), que son clave para la
regulación del ciclo celular, también intervienen en el reclutamiento de OPCs. La Cdk2
concretamente regula la progresión del ciclo celular de OPCs, reduciéndose su proliferación
cuando está ausente (Caillava et al., 2011).
En definitiva, la fase de reclutamiento para la remielinización por parte de los OPCs,

envuelve la participación de un gran número de factores que juntos, llevan a los OPCs a entrar
en la fase de diferenciación, para dar lugar a oligodendrocitos maduros mielinizantes.
24
Fase de diferenciación de los OPCs
La fase de diferenciación corresponde a la fase final en la que los OPCs reclutados

maduran, establecen contacto con los axones, los envuelven y se produce la compactación de
la mielina produciéndose así la remielinización (TABLA 2).
Por un lado, la triyodotironina (T3) y la retirada de PDGF llevan a la salida del ciclo
celular y al comienzo de la diferenciación, reduciendo los niveles de ciclinas y actuando por
tanto a través de quinasas dependientes de ciclinas (Dugas et al., 2012). Los receptores X de
ácido retinoico (RXRs) pueden ser la diana de actuación de la T3 para la diferenciación de OPCs
(Huang y Franklin, 2011). Los RXR junto con los receptores activados de proliferación de los
peroxisomas (PPARs), en cuya activación también participa la T3, inhiben la activación
microglial y promueven la remielinización (Hanafy y Sloane, 2011). También IGF-1 actúa como
factor diferenciador de OPCs adultos activados (Hinks y Franklin, 1999).
Las citoquinas como CXCL12 y el receptor CXCR4 están implicados igualmente en el

proceso de diferenciación (Carbajal et al., 2011).
En cuanto a factores de transcripción, se sabe también que hay varios implicados en la

inhibición de la diferenciación a través de las vías de Notch y Wnt como por ejemplo Hes1 y 5,
Id2 y 4 y Sox2 (Hanafy y Sloane, 2011). Por el contrario, Olig1, en colaboración con Olig2,
promueve la reparación (Cheng et al., 2007; Dai et al., 2015) aunque su papel en la
diferenciación de los OPCs no está claro (Paes de Faria et al., 2014; Dai et al., 2015). También
Nkx2.2 está implicado en el proceso de diferenciación y promueve la transcripción de genes
específicos de mielina (Labombarda et al., 2009). Gtx, es otro factor de transcripción que se
expresa únicamente en oligodendrocitos maduros, también podría estar implicado en asegurar
una correcta diferenciación final (Awatramani et al., 1997) al igual que Myt1 (Hanafy y Sloane,
2011).
Recientemente se ha conseguido demostrar in vivo mediante técnicas de optogenética

que la estimulación neuronal regula cambios en las células formadoras de mielina
incrementando su número y aumentando el grosor de las vainas de mielina (Gibson et al.,
2014).
Por último, es importante destacar que el FTY720 (Fingolimod; Gilenya®), que es el

primer tratamiento oral aprobado para el tratamiento de la EM, disminuye la respuesta
inmune y recientemente se está estudiando también como posible agente remielinizante y
reparador (Miron et al., 2010; Kipp y Amor, 2012).
Como se puede observar, son muchos los factores implicados en la diferenciación y

debemos tener en cuenta que la regulación de esta fase de la remielinización es
particularmente importante porque es la principal causa del fallo en la remielinización que
ocurre en la EM (Wolswijk, 1998; Chang et al., 2000, 2002; Kuhlmann et al., 2008). Aunque se
puede encontrar una cantidad considerable de OPCs en las proximidades de las lesiones de
EM, estas células parecen ser incapaces de diferenciarse y formar oligodendrocitos maduros
mielinizantes (Wolswijk, 1998, 2000; Chang et al., 2000, 2002; Kuhlmann et al., 2008). Sería
muy útil por tanto el estudio exhaustivo de las moléculas que participan en este proceso para
Introducción 25
conseguir una terapia eficaz. El estudio de factores que promuevan la diferenciación de los
OPCs y la remielinización y a la vez sean capaces de mediar la respuesta inmune podría ser el
abordaje ideal en la búsqueda de tratamientos para la EM.
5. El AMPc y su implicación en la diferenciación de los precursores de

oligodendrocitos, la mielinización y la remielinización.
La adenosina 3´,5´-monofosfato cíclico (AMPc) es un segundo mensajero intracelular

ubicuo en células animales que actúa interaccionando con diferentes proteínas,
principalmente con la proteína quinasa A (PKA), molécula que participa en un gran número de
procesos fisiológicos. La activación de la PKA por el AMPc da lugar a la fosforilación de un gran
número de proteínas produciéndose efectos variables como modificaciones de canales iónicos,
movilización de Ca2+ intracelular, cambios en la síntesis de neurotransmisores o expresión de
genes específicos. Una vez que se activa la PKA, la subunidad catalítica difunde hacia el núcleo
de la célula dónde, mediante la fosforilación del residuo de serina 133, activa al factor de
transcripción de respuesta a AMPc, CREB, que, en este estado, activa la expresión de genes de
respuesta al AMPc implicados en numerosos procesos dependiendo del tipo celular y del
contexto (Borrelli et al., 1992; FIGURA 9).
FIGURA 9. Señalización
intracelular activada por
AMPc vía PKA. La
activación de la PKA se
lleva a cabo por el AMPc
y, a su vez, la PKA activa
CREB induciendo la
expresión de genes de
respuesta al AMPc
implicados en numerosos
procesos dependiendo
del tipo celular y del
contexto. Imagen de
http://mybionotes.tumblr
.com/post/33588864782/
wtf-are-gpcrs-signal-
transduction-and-
messaging.
El AMPc, por tanto, está involucrado en el mecanismo de acción y en procesos de

transducción de la señal de múltiples moléculas como hormonas, neurotransmisores,
citoquinas y factores de crecimiento y, debido a la gran variedad de moléculas que median su
acción vía AMPc, éste se encuentra implicado, como ya se ha dicho, en procesos celulares muy
diversos entre los que se encuentran dos especialmente interesantes para este trabajo como
son la diferenciación celular, concretamente de los OPCs, y la remielinización.
26
En primer lugar, en cuanto a los efectos del AMPc sobre la diferenciación

oligodendroglial, existen numerosos estudios. El AMPc actúa a través de diferentes
mecanismos bloqueando la proliferación de los OPCs y aumentando la diferenciación (Raible y
McMorris, 1993). La señalización por AMPc suprime la expresión de PDGFRα, inhibiendo la
proliferación (Li y Wang, 2011), y promueve la expresión de CNPasa (McMorris, 1983), MBP
(Clark et al., 2002) y PLP (Afshari et al., 2001) durante el desarrollo de los oligodendrocitos.
También se sabe desde hace décadas que los análogos de AMPc como el dibutiril AMPc (db-
AMPc) aceleran la diferenciación de oligodendrocitos a partir de cultivos primarios de cerebro
de rata (Raible y McMorris, 1989) y que en este proceso está implicado CREB, que alcanza el
máximo en su expresión en oligodendrocitos inmediatamente antes del periodo más rápido de
mielinización en el cerebro de rata y, usando in vitro un deoxioligonucleótido antisentido
contra el ARNm de CREB, desaparece el efecto diferenciador producido por el db-AMPc,
disminuyendo el número de células positivas para MBP y el grado de diferenciación en cultivos
de oligodendrocitos neonatales (Sato-Bigbee et al., 1994; Sato-Bigbee y DeVries, 1996).
Además, la apotransferrina, que es sintetizada y secretada durante el desarrollo por los
oligodendrocitos y que se ha visto que es esencial para la mielinización, también promueve la
diferenciación de oligodendrocitos en cultivo y se ha demostrado que el AMPc y CREB están
implicados en esta respuesta (Marta et al., 2002; García et al., 2004). Recientemente se ha
descrito que el aumento de AMPc en las neuronas es importante para promover la
mielinización, probablemente favoreciendo la receptibilidad del axón a ser mielinizado y
aumentando la estabilidad de la vaina de mielina. La estimulación eléctrica de neuronas del
ganglio de la raíz dorsal (DRG) co-cultivadas con oligodendrocitos promueve la mielinización a
través de un aumento de los niveles de cAMP (Malone et al., 2013). Además, el AMPc no solo
favorece la diferenciación de oligodendrocitos y la mielinización sino que tiene igualmente un
papel muy importante en la remielinización tras una lesión, habiéndose demostrado que el
aumento de sus niveles favorece este proceso en cultivos organotípicos de cerebelo
desmielinizados con LPC y también en el modelo de desmielinización por cuprizona in vivo (Sun
et al., 2012). También se ha comprobado que la inhibición de proteína glucógeno sintasa
quinasa 3 (GSK-3), que está relacionada con la vía del AMPc dado que es susceptible de ser
fosforilada e inactivada por PKA (FIGURA 10; Fang et al., 2000), conlleva a la estimulación de
CREB y aumenta la remielinización en el modelo de desmielinización por LPC in vivo (Azim y
Butt, 2011).
FIGURA 10. Implicación de la

enzima GSK-3 en la
señalización por AMPc. La
enzima GSK-3 puede ser
inhibida por PKA que a su vez
se activa por AMPc,
estimulando CREB y activando
la expresión de genes
específicos. Imagen de
Morales-García et al., 2014.
Introducción 27
Por último, se sabe que los niveles de AMPc juegan un papel muy importante en la
respuesta inmune (Lonze y Ginty, 2002; Volakakis et al., 2010) por lo que el control de los
niveles de este nucleótido podría ser clave en la regulación del proceso inflamatorio. La
conclusión a la que se ha llegado tras numerosos estudios es que el AMPc principalmente tiene
un efecto anti-inflamatorio, interviniendo tanto en la respuesta inmune innata como la
adaptativa a diferentes niveles (Serezani et al., 2008; Gerlo et al., 2011). Estas acciones han
sido atribuidas, en parte, a la capacidad del AMPc para inducir señales que interfieren con el
factor pro-inflamatorio nuclear-kappaB (NF-κB) que juega un papel muy importante en la
regulación de la expresión de genes que codifican para mediadores inflamatorios o inmunes y
es actualmente una diana clave para el diseño de fármacos anti-inflamatorios (Serezani et al.,
2008; Gerlo et al., 2011).
Por tanto, con estos antecedentes, teniendo en cuenta que el AMPc está implicado
tanto en la disminución de la respuesta inflamatoria como en el aumento de la diferenciación
oligodendroglial y la remielinización, procesos que en conjunto fallan en la EM, podemos
pensar en la regulación de los niveles de este nucleótido de cara a una posible terapia para
tratar esta enfermedad.
La regulación de los niveles intracelulares de AMPc dependen, por un lado, de su

síntesis, llevada a cabo por las adenilil ciclasas, y por otro lado, de su degradación por las
fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos (PDEs; Mehats et al., 2002; Conti y Beavo, 2007;
FIGURA 11). Este trabajo se ha centrado en la inhibición de la degradación por las PDEs para
conseguir aumentar los niveles de AMPc en OPCs y observar los efectos que este aumento
produce sobre su biología y la remielinización dado que la activación de la síntesis por las
adenilil ciclasas sólo induce alteraciones transitorias en los niveles de AMPc compensadas por
el aumento en la actividad de las PDEs (Essayan, 2001).
FIGURA 11. Control de los niveles

intracelulares de AMPc. Los niveles
intracelulares de AMPc se pueden regular
mediante su síntesis por las adenilil ciclasas (AC)
o mediante su degradación por las PDEs. La
activación de la síntesis por las AC sólo induce
alteraciones transitorias compensadas por el
aumento en la actividad de las PDEs por lo que,
la forma de conseguir un aumento continuado
en los niveles de AMPc, es a través de la
inhibición de las PDEs. Imagen tomada de
http://www.medscape.org
6. Las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos y sus inhibidores
La actividad de las PDEs fue descrita por primera vez poco después del descubrimiento
del AMPc por Sutherland y Rall, en 1958, y en la década de los 70 ya se sabía que existía una
gran diversidad entre las PDEs y que cada una tenía diferentes afinidades por el AMPc o el
GMPc y distintas propiedades fisicoquímicas (Thompson y Apleman, 1971). Existen 11 familias
28
de PDEs que se clasifican en base a su secuencia de aminoácidos, propiedades bioquímicas,

sensibilidad a inhibidores, mecanismos reguladores y afinidad por el AMPc o el GMPc. La
mayoría de las familias están compuestas por más de un subtipo y éstos, a su vez, cuentan con
diferentes isoformas resultado del splicing alternativo, de hecho, en humanos existen entorno
a 50 PDEs distintas (Essayan, 2001).
Algunos inhibidores de PDEs ya se utilizaban como fármacos en la práctica médica

mucho antes de conocer sus características inhibidoras. En 1868, Henry Hyde Salter ya publicó
un trabajo en el que se recomendaba la toma de dos tazas de café concentrado con el
estómago vacío para mejorar el asma. En los años 60, Butcher y Sutherland (1962)
demostraron que las metilxantinas, como la cafeína y la teofilina, inhibían la degradación de
nucleótidos cíclicos. La cafeína es un inhibidor competitivo y no selectivo de PDEs que
actualmente se sabe que aumenta el cAMP intracelular, activa la PKA y reduce la inflamación y
la respuesta inmunitaria innata (Marqués et al 1999; Peters-Golden et al., 2005; Deree et al.,
2008). Está presente en sustancias que se consumen habitualmente desde hace mucho tiempo
como el café o el cacao y otras más actuales como los refrescos de cola o las bebidas
energéticas. La teofilina actúa del mismo modo y también la consumimos de forma habitual en
el té negro y el té verde.
El potencial anti-inflamatorio de los inhibidores de PDEs se demostró ya en 1971

(Henney y Lichtenstein, 1971; Henney et al., 1972) y esto, unido a que varios grupos del
momento estaban investigando los diferentes tipos de PDEs y su diferente localización en los
tejidos (Beavo et al., 1970; Wells y Sprinkle, 1981), hizo que se empezara a pensar en el
potencial de la inhibición específica de las diferentes PDEs dirigida a tejidos y enfermedades
determinadas. Hoy en día se conoce una gran variedad de inhibidores específicos para muchas
de las diferentes PDEs y los continuos avances están permitiendo su evaluación como agentes
terapéuticos para enfermedades como el cáncer, el fallo cardiaco, las enfermedades
pulmonares, las enfermedades neurodegenerativas, la depresión o la disfunción sexual (Bolger
et al., 1993; Quadri et al., 1998; Essayan, 2001; Lerner et al., 2000; Jackson 2001; Hoffmann et
al., 2001; Bollen y Prickaerts, 2012). En los últimos años, respecto a esto, se han desarrollado
numerosos ensayos clínicos (Torphy et al., 1999; Kumar et al., 2013; Matera et al., 2014)
aunque algunos han fallado debido a sus efectos secundarios. En la TABLA 3 se recogen
algunos de los más recientes.
Enzima Fármaco Indicación Estado Identificador

(Fase) (ClinicalTrials.gov)
PDE1 ITI-214 (Takeda/Intra-Cellular Esquizofrenia I NCT01900522

Therapies)
PDE2 PF-05180999 (Pfizer) Migraña I NCT01981486
PDE3 Cilostazol (Universitair Ziekenhuis Fertilidad Desconocid NCT00823420
Brussel) o
Cilostazol (Korea Otsuka Acúfenos crónicos II NCT01378650
Pharmaceutical)
Cilostazol (Seoul National University Demencia IV NCT01409564
Hospital)
Cilostazol (Hanyang University) Eventos ateroscleróticos IV NCT00886574
Cilostazol (University of Southern Fertilidad II NCT01915069
California)
Cilostazol (Kobe City General Hospital) Restenosis IV NCT01261234
Introducción 29
Cilostazol (Korea Otsuka Isquemia IV NCT01013532

Pharmaceutical)
Milrinone (University of Fallo cardiaco I NCT01571037
Nebraska/Thoratec Corporation)
Enoximone (Gilead Fallo cardiaco III NCT00077948
Sciences/AstraZeneca)
PDE4 Rolipram (US National Institutes of Depresión I NCT00369798
Health)
Rolipram (GlaxoSmithKline) Enfermedad de Huntington I NCT01602900
GSK356278 (GlaxoSmithKline) Enfermedad de Huntington I NCT01602900
ASP9831 (Astellas Pharma) Esteatohepatitis no alcoholica II NCT00668070
GSK256066 (GlaxoSmithKline) Rinitis II NCT00464568
CHF6001 (Chiesi Farmaceutici) Asma; Enfermedad pulmonar II NCT01730404
obstructiva crónica (COPD)
Apremilast (Celgene) Acné II NCT01074502
Apremilast (Celgene) Espondiditis aquilosante III NCT01583374
MK0952 (Merck Sharp & Dohme) Alzheimer II NCT00362024
CHF6001 (Chiesi Farmaceutici) COPD II NCT01730404
Roflumilast (Takeda) Dermatitis atópica II NCT01856764
NCT01856764 Demencia II NCT01433666
Roflumilast (The National Heart, Lung Obesidad II NCT01862029
and Blood Institute)
AN2898 and AN2728 (Anacor Dermatitis atópica II NCT01301508
Pharmaceuticals)
PDE5 Sildenafil (University of Milan) Distrofia muscular de Duchenne I NCT01580501
NCT01359670
Sildenafil (University of Milan) Fallo cardiaco III NCT00407446
Sildenafil (IRCCS, San Raffaele) Función endocrina en pacientes III NCT00420901
con diabetes
Sildenafil (Vanderbilt University) Intolerancia a la glucosa III NCT01812434
Sildenafil (University of Minnesota) Vasculopatía cardiaca II NCT01812434
Sildenafil (Massachusetts General Esquizofrenia IV NCT00455715
Hospital)
Tadalafil (Västra Götaland Region) Diabetes II NCT01238224
Tadalafil (University of Roma La Cardiomiopatía diabética IV NCT01803828
Sapienza)
Tadalafil (Cedars-Sinai Medical Center) Distrofia muscular de Becker IV NCT01070511
Tadalafil (Sidney Kimmel Mieloma múltiple II NCT01374217
Comprehensive Cancer Center)
Tadalafil (Washington University Estenosis aórtica IV NCT01275339
School of Medicine)
Tadalafil (Sidney Kimmel Cáncer de cabeza y cuello IV NCT01697800
Comprehensive Cancer Center)
Tadalafil (Sanjay Gandhi Institute of Enfermedades hepáticas III NCT01553981
Medical Sciences)
Udenafil (Seoul National University Fenómeno de Raynaud III NCT01280266
Hospital)
PF-00489791 (Pfizer) Nefropatía diabética III NCT01200394
PDE9 PF-04447943 (Pfizer) Alzheimer II NCT00930059
PF-04447943 (Pfizer) Alzheimer II NCT00988598
PDE10 PF-02545920 (Pfizer) Esquizofrenia I NCT01244880
PF-02545920 (Pfizer) Enfermedad de Huntington I NCT01806896
AMG 579 (Amgen) Esquizofrenia I NCT01568203
TAK- 063 (Takeda) Esquizofrenia I NCT01879722
TABLA 3. Inhibidores de PDEs usados en estudios clínicos actualmente. En la actualidad existen un gran
número de inhibidores de PDEs que se están utilizando en ensayos clínicos para el tratamiento de
enfermedades de muchos tipos, entre otras, enfermedades neurodegenerativas, autoinmunes, cáncer y
enfermedades cardiacas o respiratorias. Tabla tomada de Maurice et al., 2014.
Sin embargo, otros inhibidores ya se han comercializado, como por ejemplo un

inhibidor de la PDE5, el sildenafil, para el tratamiento de la disfunción eréctil como principio
activo de la conocida VIAGRA® o para la hipertensión arterial pulmonar (REVATIO®).
30
Por el gran potencial terapéutico de los inhibidores de PDEs y por los beneficios sobre
la respuesta inmune y sobre la remielinización que se sabe que conlleva el aumento de AMPc
intracelular subyacente a esta inhibición, este trabajo se centrará en este punto y para ello
debemos tener en cuenta que, de las 11 familias de PDEs conocidas, sólo tres (la PDE4, la PDE7
y la PDE8) se encargan específicamente de la degradación de AMPc, por lo que se detallan a
continuación sus características y lo referente a su inhibición específica para conseguir el
aumento de los niveles intracelulares de este nucleótido cíclico.
6.1. Fosfodiesterasa- 4
La familia PDE4 es la más grande de todas y la más estudiada hasta el momento. Está
constituida por 4 genes (PDE4A, PDE4B, PDE4C y PDE4D) y al menos 35 isoformas (Swinnen et
al., 1989; Livi et al., 1990; Bolger et al., 1993; McLaughlin et al., 1993; Obernolte et al., 1993;
Baecker et al., 1994; Sullivan et al., 1994; Engels et al., 1995; Owens et al., 1997). Hidroliza
exclusivamente el AMPc con una afinidad muy elevada (Constante de Michaelis-Menten -Km-
2-4 μM; Bolger et al., 1993) y se considerada insensible a GMPc (Beavo et al., 1970; Beavo y
Reifsnyder, 1990; Francis et al., 2002). La gran variedad estructural que presenta esta familia
permite hablar de distintas formas de regulación bien sea por los propios niveles de AMPc, por
fosforilación por PKA, ácido fosfatídico o las quinasas ERK-MAPK o IP3, por asociación a
proteínas o por proteólisis dependiendo de la isoenzima de la que se trate y del lugar donde se
exprese (Nemoz et al., 1997; Lugnier, 2006; Sun et al., 2012).
En cuanto a su distribución, se sabe que está presente principalmente en cerebro,

células inflamatorias y tejido cardiovascular, entre otros (Houslay et al., 1998; Tenor et al.,
1996). La PDE4A en rata y humano se ha detectado concretamente en cerebro, corazón,
pulmón, riñón, placenta e hígado (Engels et al., 1994); la PDE4B en corazón, pulmón,
musculatura esquelética y cerebro (McLaughlin et a., 1993; Engels et al., 1994); la PDE4C en
riñón, corazón, placenta, hígado, páncreas, musculatura esquelética, pulmón, testículos y
cerebro (Engels et al., 1994, 1995; Obernolte et al., 1997); y la PDE4D en riñón, corazón,
placenta, musculatura esquelética, pulmón, testículos y cerebro (Baecker et al., 1994; Engels et
al., 1994; Salanova et al., 1999).
En células del sistema inmune todas, excepto la PDE4C, se han encontrado en

neutrófilos, macrófagos, basófilos, plaquetas, eosinófilos, linfocitos T y B, mastocitos y
monocitos (Engels et al., 1995)
En el SNC de roedores se distribuyen como sigue: la PDE4A en bulbo, hipocampo,

corteza cerebral, determinados núcleos talámicos, cerebelo y núcleos del tronco cerebral
(Engels et al., 1995); la PDE4B en corteza cerebral, ganglios basales, hipocampo y
determinados núcleos talámicos (Cherry y Davis, 1999); la PDE4C sólo se expresa en bulbo
olfativo (Engels et al., 1995; Pérez-Torres et al., 2000); y la PDE4D en corteza cerebral,
hipocampo, cerebelo, tálamo y determinados núcleos del tronco cerebral (Engels et al., 1995;
Cherry y Davis, 1999). No obstante, si comparamos este patrón de expresión con el
encontrado en primates y humanos encontramos diferencias, como que PDE4A se expresa en
varios núcleos del tronco encefálico de rata mientras que en humano sólo se observa en el
núcleo pontino. La PDE4B se encuentra en núcleos cerebelares y en células de Purkinje de
humano pero no de rata. En el caso de la PDE4D se expresa en los núcleos interpeduncular y
Introducción 31
reticulotegmental y en colículo superior de rata y no de humano y la PDE4C tiene un patrón

mucho más limitado en las tres especies y sólo se expresa en la corteza cerebral, algunos
núcleos talámicos y cerebelo humano, corteza cerebral y cerebelo de mono y exclusivamente
en bulbo olfatorio de rata, como se ha mencionado (Pérez-Torres et al, 2000; Miró et al 2002).
En lo que respecta a su inhibición específica, hay tres moléculas que se han estudiado
en profundidad: el Rolipram, el Roflumilast y el Cilomilast. La mayoría de las investigaciones
para reducir la respuesta inflamatoria se han centrado en los inhibidores de la PDE4, ya que es
la más representada en las preparaciones de células T y sus inhibidores son capaces de
disminuir la producción de citoquinas inflamatorias (Giembycz et al., 1996; Manning et al.,
1999). Los inhibidores de PDE4 están actualmente en desarrollo para el tratamiento de
enfermedades como el asma y la enfermedad obstructiva crónica pulmonar (COPD; Gamble et
al., 2003; Grootendorst et al., 2007) entre otras (TABLA 3). Los efectos potenciales observados
en animales para el tratamiento de estas enfermedades fueron trasladados a ensayos clínicos
de fase II y III. Tras los primeros intentos con Rolipram, se vio que el tratamiento causaba
náuseas, aumento de la secreción de ácidos gástricos y vómitos y que estos efectos adversos
parecían ligados al denominado locus de alta afinidad para Rolipram (Barnette et al., 1998; Dal
Piaz y Giovannoni, 2000). Sabiendo esto se desarrollaron los compuestos denominados de
segunda generación con una menor afinidad para este locus como el Roflumilast y el
Cilomilast. Sin embargo, la aparición de nuevo de efectos secundarios como náuseas, vómitos,
diarreas y dolor de cabeza han hecho que actualmente se sigan buscando alternativas que
consigan reducirlos (Rabe et al., 2005; Calverley et al., 2007; Spina, 2008).
Los inhibidores de PDE4 han sido ampliamente estudiados también como agentes
terapéuticos para enfermedades autoinmunes y entre ellas para la EM (Sommer et al., 1995;
Martínez et al., 1999; Dal Piaz y Giovannoni, 2000; Sánchez et al., 2005; Paintlia et al., 2008).
Desde hace tiempo se sabe que el Rolipram interviene en la respuesta inmune (Sommer et al.,
1995) y se ha usado en el modelo de EAE en ratón, rata y primates no humanos para
demostrarlo (Genain et al., 1995; Folcik et al., 1999; Martínez et al., 1999). Sin embargo, la
inflamación no es el único problema en la EM como se describió anteriormente. La expresión
de PDE4 se ha descrito también en oligodendrocitos (Whitaker et al., 2008) y un estudio de
2008 muestra que su inhibidor, Rolipram, es capaz de disminuir la severidad de los síntomas en
el modelo de EAE disminuyendo la inflamación, y también la pérdida axonal y la
desmielinización (Paintlia et al., 2008). Más recientemente, se ha demostrado que promueve
la maduración de OPCs y promueve la remielinización tanto ex vivo (rodajas de cerebelo
desmielinizadas con LPC), como in vivo (modelo de desmielinización por cuprizona y bromuro
de etidio) a través de la activación de la vía de las quinasas ERK-MAPK (Sun et al., 2012; Syed et
al., 2013). Sus efectos neuroprotectores también habían sido anteriormente vistos sobre las
neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra en el modelo de MPTP para la enfermedad de
Parkinson (Hulley et al. 1995). Desafortunadamente, los ensayos clínicos con inhibidores de
PDE4 en este campo han revelado que el tratamiento provoca efectos secundarios al igual que
se había visto para el tratamiento de las enfermedades respiratorias (Dinter, 2000) ya que
provocan una mala tolerancia en los pacientes y producen náuseas, vómitos e insomnio
(Bielekova et al., 2009).
32
Los prometedores resultados preclínicos hacen que resulte de gran interés la

búsqueda de alternativas a estos inhibidores para evitar los efectos indeseables que producen
sobre los pacientes. Para este propósito se están empezando a estudiar otras familias de PDEs
descubiertas posteriormente (PDE7 y PDE8), que metabolizan también exclusivamente el
AMPc y se expresan en células del sistema inmunitario y en el cerebro, y se están intentando
sintetizar inhibidores cada vez más específicos para ellas.
6.2. Fosfodiesterasa -8
La PDE8 es una familia que se ha identificado más recientemente y de la que aún no se

conoce tanto como de otras PDEs. Se sabe, por ejemplo, que tiene mayor afinidad por el AMPc
(Km 0,06-0,15 μM), hasta 40 veces más que la de PDE4, pero con una velocidad de hidrólisis
del AMPc 10 veces menor (Fisher et al., 1998; Gamanuma et al., 2003). Existen dos isoenzimas:
PDE8A y PDE8B y se distribuyen como sigue: PDE8A se expresa en testículos, bazo, intestino
delgado, ovarios, colon y riñón tanto en humanos como en roedores (Soderling et al., 1998;
Fisher et al., 1998; Wang et al., 2001), en células T (Glavas et al., 2001) y en cerebro de
roedores, pero no en cerebro humano. Mientras, PDE8B si se encuentra en el cerebro,
concretamente en los ganglios basales, en algunas regiones hipocampales y en corteza frontal
y temporal, y también se encuentra expresada en el cerebelo (Pérez-Torres et al., 2003).
Además, también hay expresión de PDE8B en la glándula tiroides y en los testículos (Hayashi et
al., 1998; Bender y Beavo, 2006).
A pesar de su alta afinidad por el AMPc y su expresión en células inmunes y en el SNC,

hasta 2011 no se describieron los primeros inhibidores específicos para esta enzima (amidas
del ácido nipecótico 1,5-disustituidas; DeNinno et al., 2011) y aún no se han estudiado sus
efectos o posibilidades terapéuticas. Se sabe que PDE8 es insensible a inhibidores no
específicos que inhiben otras PDEs, como la isobutilmetilxantina (IBMX) y se ha podido inhibir
con dipiridamol, que también inhibe PDE5 y PDE6 (Soderling et al., 1998), aunque aún no se
conoce tampoco ninguna posibilidad terapéutica de esta molécula como inhibidor de PDE8.
6.3. Fosfodiesterasa- 7
La familia PDE7, al igual que la PDE4 y la PDE8, presenta una elevada especificidad por
el AMPc y nula por el GMPc. Existen dos genes que codifican para los miembros de la familia
PDE7: la PDE7A y la PDE7B. Ambas tienen una Km hasta diez veces mayor que la encontrada
para la PDE4 (0,2 μM para PDE7A y 0,13 μM para PDE7B) sugiriendo que la PDE7, al ser más
específica estaría activa a bajas concentraciones de AMPc (Soderling y Beavo, 2000). Parece
ser que existe una regulación diferencial según la isoenzima: PDE7A contiene secuencias CRE
que contribuyen a su activación (Torras-Llort y Azorín, 2003) y PDE7B se activa tras la
activación de PKA por AMPc (Sasaki et al., 2004). La distribución de las isoenzimas de PDE7 se
estudió por hibridación in situ, encontrándose expresión de PDE7A en el SNC, la musculatura
esquelética, el corazón, el riñón y el pulmón en humanos (Michaeli et al., 1993; Han et al.,
1997). En roedores, está presente en testículos, hígado, bazo, glándulas adrenales y riñón
(Miró et al., 2001) y en el SNC, concretamente, en bulbo olfativo, hipocampo, cerebelo,
glándula pineal, habénula media, área postrema y plexos coroideos de roedores (Miró et al.,
2001, Johansson et al., 2012). En cambio, en el SNC humano su expresión se encuentra en
corteza cerebral, hipocampo, cerebelo y núcleos caudado y putamen (Pérez-Torres et al.,
Introducción 33
2003). También se expresa en linfocitos T y otras células inmunes (Li et al., 1999; Smith et al.,
2003).
La PDE7B se ha detectado en cerebro, corazón, musculatura esquelética y páncreas

(Hetman et al., 2000) en roedores y en humanos, y en estos últimos está además presente en
ovarios, glándula pituitaria, timo e intestino (Gardner et al., 2000). En el SNC de roedores se
encuentra en hipocampo, algunos núcleos talámicos, corteza cerebral y cerebelo (Reyes-Irisarri
et al., 2005; Johansson et al., 2012) y en humano en corteza cerebral, en hipocampo y cerebelo
(Pérez-Torres et al., 2003).
La inhibición específica de PDE7 se comenzó a estudiar más tarde que la de PDE4 como
alternativa a ésta, con el fin de intentar evitar los efectos secundarios que se observaban, y
dado el gran potencial terapéutico que se le ha atribuido. Desde que se empezaron a
desarrollar los primeros inhibidores de PDE7 (Martínez et al., 2000; Barnes et al., 2001; Castro
et al., 2001), se han ido generando nuevos compuestos cada vez más específicos. En 2004 se
descubrió el BRL 50481 (BRL; Smith et al., 2004) que es un inhibidor específico de PDE7 cuyo
efecto neuroprotector sobre las neuronas dopaminérgicas in vitro e in vivo ha sido probado en
un modelo animal de la enfermedad de Parkinson que consiste en la inyección de
lipopolisacarido (LPS) en la sustancia negra y dónde también se ha observado un efecto anti-
inflamatorio (Morales-García et al., 2011). En este estudio se utilizó también otro inhibidor de
PDE7, un derivado de quinazolina (S14), descubierto en el Instituto de Química Médica-CSIC
mediante el programa CODES que permite realizar un screaning virtual utilizando redes
neuronales artificiales y predecir las propiedades de nuevas moléculas (Castro et al., 2008). El
S14 produjo el mismo efecto anti-inflamatorio y neuroprotector que el BRL, actuando ambos
inhibidores a través de los aumentos intracelulares de AMPc y la estimulación de PKA y CREB
(Morales-García et al., 2011). Otros derivados de quinazolinas habían demostrado in vitro que
aumentaban la producción de AMPc en líneas celulares de macrófagos y células T y reducían la
respuesta inflamatoria inducida por LPS en cultivos celulares de ambos tipos (Castaño et al.,
2009). También otros derivados de este tipo, como el TC3.6, han demostrado su efecto anti-
inflamatorio y neuroprotector en cultivos primarios de astrocitos, microglía y neuronas
tratados con LPS y en un modelo animal de accidente cerebrovascular donde redujeron el
volumen de la zona infartada y los déficits motores asociados (Redondo et al., 2012c). Los
efectos de S14 se estudiaron también en un modelo de lesión medular y se demostró un
descenso de la inflamación y del daño tisular (Paterniti et al., 2011). Tanto BRL como S14
fueron utilizados después en un modelo animal de la enfermedad de Alzheimer observándose
también un efecto neuroprotector y anti-inflamatorio de los inhibidores en estos ratones
(Pérez-González et al., 2013). Actualmente se siguen sintetizando inhibidores derivados de
quinazolinas de gran afinidad para PDE7 (Sánchez et al., 2013)
Otro tipo de inhibidores potentes y selectivos para PDE7 son los tiadiazoles, que son
capaces de actuar a concentraciones nanomolares (Vergne et al., 2004). A este grupo
pertenecen el VP1.15 y el VP3.15 que también han resultado beneficiosos en la reducción de la
respuesta inmune en modelos de lesión medular (Paterniti et al 2011) y han sido capaces de
revertir los síntomas clínicos en el modelo de EAE (Redondo et al., 2012a,b).
34
Los efectos de la inhibición de PDE7 con otro compuesto (3,4,5-Trimetoxibenzil 5-fenil-

2-furoato) en el modelo de EAE se han estudiado en otro trabajo apreciándose también esa
reversión de los síntomas clínicos (Redondo et al., 2012a). También el TC3.6, que se ha
mencionado anteriormente, se ha probado que reduce la respuesta inmune y el score clínico
en el modelo de EAE a diferencia del BRL, que no logró revertir los síntomas (González-García
et al., 2013).
Pese a que se ha visto en multitud de trabajos que los inhibidores de PDE7 consiguen
reducir la respuesta inmune en numerosos modelos animales y también revertir los síntomas
clínicos en el modelo de EM, no se conocen aún sus efectos sobre la remielinización que, como
se ha desarrollado anteriormente, se sabe que son positivos cuando se inhibe la PDE4 (Paintlia
et al., 2008; Sun et al., 2012; Syed et al., 2013). Se sabe que los mecanismos mediante los
cuales la inhibición de PDE7 regula la respuesta inmunológica en EAE no son los mismos por los
que actúan los inhibidores de PDE4 (González-García et al., 2013). TC3.6 (inhibidor de PDE7)
reduce la proliferación de células T y los niveles de IL-17 y aumenta la expresión de Foxp3,
mientras que Rolipram (inhibidor de PDE4) aumenta la expresión de IL-27 e IL-10. Se sabe
también que la inhibición de PDE7 no tiene efecto en el tratamiento del asma en estudios
preclínicos, al contrario que la inhibición de PDE4 (Chevalier et al., 2012). Por tanto, los efectos
en la remielinización podrían no ser tampoco iguales. Además, dado que actúan de forma
diferente, la inhibición de PDE7 podría no producir los indeseables efectos secundarios que
provoca la inhibición de PDE4 y ser, de esta manera, una buena alternativa para el tratamiento
de la EM que podría conducir, no solo a la reducción de la respuesta inmune y los síntomas,
sino también a una reparación del tejido dañado. De hecho, muy recientemente se ha
demostrado que varios inhibidores de PDE7 como el BRL, el TC3.6, el MR1.51 y el VP1.15 no
producen efectos eméticos en un modelo murino de emesis (surrogate emesis model;
Robichaud et al., 2002; García et al., 2014).
A continuación se detallan más ampliamente las características y los antecedentes de

los inhibidores concretos utilizados en el presente trabajo.
7. Características y antecedentes de los inhibidores de fosfodiesterasa-7.
BRL
El BRL (3-(N,N-dimetilsulfonamida)-4-metil-nitrobenzeno; TABLA 4) es un inhibidor

comercial que fue descubierto en 2004 (Smith et al., 2004). Inhibe específicamente a PDE7 con
un IC50 de 0,26 µM y es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica (Nandhakumar et al.,
2011). Los estudios previos con BRL no muestran resultados claros con respecto a la inhibición
de la respuesta inflamatoria. En un primer estudio se vio que BRL no tenía efecto sobre la
proliferación de linfocitos T CD8+ y muy poco en la reducción del factor pro-inflamatorio TNFα
inducido por LPS en monocitos sanguíneos y macrófagos del hígado humano. Sin embargo,
otros estudios muestran que además del efecto neuroprotector sobre las neuronas
dopaminérgicas in vitro e in vivo probado sobre un modelo animal de la enfermedad de
Parkinson muestra un efecto anti-inflamatorio (Morales-García et al., 2011), igual que sobre
un modelo de la enfermedad de Alzheimer (Pérez-González et al., 2013), y que en cultivos
primarios de astrocitos de rata sí inhibe el aumento en los niveles de nitritos y reduce la
Introducción 35
expresión intracelular de factores pro-inflamatorios (TNFα y COX-2) inducida por LPS (Morales-
García et al., 2014). No obstante, se sabe que no reduce los infiltrados inflamatorios
perivasculares ni previene la aparición de los síntomas de ratones con EAE (González-García et
al., 2013). Por último, se ha comprobado que el tratamiento con este inhibidor no produce
efectos eméticos en el modelo murino de emesis (García et al., 2014).
COMPUESTO ESTRUCTURA QUÍMICA IC50 (µM) EFECTOS OBSERVADOS

-Neuroprotector y anti-inflamatorio en
modelo animal de Parkinson (Morales-
García et al., 2011) y Alzheimer (Pérez-
González et al., 2013)
- Disminución niveles de nitritos y
0,26 factores pro-inflamatorios tras LPS en
BRL para cultivos primarios de astrocitos de rata
PDE7 (Morales-García et al., 2014).
- No reduce los infiltrados inflamatorios
perivasculares ni previene la aparición
de los síntomas de ratones con EAE
(González-García et al., 2013).
- No emesis
-Anti-inflamatorio por disminución
niveles de nitritos y factores pro-
inflamatorios tras LPS en cultivos
primarios de astrocitos de rata
(Morales-García et al., 2014) y en
cultivos de microglia y de neuronas.
1,04 - Neuroprotector por la reducción del
TC3.6 área infartada en un modelo de
para
accidente cerebrovascular (Redondo et
PDE7
al., 2012c).
- Previene los síntomas en el modelo de
EAE y disminuye infiltrados
perivasculares, la proliferación de
células T y la producción de IL-17
- No emesis
-Anti-inflamatorio reduce, aún más
que los inhibidores anteriores, los
niveles de nitritos y la expresión
1,1 para intracelular de factores pro-
PDE7 inflamatorios inducida por LPS
VP1.15 1,95 (Morales García et al.,2014)
para - Reduce el grado de inflamación, el
GSK-3 daño tisular y la expresión de TNFα, IL-
6, COX-2 e iNOS en un modelo de
lesión medular (Paterniti et al., 2011).
- No emesis
36
- Anti-inflamatorio por reducción de los

niveles de nitritos y la expresión
intracelular de factores pro-
1,59 inflamatorios inducida por LPS
para (Morales García et al.,2014)
PDE7 - Atenúa los síntomas en el modelo de
VP3.15 EAE (Redondo et al., 2012b)
0,88
- Mejores características
para farmacodinámicas que los inhibidores
GSK-3 anteriores y un perfil de seguridad en
cuanto a genotoxicidad y
mutagenicidad que permite su uso
como fármaco (Redondo et al., 2012b)
0,69 - Reducción de nitritos y factores pro-
para inflamatorios en cultivo de astrocitos
GSK-3, de rata aunque menor que con los
TDZD8 inhibidores duales VP1.15 y VP3.15
no
(Morales-García et al., 2014).
inhibe
PDE7
TABLA 4. Inhibidores de PDE7 utilizados para el estudio. Nombre, estructura química, IC50 y efectos
conocidos de los inhibidores utilizados en el presente trabajo.
TC3.6
El TC3.6 es un derivado de quinazolina (3-Fenil-2,4-ditioxo-1,2,3,4-

tetrahidroquinazolina; TABLA 4) sintetizado más recientemente por el grupo de la Dra. Ana
Martínez en el Instituto de Química Médica del CSIC que inhibe también específicamente a
PDE7 con un IC50 de 1,04 µM aumentando los niveles intracelulares de AMPc intracelular
(Castaño et al., 2009). Es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica (Redondo et al.,
2012c) y se sabe que en cultivos primarios de astrocitos de rata inhibe, al igual que el BRL, el
aumento en los niveles de nitritos y reduce la expresión intracelular de factores pro-
inflamatorios (TNFα y COX-2) inducida por LPS, confirmando sus efectos anti-inflamatorios
(Morales García et al., 2014). También se sabe que reduce los niveles de nitritos tras un
tratamiento con LPS en cultivos de microglia y de neuronas, demostrando un efecto
neuroprotector que también se ha visto in vivo en un modelo de accidente cerebrovascular, al
verse reducida el área infartada (Redondo et al., 2012c). Además, este inhibidor sí es capaz de
prevenir los síntomas en el modelo de EAE y disminuir significativamente el tamaño y el
número de infiltrados perivasculares, la proliferación de células T y la producción de IL-17
(González-García et al., 2013). Por último, es importante destacar que el tratamiento con este
inhibidor tampoco produce efectos eméticos en el modelo murino de emesis (García et al.,
2014).
VP1.15
El VP1.15 es un tiadiazol (Hidrobromuro 2,3-difenil-5-(2-hidroxietilimino) -2,5-dihidro-

1,2,4-tiadiazol; TABLA 4) sintetizado también en el Instituto de Química Médica-CSIC que
inhibe a PDE7 con un IC50 de 1,1 µM y es capaz de atravesar también la barrera
hematoencefálica (Paterniti et al., 2011; Pérez et al., 2012; Palomo et al., 2012).
Introducción 37
Además, el VP1.15 inhibe también la enzima GSK-3 (IC50 = 1,95 µM; Pérez et al., 2012;
Morales-García et al., 2014). La enzima GSK-3 es una quinasa que se expresa de forma ubicua
en mamíferos y regula numerosas vías relacionadas con enfermedades neurodegenerativas
(Aghdam y Barger, 2007). La inhibición de GSK-3 modula diferentes aspectos de la función
neuronal como la expresión génica, la neurogénesis, la plasticidad sináptica, la estructura
neuronal, o su supervivencia (Rayasam et al., 2009). Por ello, GSK-3 se ha convertido también
en diana terapéutica para numerosas enfermedades de este tipo (Kannoji et al., 2008).
Concretamente en la enfermedad de Alzheimer se ha demostrado que la sobreexpresión de
GSK-3 está unida a la gliosis y la muerte neuronal (Hooper et al., 2008).
El mecanismo por el cual GSK-3 y PDE7 podrían estar relacionados todavía no se

conoce claramente pero, como se ha dicho anteriormente, la activación de PKA a través de
AMPc conlleva la inactivación de GSK-3 (FIGURA 10; Fang et al., 2000). Este podría ser el
mecanismo de acción de este inhibidor de PDE7 (VP1.15), que conseguiría, a través del
aumento de los niveles de AMPc (Paterniti et al., 2011), inhibir GSK-3 (Morales-García et al.,
2014).
Por su parte, la inhibición de GSK-3, estimula la proliferación y la supervivencia de

OPCs, aumenta el número de oligodendrocitos y promueve la remielinización en el modelo de
desmielinización por LPC in vivo (Azim y Butt, 2011) como se ha mencionado anteriormente.
Además, el pretratamiento con inhibidores de GSK-3 en el modelo de EAE suprime los
síntomas y reduce la desmielinización, la activación microglial y la infiltración de células
inflamatorias. El tratamiento con estos inhibidores después de la inmunización reduce la
severidad de la enfermedad y facilita la recuperación parcial. Por el contrario, un ratón que
expresa GSK-3 activada de forma constitutiva desarrolla la EAE de manera más rápida y más
severa (De Sarno et al., 2008).
Sobre los efectos de la inhibición dual de PDE7 y GSK-3 llevada a cabo por VP1.15 se
sabe, hasta el momento, que reduce, aún más que los inhibidores anteriores, los niveles de
nitritos y la expresión intracelular de factores pro-inflamatorios (TNF-α y COX-2) inducida por
LPS (Morales García et al.,2014) y reduce el grado de inflamación, el daño tisular y la expresión
de TNF-α, IL-6, COX-2 e iNOS en un modelo de lesión medular (Paterniti et al., 2011).
Además, se sabe que el tratamiento con este inhibidor tampoco produce efectos
eméticos en el modelo murino de emesis (García et al., 2014).
VP3.15
El conocimiento de los numerosos efectos positivos de los inhibidores de PDE7 hace

que se siga investigando en este campo y se busquen moléculas cada vez con mejores
propiedades farmacodinámicas y más seguras para su uso terapéutico. Con estos requisitos se
generó el VP3.15 (Palomo et al., 2012; Redondo et al., 2012b). El VP3.15 es otro tiadiazol
(Hidrobromuro-2,3-difenil-5-(2-morfolinetilimino)-2,5-dihidro-1,2,4-tiadiazol; TABLA 4)
sintetizado muy recientemente también en el Instituto de Química Médica-CSIC. Inhibe a PDE7
con un IC50 de 1,59 µM y también a GSK-3 (IC50 = 0,88 µM; Morales-García et al., 2014).Este
inhibidor es capaz de atravesar, de igual modo, la barrera hematoencefálica y de aumentar los
niveles de AMPc más de lo que lo hace el BRL (Redondo et al., 2012b). De este inhibidor se
38
conoce menos pero se sabe que, como los anteriores, reduce los niveles de nitritos y la
expresión intracelular de factores pro-inflamatorios (TNF-α y COX-2) inducida por LPS (Morales
García et al., 2014) y atenúa los síntomas en el modelo de EAE (Redondo et al., 2012b). El
VP3.15 presenta mejores características farmacodinámicas que los inhibidores anteriores y un
perfil de seguridad en cuanto a genotoxicidad y mutagenicidad que permite su uso como
fármaco (Redondo et al., 2012b). Sin embargo, sus efectos eméticos no se han estudiado aún.
TDZD8
El TDZD8 es una tiadiazolidinona (4-benzil-2-metil-1,2,4-tiadiazolidina-3,5-diona;

Martínez et al., 2002; TABLA 4) sintetizada igualmente en el Instituto de Química Médica-CSIC
que inhibe únicamente a GSK-3 (IC50 0,69 µM; Martínez et al., 2002) y que se ha utilizado para
comparar y discernir si los efectos observados con los inhibidores duales (VP1.15 y VP3.15) se
deben a la inhibición de PDE7, de GSK-3 o de ambas. Su uso en cultivos de astrocitos de rata
muestra un efecto menor en la reducción de nitritos que ambos inhibidores duales y también
es capaz, como ellos, de reducir la expresión de factores pro-inflamatorios (Morales-García et
al., 2014).
En resumen, se han utilizado inhibidores, tanto comerciales como de nueva

generación, que inhiben exclusivamente a PDE7, a GSK-3 o a ambas pero que en cualquier caso
están implicados con el aumento de AMPc intracelular. Para todos ellos, se conoce bastante
bien su potencial anti-inflamatorio e incluso que algunos son capaces de inhibir, revertir o
atenuar los síntomas en el modelo de EAE pero no se sabe en ningún caso cómo afectan a los
oligodendrocitos y si son capaces de reemplazar a los que han muerto consiguiendo así una
remielinización efectiva. Esta remielinización podría ser un primer paso hacía una terapia para
la EM que no sólo controle la inflamación sino que, a la vez, promueva la reparación del tejido
dañado. Por este motivo nos planteamos los objetivos que se exponen a continuación.
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
Hipótesis y Objetivos 41
Los antecedentes muestran que los niveles intracelulares de AMPc están implicados
tanto en la disminución de la respuesta inflamatoria como en el aumento de la diferenciación
oligodendroglial y la remielinización, procesos se ven alterados en la EM (Raible y McMorris,
1989; Raible y McMorris, 1993; Sato-Bigbee et al., 1994; Sato-Bigbee y DeVries, 1996; Lonze y
Ginty, 2002; Serezani et al., 2008;Volakakis et al., 2010; Gerlo et al., 2011;Azim y Butt, 2011;
Sun et al., 2012;). Por tanto, podemos pensar en la regulación de los niveles de este nucleótido
de cara a una posible terapia para tratar esta enfermedad, dado que los tratamientos
existentes en la actualidad se basan en disminuir la respuesta inmune pero no logran reparar
las lesiones desmielinizantes de los pacientes. La mejor forma de controlar los niveles de AMPc
intracelular es inhibiendo su degradación por medio de las PDEs, concretamente la PDE4, la
PDE7 y la PDE8 (Essayan, 2001; Mehats et al., 2002; Conti y Beavo, 2007). La inhibición de
PDE4, aunque ha mostrado resultados muy prometedores en cuanto a la reducción de la
respuesta inmune y remielinización, presenta unos efectos secundarios tan serios (náuseas,
vómitos, diarreas y dolor de cabeza) que no permiten su uso real como fármacos (Rabe et al.,
2005; Calverley et al., 2007; Spina, 2008). Para PDE8, hasta 2011, no se han conocido los
primeros inhibidores específicos y sus efectos y posibilidades terapéuticas no se han estudiado
aún (Soderling et al., 1998; Beavo et al., 2006; DeNinno et al., 2011) por lo que, como
alternativa a la PDE4, se está comenzando a estudiar la inhibición de PDE7. La inhibición de
PDE7 ha demostrado tener un potente efecto anti-inflamatorio e incluso prevenir, atenuar o
revertir los síntomas en modelos animales de EM sin provocar efectos eméticos (Morales-
García et al., 2011; Paterniti et al 2011; Redondo et al., 2012a,b,c; Pérez-González et al., 2013;
González-García et al., 2013; García et al., 2014). Sin embargo, no se conoce su efecto sobre
los oligodendrocitos y la remielinización mediada por éstos, lo que sería muy importante para
determinar si su uso podría suponer una terapia regenerativa además de inmunomoduladora.
En este punto se encuadra la hipótesis de este trabajo: La inhibición de la enzima PDE7 y el
consiguiente aumento en los niveles de AMPc intracelular promovería la supervivencia y la
diferenciación de los OPCs adultos murinos y humanos hacia oligodendrocitos maduros,
pudiendo favorecerse el que estos OPCs remielinizasen, posteriormente, el SNC dañado.
42
Para resolver esta cuestión se plantearon los siguientes objetivos concretos:
1. Puesta a punto de un protocolo que permita aislar OPCs funcionales de corteza

cerebral de ratones a diferentes edades y de biopsias de la misma región en
humanos adultos y en cantidad suficiente para abordar los experimentos a
realizar.
2. Estudio in vitro de la expresión de PDE7 en OPCs de ratón a diferentes edades.
3. Estudio in vitro del efecto de la inhibición de PDE7 sobre la proliferación,

supervivencia y diferenciación de OPCs murinos neonatales y postnatales y de las
vías intracelulares que participan.
4. Estudio in vitro de la expresión de PDE7 en OPCs de humanos adultos y efecto de

la inhibición de PDE7 sobre su diferenciación.
5. Estudio del efecto de la inhibición de PDE7 sobre la remielinización en un modelo

ex vivo de desmielinización por LPC sobre rodajas de cerebelo.
6. Estudio in vivo del efecto de esta inhibición sobre la remielinización en un modelo

animal de desmielinización por LPC in vivo.
MATERIAL Y MÉTODOS
44
Material y Métodos 45
1. Animales
Para los experimentos in vitro, los animales utilizados fueron ratones postnatales (P0,
P15) y adultos (P60, P180) de la estirpe CD1 y C57/BL6 (P60; Laboratorios Charles River;
Wilmington, MA, USA). El ratón transgénico plp-GFP (Spassky et al., 2001; Le Bras et al., 2005;
Bribián et al., 2006) se utilizó porque expresa el gen reportero GFP bajo el control del
promotor de plp facilitando la detección de células oligodendrogliales y su aislamiento
mediante separación celular activada por fluorescencia (FACS; Le Bras et al., 2005).
En los ensayos ex vivo se utilizaron ratones CD1 postnatales (P7; Laboratorios Charles
River; Wilmington, MA, USA).
Todos estos animales se mantuvieron en el animalario del Hospital Nacional de

Parapléjicos (Toledo) y los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo las normativas
españolas (RD223/88) y europeas (86/609/ECC), y fueron aprobados por el Comité de
Bienestar Animal del Hospital Nacional de Parapléjicos (SAPA001).
Para los experimentos in vivo se utilizaron ratones macho C57/BL6 de

aproximadamente 8 semanas de edad (Laboratorios Charles River; Wilmington, MA, USA)
mantenidos en el animalario del MRC Centre for Regenerative Medicine (Universidad de
Edimburgo, Reino Unido). Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo las normativas
europeas (86/609/ECC) y de la Universidad de Edimburgo bajo la regulación del Ministerio del
Interior del Reino Unido, con el consentimiento del comité ético local.
2. Biopsias humanas
Las biopsias humanas se obtuvieron de la corteza cerebral de individuos adultos (29-59

años). Las muestras denominadas en este trabajo como “tumorales” fueron obtenidas de los
márgenes de resección de tumores (no del tumor en sí) y las englobadas bajo el nombre de
“no tumoral” procedieron de cirugías de epilepsia de pacientes que no respondieron al
tratamiento con fármacos o de traumatismos cerebrales. Las muestras se obtuvieron de los
Servicios de Neurocirugía del Hospital Universitario La Princesa (Madrid) y del Hospital Virgen
de la Salud (Toledo). Todas las muestras fueron transportadas en AQIX®RS-I (AQIX Ltd.,
Imperial College Bio Incubator) a 4 ºC lo más rápido posible para reducir el daño celular.
Todos los experimentos realizados con muestras humanas se llevaron a cabo tras la
aprobación del Comité Ético de Investigación del Complejo Hospitalario de Toledo y a todos los
sujetos se les proporcionó un informe para dar su consentimiento.
3. Aislamiento de precursores de oligodendrocitos de corteza cerebral de ratón

a diferentes edades y de humano adulto.
Para aislar OPCs murinos se han descrito diversos métodos como el immunopanning,
FACS, MACS, centrifugación en gradiente diferencial o el método de agitación (shake-off)
basado en las diferentes propiedades adherentes de las células gliales (para una revisión
específica sobre el tema, ver: Chew et al., 2014).El método de agitación, que es el utilizado en
el presente trabajo, se ha usado para aislar OPCs de ratas neonatas, principalmente, ya que los
OPCs de ratón son más difíciles de aislar (McCarthy y de Vellis, 1980; Yang et al., 2005; Chen et
46
al., 2007; Niu et al., 2012). Para aislar OPCs de ratón con el método de agitación existen sólo
dos trabajos previos, uno de ellos a partir de neuroesferas de embriones E14,5-17,5 y el otro a
partir de ratones neonatos (Chen et al., 2007; O´Meara et al., 2011), pero ninguno de ellos se
ha utilizado para el aislamiento de OPCs murinos o humanos adultos. Por ello, en el presente
trabajo partimos de uno de los protocolos previamente descritos (Chen et al., 2007) e
introdujimos algunas modificaciones que permitieron el aislamiento de OPCs de ratón a
diferentes edades (P0, P15, P60, P180) y de OPCs de humanos adultos (29-59 años) y que se
desarrollarán en el apartado de Resultados.
El método del que partimos es un protocolo que se utiliza para el aislamiento de

OPCs de ratas neonatas (Chen et al., 2007). Consiste en diseccionar las cortezas cerebrales en
HBSS (Hanks balanced salt solution; Invitrogen) frío y eliminar las meninges. Incubar durante
15 minutos a 37 ºC en 13,6 ml de HBSS, 0,8 ml de una disolución stock de DNasa (0,2 mg/ ml) y
0,6 ml de una disolución stock de tripsina (0,25%). Pipetear y transferir a un tubo con 5 ml de
DMEM20S compuesto por DMEM sin glutamina ni piruvato sódico (Dulbecco’s modified
Eagle’s media; Invitrogen), 4 mM de L-glutamina (Sigma), 1 mM de piruvato sódico (Sigma),
20% de suero fetal bovino (FBS; Hyclone), 50 U/ml de penicilina (Invitrogen) y 50 mg/ml de
estreptomicina (Invitrogen) para parar la tripsinización. Centrifugar a 800 rpm durante 5
minutos. Descartar el sobrenadante, añadir 20 ml de DMEM20S al tubo y triturar el pellet con
una pipeta de vidrio de 10 ml. Filtrar a través de un filtro de nylon de 70 nm, sembrar en flasks
de 75 cm2 cubiertos con poli-D-lisina e incubar con 5% de CO2 a 37 ºC renovando el medio de
cultivo cada 2 días. Tras 10 días en cultivo, agitar los flask en un agitador orbital horizontal
durante 1 hora a 200 rpm y 37 ºC para eliminar la microglía primero, y después a 200 rpm
hasta el día siguiente (18-20 horas) para despegar los OPCs. Poner el medio que contiene los
OPCs en una placa Petri durante 30-60 minutos a 37 ºC para eliminar la microglia restante, que
quedará adherida a la placa, y pasar por un filtro de 20 nm. Centrifugar a 800 rpm durante 10
minutos y resuspender en el medio deseado para sembrar los OPCs. Con este protocolo se
consiguió aislar los OPCs en, aproximadamente, 12 días.
Para comparar la eficacia del nuevo protocolo descrito en el presente trabajo (Ver
Resultados) con la de otros protocolos usados hasta el momento se realizaron aislamientos de
OPCs de corteza cerebral de ratón mediante dos métodos. Primeramente, se aislaron OPCs
mediante FACS de ratones transgénicos plp-GFP (P15 y P60) cuyas cortezas fueron disociadas
con el kit T de disociación neural (Miltenyi Biotec; Környei et al., 2007; Szulwach et al., 2010)
siguiendo la instrucciones de la casa comercial. Las células disociadas fueron filtradas y
centrifugadas para resuspender el pellet en una disolución de sacarosa en HBSS 0,9 M y
marcarlo con el anticuerpo anti- A2B5 conjugado con ficoeritrina (Miltenyi Biotec). Las células
que co-expresaron A2B5 y GFP fueron separadas en un citómetro de flujo FACS Aria TM (BD
Biosciences) en HBSS con el 2% de FBS, 25 mM de tampón HEPES (FlukaBiochemika) y 5 mM de
EDTA (Roche). El número de células vivas se contó usando azul tripán y se sembraron en la
densidad deseada y se incubaron a 37 ºC y 5% de CO2. Por otro lado, se utilizó un kit de
selección de oligodendrocitos que permite aislar estas células por la unión a tenascina R
(Pesheva WO/2006/067094 A1) siguiendo las instrucciones de la casa comercial.
4. Inmunocitoquímica
La identificación de los OPCs aislados se llevó a cabo usando marcadores

característicos como A2B5 (1:10, Hybridoma Bank), NG2 (1:200, Millipore), PDGFRα (1:200;
Santa Cruz Biotechnology) y Olig2 (1:200, Millipore).
Para la detección de PDE7 en OPCs, éstos fueron caracterizados usando los mismos
marcadores característicos mencionados (A2B5, NG2 o PDFGRα) y, a la vez, se tiñeron con anti-
PDE7A (1:50; Santa Cruz Biotechnology) o anti-PDE7B (1:50; Santa Cruz Biotechnology).
Antes de la incubación con el anticuerpo primario correspondiente, las células en

cultivo fueron incubadas en PBS 1x con 10% de suero de burro para bloquear uniones
inespecíficas del anticuerpo secundario (para los marcadores intracelulares se añadió 0,2 % de
triton X-100 para permeabilizar). Después de la incubación con los anticuerpos primarios
durante la noche, se añadieron los anticuerpos secundarios apropiados (Alexa anti-IgG de
ratón hecho en burro para A2B5, Alexa anti-IgG de conejo hecho en burro para NG2; Alexa
anti-IgG de ratón hecho en burro para PDGFRα; Alexa anti-IgG de conejo hecho en burro para
Olig2; Alexa anti-IgG de cabra hecho en burro para PDE7A y PDE7B; 1:1000, Invitrogen).
Las imágenes se obtuvieron en un microscopio confocal resonante SP5

(LeicaMicrosystems) en el Servicio de Microscopía Hospital Nacional de Parapléjicos (Toledo).
5. Inhibidores de fosfodiesterasa-7 utilizados
El inhibidor comercial BRL, fue suministrado por Calbiochem, mientras que el resto:
TC3.6, VP1.15, VP3.15 y TDZD8, fueron sintetizados en el Instituto de Química Médica-CSIC
por el grupo de la Dra. Ana Martínez (TABLA 4). La identificación de TC3.6 se realizó mediante
un screaning virtual basado en el ligando utilizando CODES (Castro et al., 2008) mientras que
los tiadiazoles se descubrieron usando una red neuronal artificial específica (Redondo et al.,
2012a). Los programas para el método hit-to-lead llevaron a la identificación de estos
compuestos basándose en la optimización de la actividad biológica y sus propiedades como
fármacos, como la penetración de la barrera hematoencefálica.
Para los estudios in vitro y ex vivo los compuestos se diluyeron en 50 µl de DMSO y se

añadió una cantidad de PBS hasta preparar un stock de cada compuesto de 10 mM. Para cada
inhibidor se preparó un stock control que contenía la misma cantidad de DMSO y PBS.
Para el estudio in vivo se diluyó, como se había descrito previamente (Redondo et al.,
2012b), cada inhibidor en DMSO (100 mg/mL) y esta disolución se mezcló en una proporción
de 1:50 con una disolución de Tocrisolve (5% en agua destilada; Tocris, U.K.). Una disolución
con la misma cantidad de DMSO y Tocrisolve se preparó para ser inyectada como vehículo al
grupo de ratones sin tratar.
6. Supervivencia celular
Los OPCs se cultivaron (2 × 104células/cubreobjeto) en cubre objetos tratados con poli-

L-lisina (Sigma, 0,1 mg/ml en tampón borato) y laminina (Sigma, 10 μg/ml en PBS 1X estéril) e
incubados con los inhibidores de PDE7 (1 μM) en el medio de diferenciación previamente
48
descrito (Casaccia-Bonnefil et al, 1997) que contenía BME:F12 (1:1, Gibco) suplementado con
100 μg/ml de holo-transferrina (Sigma), 20μg/ml de putrescina (Sigma), 12,8 ng/ml de
progesterona (Sigma), 10,4 ng/ml de selenito de sodio (Sigma), 25 μg/ml de insulina (Sigma),
0,8 μg/ml de tiroxina (Sigma), 0,6% de D(+)-glucosa (Normapur), 6,6 mM de L-glutamina
(Gibco), una disolución de antibiótico y antimicótico (100 U/mL de penicilina, 0,1 mg/mL de
estreptomicina y 25 µg/ml de anfotericina B; Sigma). Primero, una gota de 50 μl del medio que
contiene los OPCs fue sembrada en los cubreobjetos situados sobre placas multipocillo y se
dejó 1 hora para permitir que las células se adhieran antes de añadir 450 μl del medio de
diferenciación. Los cultivos se mantuvieron a 5% de CO2 y 37 ºC y después de dos días se
fijaron con parafolmaldehído (PFA) al 4% y se realizó una inmunocitoquímica para detectar
Caspasa3 activa (1:200, Abcam) que marca células apoptóticas junto con el marcador A2B5
(1:10, Hybridoma Bank). El recuento de células marcadas se realizó utilizando el analizador
celular robotizado (In cell analyzer 1000 GE).
Los datos se han mostrado como el ratio de células doblemente marcadas (Caspasa3
activa /A2B5+) referido al total de células precursoras presentes (A2B5+).
+
7. Ensayos de proliferación de precursores de oligodendrocitos.
Los OPCs fueron sembrados (2 × 104células/cubreobjeto) en cubreobjetos tratados con

poli-L-lisina (Sigma, 0,1 mg/ml en tampón borato) y laminina (Sigma, 10 μg/ml en PBS 1X
estéril) e incubados con los inhibidores de PDE7 (1 μM) en el mismo medio de diferenciación
descrito anteriormente para los experimentos de supervivencia celular y, tras 42 horas en
cultivo, se añadió BrdU (50 μM; Sigma) y se mantuvo durante 6 horas. Después de 72 horas
totales en cultivo, las células fueron fijadas y la incorporación de BrdU se detectó por
inmunocitoquímica (1:20, G3G4 Hybridoma Bank), combinando este marcaje con el marcador
oligodendroglial Olig2 (1:200, Millipore). El recuento de células marcadas se realizó utilizando
el analizador celular robotizado (In cell analyzer 1000 GE).
Los resultados se mostraron como el ratio de células doblemente marcadas

(BrdU /Olig2+) referido al total de células oligodendrogliales presentes (Olig2+).
+
8. Estudios de diferenciación de precursores de oligodendrocitos
Para los estudios de diferenciación las células se sembraron sobre cubreobjetos (2x104
células/ cubreobjetos) tratados con poli-L-lisina (Sigma, 0,1 mg/ml en tampón borato) y
laminina (Sigma, 10 μg/ml en PBS 1X estéril) y se utilizó el medio de diferenciación descrito
anteriormente y 1 µM del inhibidor de PDE7 correspondiente fue añadido este medio de
cultivo. Los cultivos se mantuvieron a 5% de CO2 y 37°C durante 5-7 días y se fijaron con
parafolmaldehído (PFA) al 4% para el análisis inmunocitoquímico. Para identificar los
oligodendrocitos diferenciados a partir de los OPCs sembrados se utilizaron los anticuerpos
anti-CNPasa (1:200, Covance) o anti-MBP (1:100, Abcam) combinados con anti-Olig2 (1:200,
Millipore). El número de oligodendrocitos CNPasa+/Olig2+o MBP+/Olig2+ fue cuantificado en
fotografías tomadas de forma aleatoria y fue expresado respecto al número de células Olig2+
totales.
Las imágenes digitales de fluorescencia fueron tomadas con una cámara digital DFC480
FX (Leica) acoplada a un microscopio Leica DM5000B o utilizando un microscopio confocal
resonante SP5 (LeicaMicrosystems).
9. Estudio de la señalización intracelular en cultivos primarios de precursores de

oligodendrocitos
Para determinar si la vía AMPc/PKA está implicada en la maduración de los OPCs los
cultivos, realizados como se ha indicado en el apartado anterior para el estudio de la capacidad
de diferenciación, fueron tratados con un antagonista de AMPc, el Rp-cAMP (100 μM, BIOMOL
Research Laboratories), para bloquear la activación de PKA. Los datos se han mostrado como
el ratio de células doblemente marcadas (CNPasa+/Olig2+) referido al total de células
oligodendrogliales presentes (Olig2+).
Además de analizar la implicación de PKA en los procesos estudiados se comprobó

también si ERK y CREB sufrían modificaciones con la inhibición de la PDE7.
La señalización de ERK se estudió en placas de cultivo de 96 pocillos sembrando 5 ×

4
10 células en cada uno en medio de OPCs, consistente en DMEM con L-glutamina, glucosa y
piruvato sódico (Invitrogen) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS; BioWhittaker,
Lonza) y una disolución de antibiótico y antimicótico (100 U/mL de penicilina, 0,1 mg/mL de
estreptomicina y 25 µg/ml de anfotericina B; Sigma), y manteniéndolas a 37 ºC en una
atmósfera con 5% de CO2. Tras un día en cultivo a las células se les retiró el suero durante 24
horas y se les estimuló con los inhibidores de PDE7 (30 μM) durante 10 minutos. Después las
células fueron fijadas con PFA 4% y teñidas con anti-pERK (1:250; Santa Cruz) y anti-ERK (1:300;
SantaCruz) siguiendo las instrucciones para la medida de la intensidad de fluorescencia
mediante el Odyssey Infrared Imaging System (LICOR). Los anticuerpos secundarios utilizados
estaban conjugados con 680 o 800 IRDye. La expresión de ERK y pERK se analizó siguiendo el
manual del equipo y la cantidad de pERK relativa a la cantidad total de ERK se normalizó con
respecto al valor de pERK/ERK en los pocillos control.
Para cuantificar CREB, se realizó un Western Blot cuantitativo usando también el

Odyssey Infrared Imaging System (LICOR) para el análisis simultáneo de dos proteínas
marcadas con dos anticuerpos secundarios fluorescentes distintos. La estimulación de las
células con los inhibidores de PDE7 (30 μM) se realizó durante 10 minutos. Los anticuerpos
primarios fueron anti-pCREB y anti-CREB (1:400; Cell Signalling). Las membranas fueron
incubadas con los anticuerpos secundarios conjugados con 680 o 800 IRDye y escaneadas en el
Odyssey Infrared Imaging System (LICOR). Las bandas correspondientes a pCREB y CREB se
analizaron siguiendo las instrucciones del manual del equipo y la cantidad de pCREB relativa a
la cantidad de CREB total fue normalizada con respecto al valor de pCREB/CREB en las
muestras control.
10. Cultivos organotípicos de cerebelo
Para el estudio de la remielinización ex vivo se realizaron cultivos de rodajas de

cerebelo utilizando un protocolo basado en el previamente descrito (Zhang et al., 2011). Los
ratones fueron decapitados y su cerebro se extrajo y se separó el cerebelo en HBSS frío.
50
Usando un McIllwain Tissue Chopper se cortaron rodajas sagitales de cerebelo de 300 μm que
fueron cuidadosamente separadas y colocadas sobre unos insertos de cultivo Millicell® de
0,4μm de tamaño de poro y 30 mm de diámetro (Millipore) que, previamente, habían sido
puestos sobre una placa de 6 pocillos con 1 ml de medio de cultivos organotípicos atemperado
que debe quedar por debajo del inserto y que estaba compuesto de HBSS:BME:suero de
caballo (1:2:1, Gibco), 28 mM de D(+)-glucosa (Normapur), 1% de una disolución de
antibiótico y antimicótico (100 U/mL de penicilina, 0,1 mg/mL de estreptomicina y 25 µg/ml de
anfotericina B; Sigma) y 0,25 µM de L-Glutamina (Gibco). Se colocaron 3 rodajas en cada
inserto separadas entre sí y de los bordes y se incubaron a 5% de CO2 y 37 ºC renovando el
medio al día siguiente y, después, cada dos días. Después de una semana en cultivo, se indujo
la desmielinización sustituyendo el medio por otro de la misma composición pero que contiene
LPC (0,5 mg/ml, Sigma) que se mantuvo durante 15 horas. Transcurrido este tiempo el medio
se sustituyó por medio fresco que contenía el inhibidor de PDE7 correspondiente (5 μM). Este
medio también fue renovado cada 2 días y los cultivos fueron fijados a diferentes tiempos (1 y
3 días tras la lesión) con PFA al 4% durante 40 minutos.
11. Inmunohistoquímica y toma de imágenes
Las rodajas fueron permeabilizadas con 0,5% de triton en PBS 1x con 10% de suero de
burro para bloquear uniones inespecíficas del anticuerpo secundario. Los anticuerpos
primarios utilizados fueron anti-MBP para el marcaje de la mielina (1:200, Serotech) y anti-NFH
(1:200, Abcam) para teñir neurofilamentos. Los anticuerpos secundarios apropiados fueron
usados (Alexa anti-IgG de rata hecho en burro para MBP; Alexa anti-IgG de conejo hecho en
burro para NFH; 1:1000, Invitrogen).
Las imágenes se obtuvieron en un microscopio confocal resonante SP5 (Leica

Microsystems) en las zonas de sustancia blanca con el objetivo de 40x, en intervalos de 1 μm
descartando las partes más superficiales de la rodaja y seleccionando aproximadamente 10
fotografías consecutivas de la parte central de cada una.
La proyección máxima de las fotos tomadas para cada rodaja se realizó y se cuantificó
el índice de mielinización con el programa Image J. Para ello fue necesario convertir las
proyecciones máximas de ambos marcajes en imágenes de 8 bit y utilizar el plugin
“Colocalization highligter” para crear una imagen mezclada de ambos canales y,
automáticamente, otra imagen que mostró los puntos donde ambos marcajes colocalizaban y
que se correspondían con los axones mielinizados. Ajustando el umbral se pudo medir el área
correspondiente a las zonas de colocalización, que se relativizaron al área total que ocupaban
los axones para obtener así el índice de mielinización mencionado, que es una medida de la
cantidad de mielina que hay en el área total ocupada por los axones. El índice de mielinización
se expresó con respecto al grupo control sin inhibidor (índice de mielinización normalizado).
12. Desmielinización in vivo por inyección de lisolecitina en el cuerpo calloso y

tratamiento
Los ratones fueron anestesiados con isofluorano, inyectados con 60 µl de un

analgésico compuesto por 2 partes de Vetergesic (diluido previamente 0,03 mg/ml en agua
destilada) y 1 parte de Rimadyl (diluido previamente 0,5 mg/ml en agua destilada) y sometidos
a cirugía estereotáxica para la inyección de LPC en un punto concreto del cerebro. 2 μl de LPC
al 1% fueron inyectados a través de un agujero en el cráneo en las coordenadas -1,2 mm
antero-posterior, -0,5 mm lateral y -1,4 mm vertical desde el bregma (FIGURA 12a), durante 4
minutos usando una aguja de 30 G unida a una jeringa Hamilton, manejada por una bomba KD
Scientific Nano, que hace que la inyección se produzca lentamente para evitar el reflujo (Boyd
et al., 2013).
Transcurridos nueve días tras la lesión por LPC (9 días post-inyección; dpi) se les
inyectó intraperitonealmente la primera dosis de inhibidores de PDE7 (10mg/kg de animal).
Cada inhibidor fue inyectado a un grupo de 10 ratones y a otro grupo con el mismo número de
animales se les inyectó el vehículo.
Dos días después se inyectó una segunda dosis (11 dpi) y en el día 14 (14 dpi), 5
animales de cada grupo fueron perfundidos con una mezcla de PFA al 4% y Glutaraldehído
(GTA) al 2% en tapón fosfato para procesar el tejido para microscopía electrónica. Los animales
restantes recibieron una inyección más en el día 15 y fueron perfundidos de la misma manera
en el día 21 (21 dpi).
Los resultados se compararon con un grupo control de tres ratones que no habían sido
lesionados ni tratados.
13. Procesamiento del tejido para microscopía electrónica de transmisión
Los cerebros, fueron extraídos y permanecieron hasta el día siguiente en la mezcla de

PFA 4% y GTA 2% que se sustituyó entonces por GTA al 1% donde permanecieron durante 7
días. Los cerebros fueron entonces cortados con una cuchilla y un molde que permite hacer
cortes coronales de 1 mm de grosor. De estos cortes seleccionamos el correspondiente a la
zona en la que se inyectó la LPC y se diseccionó la zona del cerebro que incluye el área del
cuerpo calloso lesionada (FIGURA 12b).
Estas porciones fueron postfijadas de nuevo en tetróxido de osmio al 1% en tampón
fosfato durante 1 hora y, posteriormente, lavadas y deshidratadas en varios pasos de 10
minutos cada uno con etanol en concentraciones crecientes (50%, 70%, 90%, 100%, 100%,
100%) y, por último, con óxido de propileno dos veces durante 15 minutos cada una utilizando,
en todos los pasos, un mezclador rotatorio. Finalmente, fueron incluidas en una resina
(Araldite/TAAB 812 Resin Kit, TAAB) siguiendo las instrucciones de la casa comercial utilizando
un mezclador rotatorio.
Tras el último cambio cada porción fue puesta en un molde relleno con la resina y se
puso en el horno a 60 ºC, al menos 12 horas, hasta que la resina se endureció.
Para seleccionar las zonas lesionadas se cortaron secciones sagitales semi-finas (1 μm)
en el ultramicrotomo (Leica Ultracut UCT ultramicrotome) de cada muestra y se tiñeron con
azul de toluidina. Las zonas seleccionadas se cortaron en secciones ultra-finas (60nm) y se
tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo.
52
FIGURA 12. Zona lesionada por LPC para el estudio de la remielinización en cuerpo calloso. (a) Las
coordenadas para la inyección de LPC para provocar la lesión desmielinizante fueron -1,2 mm
antero-posterior, -0,5 mm lateral y -1,4 mm vertical desde el bregma. (b) Zona del tejido cerebral
diseccionada para su procesado y estudio, que incluye el área del cuerpo calloso lesionada.
14. Toma y análisis de imágenes
Las imágenes fueron tomadas en un microscopio electrónico de transmisión (Philips

CM120) con una cámara GatanOrius CCD para estudiar el porcentaje de fibras mielinizadas
(índice de mielinización) y el grosor de las vainas de mielina.
Para calcular el índice de mielinización se fotografiaron 10 campos aleatorios por

animal y se calculó dividiendo el número de axones mielinizados entre el número de axones
totales. Para realizar esta cuantificación se contaron los axones tanto mielinizados como no
mielinizados que fueron intersectados por las líneas de una plantilla superpuesta en forma de
aspa (Williams, 1977; Edgar et al., 2009; Münzel et al., 2014).
El grosor de la mielina se expresó como el G-ratio (perímetro del axón dividido por el
perímetro de la fibra mielinizada) utilizando para la medida el programa Image J trazando el
perímetro de al menos 100 fibras por ratón usando una tableta gráfica (Bamboo pad, Wacom).
Para elegir aleatoriamente las fibras a medir se superpuso a cada fotografía una plantilla
compuesta por cuadrados de 8 µm2 y se contaron las fibras contenidas en la mitad de los
cuadrados alternos (Williams, 1977; Edgar et al., 2009; Münzel et al., 2014).
15. Análisis estadístico
Los resultados muestran el valor de la media ± error estándar (EE) y fueron analizados
con el programa SigmaPlot (Jandel Scientific) realizando el análisis comparativo mediante el
estadístico t-student o su correspondiente test no paramétrico (test Mann–Whitney Rank-
Sum) o ANOVA de una vía. Todos los experimentos han sido replicados al menos tres veces y la
significación estadística se fijó en p < 0,05: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
RESULTADOS
54
Resultados 55
1. Desarrollo de un método mejorado para el aislamiento de precursores de

oligodendrocitos.
1.1. Mejoras introducidas en el protocolo previamente descrito.
Los flasks de cultivo fueron cubiertos con poli-L- ornitina (10 μg/ml, Sigma) diluida en
agua destilada estéril durante 3 horas a 37 ºC (volumen final de 7 ml/ flask de 75 cm2o 4 ml/
flask de 25 cm2). Tras eliminar esta disolución de los flasks fueron lavados tres veces con agua
destilada estéril y se dejaron secar completamente antes de ser utilizados.
Se preparó una disolución de papaína diluyendo papaína (0,9 mg/ml, Worthington

Biochemical Corp.), L-cisteína (0,2 mg/ml, Sigma) y EDTA (0,2 mg/ml, Roche) en HBSS sin Ca2+ni
Mg2+ (Invitrogen).
Para la obtención del cultivo primario a partir de ratones postnatales y adultos, los
animales fueron sacrificados por dislocación cervical y/o inhalación de CO2 (dependiendo de la
edad) y decapitados con tijeras quirúrgicas. El cráneo fue retirado rápidamente en una
campana de flujo laminar tras cortar la piel con un bisturí y el cerebro fue sacado
cuidadosamente con pinzas (se podrían procesar a la vez un máximo de 10 animales). Los
cerebros se mantuvieron en un tubo cónico de 50 ml que contenía 10 ml de HBBS (con Ca2+ y
Mg2+) frío y permanecieron en hielo hasta terminar la disección. Una vez terminada, el tubo
que contenía los cerebros fue atemperado durante 5 minutos a 37 ºC en un baño de agua. La
disolución de papaína previamente preparada fue añadida al tubo y se incubó en el baño a 37
ºC de nuevo. La concentración óptima de esta disolución y el tiempo de incubación dependió
de la edad de los animales (TABLA 5).
Edad Animales/ flask Retirada de meninges Digestión del tejido
P0 3 DP (1:10) en HBSS, 5 min DP (1:10) en HBSS, 5 min

TABLA 5. Detalles del protocolo de aislamiento de OPCs. El número de ratones por flask, la concentración
de la enzima para la digestión de las meninges, los plexos coroideos y la corteza cerebral (disolución de
papaína: DP) y el tiempo de incubación dependen de la edad de los ratones de partida.
Este paso resulta crucial para facilitar la eliminación a continuación de las meninges,
las cuales están más fuertemente adheridas al parénquima en los ratones adultos. La reacción
de la papaína fue parada añadiendo 20 ml de HBSS (sin Ca2+ ni Mg2+) y poniendo el tubo en
hielo. Los cerebros fueron entonces puestos, uno a uno, en una placa Petri para retirar las
meninges y los plexos coroideos con la ayuda de unas pinzas, con una lupa de disección, lo más
rápido posible para minimizar la muerte celular. Una vez terminado este paso, los bulbos
olfatorios y el cerebelo fueron también eliminados y el cerebro fue separado en dos por la
línea media eliminando también el diencéfalo. Las cortezas cerebrales se dejaron en 10 ml de
HBSS frío (sin Ca2+ ni Mg2+), de nuevo en hielo. La ausencia de estos cationes favorece la
56
digestión enzimática. El tejido fue entonces disociado mecánicamente con unas tijeras
primero, y por pipeteo después y el tubo con los trozos pequeños fue atemperado en el baño a
37 ºC durante cinco minutos para añadir después la disolución de papaína en la concentración
y tiempo adecuados para la edad de los ratones utilizados (TABLA 5). Tras esta digestión
enzimática se paró la reacción añadiendo 0,1 mg/ml de DNasa (Sigma) y hasta 30 ml (volumen
final) de medio de OPCs, se volvió a pipetear varias veces para terminar la disgregación y se
incubó a 37 ºC durante 5 minutos. Después se centrifugó a 900 rpm durante 10 minutos y se
eliminó el sobrenadante y la parte más superficial del pellet (que corresponde al debris de
mielina). El pellet fue resuspendido en 10 ml de medio de OPCs y la suspensión celular se pasó
a través de un filtro de nylon de 100 µm (BD Biosciences) y se recogió de nuevo en un tubo
cónico de 50 ml donde se añadió medio de OPCs en función del número de flasks que se
fueran a sembrar (10 ml por flask) y las células fueron sembradas en los flasks de 75 cm2
previamente tratados. El número de animales por flask depende también de la edad de los
ratones (TABLA 5). Por último, los flasks se incubaron a 37 ºC y 5% de CO2. Tras un día en el
incubador, el medio fue reemplazado por medio nuevo suplementado con PDGF-AA (10ng/ml,
Millipore) en el caso de trabajar con ratones adultos. Para los ratones P0 no fue necesario
suplementar el medio y para los cultivos que se vayan a utilizar para ensayos de diferenciación
no es conveniente mantener el medio con PDGF-AA más de 10-15 días. El medio se cambió
cada 2-3 días hasta que el cultivo mixto alcanzó la confluencia, tapizando toda la superficie del
flask sembrada, y los OPCs se pudieron observar sobre una monocapa de astrocitos. Esta
confluencia se alcanzó tras 7 días para ratones P0, 15-20 días para ratones P15 y 25-35 días
para ratones P60 y P180. Una vez alcanzada la confluencia, el cultivo está preparado para el
aislamiento de los OPCs separándolos del resto de células presentes en el cultivo mediante
una agitación suave que hará que los OPCs y la microglía se separen de los astrocitos, que
están fuertemente adheridos al flask formando una monocapa.
En primer lugar, para la purificación, los flasks se cerraron bien y se colocaron en un

agitador orbital a 37 ºC y 250 rpm hasta el día siguiente (18-20 horas). El medio con las células
despegadas tras la agitación (OPCs y microglía) fue recogido rápidamente, pasado por un filtro
de nylon de 40 μm y centrifugado a 900 rpm durante 10 minutos. El pellet se resuspendió en
10 ml de medio de OPCs y se sembró en una placa Petri bacteriológica que permitirá que se
adhiera la microglia, pero no los OPCs. La placa se mantuvo a 37 ºC durante 45 minutos.
Transcurrido este tiempo, el medio con las células no adheridas a la placa se recogió y se volvió
a filtrar, centrifugar, resuspender y sembrar en una nueva placa, esta vez durante 30 minutos,
para eliminar el máximo número de células microgliales posible. El medio que contendría los
OPCs purificados fue entonces recogido y centrifugado de nuevo para eliminar el medio de
OPCs. El pellet se resuspendió de nuevo en medio fresco y el número de células se contó
usando azul tripán. Finalmente, las células se sembraron en un número y un medio
determinado dependiendo del tipo de ensayo que se fuera a llevar a cabo y se mantuvieron en
un incubador de cultivos a 37 ºC y 5% de CO2 el tiempo deseado para cada experimento (Ver
Material y Métodos).
El protocolo utilizado para aislar OPCs humanos fue el mismo que el que se usó para
ratones adultos con ligeras modificaciones. En lugar de flasks de 75 cm2 se utilizaron flasks de
25 cm2 poniendo un volumen final de 5 ml por flask. La digestión enzimática de las meninges
se llevó a cabo con la disolución de papaína a 1:2,5 durante 10 minutos y la digestión del tejido
Resultados 57
a 1:10 durante 15 minutos. Estos cultivos tardaron en alcanzar la confluencia entre 30 y 40

días, tras los que se agitaron a 230 rpm en lugar de 250 rpm.
La mayor eficiencia del protocolo se obtuvo con muestras de 4 gramos de peso fresco
aunque el protocolo funcionó con muestras a partir de 0,5 gramos.
1.2. Caracterización de los precursores de oligodendrocitos murinos aislados.
FIGURA 13. Las células aisladas expresan marcadores específicos que las caracterizan como OPCs. (a-f)
OPCs obtenidos de corteza cerebral de ratones P15 CD1 tras 24 horas en cultivo. Los OPCs fueron
identificados con una doble tinción para NG2/A2B5 (a-c) y Olig-2/A2B5 (d-f). (g-l) OPCs de corteza cerebral
de ratones P60 CD1 tras 24 horas en cultivo. Los OPCs fueron igualmente caracterizados por la expresión de
NG2/A2B5 (g-i) y Olig-2/A2B5 (j-l). La barra de escala representa 25μm en a-f o 10μm en g-r.
58
Para identificar los OPCs aislados se utilizaron marcadores característicos

previamente validados como NG2, A2B5 y PDGFRα, así como el marcador Olig2 que se expresa
en toda la estirpe oligodendroglial (FIGURA 13; Hart et al., 1989; Raff et al., 1983; Pringle et al.,
1992; Richardson et al., 2011). De esta manera se comprobó que los OPCs aislados con el
nuevo método muestran una morfología similar tras 1 día en cultivo y expresan los mismos
marcadores que los embrionarios y perinatales (P15, FIGURA 13a-f y P60, FIGURA 13g-l;
Girolamo et al., 2010).
1.3. Eficacia del nuevo protocolo descrito.
Para determinar la eficiencia del protocolo se cuantificó el número de OPCs

obtenidos a partir de la corteza cerebral de ratones CD1 de diferentes edades (P0, P15, P60,
P180; TABLA 6). Según los resultados obtenidos, el número mayor de OPCs se obtuvo a partir
de ratones P0 (263.148 ± 6.508 OPCs/animal) y fue disminuyendo con la edad. A partir de la
corteza de un ratón P15 se obtuvieron la mitad de OPCs aproximadamente (123.194 ± 8.774
OPCs/animal) y este número de nuevo se redujo a la mitad en los OPCs obtenidos a partir de
la corteza cerebral de un ratón P60 (68.444 ± 5.461 OPCs/animal) y de nuevo con los ratones
P180 (39.757 ± 4.410 OPCs/animal).
Si comparamos la cantidad de OPCs obtenidos, a partir de ratones P15 se obtuvo

aproximadamente un 50 % del que se obtuvo a partir de ratones P0, a partir de P60 un 25 % y
de P180 un 12 % (TABLA 6).
% OPCs/resto de
Número de OPCs % de OPCs
Edad células gliales en el
obtenidos por animal relativo a P0
cultivo primario
P0 263.148± 6.508 100% 12,9%
P15 123.194 ±8.774 50% 6,3%
P60 68.444 ±5.461 25% 3,8%
P180 39.757 ±4.410 12% 2,02%
TABLA 6. Eficacia de protocolo. En la tabla se muestra el número de OPCs obtenidos a partir de ratones a
diferentes edades (P0, P15, P60, P180). El número de OPCs aislado disminuyó con la edad consiguiéndose la
mitad de OPCs a partir de la corteza cerebral de ratones P15 que de ratones P0, un 25 % a partir de ratones
P60 y un 12% de ratones P180. Además se indica el porcentaje de OPCs con respecto al total de células
gliales presentes en el cultivo primario para cada edad y también este porcentaje es dependiente de la
edad, disminuyendo cuando aumenta ésta.
Resultados 59
Por otro lado, si comparamos el número de OPCs, caracterizados por la expresión de

marcadores característicos (PDGFRα, NG2 o A2B5), con respecto al número de células gliales
presentes en el cultivo primario podemos ver que sólo el 12,9 % de las células son OPCs en los
cultivos de P0, 6,3% en los de P15, 3,8 % en los de P60 y 2,02% en los de P180 (TABLA 6). Sin
embargo, partiendo de cultivos primarios con tan bajo porcentaje de OPCs, tras el aislamiento
conseguimos unos cultivos de OPCs de elevada pureza. Por ejemplo, contando el número de
células PDGFRα+ presentes en un cultivo purificado de OPCs de ratones P0 tras dos días en
cultivo se obtuvo el 87 ± 0,2 % de células positivas que es un porcentaje similar al que se
obtuvo en las mismas condiciones con ratones P15 (82 ± 0,7 %; FIGURA 14)
FIGURA 14. Los cultivos de OPCs murinos presentan una elevada pureza. (a-f) Imágenes de fluorescencia
de baja magnificación de células positivas para PDGFRα, marcador molecular característico de OPCs tras un
día en cultivo, aisladas de corteza cerebral de ratones P0 (a-c) y P15 (d-f). (g) El gráfico muestra la
+
cuantificación del porcentaje de OPCs identificados como PDGFRα tras un día en cultivo respecto del
número total de células purificadas. La pureza de los cultivos murinos es similar en ratones neonatales y
adultos (mayor del 80%). La barra de escala representa 50 μm en a-f. Los valores se expresan como la media
± EE y la significación estadística se fijó en p < 0,05: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
Para corroborar la eficacia del método desarrollado se compararon los resultados

con otras técnicas que se habían estado utilizando hasta el momento. Primero se aislaron OPCs
de ratones P15 y P60 mediante FACS (Környei et al., 2007; Szulwach et al., 2010), utilizando
60
los ratones transgénicos plp-GFP, a partir de los cuales pudimos separar OPCs identificados por
la co-expresión de GFP y A2B5. Los resultados obtenidos coincidían con los anteriores en el
decremento del número de OPCs obtenidos según aumenta la edad de los ratones, ya que a
P15 aproximadamente un 20% de las células fueron GFP+/A2B5+ mientras que a P60 sólo lo
fueron alrededor del 2%. Con esta técnica la supervivencia se veía muy disminuida, de hecho
tras 24 horas de cultivo, menos del 50% del total de células estaban vivas. En ratones P60, a
pesar de utilizar la digestión enzimática para reducir el tiempo del cerebro ex vivo y la muerte
celular, el número total de OPCs obtenido por animal fue de unos 10.000 OPCs, es decir,
alrededor de siete veces menos del número obtenido con el nuevo protocolo (TABLA 7).
Además se utilizó un kit de selección de oligodendrocitos (Pesheva WO/2006/067094 A1) con
el que también el número de OPCs purificados a partir de la corteza cerebral de ratones P60
fue claramente menor (sólo 7.500/animal) que con el protocolo desarrollado en este trabajo,
aproximadamente 10 veces menor (TABLA 7).
Eficiencia relativa
Región del del nuevo
Edad Método OPCs/animal
SNC protocolo respecto
a otros métodos
Nuevo método
Corteza
desarrollado
cerebral 263.148
(Apartado 1.1 de
(ratón)
Resultados)
Corteza
P0 Kit de selección de
cerebral 250.000 Similar
oligodendrocitos
(ratón)
Corteza 368.000
cerebral MACS (Dincman et al., 1,4 veces menor
(ratón) 2012)
Nuevo método
Corteza
Desarrollado
cerebral 68.444
(Apartado 1.1 de
(ratón)
Resultados)
Corteza
cerebral FACS 10.000 7 veces mayor
P60
(ratón)
Corteza
Kit de selección de
cerebral 7.500 10 veces mayor
oligodendrocitos
(ratón)
Nervio óptico 2.000-2.500
Immunopanning 30 veces mayor
(rata) (Shi et al., 1998)
TABLA 7. Comparación de la eficiencia del nuevo protocolo desarrollado con otros métodos existentes.
Aunque el método desarrollado en este trabajo muestra una eficiencia similar a la de otros protocolos
descritos a la hora de aislar OPCs de ratones neonatos, el nuevo protocolo resulta más eficiente cuando se
trata de aislar OPCs de cerebro murino adulto.
A la vista de estos resultados, podemos decir que el protocolo desarrollado en el

presente trabajo tiene una eficacia similar en ratones P0 a la del kit de selección de
oligodendrocitos (TABLA 7) o algo menor (1,4 veces) que la del aislamiento por MACS
Resultados 61
(Dincman et al., 2012; TABLA7). Sin embargo, fue bastante más eficiente cuando se trataba de
aislar OPCs adultos (P60), superando en 7-10 veces al número obtenido de la misma región
mediante FACS o mediante el kit de selección de oligodendrocitos y en 30 veces al
previamente descrito para el método de immunopanning a partir de nervio óptico de rata de
esta misma edad (Shi et al., 1998; TABLA 7).
1.4. Influencia de la estirpe en el rendimiento del proceso de aislamiento
Dado que existen diferencias demostradas en cuanto al diferente comportamiento

de los OPCs de una estirpe a otra (Chen et al., 2007) quisimos comprobar si la eficiencia del
protocolo propuesto variaba también cuando se utilizaban otras cepas de ratones. Para ello,
además de aislar OPCs de ratones CD1, se realizó el aislamiento de OPCs de corteza cerebral
de ratones C57/BL6 y, a su vez, del ratón transgénico plp-GFP (con fondo genético C57/BL6). El
rendimiento del protocolo con los ratones C57/BL6 no varió con respecto a los transgénicos
plp-GFP (del mismo fondo genético) pero sí lo hizo el de ambos con respecto a los ratones CD1.
El número de OPCs obtenidos por animal a partir de ratones CD1 fue, con mucha diferencia,
mayor que el que se obtuvo a partir de los ratones C57/BL6 o el transgénico (FIGURA 15).
A la vista de estos resultados, los experimentos posteriores se realizaron con ratones

CD1.
FIGURA 15. La eficacia de

aislamiento del protocolo es
dependiente de la estirpe de ratón
utilizada. El número de OPCs
aislados de corteza cerebral de
ratones adultos (P60) fue mayor a
partir de ratones CD1 que a partir
de ratones C57/BL6 o plp-GFP
(fondo genético C57/BL6). Los
valores se expresan como la media
± EE y la significación estadística se
fijó en p < 0,05: *p < 0,05, **p <
0,01, ***p < 0,001.
1.5. Viabilidad y capacidad de diferenciación de los precursores de

oligodendrocitos aislados de ratones de diferentes edades.
Para comprobar que los OPCs aislados eran viables y capaces de diferenciarse se
llevaron a cabo varios experimentos. Previamente se había demostrado en otro trabajo de
nuestro laboratorio que los OPCs de ratones P60, obtenidos usando este protocolo,
respondían a estudios de quimiotaxis, demostrándose que el factor de crecimiento FGF2
favorecía su migración mientras que la proteína Anosmina-1 la obstaculizaba, al igual que
ocurre en los OPCs embrionarios (Clemente et al., 2011), quedando demostrada la viabilidad
de los OPCs aislados.
62
Además de este trabajo sobre la capacidad de migración de los OPCs, se quiso

comprobar si los OPCs eran capaces de diferenciarse y para ello se sembraron los OPCs de
ratones P15 y P60, obtenidos mediante este protocolo, durante 7 días en medio de
diferenciación y se estudió la expresión de CNPasa, que está presente durante la maduración
de los OPCs hacia oligodendrocitos, junto con el marcador oligodendroglial Olig2 (FIGURA 16).
FIGURA 16. Identificación de oligodendrocitos obtenidos a partir de los OPCs aislados. (a-f) Imágenes de
baja (a-c) y alta (d-f) magnificación que muestran oligodendrocitos diferenciados a partir de los OPCs
obtenidos de ratones P15, caracterizados por la expresión de Olig2 y CNPasa tras 7 días en cultivo. (g-l)
Imágenes de baja (g-i) y alta (j-l) magnificación que muestran oligodendrocitos diferenciados a partir de los
OPCs obtenidos de ratones P60, caracterizados por la expresión de Olig2 y CNPasa tras 7 días en cultivo. Las
barras de escala representan 25 μm en a-l.
Tanto en los cultivos de OPCs de corteza cerebral de ratones P15 (FIGURA 16a-f)
como en los de P60 (FIGURA 16g-l), transcurridos 7 días se pudieron observar células
diferenciadas y positivas para ambos marcadores (CNPasa+/Olig2+) quedando demostrada así
Resultados 63
también su capacidad para diferenciarse a oligodendrocitos. Además, se realizaron otros

estudios de diferenciación, supervivencia y proliferación que corroboraron tanto la viabilidad
de los OPCs como su capacidad de diferenciación, que se expondrán más adelante.
1.6. Aislamiento y caracterización de precursores de oligodendrocitos de corteza

cerebral de humano adulto
Finalmente, se estudió la validez del nuevo método para aislar OPCs de corteza
cerebral humana de adultos, aunque se introdujeron leves modificaciones respecto al
protocolo original (ver Material y Métodos).
Primeramente, se comprobó que los OPCs humanos aislados también expresaban los
marcadores característicos de este tipo celular (A2B5, PDGFRα, NG2) y se pudo ver que, como
en ratón, los OPCs expresaban dichos marcadores, así como el marcador oligodendroglial Olig2
(FIGURA 17).
FIGURA 17. Identificación de los OPCs aislados de corteza cerebral humana. (a-f) Los OPCs aislados
de biopsias de corteza cerebral de humanos adultos, tras 24 horas en cultivo, pudieron
caracterizarse, al igual que los OPCs murinos, por la co-expresión de NG2/A2B5 (a-c) y Olig2/A2B5
(d-f). Las barras de escala representan 10 μm en a-f.
1.7. Eficacia del método en el aislamiento de precursores de oligodendrocitos

humanos.
Para medir la eficiencia del protocolo a la hora de aislar los OPCs humanos se
utilizaron dos tipos de muestras (FIGURA 18a). Por un lado, las que se denominaron tumorales,
aunque en todos los casos se trataba de los márgenes de resección de tumores (ver Material y
Métodos), y por otro, biopsias de origen no tumoral (traumatismos o epilepsia). Al comparar
el número de OPCs obtenidos en relación a los gramos de tejido procesado entre ambos tipos
de muestras, se observó que había diferencias. Las muestras denominadas tumorales daban
un número de células mayor que las no tumorales (aproximadamente el triple) aunque en
ambos casos ese número era menor que el obtenido a partir de ratones adultos CD1. Sin
64
embargo, el número de OPCs procedentes de las muestras tumorales superaron al que se

extrajo de ratones C57/BL6 aunque, por el contrario, los OPCs de procedencia no tumoral no
mostraron diferencias significativas con respecto al número de OPCs obtenidos a partir de
ratones de esta estirpe (FIGURA 18a). Por tanto, descartamos el uso de células procedentes de
márgenes de resección de tumores por tener una tasa de proliferación muy elevada, algo que
podría significar un comportamiento anómalo en nuestros experimentos.
En cuanto a la pureza de los cultivos, la de los OPCs humanos fue algo más baja que
la de los cultivos murinos, aunque no encontramos diferencias significativas. El número de
células PDGFRα+ fue 70 ± 0,04 % tras dos días en cultivo (FIGURA 18b-e).
FIGURA 18. Eficacia del protocolo para la obtención de OPCs humanos y pureza de los cultivos obtenidos.
(a) Comparación de la eficiencia del protocolo en la obtención de OPCs a partir de biopsias de corteza
cerebral de humanos adultos (de márgenes de resección de tumores y de tejido no tumoral), con la que se
había obtenido a partir de la misma zona de ratones también adultos (CD1, C57/BL6 o plp-GFP, P60). La
cantidad de OPCs por gramo de peso fresco obtenidos a partir de ambos tipos de biopsias humanas
(tumorales y no tumorales) fue menor que el obtenido a partir de ratones CD1 pero mayor que el alcanzado
a partir de ratones C57/BL6 y plp-GFP. Entre las muestras humanas, las de procedencia no tumoral
proporcionaron un menor número de OPCs que las tumorales y mostraron un comportamiento diferente.
+
(b-e) La pureza de los cultivos humanos fue cuantificada como el porcentaje de células PDGFRα , marcador
característico de OPCs, con respecto al total de células tras un día en cultivo y resultó ser algo menor que la
pureza de los cultivos de OPCs murinos (b). Las imágenes muestran esta expresión de PDGFRα en los
cultivos obtenidos de corteza cerebral humana adulta (c-e). Los valores en los gráficos se muestran como la
media ± EE y la significación estadística se fija en p<0,05: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. La barra de
escala representa 50 μm en c-e.
Resultados 65
1.8. Estudio de la viabilidad y capacidad de diferenciación de los precursores de

oligodendrocitos aislados de corteza cerebral de humano adulto
Para comprobar la viabilidad de los OPCs humanos obtenidos se mantuvieron en

cultivo durante 5 días en medio de diferenciación y se estudió su capacidad para diferenciarse
mediante inmunocitoquímica para CNPasa y Olig2 (FIGURA 19) que mostró, al igual que en los
cultivos de ratón, la presencia de oligodendrocitos en el cultivo.
FIGURA 19. Identificación de oligodendrocitos humanos diferenciados a partir de los OPCs obtenidos. (a-f)
Imágenes de baja (a-c) y alta (d-f) magnificación que muestran oligodendrocitos identificados como
+ +
Olig2 /CNPasa obtenidos a partir de los OPCs aislados de biopsias de corteza cerebral humana de adultos
tras 5 días en cultivo. Las barras de escala representan 25 μm en a-f.
2. Análisis de la expresión de la enzima fosfodiesterasa-7 y de los efectos de su inhibición in

vitro sobre los precursores de oligodendrocitos
Tras comprobar que los OPCs eran completamente viables y funcionales para el
estudio de su respuesta frente a fármacos, comenzamos a estudiar la expresión de la PDE7 y el
efecto que provocaba el aumento de los niveles intracelulares de AMPc sobre este tipo celular,
utilizando varios inhibidores de esta enzima (TABLA 4).
2.1. Expresión de la fosfodiesterasa-7 en precursores de oligodendrocitos

murinos
Para analizar la expresión en OPCs de las dos isoenzimas de PDE7 que existen (PDE7A
y PDE7B) se cultivaron OPCs corticales de ratones perinatales (P0) y postnatales (P15) y se
realizó una inmunocitoquímica para PDE7A y PDE7B, junto con el marcador característico de
OPCs, PDGFRα (FIGURA 20). Este doble marcaje reveló que ambas, PDE7A y PDE7B, se
expresaban en todos los OPCs provenientes tanto de ratones P0 (FIGURA 20a-f), como de
ratones adultos (P15; FIGURA 20g-l).
66
FIGURA 20. Todos los OPCs expresan PDE7. (a–f) Imágenes de inmunofluorescencia de alta magnificación
de OPCs obtenidos de corteza cerebral de ratones P0 teñidos para PDE7A/PDGFRα (a–c) o PDE7B/PDGFRα
(d-f). Todos los OPCs expresaron ambas isoenzimas, junto con el marcador característico de OPCs PDGFRα,
tras un día en medio de diferenciación. (g–l) Imágenes de inmunofluorescencia de alta magnificación de
OPCs obtenidos de corteza cerebral de ratones P15 teñidos para PDE7A/PDGFRα (a–c) o PDE7B/PDGFRα (d-
f). Todos los OPCs a esta edad también expresaron ambas isoenzimas junto con el marcador característico
de OPCs PDGFRα, tras un día en medio de diferenciación. Las barras de escala representan 10 μm en a–f y
7,5 μm en g–l.
Resultados 67
2.2. Efectos de la inhibición de la fosfodiesterasa-7 sobre la supervivencia y la

proliferación de los precursores de oligodendrocitos aislados de corteza cerebral de ratones
neonatales y postnatales
Tras comprobar que los OPCs expresan la enzima diana de los inhibidores que vamos a
utilizar (TABLA 4), quisimos investigar los efectos que dicha inhibición provocaba sobre este
tipo celular.
FIGURA 21. TC3.6 y VP 1.15 favorecen la supervivencia de los OPCs neonatales y adultos sin afectar a su
proliferación. (a) Cuantificación de la incorporación de BrdU por los OPCs de ratones P0 caracterizados
por la expresión del marcador oligodendroglial Olig2. La presencia de BRL, TC3.6 o VP1.15 (1 μM) no
+ +
modificó el número de OPCs BrdU /Olig2 tras 3 días en cultivo en comparación con sus respectivos
+ +
controles. (b) Determinación de los OPCs apoptóticos (casp3 activa /A2B5 ) respecto al número total de
OPCs tras 2 días de cultivo en presencia de los inhibidores de PDE7. Con los inhibidores TC3.6 y VP1.15 la
supervivencia de los OPCs aumentó, mientras que el inhibidor comercial BRL no tuvo ningún efecto. (c)
Cuantificación de la incorporación de BrdU por doble inmunocitoquímica en OPCs de ratones P15
caracterizados con el marcador oligodendroglial Olig2. Igual que a P0, la presencia de TC3.6, VP1.15 o BRL
+ +
(1 μM) no modificó el número de células BrdU /Olig2 después de 3 días en cultivo en comparación con sus
+ +
respectivos controles. (d) Determinación de células apoptóticas (casp3 activa /A2B5 ) tras 2 días en
cultivo. La supervivencia de los OPCs se vio aumentada en presencia de los inhibidores de PDE7 (1 μM).
Los valores se muestran como la media ± EE y la significación estadística se fijó a partir de p<0,05: *p <
0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
El análisis de los cultivos se realizó en presencia de dos inhibidores de PDE7 de nueva

generación, TC3.6 y VP1.15, y del inhibidor comercial BRL para comparar sus efectos. Los
experimentos revelaron que el número de células oligodendrogliales, identificadas como
Olig2+, aumentó en comparación con los controles (% células Olig2+ respecto al control: BRL:
125 ± 6, p = 0,002; TC3.6: 130 ± 8, p = 0,023 y VP1.15: 179 ± 12, p < 0,001). Para determinar si
68
este incremento se debía a un aumento de la proliferación o de la supervivencia celular, se

analizaron la incorporación de BrdU y el número de células caspasa 3+ respectivamente. El
análisis de la incorporación de BrdU en los cultivos de OPCs de P0 reveló que ninguno de los
tres inhibidores tenía efecto alguno sobre la proliferación de OPCs (FIGURA 21a). Sin embargo,
en los estudios de supervivencia, se encontró que había menos células apoptóticas (que
expresaban caspasa 3) en presencia de los inhibidores de PDE7, sólo con los de nueva
generación y no con el BRL, que en los respectivos controles (FIGURA 21b). Por otro lado, al
igual que a P0, la inhibición de PDE7 no produjo ningún cambio sobre la proliferación de los
OPCs obtenidos de ratones P15 (FIGURA 21c) y favoreció su supervivencia (FIGURA 21d).
2.3. Efectos de la inhibición de la fosfodiesterasa-7 sobre la diferenciación de

precursores de oligodendrocitos murinos a diferentes edades.
En primer lugar, se investigaron los efectos de la inhibición de PDE7 sobre la

diferenciación de OPCs neonatales (P0) usando los inhibidores TC3.6, VP1.15 y BRL. Para ello,
se mantuvieron los OPCs durante 5 días en cultivo con medio de diferenciación y en presencia
de los tres inhibidores o sus respectivos controles. Mientras que BRL mostró no tener un
efecto diferenciador sobre los OPCs, la exposición a 1μM de TC 3.6 produjo un aumento
significativo, con respecto a su control, del número de células CNPasa+/Olig2+ relativo al
número total de células Olig2+ presentes en cada muestra (FIGURA 22a-f,y) y con VP1.15 el
efecto observado fue incuso mayor (FIGURA 22m-r,y). Además, estudiamos el número de
oligodendrocitos maduros que se formaban a partir de los OPCs en presencia de los
inhibidores. Tras 5 días en cultivo se observó que el número de células MBP+/Olig2+ respecto al
total de células Olig2+ también fue mayor que en los controles con los nuevos inhibidores
(TC3.6: FIGURA 22g-l, z; VP1.15: FIGURA 22s-x,z) y tampoco aquí se observaron cambios con el
BRL (FIGURA 22z).
A la vista de estos resultados, se investigó el efecto de la inhibición de PDE7 sobre

OPCs obtenidos de ratones P15, que es la edad a la que se da un pico en los niveles de mRNA
de PLP (Furusho et al., 2012). Los dos inhibidores nuevos aceleraron la diferenciación de los
OPCs hacia células CNPasa+/Olig2+ mientras que el inhibidor comercial BRL no mostro un
efecto significativo (FIGURA 23a-l,y) y también se observó este efecto diferenciador hacia
oligodendrocitos más maduros MBP+/Olig2+ (FIGURA 23m-x,z).
Resultados 69
FIGURA 22. Tanto TC3.6 como VP 1.15 promueven la diferenciación de los OPCs obtenidos de corteza
cerebral de ratones P0. (a–l) Imágenes de inmunofluorescencia de la expresión de Olig2 y CNPasa (a–f) u
Olig2 y MBP (g-l) en OPCs aislados de cerebros de ratones P0 crecidos durante 5 días en medio de
diferenciación (a–c, g–i) y en presencia de 1 μM de TC3.6 (d–f, j–l). (m–x) Las imágenes muestran la
expresión de Olig2 y CNPasa (m–r) u Olig2 y MBP (s–x) cuando la diferenciación fue estudiada en
condiciones control (m–o, s–t) o en presencia de 1 μM de VP 1.15 (p–r, v–x). (y) El gráfico representa el
+ + +
número de células (CNPasa /Olig2 ) respecto al número total de células oligodendrogliales (Olig2 ). En
presencia de ambos inhibidores de PDE7 de nueva generación (TC3.6 y VP1.15), el número de células
diferenciadas fue significativamente mayor que en condiciones control, efecto que no se produjo al añadir el
+ +
inhibidor comercial BRL. (z) Cuantificación de oligodendrocitos maduros (MBP /Olig2 ) diferenciados
+
respecto al número total de células Olig2 . Ambos inhibidores nuevos fueron más eficientes que el inhibidor
comercial, de nuevo, produciendo un mayor número de oligodendrocitos maduros. La barra de escala
representa 50 μm para a–x. Los valores se muestran como la media ± EE y la significación estadística se fijó
en p<0,05: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
70
FIGURA 23. Los inhibidores de PDE7, TC3.6 y VP 1.15, incrementaron la diferenciación de OPCs de ratones
P15. (a–l) Imágenes de inmunofluorescencia para detectar la expresión de Olig2 y CNPasa en OPCs extraídos
de ratones P15 mantenidos durante 7 días en cultivo en medio de diferenciación (a–c, g–i) o en presencia de
1μM de TC3.6 (d–f) o 1μM de VP1.15 (j–l). (m–x) Las imágenes muestran oligodendrocitos maduros
diferenciados a partir de OPCs de ratones P15 tras 7 días en cultivo en medio de diferenciación identificados
+ +
como células MBP /Olig2 (m–o, s–u) y en presencia de 1μM de TC3.6 (p–r) o 1μM de VP1.15 (v–x). (y) La
+ + +
cuantificación del número de células CNPasa /Olig2 respecto al número total de células Olig2 reveló que,
en presencia de los dos inhibidores de nueva generación, el número de células diferenciadas fue
significativamente mayor que en condiciones control. (z) Cuantificación de oligodendrocitos maduros
+ +
(MBP /Olig2 ). En presencia de TC3.6 y VP1.15 el número de oligodendrocitos maduros fue también mayor
que en condiciones control. Ambos inhibidores fueron más eficientes que el comercial BRL. La barra de
escala representa 50 μm en a–x. Los valores se dan como la media ± EE y la significación estadística se fijó en
p<0,05: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
2.4. Vías intracelulares implicadas en la inhibición de la fosfodiesterasa -7.
Para definir las vías intracelulares que se activaban al inhibir PDE7 y que producían
los efectos observados sobre la maduración y la supervivencia de los OPCs, estudiamos
primero la implicación de ERK puesto que se sabe que esta proteína juega un papel clave en el
momento en el que los OPCS dejan de proliferar y empiezan a diferenciarse, además de
participar en la mielinización (Joubert et al., 2010; Xiao et al., 2012; Ishii et al., 2013). Además,
esta proteína también participa en el aumento de la mielinización mediada por la inhibición de
Resultados 71
PDE4 (Sun et al., 2012). Para este estudio, los cultivos fueron tratados durante 10 minutos con
los inhibidores de PDE7 y se analizaron los niveles de la forma fosforilada de ERK (pERK), que
es la forma activa de la proteína, con respecto a la forma inactiva (ERK).
FIGURA 24. La inhibición de PDE7 en OPCs activa las vías intracelulares de ERK, PKA, y CREB. (a) Estimación
del cociente pERK/ERK por medida de la intensidad de fluorescencia en cultivos de OPCs de P0, tras la
inmunocitoquímica con anti-pERK y anti-ERK. La proteína ERK se activó más significativamente cuando los
OPCs fueron expuestos a BRL, TC3.6 y VP1.15 (30 μM). (b) Estimación del cociente pERK/ERK midiendo la
intensidad de fluorescencia en cultivos purificados de OPCs de ratones P15 tras la inmunotinción con anti-
pERK y anti-ERK. Esta proteína fue también activada tras la exposición a los tres inhibidores (BRL, TC3.6, y VP
+ +
1.15; 30 μM). (c) Detección y cuantificación de oligodendrocitos CNPasa /Olig2 en los cultivos purificados
tratados con los inhibidores de PDE7 junto con un antagonista de AMPc, Rp-cAMP (100 μM), que inhibe
PKA. Los efectos favorecedores, observados tras la inhibición de PDE7, sobre la diferenciación de los OPCs,
desaparecieron cuando la vía de PKA fue inhibida, lo que sugiere la implicación de la señalización de
AMPc/PKA en la diferenciación de OPCs. (d) Determinación del cociente pCREB/CREB. Un incremento de
pCREB/CREB fue también observado en los OPCs aislados de P0 en presencia de los inhibidores de PDE7
utilizados, siendo mayor en presencia del inhibidor comercial BRL. Los valores se muestran como la media ±
EE y la significación estadística se fijó en p<0,05: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
Los tres inhibidores produjeron un aumento de la activación de ERK en los OPCs de

P0 (FIGURA 24a) y P15 (FIGURA 24b) sugiriendo que la inhibición de PDE7 emplea un
mecanismo de acción similar sobre OPCs de ratones neonatos y postnatales. El aumento
producido por BRL fue el más alto, mientras que no tuvo efecto sobre la diferenciación o la
supervivencia, al contrario que los otros dos inhibidores. Esto podría deberse a la implicación
también de otras moléculas u otras vías de señalización, por lo que estudiamos la vía de PKA y
CREB, que se sabe que está relacionada con el aumento intracelular de AMPc (Borreli et al.,
72
1992). Para ello, repetimos el estudio de diferenciación con OPCs de ratones P0 y se inhibió la
PKA con un antagonista de AMPc (Rp-cAMP). Se observó que el aumento en el número de
células diferenciadas que se había visto al inhibir PDE7 desaparecía y volvía a niveles control al
inhibir PKA, señalando la implicación de esta proteína en el proceso (FIGURA 24c). El estudio
los niveles de CREB, cuantificando la forma activa (pCREB) frente a la inactiva (CREB), mostró
también un aumento de la activación de esta proteína tras la inhibición de PDE7 en OPCs de
P0, de nuevo mayor con BRL que con TC3.6 o VP1.15 (FIGURA 24d).
2.5. Expresión de la fosfodiesterasa-7 en los precursores de oligodendrocitos

humanos y efecto de su inhibición sobre la capacidad de diferenciación.
En primer lugar, como en el caso de los OPCs murinos, se comprobó que los OPCs
obtenidos a partir de biopsias humanas de corteza cerebral de individuos adultos expresaban
la enzima PDE7. La inmunocitoquímica reveló la expresión de PDE7A y PDE7B en OPCs
humanos junto con el marcador PDGFRα. Además de corroborar la expresión de ambas
isoenzimas, se pudo hacer un estudio de diferenciación. Tras cinco días en cultivo en presencia
de los inhibidores de PDE7 se observó que en los cultivos de OPCs humanos aumentaba el
número de células CNPasa+/Olig2+ con respecto al número total de células Olig2+, en los
cultivos tratados tanto con TC3.6 como con VP1.15, al igual que ocurría con los OPCs de ratón
(FIGURA 25).
2.6. Diferenciación de los precursores de oligodendrocitos murinos y humanos en

respuesta a VP3.15
El inhibidor VP3.15, que es inhibidor dual de PDE7 y GSK-3, similar a VP1.15 pero con
mejores propiedades farmacodinámicas y más seguro para su uso terapéutico, no llegó a
ejercer un efecto significativo sobre el proceso de supervivencia, aunque se observó una
tendencia a disminuir el número de células apoptóticas (FIGURA 26a). Para saber hasta qué
punto los efectos que se estaban viendo se debían a la inhibición de PDE7 y hasta qué punto,
en estas condiciones, estaba influyendo la inhibición de GSK-3, se utilizó un inhibidor
específico de GSK-3 (TDZD8). El TDZD8, en este caso, sí favoreció significativamente la
supervivencia (FIGURA 26a). Los estudios de proliferación de OPCs murinos con VP3.15 y
TDZD8 no muestran cambios en presencia de ninguno de los dos inhibidores (FIGURA 26b),
igual que se había visto con los inhibidores anteriores. Por último, en cuanto a la maduración
de los OPCs, se vio que el número de células CNPasa+/Olig2+ respecto al total de Olig2+ también
aumentaba en presencia de VP3.15 (FIGURA 26c,d,g) mientras que TDZD8 mostró no tener
efecto sobre la diferenciación de los OPCs (FIGURA 26e,f,g) y dejó claro que, en las condiciones
experimentales que se usaron, la inhibición por sí sola de GSK-3 no influye en los resultados.
No podemos descartar que la inhibición de los compuestos VP1.15 y el VP3.15, ambos
inhibidores de PDE7 y GSK-3, tengan efectos más pronunciados, en general, que el TC3.6
(selectivo de PDE7).
En cuanto al estudio con OPCs humanos, se pudo comprobar también que el

tratamiento con VP3.15, resultó en una tendencia a aumentar el número de células
diferenciadas tras 5 días en cultivo (resultado preliminar a la espera de más muestras
Resultados 73
humanas). Por el contrario, el inhibidor de GSK-3 no produjo ningún cambio observable

referido a la diferenciación de este tipo de células (FIGURA 27).
FIGURA 25. Todos los OPCs humanos expresan la PDE7 y aumentan su tasa de diferenciación al inhibir la
enzima. (a-f) Imágenes de inmunocitoquímica de PDE7A/PDGFRα (a–c) o PDE7B/PDGFRα (d–f) en OPCs
cultivados a partir de biopsias cerebrales de humanos adultos. Ambas isoenzimas fueron expresadas por los
+ +
OPCs humanos, como por los OPCs murinos. (g) El número de células diferenciadas (CNPasa /Olig2 )
respecto al número total de células Olig2, en comparación con sus respectivos controles, en presencia de
TC3.6 o VP1.15 (1 μM) durante 5 días en cultivo fue significativamente mayor sugiriendo un
comportamiento similar de OPCs humanos adultos y murinos. La barra de escala representa 25 μm en a–f.
Los valores se dan como la media ± EE and la significación estadística se fijó en p<0,05: *p < 0,05, **p < 0,01,
***p < 0,001.
74
FIGURA 26. El inhibidor de PDE7 y GSK-3, VP3.15, favorece la diferenciación de los OPCs murinos sin
afectar a su supervivencia ni a su proliferación. (a) Determinación de células apoptóticas (caspasa 3
+ +
activa /A2B5 ) tras 2 días en cultivo. La supervivencia de los OPCs se vio aumentada en presencia del
inhibidor de GSK-3 (TDZD8) pero no con el inhibidor dual de PDE7 y GSK-3 (VP3.15) en este caso (1 μM). (b)
Cuantificación de la incorporación de BrdU por doble inmunocitoquímica en OPCs de ratones P0
caracterizados con el marcador oligodendroglial Olig2. Igual que con los inhibidores anteriores, la presencia
+ +
de VP3.15 o TDZD8 (1 μM) no modificó el número de células BrdU /Olig2 después de 3 días en cultivo en
comparación con sus respectivos controles. (c–f) Imágenes de inmunofluorescencia para detectar la
expresión de Olig2 y CNPasa en OPCs extraídos de ratones P0 mantenidos durante 5 días en cultivo en
medio de diferenciación en presencia o no de 1 μM del inhibidor dual de PDE7 y GSK-3, VP3.15 (c-d) o del
+ +
inhibidor de GSK-3, TDZD8 (e-f). (g) La cuantificación del número de células CNPasa /Olig2 respecto al
+
número total de células Olig2 reveló que en presencia del inhibidor dual VP3.15 el número de células
diferenciadas fue significativamente mayor que en condiciones control, mientras que la inhibición de GSK-3
por sí sola no indujo cambios en la diferenciación de los OPCs. La barra de escala representa 25μm en c–f.
Resultados 75
Los valores se muestran como la media ± EE y la significación estadística se fijó en p<0,05: *p < 0,05, **p <
0,01, ***p < 0,001.
FIGURA 27. El inhibidor VP3.15 favorece la diferenciación de los OPCs humanos adultos. (a–d) Imágenes
de inmunofluorescencia para detectar la expresión de Olig2 y CNPasa en OPCs extraídos de corteza cerebral
de humanos adultos mantenidos durante 5 días en cultivo en medio de diferenciación en presencia del
inhibidor dual de PDE7 y GSK-3, VP3.15 (a-b) o del inhibidor de GSK-3, TDZD8 (c-d). (e) La cuantificación del
+
número de células CNPasa en los cultivos reveló que en presencia del inhibidor dual VP3.15, el número de
células diferenciadas fue mayor que en condiciones control mientras que la inhibición de GSK-3 por sí sola
no indujo cambios en la diferenciación de los OPCs humanos. La barra de escala representa 25 μm en a–d.
Los valores se muestran como la media ± EE y la significación estadística se fijó en p<0,05: *p < 0,05, **p <
0,01, ***p < 0,001.
76
3. Análisis de la inhibición de la fosfodiesterasa-7 en la remielinización.
3.1. Estudio de la inhibición de la fosfodiesterasa-7 sobre la remielinización ex

vivo.
Para el estudio de la remielinización en respuesta a la inhibición de PDE7 se usó, en

primer lugar, un modelo en el que se provocó una lesión desmielinizante con LPC sobre
rodajas de cerebelo. Este modelo tiene la ventaja con respecto a los cultivos celulares de que
mantiene la estructura tridimensional y el entorno se asemeja más al fisiológico.
Tras el tratamiento durante 15 horas con LPC (ver Material y Métodos) los axones
habían perdido el gran parte del recubrimiento de mielina (inmunoteñida con MBP) que se
podía ver en el tejido sin lesionar (FIGURA 28a).
Para estos experimentos se eligieron los inhibidores que mejores resultados habían
mostrado in vitro, VP1.15 y VP3.15, y de nuevo el TDZD8 para comprobar si la inhibición de
GSK-3 por sí misma ejerce algún efecto en la remielinización, en este caso ex vivo.
El índice de mielinización normalizado reveló que la remielinización era

significativamente mayor respecto a los respectivos controles, cuando el tratamiento con los
inhibidores duales se mantenía durante tres días tras la lesión (DPL) y sobre todo con VP1.15
(FIGURA 28d,e,n). Con VP3.15 (FIGURA 28h,i,n) el aumento fue menor aunque también
estadísticamente significativo. En ningún caso hubo diferencia con respecto al control con un
solo día de tratamiento (FIGURA 28b,c,f,g,n). El TDZD8, por su parte, no provocó ninguna
variación en el índice de remielinización descartándose así la posibilidad de que la inhibición
de GSK-3 en estas condiciones tenga un efecto notorio (FIGURA 28 l,m,n).
3.2. Efectos de la inhibición de la fosfodiesterasa-7 sobre la remielinización in

vivo.
Para estudiar cómo afectaba la inhibición de PDE7 a la remielinización in vivo se

utilizó un modelo animal de desmielinización por LPC. Este modelo permite estudiar el efecto
directo de los fármacos sobre la remielinización tras una lesión en ausencia de la respuesta
inmune, que puede influir enmascarando o modificando dicho efecto. Dado que,
anteriormente, se ha estudiado el efecto de la inhibición de PDE7 sobre la respuesta inmune
observándose una atenuación de ésta e incluso una reversión de los síntomas en el modelo de
EAE (Morales-García et al., 2011; Paterniti et al., 2011; Redondo et al., 2012a,b,c; González-
García et al., 2013; Pérez-González et al., 2013; Morales-García et al., 2014), este trabajo se ha
centrado en el efecto de esta inhibición sobre la remielinización sin la influencia de otros
factores.
Resultados 77
FIGURA 28. La inhibición de PDE7 favorece la remielinización tras la desmielinización con LPC en rodajas
de cerebelo. (a) Las rodajas de cerebelo de cultivaron y se mostró la reconstrucción tridimensional realizada
con Image J de los planos tomados con el microscopio confocal, en primer lugar, del tejido sin lesionar en el
que se podía ver los oligodendrocitos teñidos para MBP (rojo) recubriendo prácticamente la totalidad de los
axones teñidos en verde. Tras la lesión inducida sobre las rodajas durante 15 horas con LPC (0,5 mg/ml) se
pudo ver la pérdida de ese recubrimiento en la mayor parte de las fibras. (b-m) Las imágenes muestran el
tejido después de 1 y 3 días post-lesión (DPL) donde podemos ver los oligodendrocitos (rojo) los axones
(verde) y las zonas de colocalización de ambos marcadores (blanco) que representan las fibras mielinizadas
tras el tratamiento con 5 µM de VP1.15 (b-e), VP3.15 (f-i) o TDZD8 (j-m). (n) El gráfico muestra el índice de
colocalización normalizado que representa el área de colocalización con respecto al área que ocupan las
fibras en total, normalizado con respecto al valor del control al que se le asignó el valor de 1 (línea roja). Se
78
pudo ver que el tratamiento con los inhibidores suministrado durante 24 horas (1 DPL) no indujo ningún
efecto visible sobre la remielinización de las rodajas tratadas con LPC, efecto que sí se observó al prolongar
el tratamiento durante 48 horas más (3DPL). Tras 3 días de tratamiento tanto el VP1.15 como el VP3.15,
ambos inhibidores duales de PDE7 y GSK-3, indujeron un aumento en la remielinización con respecto al
control, efecto que no se observó con el tratamiento con TDZD8, inhibidor de GSK-3. La barra de escala
representa 50 μm en b–m. Los valores se muestran como la media ± EE y la significación estadística se fijó
en p<0,05: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
Los resultados obtenidos tras estudiar la ultraestructura del tejido mediante

microscopía electrónica mostraron, en primer lugar, un aumento en el porcentaje de fibras
mielinizadas tras la desmielinización por LPC en el cuerpo calloso de los ratones tratados con
VP1.15 (LPC+VP1.15), que es significativo tanto en los animales que fueron tratados con dos
inyecciones del inhibidor (ver Material y Métodos) y que fueron sacrificados 14 dpi, como en
los que recibieron tres dosis de tratamiento y fueron sacrificados una semana más tarde (21
dpi), con respecto a los ratones que fueron lesionados e inyectados con el vehículo
(representados como LPC). Este efecto no llega a ser significativo con VP3.15 (LPC+VP3.15). Por
tanto, in vivo se corroboró un mayor efecto remielinizador del inhibidor VP1.15 que del VP3.15
(FIGURA 29a-h). Con VP1.15, en los ratones sacrificados a 21 dpi la remielinización que ocurre
tras el tratamiento es tal, que se acerca a los niveles de mielinización que tiene un ratón
normal (CT), cuyo cuerpo calloso no ha sido lesionado tal como muestra el análisis de la
varianza (ANOVA) que no apunta diferencias significativas en este caso (FIGURA 29h).
En cuanto al grosor de las vainas de mielina, representado como el G-ratio respecto

al diámetro del axón (FIGURA 29i), se pudo comprobar que dicho grosor aumenta con ambos
tratamientos (LPC+VP1.15 y LPC+VP3.15) mostrando un G-ratio menor que los ratones
lesionados sin tratar (LPC). Pudimos observar que los valores para el grosor de las vainas de
mielina de los ratones tratados con los inhibidores de PDE7 están, en todos los casos, más
cerca de los que muestran los ratones CT, sin llegar a alcanzarlos. Esto indica que existe un
aumento en la remielinización con respecto a los ratones lesionados, que remielinizan de
forma espontánea más lentamente que los ratones tratados con ambos inhibidores, y que
estos valores de remielinización se acercan a los que aparecen en el cuerpo calloso de ratones
normales, sin que se produzca en ningún caso una hipermielinización. Observando la media del
G-ratio de los diferentes grupos, se pudo ver un aumento mayor de la mielina en los ratones
que fueron inyectados con dos dosis del tratamiento (VP1.15 o VP3.15) y sacrificados a 14 dpi
con respecto a los animales inyectados con el vehículo (FIGURA 29a-g, j).
Estas observaciones resultan muy prometedoras, ya que la inhibición de PDE7

aumentó la remielinización tanto en lo referido número de axones mielinizados como al grosor
de las vainas de mielina, lo que supone un paso adelante para que los inhibidores de PDE7
puedan proponerse como agentes remielinizadores para la terapia de la EM.
Resultados 79
80
FIGURA 29. El porcentaje de fibras mielinizadas y el grosor de la mielina aumentan tras la inhibición de
PDE7 en el modelo de desmielinización por LPC in vivo. (a-g) Imágenes del estudio de la ultraestructura del
cuerpo calloso por microscopía electrónica en ratones adultos control (a) y en ratones a los que se les ha
inducido una lesión desmielinizante por la inyección de LPC (b-g) y posteriormente se les ha inyectado el
vehículo (b, e) o los inhibidores de PDE7, VP1.15 (c, f) o VP3.15 (d, g). Los ratones sacrificados 14 días post-
inyección (14 dpi) fueron tratados con dos inyecciones (b-d) mientras que los sacrificados a 21 dpi
recibieron una inyección más (e-f). (h) Histograma que muestra el porcentaje de axones mielinizados en el
cuerpo calloso de ratones control y de ratones cuyo cuerpo calloso ha sido lesionado con LPC y sacrificados
a 14 dpi o 21 dpi. Algunos de estos ratones no han recibido tratamiento (LPC) y otros han sido inyectados
intraperitonealmente con los inhibidores de PDE7, VP1.15 (LPC+VP1.15) o VP3.15 (LPC+VP3.15). El
porcentaje de axones mielinizados es significativamente mayor en los ratones tratados con VP1.15 y los que
han recibido tres inyecciones de este inhibidor (21 dpi) alcanzaron un porcentaje similar al de los ratones
control, no lesionados. (i) El gráfico de puntos muestra el valor del G-ratio con respecto al diámetro de cada
fibra medida. Las líneas de tendencia muestran que el G-ratio es menor para los ratones tratados con los
inhibidores de PDE7 que los no tratados (LPC), es decir, presentan unas vainas e mielina más gruesas, y que
los valores se acercan más a los que presentan los ratones control sin lesionar. (j) El gráfico muestra la
media del G-ratio para cada ratón y la media de cada grupo, pudiéndose comprobar un aumento en el
grosor de la mielina (disminución del G-ratio) en los ratones tratados con los inhibidores con respecto a los
grupos sin tratar (LPC). El grosor de la mielina de los ratones tratados se acerca, pero nunca alcanza, los
valores para el G-ratio de los ratones normales (CT), descartándose así una hipermielinización debida al
tratamiento. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de una vía o su correspondiente test no
paramétrico para comparar el grupo control con el resto de grupos y los grupos tratados fueron
comparados dos a dos con sus respectivos grupos inyectados con el vehículo (LPC) mediante el test de la t
de Student o su correspondiente test no paramétrico. Los valores se muestran como la media ± EE y la
significación estadística se fijó en p<0,05: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
DISCUSIÓN
82
Discusión 83
1. El nuevo protocolo desarrollado permite aislar un mayor número de

precursores de oligodendrocitos viables tanto de la corteza cerebral de ratones como de
humanos adultos.
En los últimos años se están desarrollando métodos para el aislamiento de OPCs de

ratones, tanto completamente nuevos como adaptados a partir de los ya utilizados, para aislar
OPCs de corteza cerebral o nervio óptico de rata; así, tenemos métodos como el de agitación
(McCarthy y de Vellis, 1980; Szuchet y Yin, 1984), el immunopanning (Gard y Pfeiffer., 1993;
Shi et al., 1998; Mayer-Proschel, 2001; Dugas y Emery, 2013), por FACS (Behar et al., 1988) o la
separación por centrifugación en gradiente de densidad (Colello y Sato-Bigbee, 2001; Vitry et
al., 2001). La adaptación de estos protocolos ha sido necesaria dado que los OPCs de ratón y
rata presentan diferencias inter-específicas en cuanto a la expresión innata de antígenos
(Fanarraga et al., 1995) y también en lo relacionado con su capacidad de adhesión,
proliferación y diferenciación (Chen et al., 2007). Además, la demanda de cultivo de OPCs de
ratón ha aumentado drásticamente debido al desarrollo de modelo animales y estirpes
mutantes que sólo pueden desarrollarse en esta especie. Estos nuevos métodos buscan
mejorar la eficacia y la pureza de los cultivos de OPCs de ratón e incluyen la generación de
oligoesferas a partir de neuroesferas (Vitry et al., 1999; Chen et al., 2007), adición de
mitógenos al medio (Lin et al., 2006) o enriquecimiento a través de la inmunoselección de
células NG2 por FACS (Horiuchi et al., 2012) o de células O4 por MACS (Dincman et al., 2012).
Es el caso del immnopanning, que anteriormente sólo permitía el aislamiento por la expresión
de A2B5, ahora ha evolucionado para poder aislar células PDGFRα+, que es un antígeno mucho
más específico de OPCs (Emery y Dugas, 2013). Sin embargo, todos estos protocolos se han
utilizado, principalmente, para obtener OPCs de ratas y ratones embrionarios o perinatales
(Chew et al., 2014), mientras que no resultan eficaces a la hora de aislar los OPCs a partir de
animales adultos. El estudio de la fisiología de los OPCs adultos resulta imprescindible, puesto
que se comportan de manera diferente a los embrionarios o perinatales, lo que conlleva
graves consecuencias a la hora de completar el escenario patológico en las enfermedades
desmielinizantes primarias y en aquellas entidades en las que la desmielinización secundaria
sea, también, relevante (Brockes et al., 1980; Wolswijk y Noble, 1989; Wolswijk et al., 1991;
Wren et al., 1992; Marchionni et al., 1993; Engel y Wolswijk, 1996; Canoll et al., 1996; Shi et
al., 1998; Kessaris et al., 2006; Richardson et al., 2006; Psachoulia et al., 2009; de Castro et al.,
2013; Young et al., 2013). Por ejemplo, recientemente hemos visto en nuestro grupo que la
respuesta migratoria frente a la proteína de matriz extracelular Anosmina-1 es diferente
dependiendo de la edad de los ratones de los que se obtienen los OPCs (Clemente et al., 2011;
Murcia-Belmonte et al., 2014, Bribián*, Medina-Rodríguez* et al., Enviado).
El método desarrollado en el presente trabajo introduce unas modificaciones a

protocolos anteriores, como el uso de papaína para disgregar las meninges y eliminarlas más
rápidamente, disminuyendo la muerte celular, el ajuste de las condiciones para mejorar la
eficiencia en las diferentes edades y la adición de factores de crecimiento al cultivo glial mixto,
lo que facilita su crecimiento. Todo ello permite el aislamiento de OPCs adultos que expresan
los mismos marcadores que los OPCs embrionarios o perinatales (NG2, A2B5, PDGFRα), así
como Olig2, que marca todo el linaje oligodendroglial (FIGURA 13, 14; Raff et al., 1983; Hart et
al., 1989; Pringle et al., 1992; Richardson et al., 2011), y que son viables y capaces de
diferenciarse para formar oligodendrocitos maduros mielinizantes (FIGURA 16). La validación
84
de la viabilidad de los OPCs obtenidos por el nuevo método desarrollado también se ha

corroborado en otros trabajos realizando estudios de quimiotáxis (Clemente et al., 2011).
Nuestro nuevo protocolo permite obtener números similares de OPCs de ratones

neonatales que otros métodos descritos con anterioridad, como los kits de selección de
oligodendrocitos (Pesheva WO/2006/067094 A1) o el aislamiento por MACS (Dincman et al.,
2012). Sin embargo, a pesar de que el número de OPCs obtenidos disminuye con la edad
(TABLA 6), cuando se trata de aislar OPCs adultos, la eficacia de este nuevo método es de 7 a
10 veces mayor que la obtenida con FACS o con el kit de separación (Pesheva
WO/2006/067094 A1) y también es 30 veces mayor que la anteriormente descrita para el
aislamiento de OPCs por immunopanning de nervio óptico de rata adulta (Shi et al., 1998;
TABLA 5), lo que supone una reducción en el número de animales a utilizar (principio de las
tres “R” -reducción, refinamiento y reemplazo- en la experimentación animal; RD 53/2013), en
el tiempo y en los costes. Además de las diferencias inter-específicas y las referidas a la edad
de los OPCs que se han mencionado, este protocolo ha mostrado diferencias, en lo referente al
número de OPCs obtenidos a partir de ratones adultos, entre distintas cepas de ratón,
resultando más eficaz a partir de ratones CD1 (FIGURA 15). No es la primera vez que se
describen diferencias entre las distintas cepas de ratón. Se sabe, por ejemplo, que las cepas
C57/BL6 y BALB/cJ difieren en la desmielinización cortical en el modelo de cuprizona. La
corteza cerebral de los ratones C57/BL6 se desmieliniza por completo tras 6 semanas de
alimentación con cuprizona, mientras que en los ratones BALB/cJ se observa una
desmielinización parcial en este tiempo. Además, se da una marcada acumulación de microglía
en la corteza cerebral de los ratones BALB/cJ, que no se observa en los C57/BL6 (Skripuletz et
al., 2008). También se sabe que hay diferencias entre cepas en el número de células de
microglía y macrófagos productores de TNF presentes en el cerebro tras un daño isquémico.
Los ratones BALB/c, que son los que desarrollan zonas infartadas más grandes, presentan un
menor número de estas células que los ratones SJL y C57/BL6 (Lambertsen et al., 2002).
No obstante, quizás lo más importante de este protocolo es que, con unos leves
ajustes (descritos en Resultados), también permite el aislamiento de OPCs de muestras de
humano adulto. Esto supone un gran avance, dado que se sabe muy poco acerca de los OPCs
humanos adultos. El estudio del comportamiento de estas células y su comparación con el de
sus homólogas de ratón resulta crucial, dado que la progresión de los OPCs perinatales
murinos no es igual que la de los humanos (Dean et al., 2011; Barateiro y Fernandes, 2014) y
pueden mostrar diferencias comportamentales con el ratón igual que existen entre los OPCs
de ratas y ratones (Chen et al., 2007). Además, la posibilidad de aislar OPCs humanos adultos
permitiría también realizar una comparación comportamental entre éstos y los del desarrollo o
los neonatales ya que el perfil transcripcional de los OPCs neonatales es diferente al de los
OPCs humanos adultos (Othman et al., 2011).
Actualmente, hay muy pocos trabajos que hayan aislado OPCs de humanos adultos y
que nos permita comparar la eficiencia de este nuevo protocolo. Un estudio publicado indica
que sólo el 1% de las células aisladas de corteza cerebral fueron A2B5+ y la mayoría de células
fueron oligodendrocitos maduros (Targett et al., 1996). Existen algunos estudios más que
consiguen aislar OPCs de corteza cerebral de humanos adultos también por selección con A2B5
(Cui et al., 2010, 2013), sin embargo, el marcaje para A2B5, que se ha utilizado en estos
Discusión 85
trabajos, no es suficientemente específico para marcar OPCs, ya que tiñe también neuronas,
astrocitos y oligodendrocitos en el SNC de humano adulto (Satoh y Kim, 1995; Zhang, 2001).
Otro trabajo en el que han conseguido aislar células de sustancia blanca subcortical ha
mostrado también un bajo porcentaje de OPCs NG2+ (16%) y una mayoría de oligodendrocitos
maduros (84%; Othman et al., 2011). Otro grupo ha conseguido aislar células de corteza
cerebral humana adulta con fenotipo A2B5+/PSA-NCAM– mediante FACS, que tampoco es una
selección totalmente específica porque otras poblaciones gliales (astrocitos, células
oligodendrogliales más maduras) pueden quedar dentro de la población de células separadas
(Windrem et al., 2004), al igual que un último estudio muy reciente que separa también por
FACS OPCs de humanos adultos mediante selección con O4 y A2B5 (Leong et al., 2014).
Además, ninguno de estos dos estudios muestra datos de eficacia y pureza que nos permitan
comparar con los resultados obtenidos. En cualquier caso, podemos aventurarnos a decir que
nuestro trabajo caracteriza los OPCs de una forma más selectiva que todos estos ejemplos.
El protocolo desarrollado en este trabajo permite obtener cultivos de OPCs de

biopsias humanas no tumorales que expresan no sólo A2B5, sino también NG2, PDGFRα y Olig
2 (FIGURA 17, 18), con el 70 % de pureza y en buen número comparado con el obtenido a
partir de ratones adultos C57/BL6, aunque es mucho menor que el obtenido con la estirpe CD1
(FIGURA 18). Curiosamente, el número de OPCs obtenidos a partir de los márgenes de
resección de tumores, aunque no provenían del tumor en sí, fue mucho mayor (FIGURA 18)
que el proveniente de muestras no tumorales y mostraron una elevada tasa de proliferación,
por lo que se descartaron para el resto de estudios por la posibilidad de que fueran células
alteradas ya que el margen de los tumores, en muchos casos, es difícil de delimitar (Shinoura
et al., 2005; Price y Gillard, 2011; Fillon, 2013). Por otro lado, los OPCs obtenidos de muestras
no tumorales fueron, al igual que los de ratón, viables y capaces de madurar y formar
oligodendrocitos (FIGURA 19).
Por tanto, con este nuevo protocolo se pueden obtener OPCs adultos de ratón y
humano en número suficiente para realizar estudios celulares que nos permitan conocer más
acerca de su biología, dándonos una idea de cómo podemos potenciar ciertos
comportamientos de los OPCs adultos endógenos del SNC o plantear terapias celulares
dirigidas a reparar el daño en enfermedades como la EM.
En el caso de los OPCs humanos, los OPCs derivados de células madre embrionarias
humanas (hESC-OPCs) o inducidos a partir de células pluripotenciales humanas (hiPSC-OPCs)
parecen ser una fuente alternativa para estas terapias celulares (Keirstead et al., 2005; Izrael et
al., 2007; Hu et al., 2009; Sundberg et al., 2010; Najm et al., 2013; Wang et al., 2013; Yang et
al., 2013). Estas células han sido capaces de restablecer la función locomotora y aumentar la
mielinización en ratas con lesión medular (Keirstead et al., 2005) y de mielinizar el cerebro de
ratones transgénicos shiverer, que presentan una hipomielinización congénita (Izrael et al.,
2007; Najm et al., 2013; Wang et al., 2013; Yang et al., 2013). Sin embargo, en estudios
preclínicos usando estas células se ha visto la aparición ocasional de quistes epiteliales en el
lugar del daño (Keirstead et al., 2005), lo que puede ocasionar importantes efectos
secundarios, como convulsiones. Además, los datos experimentales sugieren que la
diferenciación de hESC-OPCs o hiPSC-OPCs para formar oligodendrocitos en número suficiente
para trasplantar es difícil (Duncan, 2005) y puede conllevar problemas éticos, sobre todo por la
86
controversia que despierta el uso de embriones humanos, y técnicos, ya que el uso de este
tipo de células puede llevar a la formación de quistes y tumores, y la posibilidad de trasplantar
células más diferenciadas no proporcionaría una fuente que pudiera reponer continuamente
células una vez que murieran las trasplantadas. Además, este tipo de trasplantes pueden
provocar rechazo (Gruen y Grabel, 2006; Noble et al., 2013). Estos problemas se pueden evitar
utilizando los OPCs endógenos que se pueden aislar con el protocolo desarrollado en este
trabajo.
Además, el aislamiento de OPCs humanos adultos permitirá el análisis de los efectos

sobre estas células de los tratamientos actuales para la EM, como el Natalizumab o el
Fingolimod, ya que, hasta la fecha, sólo se han podido estudiar sobre OPCs humanos fetales
(Miron et al., 2008), o de nuevos tratamientos que puedan favorecer la remielinización unida a
la inmunosupresión. Así, este protocolo puede facilitar la búsqueda de terapias alternativas
para enfermedades desmielinizantes y avanzar hacia ensayos clínicos potenciando su
capacidad como OPCs endógenos capaces de remielinizar o utilizándolos para una terapia
celular evitando las implicaciones éticas que conlleva el uso de hESC o hiPSC. Por tanto, el
desarrollo de este protocolo supone un avance importante en la búsqueda de tratamientos
potenciales para los enfermos de EM.
2. La inhibición de la fosfodiesterasa-7 favorece la supervivencia y la

diferenciación de los precursores de oligodendrocitos murinos y humanos adultos hacia
fenotipos mielinizantes.
Los inhibidores de PDE7 tienen un efecto neuroprotector y favorecen la disminución

de la respuesta inmune in vitro (Castaño et al., 2009) e in vivo en modelos animales de lesión
medular, accidente cerebrovascular, Parkinson, Alzheimer y EM (Morales-García et al., 2011;
Paterniti et al., 2011; Redondo et al., 2012a,b,c; González-García et al., 2013; Pérez-González
et al., 2013), pero no se conocen sus efectos sobre los oligodendrocitos y la remielinización
que es el otro problema que aparece en la EM.
La expresión de PDE7 es variable entre especies y por esta razón es imprescindible

localizarla en OPCs de ambos tipos, murinos y humanos (Michaeli et al., 1993; Han et al., 1997;
Hetman et al., 2000; Gardner et al., 2000; Miró et al., 2001; Pérez-Torres et al., 2003; Smith et
al., 2003; Reyes-Irisarri et al., 2005; Johansson et al., 2012). En cuanto a su expresión en células
del sistema nervioso, se ha demostrado la presencia de varias PDEs en poblaciones neurales,
incluyendo la PDE3, 4, 7 y 9 (van Staveren et al., 2002; Reyes-Irisarri et al., 2005; Castro et al.,
2010; Nunes et al., 2012) y la PDE9 se ha encontrado en una subpoblación de astrocitos (Susin
et al., 2012). En cuanto a células formadoras de mielina, sólo se ha demostrado la expresión de
PDE4 en células de Schwann y oligodendrocitos y la de PDE3 en OPCs (Monge et al., 1993;
Walikonis y Poduslo, 1998; Whitaker et al., 2008; Mitome-Mishima et al., 2013). El presente
trabajo es el primero en el que se demuestra que tanto los OPCs neonatales como los adultos
murinos y humanos expresan la enzima PDE7 y, por tanto, son susceptibles a la inhibición de
esta enzima (FIGURA 20, 25).
Al contrario que la PDE3, que también se expresa en OPCs, la PDE7 se encarga

exclusivamente de la degradación del AMPc. El aumento de los niveles intracelulares de AMPc
Discusión 87
por la inhibición de PDEs, como la PDE4, o por la adición de análogos, además de participar en
la reducción de la respuesta inmune, bloquea la proliferación de los OPCs y aumenta la
diferenciación (McMorris, 1983; Raible y McMorris, 1993; Afshari et al., 2001; Clark et al.,
2002; Lonze y Ginty, 2002; Volakakis et al., 2010). Los resultados del presente trabajo tras
inhibir con varias moléculas (BRL, inhibidor comercial, y TC3.6, VP1.15 y VP3.15, inhibidores de
nueva generación) la PDE7 en OPCs, están en consonancia con dichos estudios previos, puesto
que hemos visto que los nuevos inhibidores específicos de PDE7 aumentan la supervivencia de
OPCs neonatales y postnatales, aunque sin afectar a su proliferación, lo que evitaría posibles
problemas derivados de la formación de tumores en caso de llegar a poder usarse en clínica
(FIGURA 21, 26). Muchas otras moléculas participan en estos procesos, como la hormona T3
que es fundamental para la supervivencia, proliferación y maduración de los OPCs (Jones et al.,
2003), las moléculas neurotróficas segregadas por las células endoteliales del cerebro, como
FGF2 y BDNF, que forman el llamado “nicho oligovascular”, que protegen también a estos
precursores (Arai y Lo, 2009), o antibióticos, como la minociclina, que los protegen en
condiciones de estrés oxidativo (Schmitz t al., 2012). El aumento de la supervivencia observado
al inhibir la PDE7 con TC3.6 o VP1.15 (del 20 al 40%) supera al descrito para la minociclina (10%
aproximadamente; Schmitz et al., 2012) y es similar al producido por las moléculas del “nicho
oligovascular” (Arai y Lo, 2009). Además, se ha visto en el presente estudio que los inhibidores
de PDE7 inducen la maduración de los OPCs hacia oligodendrocitos, no sólo de los OPCs
murinos (FIGURA 22, 23, 26), sino también de los humanos adultos (FIGURA 25). Hay una gran
cantidad de moléculas que participan en la diferenciación de OPCs, como se ha visto en la
Introducción de este trabajo, pero muy pocas que se hayan probado en OPCs humanos. Sobre
OPCs humanos fetales se ha visto, por ejemplo, que la citoquina CXCL1 promueve la
proliferación de OPCs fetales humanos pero no afecta a su diferenciación (Filipovic y Zecevic,
2008), que una proteína dependiente de la vitamina K, Gas6 (Growth-arrest specific protein 6),
promueve la supervivencia y la maduración de estas células (O'Guin et al., 2014) o que el
Fingolimod reduce su diferenciación (Miron et al., 2008). Sin embargo, hasta donde sabemos,
existen muy pocos estudios que demuestren la capacidad de diferenciación y mielinización de
los OPCs obtenidos de humanos adultos. In vitro, se ha visto que estos OPCs, en respuesta a la
combinación de diferentes factores de crecimiento (BDNF, IGF-1, PDGF-AA, FGF2), extienden
numerosos procesos e incrementan el número de contactos con los axones, en co-cultivo con
DRGs (Cui et a., 2010), y que tienen capacidad para mielinizar cuando son trasplantados ex vivo
e in vivo (Windrem et al., 2004; Leong et al., 2014). El estudio que aquí presentamos es el
primero que muestra el comportamiento de estas células humanas adultas en respuesta a la
inhibición de PDE7 y este comportamiento se corresponde con lo observado en ratón. Aunque
el estudio con células humanas no fue tan exhaustivo como con células de ratón, debido a la
dificultad para obtener las biopsias, estos resultados nos llevan a pensar que la actividad de
PDE7 esta conservada, al menos, entre ambas especies y que los resultados podrían ser
extrapolables del ratón al humano.
En los efectos observados por la inhibición de la PDE7, se ha visto que está implicada la
activación de la vía de señalización de ERK (FIGURA 24). Dado que los OPCs provenientes de
ratones P0 y P15 mostraron la misma repuesta positiva en cuanto a la activación de ERK
cuando se inhibió PDE7, se puede sugerir que la inhibición de PDE7 emplea un mecanismo de
acción similar sobre OPCs de ratones neonatos y postnatales. La activación de esta vía está en
88
consonancia con estudios previos que ya habían demostrado la implicación de la activación de

esta vía en la salida del estado proliferativo y en la estimulación de la diferenciación y la
mielinización (Joubert et al., 2010; Xiao et al., 2012; Ishii et al., 2013). Además, se sabe que la
vía de ERK está implicada en los efectos que ejercen otras PDEs como la PDE4. Se sabe, por
ejemplo, que el Rolipram, que inhibe esta PDE, promueve la remielinización en el modelo de
cuprizona por la vía de MEK-ERK (Sun et al., 2012). No obstante, llama la atención que la mayor
activación de ERK se ve con el inhibidor BRL, para el que no se ha observado un efecto
significativo sobre la diferenciación o la supervivencia de los OPCs, lo que nos indica la
implicación de otras proteínas o una saturación y disminución del efecto por sobreactivación
de ERK.
La enzima PKA también está implicada en la inhibición de PDE7 según muestran los
presentes resultados. Al inhibirla con un antagonista de AMPc podemos ver como los efectos
favorecedores que ejercía la inhibición de la PDE7 sobre la diferenciación de los OPCs
desaparecen por completo (FIGURA 24). Esta implicación era esperable puesto que PKA es la
diana principal del AMPc y se sabe que otros inhibidores, tanto de PDE7 como de PDE4, actúan
a través de esta proteína (Morales-García et al., 2011). Uno de los modos principales de
actuación de la PKA es su entrada en el núcleo para activar CREB, activación que también
hemos podido comprobar que se da cuando se inhibe la PDE7 con BRL, TC3.6 o VP1.15
(FIGURA 24), y que concuerda con la vista anteriormente con otros inhibidores de esta enzima
(Morales-García et al., 2011). BRL es el que más activó CREB, apuntando de nuevo a la
implicación de otras vías. El AMPc puede actuar, además de por la vía de PKA, por la vía de la
proteína de intercambio activada por AMPc (Epac)/proteína quinasa C (PKC). Dependiendo de
su abundancia relativa, el AMPc puede actuar por una vía u otra de forma independiente, de
forma sinérgica u opuesta, para regular una función específica (Cheng et al., 2008). Por
ejemplo, se sabe que la actividad de Epac en lugar de PKA se requiere para la diferenciación y
la formación de mielina por las células de Schwann (Bacallao y Monje, 2013). Además, Epac no
tiene efecto en la activación de CREB y reduce la activación mediada por PKA (Garay et al.,
2010). Podría ser que los inhibidores TC3.6 y VP1.15 actuaran, además de por la vía de PKA,
por la vía de EPAC, y por ello los niveles de CREB no fueran tan elevados como los que produce
la inhibición por BRL, que podría estar actuando principalmente por la vía de PKA, produciendo
una mayor activación de CREB. Para explicar con certeza las vías por las que actúan los
distintos inhibidores de PDE7 estudiados, se requiere de un estudio más amplio, investigando
la implicación otras vías como la de Epac/PKC, puesto que nuestro estudio no es el primero en
el que se ven diferencias en los efectos del BRL cuando se comparan con los efectos
producidos por otros inhibidores de PDE7. Por ejemplo, BRL tampoco es capaz de prevenir el
desarrollo de la EAE en ratones, al contrario que el TC3.6, que resulta ser tan eficiente como el
Rolipram (inhibidor de PDE4) en este aspecto (González-García et al., 2013) y el efecto anti-
inflamatorio producido por el BRL y el TC3.6 tampoco es el mismo en este modelo. Otro
aspecto a tener en cuenta para dar una posible explicación a las diferencias en los resultados
con BRL, TC3.6 y VP1.15 es que, a pesar de que el IC50 de estas moléculas no es muy diferente,
la estructura química es muy distinta y esto puede llevar a que sus propiedades
farmacocinéticas, como la capacidad de penetración en la célula o para atravesar la barrera
hematoencefálica, no sean las mismas (González-García et al., 2013).
Discusión 89
Además de estas diferencias en lo que se refiere a la señalización intracelular, en

cuanto a la diferenciación de los OPCs, VP1.15 y VP3.15, en general, muestran efectos más
marcados que los producidos por el TC3.6, aún presentando los primeros un IC50 algo mayor.
De nuevo, la estructura de las moléculas, sus propiedades farmacocinéticas y las vías
intracelulares por las que actúan pueden marcar estas diferencias. Por ejemplo, como se ha
comentado ya, se sabe que VP1.15 y VP3.15 inhiben GSK-3 además de PDE7 y, por este
motivo, se pensó que podría ser esta inhibición dual la que potenciara el efecto favorecedor de
la diferenciación. Otros estudios apoyan estas diferencias puesto que también VP1.15 y VP3.15
resultan más eficaces que TC3.6, por ejemplo, en la reducción de la inflamación medida por la
reducción de nitritos tras el tratamiento de cultivos de células gliales con LPS (Morales-García
et al., 2014). Utilizando el inhibidor de GSK-3, TDZD8, se descartó que la inhibición de GSK-3
por sí misma tenga un efecto sobre la diferenciación de los OPCs en estas condiciones, aunque
sí lo tiene sobre la supervivencia (FIGURA 26). No obstante, la inhibición de GSK-3 sí ha
mostrado en otros estudios favorecer la diferenciación de oligodendrocitos pero con otros
inhibidores y a una concentración mucho más elevada (ARA-014418; 20 µM y LiCl; 30 mM),
utilizando el nervio óptico de rata y ratón (Azim y Butt, 2011). No se puede descartar por tanto
que, en combinación con la inhibición de PDE7, la inhibición de GSK-3 por VP1.15 y VP3.15
pueda ayudar a la diferenciación de los OPCs.
Los resultados beneficiosos, sobre todo para la diferenciación de OPCs, que ejercen
especialmente el VP1.15 y el VP3.15, son muy importantes puesto que no sólo se observan
sobre OPCs de ratones a diferentes edades, sino también sobre OPCs humanos. Por ello, estos
dos inhibidores de PDE7 merecían ser tomados en consideración para posteriores estudios, ex
vivo e in vivo, que nos permitieran comprobar si esta mejoría en la diferenciación hacia
oligodendrocitos mielinizantes se traducía en una remielinización más efectiva. Esto podría
hacer que estos inhibidores tomaran fuerza en el planteamiento de ensayos clínicos, sobre
todo el VP3.15, cuyas características farmacodinámicas mejoradas con respecto al VP1.15 le
hacen ser un buen candidato a tener en cuenta para ser usado como agente terapéutico
(Redondo et al., 2012b).
3. La inhibición de la fosfodiesterasa-7 favorece la remielinización in vitro e in

vivo
Los inhibidores de PDE7 seleccionados para los estudios de remielinización sobre

rodajas de cerebelo lesionadas con LPC (VP1.15 y VP3.15), demostraron tener un efecto
positivo tras tres días ex vivo, aumentando el índice de mielinización. Por otro lado, la
inhibición de GSK-3 por sí sola a través del inhibidor TDZD8 tampoco mostró esta vez un efecto
significativo (FIGURA 28), aunque cuando ha sido inhibida en otro estudio por ARA-014418 o
LiCl en una concentración más elevada, sí se ha visto que promueve la remielinización in vivo
en el modelo de desmielinización por LPC (Azim y Butt, 2011). El incremento en la
remielinización que se observa en el presente estudio es muy pronunciado y muy rápido,
sobretodo en el caso del VP1.15. Podemos comparar los resultados del presente estudio con
los de uno similar realizado con Fingolimod (Gilenya®; Miron et al., 2010), que es uno de los
pocos tratamientos aceptados para la EM. En este trabajo realizado con Fingolimod también
sobre rodajas de cerebelo desmielinizadas por LPC y utilizando la misma concentración que la
90
usada para los inhibidores de PDE7, podemos ver que la remielinización conseguida por el
Fingolimod después 14 días de tratamiento sobre el cultivo, es similar a la que se observa en el
presente estudio tan sólo 3 días después de la incorporación de los inhibidores de PDE7. Por
tanto, el efecto sobre la remielinización de los inhibidores de PDE7 es mucho más fuerte y esto
podría suponer una disminución de la dosis a utilizar.
Con tan prometedores resultados, nos planteamos el estudio de la remielinización in

vivo en el modelo de desmielinización por LPC en ratón. Este modelo fue elegido porque la
desmielinización que se produce es focalizada y, tras la desmielinización, empieza a darse una
remielinización espontánea lenta que se completa a las 4 semanas y permite, en este periodo
de tiempo, estudiar el efecto que ejercen los fármacos sobre la remielinización sin apenas
implicación del sistema inmune, ya que, aunque se da cierta infiltración de macrófagos y
activación de microglia, la participación de células T es mínima (Waxman et al., 1979; Imai et
al., 2008). Los resultados del presente estudio muestran un aumento del porcentaje de axones
mielinizados y del grosor de la mielina tras el tratamiento con los inhibidores VP1.15 y VP3.15
y, por tanto, un efecto favorecedor de la remielinización, en concordancia con los efectos que
se habían visto in vitro y ex vivo, que se acerca al aspecto del cuerpo calloso de ratones
normales, sin hablar en ningún caso de hipermielinización (FIGURA 29). Esto es importante ya
que, en otros trabajos en los que se ha estudiado el ratón transgénico CnpCre;MekDD que
presenta una activación sostenida de ERK en células de Schwann y oligodendrocitos, se ha
demostrado que el grosor de la mielina de estos ratones es desproporcionado en relación al
diámetro del axón (Ishii et al., 2013). En el presente estudio, como decíamos, no se observa
esta indeseable hipermielinización aunque, como se ha mencionado anteriormente, la vía de
ERK se activa al inhibir PDE7. Esto puede deberse a que la activación de ERK producida está
dentro de unos niveles que favorecen la mielinización pero no la inducen de forma
desproporcionada, puesto que también se sabe que la señalización de ERK es imprescindible
para la mielinización ya que este proceso falla en ratones knock-out para ERK en OPCs y
oligodendrocitos y es imprescindible para el mantenimiento de la mielina y la integridad
axonal en el SNC adulto, visto en un transgénico condicional en el que se puede inducir la
ablación de ERK por tamoxifeno en oligodendrocitos (Ishii et al., 2012, 2014).
La importancia del aumento de la remielinización producido reside en que,

actualmente, a pesar de los muchos estudios al respecto, los tratamientos para la EM, sólo
logran reducir la respuesta inmune pero no producen una reparación efectiva de las lesiones
en el SNC. El Fingolimod, como se ha mencionado anteriormente, ha demostrado tener un
efecto remielinizante en estudios realizados ex vivo (Miron et al., 2010; Sheridan y Dev, 2012;
Kipp y Amor, 2012). Sin embargo, este efecto reparador no está claro, ya que existen estudios
in vivo que contradicen a estos y muestran que el tratamiento con Fingolimod tras la
desmielinización por cuprizona o LPC en médula espinal de rata no afecta a la remielinización
(Kim et al., 2011; Hu et al., 2011) y se ha demostrado que es insuficiente para prevenir la
neurodegeneración secundaria progresiva en el modelo de EAE (Al-Izki et al., 2011). Por otro
lado, los efectos favorecedores sobre la remielinización de otro tratamiento, el acetato de
glatirámero (Copaxone®) también se están estudiando y se ha visto, por ejemplo, que aumenta
la remielinización 28 días después de la desmielinización con LPC en médula espinal, más tarde
de lo que lo hacen los inhibidores de PDE7 utilizados en el presente estudio (FIGURA 29;
Aharoni et al., 2008; Skihar et al., 2009; Kipp et al., 2012; Aharoni, 2014). Aparte de estos
Discusión 91
estudios, se continúan buscando agentes que actúen a ambos niveles, sistema inmune y
nervioso, para el tratamiento de esta enfermedad. Actualmente hay algunos ensayos clínicos
con fármacos que en estudios preclínicos han demostrado su potencial (Cree, 2013), como el
anticuerpo monoclonal BIIB033 que bloquea a LINGO-1, y cuyo efecto favorecedor sobre la
diferenciación de oligodendrocitos y la remielinización ha sido demostrado en el modelo de
EAE (Mi et al., 2008, 2013; Tran et al., 2014).
Aunque estos tratamientos suelen ser bien tolerados, pueden producir efectos
secundarios como presión en el pecho, palpitaciones, disnea y ansiedad, en el caso del acetato
de glatirámero, diarrea, bradicardia, mareos, vómitos, debilidad, fiebre y dificultad
respiratoria, en el caso del Fingolimod, y dolor de cabeza, infección en el tracto respiratorio,
nasofaringitis, gastroenteritis e infección del tracto urinario, en el caso del inhibidor de LINGO-
1, que requieren un seguimiento del paciente (Behjati et al., 2014; Tran et al., 2014). Sin
embargo, los inhibidores de PDEs son moléculas, en principio, inocuas que, recordemos, se
encuentran en sustancias de consumo habitual como el café, el té, el cacao, los refrescos de
cola o las bebidas energéticas, y también están tomando en los últimos años mucha
importancia como agentes que disminuyen la inflamación y que promueven la remielinización.
Hay un estudio que demostró que los pacientes de EM muestran un incremento en la
expresión de PDEs (PDE2, PDE3, PDE4 y PDE7) en linfocitos de sangre periférica (Mizrachi et
al., 2010). Sobre los efectos de la inhibición de PDEs se sabe, por ejemplo, que el Ibudilast, un
inhibidor no selectivo de esta familia, que inhibe preferencialmente a PDE3A, PDE4, PDE10 y
PDE11 (Gibson et al., 2006), presenta efectos neuroprotectores en pacientes de EM,
posiblemente regulando el balance de las citoquinas Th1/Th2 (Barkhof et al., 2010). El
Rolipram, un inhibidor de PDE4, ha mostrado efectos beneficiosos en cuanto a la inflamación y
los síntomas en el modelo de EAE en ratón, rata y primates no humanos (Genain et al., 1995;
Folcik et al., 1999; Martínez et al., 1999; González-García et al., 2013) y también se ha
demostrado en este modelo que disminuye la pérdida axonal y la desmielinización (Paintlia et
al., 2008). Más recientemente, se ha demostrado que el Rolipram promueve la maduración de
OPCs y la remielinización, tanto ex vivo sobre rodajas de cerebelo desmielinizadas con LPC,
como in vivo en los modelos de desmielinización por cuprizona y bromuro de etidio (Sun et al.,
2012; Syed et al., 2013). Sin embargo, cuando ambos inhibidores han pasado a ensayos
clínicos, han provocado también efectos secundarios como dolores gastrointestinales, náuseas
o vómitos tales que han impedido seguir adelante con los ensayos (Bielekova et al., 2009;
Barkhof et al., 2010).
En la búsqueda de inhibidores de PDEs alternativos que puedan evitar estos efectos

secundarios se están estudiando los inhibidores de PDE7. Varios de los inhibidores utilizados
en este trabajo (BRL, TC3.6 y VP1.15) han demostrado no tener efectos eméticos y esto supone
una ventaja con respecto a los inhibidores de PDE4 (García et al., 2014). Además, su efecto
inmunomodulador y neuroprotector ha sido demostrado en numerosos modelos animales de
lesión medular, accidente cerebrovascular, Parkinson, Alzheimer y EM (Morales-García et al.,
2011; Paterniti et al., 2011; Redondo et al., 2012a,b,c; Pérez-González et al., 2013; González-
García et al., 2013), pero no existe ningún estudio que demuestre su efecto sobre la
remielinización. Los resultados de este trabajo muestran, por primera vez, sus efectos
beneficiosos sobre este proceso (ex vivo e in vivo).
92
Concretamente, los inhibidores de PDE7 utilizados en este estudio (VP1.15 y VP3.15)

habían demostrado previamente su efecto inmunomodulador en los modelos de lesión
medular y EAE, respectivamente, mostrando en este último una atenuación de los síntomas
(Paterniti et al., 2011; Redondo et al., 2012a,b). Además, como se ha dicho anteriormente, no
provocan efectos eméticos (García et al., 2014). Ahora, con el presente estudio, se ha
demostrado que, además, favorecen la supervivencia, la maduración de los OPCs y la
remielinización efectiva en modelos de desmielinización. Por tanto, podemos proponerlos
como candidatos con un gran potencial para el tratamiento de la EM y, aunque se debe
profundizar en los estudios preclínicos con estos inhibidores, estos descubrimientos deben
abrir una puerta hacia su posible inclusión en estudios clínicos como tratamiento que,
eventualmente, pudiera beneficiar a los pacientes de EM, no sólo reduciendo los síntomas sino
reparando las lesiones del SNC, sobre todo el VP3.15, cuyas características farmacodinámicas
mejoradas le hacen especialmente interesante como fármaco.
CONCLUSIONES
94
Conclusiones 95
1. El protocolo diseñado para el aislamiento de precursores de oligodendrocitos adultos

de corteza cerebral de ratón permite obtener un gran número de células con una pureza muy
elevada, superando en eficiencia a otros métodos utilizados hasta el momento como el
aislamiento por FACS, por immunopanning o mediante los kits de selección de
oligodendrocitos.
2. El número de precursores de oligodendrocitos obtenido disminuye con la edad de los

ratones y es dependiente de la estirpe utilizada, obteniéndose el mayor rendimiento en
ratones de la cepa CD1.
3. Los precursores de oligodendrocitos obtenidos con este nuevo protocolo son viables y
capaces de diferenciarse hacia oligodendrocitos maduros mielinizantes, lo que permite su uso
para el estudio de la biología de este tipo celular.
4. Nuestro nuevo protocolo permite el aislamiento de precursores de oligodendrocitos

de corteza cerebral de humanos adultos, a partir de muestras neuroquirúrgicas de diferentes
orígenes, con un alto rendimiento.
5. La pureza de los cultivos de precursores de oligodendrocitos adultos humanos es

similar a la obtenida para ratón adulto y el rendimiento es menor que el conseguido con
ratones CD1, pero similar o mayor al que se consigue con ratones C57/BL6.
6. Los precursores de oligodendrocitos humanos obtenidos también son viables para su

estudio y son capaces de formar oligodendrocitos maduros, lo que permite la comparación de
su comportamiento con el de los precursores de oligodendrocitos murinos y supone un avance
muy importante para su uso en terapias celulares para enfermedades desmielinizantes como
la Esclerosis Múltiple.
7. Todos los precursores de oligodendrocitos adultos, tanto murinos como humanos,

expresan la enzima fosfodiesterasa-7, cuyos inhibidores, que inducen un aumento en los
niveles intracelulares de AMPc, están tomando gran importancia en los últimos años como
fármacos que reducen la respuesta inmune y que podrían favorecer la remielinización.
8. Los inhibidores de fosfodiesterasa-7 de nueva generación utilizados en este estudio

(TC3.6, VP1.15 y VP3.15) favorecen la supervivencia y la diferenciación de los precursores de
oligodendrocitos neonatales y adultos hacia oligodendrocitos maduros, y lo hacen más que el
inhibidor comercial más estudiado hasta el momento, BRL, sin afectar en ningún caso a la
proliferación celular. Los efectos más importantes sobre la diferenciación hacia fenotipos
mielinizantes se observan con VP1.15 y VP3.15.
9. En la actuación de los inhibidores de fosfodiesterasa-7 utilizados están implicadas las

vías de de ERK y de PKA/CREB, siendo esta última la principal vía de actuación del AMPc.
96
10. Los precursores de oligodendrocitos humanos adultos, como los de ratón, también
muestran un aumento de la diferenciación hacia oligodendrocitos maduros en respuesta a la
inhibición de fosfodiesterasa-7, hallazgo importante porque confirma el potencial de esta
inhibición para su uso como terapia en enfermedades desmielinizantes y porque sugiere que la
inhibición de esta enzima conlleva a un proceso conservado entre ambas especies, lo que
facilita los estudios farmacológicos.
11. La inhibición de fosfodiesterasa-7 por los inhibidores VP1.15 y VP3.15 favorece la

remielinización sobre cultivos organotípicos de cerebelo desmielinizados por LPC.
12. La remielinización in vivo en el modelo de desmielinización por LPC en ratón también

se ve favorecida con la inhibición de fosfodiesterasa-7: el tratamiento con VP1.15 y VP3.15 tras
la desmielinización da lugar a un aumento del número de axones mielinizados y del grosor de
la mielina, con valores que prácticamente alcanzan los encontrados en el cuerpo calloso de
ratones normales.
13. El potencial remielinizador de la inhibición de fosfodiesterasa-7 observado in vitro y

corroborado in vivo, unido al efecto sobre la atenuación de la respuesta inmune comprobado
en anteriores estudios, sus características farmacodinámicas y la falta de los efectos eméticos
que produce la inhibición de fosfodiesterasa-4, convierte a este abordaje en posible terapia
para la Esclerosis Múltiple. Los inhibidores de fosfodiesterasa-7 no sólo disminuyen los
síntomas de la enfermedad, sino que también son capaces de regenerar el tejido dañado por la
desmielinización.
BIBLIOGRAFÍA
98
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120
SUMMARY
122
Summary 123
Introduction
Multiple Sclerosis (MS) is a chronic autoimmune and degenerative disease of the Central
Nervous System (CNS) characterized by inflammation, demyelination and axonal damage. It is
the most common neurological disease in young adults affecting more than 2.5 millions of
people around the world. Due to the lack of knowledge about the ethiology of the disease, the
treatments existing nowadays for MS are based on immunomodulators able to attenuate the
symptoms but not to replace the dead oligodendrocytes to achieve an effective remyelination,
repairing damaged areas in patients (López-Diego and Weiner, 2008).
FIGURE 1. The oligodendroglial lineage. There are four maturation stages of oligodendroglial lineage. The
first specific cells are the OPCs that present a bipolar morphology, migration and proliferation ability and
they express some molecular markers such as PDGFRα, A2B5 or NG2. These precursors start to differentiate
and to decrease their migratory and proliferative rate in the next stages. They differentiate into pre-
oligodendrocytes which have more ramifications and they are characterized by the expression of new
markers such as O4 and GPR17. Lately, these pre-oligodendrocytes differentiate into immature
oligodendrocytes which do not express PDGFRα, A2B5 and NG2 anymore, they start to express GalC and
CNPase, and they become in potmitotic cells with long ramifications. Finally, mature oligodendrocytes are
formed expressing myelin proteins such as PLP, MBP, MAG and MOG, and they extent their membranes to
form compact sheaths getting the capacity to myelinate axons. Image from Barateiro and Fernandes, 2014.
Remyelination includes the generation of new myelin sheaths around the naked axons,
restoring the saltatory conduction and giving axonal protection (Franklin and ffrench-Constant,
2008). However, the adult human CNS, as a rule, is not able to regenerate correctly after a
neurodegenerative disease like MS (Prineas and Connell, 1979; Barkhof et al, 2003; Patrikios et
al, 2006; Patani et al, 2007). Myelination of the CNS is mediated by oligodendrocytes, however,
mature oligodendrocytes surrounding demyelinating lesions do not seem to contribute to
remyelination (Keirstead and Blakemore, 1997). In general, it is thought that most of the
remyelinating oligodendrocytes are derived from oligodendrocyte precursor cells (OPCs) that
are present in many regions of the adult murine and human CNS (Prineas et al., 1989; Pringle
124
et al., 1992; Nishiyama et al., 1996). The formation of mature oligodendrocytes from OPCs
requires successive stages characterized by changes in their capability of migration,
proliferation and differentiation, changes in their morphology with an enhance of their
complexity and the expression of specific molecular markers (Almazán et al., 2001; Liu et al.,
2002; Rowitch, 2004; de Castro and Bribián, 2005). There are four stages of maturation; OPCs,
pre-oligodendrocytes, immature oligodendrocytes and mature oligodendrocytes (FIGURE 1).
In addition to these OPCs that are able to form mature oligodendrocytes, there is a
population of OPCs that remain undifferentiated in the adult CNS of mice and humans whose
are not exactly the same as their counterparts during development but, morphologically, they
are very similar and they express the same molecular markers (A2B5, NG2, PDGFRα; Nishiyama
et al., 1996, 1999; Dawson et al., 2000, 2003; Wilson et al., 2006; Franklin and ffrench-
Constant, 2008; Clemente et al., 2011). These adult OPCs represent approximately 8-9% of the
total population of the white matter of an adult brain and 2-3% of the gray matter (Nishiyama
1998, 2007; Levine and Reynolds., 1999; Levine et al., 2001; Dawson et al., 2003) and they
have become very interesting in the last years because they are able to differentiate in
determinate conditions and to replace oligodendrocytes dead in a physiological way or such a
cause of any pathology (Dubois-Dalq et al., 2005; Franklin and ffrench-Constant, 2008; Peru et
al., 2008; Sher et al., 2008). However, as it has been commented before, the remyelination
mediated by these adult endogenous OPCs is usually incomplete in the case of MS (TABLE 1)
and the effort should be focused on potentiate their ability of differentiate and remyelinate
these lesions looking for factors that could influence these processes.
TISSUE MYELIN AND OTHER GLIAL AND

TYPE OF LESION
CHARACTERISTICS OPCs INMUNE CELLS
ACTIVE
Hypertrophic
Demyelination,
astrocytes, strong
Indistinct margin with OPC
microglial activation,
and widespread recruitment and
macrophages and
axonal damage. occasional
lymphocyte
remyelination
infiltration
SHADOW
No astrocyte or
Sharply More than 60 %
microglia activation
demarcated and of remyelinated
and absence of
relative axonal area with thinner
macrophages and
preservation. myelin sheaths
other immune cells
Summary 125
CHRONIC-ACTIVE In the plaque,

Complete fibrous astrocytes
demyelination and few
and absent macrophages and
Sharp edge and
remyelination in leukocytes and in the
naked axons in the
the plaque but periplaque,
plaque and
with OPC hypertrophic
damaged axons in
recruitment and astrocytes, strong
the periplaque
occasional microglial activation
remyelination in and presence of
the periplaque macrophages and
immune cells
CHRONIC-INACTIVE
Astrocytic glial scar,

Complete no microglial
Sharp edge and
demyelination activation and
demyelinated
and absent reduced number of
axons.
remyelination macrophages and
leukocytes
Macrophage Microglia OPC Axon Myelin Active plaque Chronic plaque Remyelinated area
TABLE 1. Characteristics of MS lesions. MS lesions are classified in four groups: active lesions, with a indistinct
margin, axonal damage and widespread demyelination, where OPCs are present and an occasional remyelination
can occur; shadow lesions, sharply demarcated, relative axonal preservation and partially remyelinated; chronic-
active lesions, with a sharp edge, naked axons in the plaque and damaged axons in the periplaque where occasional
remyelination can occur; chronic-inactive lesions, with a sharp edge, complete demyelination and absent
remyelination. Table and images adapted from Clemente et al., 2013.
In order to study the OPC biology and the remyelination process, many techniques have
been developed in the last years such as in vitro isolation of OPCs and culture (McCarthy and
de Vellis, 1980; Shi et al., 1998; Chen et al., 2007; Dincman et al., 2012; Lee et al., 2012; Emery
and Dugas, 2013; Mei et al., 2014), that give us a first approach but do not permit the study of
the interactions with the environment. Moreover, these methods are generally useful for the
isolation of embryonic and early postnatal OPCs but not so much for adult OPCs. OPCs can be
co-cultured with neurons for the study of their interactions in the absence of other cells
(Laursen et al., 2009) but to study the remyelination process by endogenous or added OPCs in
a three-dimensional environment, the use of ex vivo models demyelinated by toxic agents
(organotypic cultures demyelinated by lysophosphatidylcholine -LPC-; also known as
lysolecithin) is necessary. Of course, after using these methods which allow us make a good
approach, using a low number of animals, it is necessary the in vivo study which allows to
reproduce the exact environment, and the temporal and spatial signalling. Animal models,
such as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) or viral models (Traugott et al.,
1986; Boyle and McGeer, 1990), reflect better the MS characteristics and are very useful to
study the immune response. However, the study of remyelination is difficult on them because
the lesions are little, widespread and demyelination and remyelination occur simultaneously.
126
For this purpose, other models have been developed such as the models of demyelination
induced by toxics such as LPC or ethidium bromide (Back et al., 2001; Jakovcevski et al., 2009;
Lindner et al., 2009) or by the copper chelator cuprizone: in all of them there is a minimal
participation of the immune system. The LPC model is a good choice because mature
oligodendrocytes are specifically affected, and not OPCs as occurs in the ethidium bromide
model, and it induces more localized lesions in comparison with the cuprizone model.
All these methods have allowed the study of many intrinsic and extrinsic factors
participating in the remyelination process including the presence of T cells, myelin specific
antibodies, transcription factors, neurotransmitters, cytokines or growth factors (Boulanger
and Messier, 2014). It is essential the comprehensive study of the action of these factors to
achieve an effective reparative therapy for MS lesions.
The best approach would be the study of molecules involved in the two processes that
fail in MS: immune response and remyelination. 3'-5'-cyclic adenosine monophosphate (cAMP)
is one of these molecules. It is an intracellular second messenger which interacts with different
proteins, mainly with protein kinase A (PKA), participating in a lot of physiological processes.
PKA activation by cAMP leads to CREB activation modifying the expression of specific genes
implicated in different processes, depending on the cellular type or the context (Borrelli et al.,
1992). Its role in the control of the immune response has been widely studied (Lonze and
Ginty, 2002; Serezani et al., 2008; Volakakis et al., 2010) and this action is in part attributed to
the capacity of cAMP to induce signals interfering with the pro-inflammatory factor NF-κB,
actually considered as a key target in the development of anti-inflammatory drugs (Gerlo et al.,
2011). Its participation on OPC differentiation and remyelination has also been reported. It is
known for example that cAMP or its analogues suppress the expression of PDGFRα, inhibiting
proliferation and increasing the expression of CNPase, PLP or MBP (McMorris, 1983; Afshari et
al., 2001; Clark et al., 2002) and, an increase of cAMP levels in neurons is also important to
promote remyelination, probably by favouring the stability of myelin sheaths (Malone et al.,
2013). Moreover, it is known that the increase of cAMP levels promotes remyelination in vivo
on the cuprizone model of demyelination (Sun et al., 2012) and also on the LPC model by
inactivation of GSK-3, a protein related with this pathway because it is susceptible to be
phosphorilated and inactivated by PKA (Azim and Butt, 2011).
The best way to regulate the intracellular levels of cAMP is by inhibiting its degradation
by cyclic nucleotide phosphodiesterases (PDEs) because the activation of its synthesis by
adenylyl cyclases just induces transient alterations (Essayan, 2001). PDEs inhibitors have been
used to treat inflammatory diseases even before the knowledge of their inhibitory
characteristics. In 1868, Henry Hyde Salter published a work where he recommended a cup of
concentrated coffee to improve asthma. Long after that, it was demonstrated that
methylxanthines such as caffeine or theophylline were PDEs inhibitors that reduce the
inflammation (Butcher and Sutherland, 1962; Marqués et al 1999; Peters-Golden et al., 2005;
Deree et al., 2008). These molecules are present in substances that we consume regularly such
as coffee, tea, cocoa, cola or energy drinks. Nowadays there are a large number of PDEs
specific inhibitors which are being studied as therapeutic agents for diseases such as cancer,
cardiac fail or pulmonary, inflammatory and neurodegenerative diseases and there are a lot of
clinical trials studying their effects (Bolger et al., 1993; Quadri et al., 1998; Torphy et al., 1999;
Summary 127
Essayan et al., 2001; Lerner et al., 2000; Jackson 2001; Hoffmann et al., 2001; Bollen and
Prickaerts, 2012; Kumar et al., 2013; Matera et al., 2014; Maurice et al., 2014) although some
of them have failed due to the side effects produced. However, some inhibitors are being used
as drugs, for example, sildenafil (VIAGRA® or REVATIO®) which is a PDE5 inhibitor currently
accepted for the treatment of erectile dysfunction or pulmonary arterial hypertension.
Among the 11 families of PDEs currently known, just PDE4, PDE7 and PDE8 are
exclusively related with the metabolism of cAMP. PDE4 inhibition has been studied for the
treatment of asthma or chronic obstructive pulmonary disease (COPD; Gamble et al., 2003;
Grootendorst et al., 2007) and also for MS (Sommer et al., 1995; Martínez et al., 1999; Dal Piaz
and Giovannoni, 2000; Sánchez et al., 2005; Paintlia et al., 2008). It is known that the immune
response is attenuated in the EAE model by PDE4 inhibition (Genain et al., 1995; Folcik et al.,
1999; Martínez et al., 1999), the axonal damage and demyelination are also reduced in this
model (Paintlia et al., 2008) and remyelination is enhanced in demyelination models ex vivo
(on cerebellar slices demyelinated by LPC) and in vivo (in the cuprizone and ethidium bromide
demyelinating models), through the activation of ERK-MAPK pathway (Sun et al., 2012; Syed et
al., 2013). Unfortunately, the clinical trials carried out with PDE4 inhibitors have revealed side
effects such as nausea, incoercible emesis and insomnia (Bielekova et al., 2009). For inhibiting
PDE8 just a specific molecule has been very recently discovered but its therapeutic use has not
been studied yet (DeNinno et al., 2011), so this work has been focused on PDE7 inhibitors as
an alternative to PDE4 inhibitors. At present, it has been widely demonstrated the anti-
inflammatory and neuroprotective effect of PDE7 inhibitors in vitro and on animals models of
spinal cord injury, stroke, Parkinson´s and Alzheimer´s disease and MS (Castaño et al., 2009;
Morales-García et al., 2011; Paterniti et al., 2011; Redondo et al., 2012a,b,c; Pérez-González et
al., 2013; González-García et al., 2013; Morales-García et al., 2014) but their effect on OPC
differentiation and on remyelination remains unknown. In this work some PDE7 specific
inhibitors, the commercial BRL50481 (BRL; Smith et al., 2004), and some newly generated by
Dr. Ana Martínez group in the Medicinal Chemistry Institute, CSIC, such as TC3.6 (Castaño et
al., 2009), VP1.15 (Paterniti et al., 2011; Palomo et al., 2012; Pérez et al., 2012) and VP3.15
(Palomo et al., 2012; Redondo et al., 2012b), whose characteristics and their background are
showed in TABLE 2, have been used to study their implication on adult murine and human OPC
differentiation and remyelination. This study has been performed in order to know if they are
candidates for being purposed as therapeutic agents for MS, not only able to decrease the
immune response but also as repairing agents for the demyelinating lesions of patients who
suffer this disease. Due to VP1.15 and VP3.15 are dual inhibitors for PDE7 and GSK-3, a GSK-3
specific inhibitor (TDZD8; Martínez et al., 2002) has been used for discriminating the effect
triggered by the inhibition of each enzyme.
It is also remarkable the fact that these compounds are able to cross the blood brain
barrier and recently it has been proved that most of these compounds do not induce emetic
effects (García et al., 2014) making them useful for their use as therapeutic agents.
128
COMPOUND CHEMICAL STRUCTURE IC50 (µM) BACKGROWND

- Neuroprotectant and anti-inflammatory in
animal models of Parkinson´s (Morales-García
et al., 2011) and Alzheimer´s disease (Pérez-
González et al., 2013)
- Decrease of nitrite levels and pro-
0.26 for inflammatory factors after LPS on rat primary
BRL astrocyte cultures (Morales-García et al.,
PDE7
2014).
- No effect on perivascular inflammatory
infiltrates reduction and no protection against
the apparition of symptoms in the EAE model
- No emesis
- Anti-inflammatory, decrease of nitrite levels
and pro-inflammatory factors after LPS on rat
primary astrocyte cultures and microglia and
neuron cultures (Morales-García et al., 2014)
1.04 for - Neuroprotectant by reduction of infarcted
TC3.6 area in a stroke model (Redondo et al., 2012).
PDE7
- Prevention of symptoms in the EAE model
and decrease of perivascular infiltrates T cell
proliferation and IL-17 production (González-
García et al., 2013).
- No emesis
- Anti-inflammatory, reduction of the nitrite
levels and the intracellular expression of pro-
inflammatory factors induced by LPS (more
1.1 for than the previous inhibitors; Morales García
VP1.15 PDE7 et al.,2014)
1.95 for - Inflammation degree, tisular damage and
GSK-3 TNF-α, IL-6, COX-2 and iNOS expression
reduction in a spinal cord injury model
(Paterniti et al., 2011).
- No emesis
- Anti-inflammatory, decrease of nitrite levels
and pro-inflammatory factors after LPS
(Morales García et al.,2014)
1.59 for - Attenuation of the symptoms in the EAE
VP3.15 PDE7 model (Redondo et al., 2012b)
0.88 for - Improved pharmacodymanic characteristics
GSK-3 respect to the previous inhibitors with a
safety profile regarding to genotoxicity and
mutageneity, which allows its use as a drug
(Redondo et al., 2012b)
0.69 for - Nitrites and pro-inflammatory factors
GSK-3, no reduction in astrocyte rat culture although
TDZD8 less than PDE7 and GSK-3 dual inhibitors
PDE7
VP1.15 and VP3.15 (Morales-García et al.,
inhibition 2014).
TABLE 2. PDE7 inhibitors used for the study. Name, chemical structure, IC50 and known effects of PDE7 inhibitors
used.
Summary 129
Results
In the first place, a new protocol for the isolation of a large amount of adult murine and
human OPCs derived from cerebral cortex has been developed in this work. We started from a
method previously described for isolating OPCs from neonatal rats cortex by the shake-off
method (Chen et al., 2007) and we have introduced some improvements such as the use of
papain for meninges disaggregation that allows to remove them more quickly (because
meninges are more attached to the parenchyma in the adult brain), reducing cell death, the
adjust of conditions and incubation times for each age (TABLE 3) and the addition of growth
factors to the primary mixed glial culture which facilitate their evolution. The newly developed
method have allow us to isolate, first, adult murine OPCs which expressed the same molecular
markers as the embryonic or perinatal OPCs (NG2, A2B5, PDGFRα; Raff et al., 1983; Hart et al.,
1989; Pringle et al., 1992; Richardson et al., 2011) and the oligodendroglial marker Olig2
(FIGURE 2). The number of murine OPCs obtained decreased with age (TABLE 4) and its
efficiency was similar when we isolated OPCs from perinatal mice but it was more efficient
than other existing methods in the isolation of adult murine OPCs (TABLE 5). The purity of
cultures from neonatal and adult mice was similar (more than 80 %; FIGURE 3). Moreover,
OPCs isolated from adult mice were viable and able to differentiate into oligodendrocytes
characterized by the expression of CNPase (Clemente et al., 2011; FIGURE 4). The number of
OPCs obtained was also strain-dependent being higher from CD1 mice than from C57/BL6 or
the transgenic plp-GFP (C57/BL6 background; FIGURE 5).
Age Animals/flask Meninges disgregation Tissue digestion
P0 3 PS (1:10) in HBSS, 5 min PS (1:10) in HBSS, 5 min

TABLE 3. Protocol details for OPC isolation. The number of mice per flask, the enzyme concentration for
meninges and tissue digestion (papain solution: PS) and the time of incubation depend on the age of the
mice.
130
FIGURE 2. Isolated cells express OPC specific markers. (a-f) OPCs obtained from cerebral cortex of P15 CD1
mice after 24 hours in culture. OPCs were identified by double immunostaining for detecting NG2/A2B5 (a-
c) and Olig-2/A2B5 (d-f). (g-l) OPCs isolated from cerebral cortex of P60 CD1 mice after 24 hours in culture.
OPCs were also characterized by the expression of NG2/A2B5 (g-i) and Olig-2/A2B5 (j-l). Scale bar
represents 25μm in a-f or 10μm in g-r.
Summary 131
% OPCs/rest of glial
% OPCs
Age OPCs/Animal cells in the primary
relative to P0
culture
P0 263,148± 6,508 100% 12.9%
P15 123,194 ±8,774 50% 6.3%
P60 68,444 ±5,461 25% 3.8%
P180 39,757 ±4,410 12% 2.02%
TABLE 4. Protocol efficiency. Number of OPCs obtained from mice at different ages (P0, P15, P60, P180).
The number of isolated OPCs decreased with age obtaining a half of OPCs from P15 mice than from P0, 25%
from P60 mice and 12% from P180 mice. The percentage of OPCs respect to the total of glial cells present in
the primary culture at each age is also showed.
Relative efficiency
Age CNS region Method OPCs/animal
of the new protocol
Cerebral
Newly developed
cortex 263,148
method
(mouse)
Cerebral
Oligodendrocyte
P0 cortex 250,000 Similar
selection kit
(mouse)
Cerebral 368,000
cortex MACS (Dincman et al., 1.4 times lower
(mouse) 2012)
Cerebral
Newly developed
cortex 68,444
method
(mouse)
Cerebral
cortex FACS 10,000 7 times higher
P60 (mouse)
Cerebral
Oligodendrocyte
cortex 7,500 10 times higher
selection kit
(mouse)
Optic nerve 2,000-2,500
Immunopanning 30 times higher
(rat) (Shi et al., 1998)
TABLE 5. Comparison of the efficiency between the newly developed method and some methods
previously described. Although the newly developed method shows a similar efficiency when it is compared
with other methods when OPCs are isolated from neonatal OPCs, the new protocol results more efficient
when OPCs were isolated from adult mouse cerebral cortex.
132
FIGURE 3. Murine OPC cultures show a high purity. (a-f) Low magnification immunofluorescence images of
OPCs expressing PDGFRα, characteristic molecular marker of OPCs, after 1 day in culture isolated from
cerebral cortex of P0 mice (a-c) and P15 mice (d-f).(g) Quantification of the percentage of OPCs identified as
+
PDGFRα after 1 day in culture respect to the total number of purified cells. The purity of murine cultures is
similar in neonatal and adult mice (higher than 80%). Scale bar represents 50 μm in a-f. Values are
represented as the mean ± SEM and the statistical significance was set at p < 0.05: *p < 0.05, **p < 0.01,
***p < 0.001.
Summary 133
FIGURE 4. Identification of oligodendrocytes differentiated from isolated OPCs. (a-f) Low (a-c) and high (d-
f) magnification images showing differentiate oligodendrocytes from P15-derived OPCs characterized by the
expression of Olig2 and CNPase after 7 days in culture. (g-l) Low (g-i) and high (j-l) magnification images
showing oligodendrocytes from P60-derived OPCs, characterized by the expression of Olig2 and CNPase,
after 7 days in culture. Scale bars represent 25 μm in a-l.
134
FIGURE 5. The efficiency of the

isolation with the new protocol is
strain dependent. The number of
OPCs isolated from adult mice
cerebral cortex was higher with
CD1 mice than from C57/BL6 or
plp-GFP mice (C57/BL6
background). Values are
represented as the mean ± SEM
and the statistical significance was
set at p < 0.05: *p < 0.05, **p <
0.01, ***p < 0.001
In the other hand, this is one of the first methods able to isolate adult human OPCs from
cerebral cortex by introducing some minor modifications. The enzymatic digestion of the
meninges was performed with a 1:2.5 papain solution for 10 minutes and the tissue digestion
with a 1:10 papain solution for 15 minutes (TABLE 3), 25 cm2 flasks instead of 75 cm2 flasks
were used and the shake was performed at 230 rpm instead of 250 rpm. The adult human
OPCs isolated expressed the same molecular markers than from mice (PDGFRα, NG2, A2B5 and
Olig2; FIGURE 6) and were also able to maturate and express CNPase (FIGURE 7). The number
of adult human OPCs obtained was higher than the number obtained from C57/BL6 mice,
much more in the case of the samples from resection margins of tumours (called tumoral
although is not the tumour itself) than from other kind of samples (non tumoral) such as the
samples obtained from traumatisms or epilepsy surgery of reluctant to treatment patients
(FIGURE 8a). In any case this number was as high as in P0 mice but the purity was similar (70 ±
0.04 %; FIGURE 8b-e). Because of the high rate of proliferation observed for OPCs obtained
from tumoral samples, these cells were discarded in subsequent studies in order to avoid
altered cells, probably due to their adjacency to the tumour focus because in most of the cases
the margins of the tumour are difficult to determinate (Shinoura et al., 2005; Price and Gillard,
2011; Fillon, 2013).
Summary 135
FIGURE 6. Identification of OPCs isolated from adult human cerebral cortex. (a-f) OPCs isolated
from human biopsies were characterized, after 24 hours in culture, with the same molecular
markers than in mice; NG2/A2B5 (a-c) and Olig2/A2B5 (d-f). Scale bars represent 10 μm in a-f.
FIGURE 7. Identification of oligodendrocytes differentiated from adult human OPCs. (a-f) Low (a-c) and
+ +
high (d-f) magnification images showing oligodendrocytes identified as Olig2 /CNPase cells obtained from
OPCs isolated from human biopsies after 5 days in culture. Scale bars represent 25μm in a-f.
136
FIGURE 8. Efficiency and purity of the new method when adult human OPCs are isolated. (a) Comparison
of the efficiency of the new protocol regarding the isolation of adult human OPCs from cerebral cortex by
using biopsies of resection margin of tumors (called tumoural although it is not the tumour itself) and of
epilepsy or traumatisms surgeries (called non tumoral), with the efficiency of the isolation of adult murine
OPCs (CD1, C57/BL6 or plp-GFP, P60). The number of OPCs/gram of fresh weight obtained from human
samples was lower than obtained with CD1 mice but it was higher than the number reached from C57/BL6
and plp-GFP mice. Between the human samples, those derived from epilepsy or traumatisms reached a
lower number of OPCs than the samples from resection margins of tumors. (b-e) The purity of the human
+
cultures was quantified as the percentage of PDGFRα cells respect to the total number of cells after 1 day in
culture resulting a few lower than the purity showed by murine cultures (b). Immunofluorescence images
show the expression of PDGFRα in the cultures derived from adult human samples (c-e). Scale bar
represents 50 μm in c-e. Values are represented as the mean ± SEM and the statistical significance was set
at p < 0.05: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001
With this protocol it was possible to face the main aim of the project: to investigate the
effects of PDE7 inhibition on OPCs from adult mice and humans and later, the effect of this
inhibition on the CNS remyelination after injury.
First of all, the expression of PDE7 (its two isoenzymes PDE7A and PDE7B) was
ascertained in P0 (FIGURE 9a-f) and P15 (FIGURE 9f-l) mice-derived OPCs together with the
OPC marker PDGFRα. This expression was observed in all OPCs at both ages studied.
Summary 137
FIGURE 9. All OPCs express PDE7. (a–f) High magnification immunofluorescence images of OPCs from P0
mice cerebral cortex stained with PDE7A/PDGFRα (a–c) or PDE7B/PDGFRα (d-f). All the OPCs expressed
both isoforms together with the characteristic marker of OPCs after 1 day in culture. (g–l) High
magnification immunofluorescence images of OPCs from P15 mice cerebral cortex stained with
PDE7A/PDGFRα (a–c) or PDE7B/PDGFRα (d-f). All P15-derived OPCs also expressed PDE7A and PDE7B
together with PDGFRα at this age after 1 day in culture. Scale bars represent 10 μm in a–f and 7.5 μm in g–l.
Once the target expression was checked, PDE7 was inhibited with the commercial
inhibitor BRL and the newly generated inhibitors TC3.6 and VP1.15, and several studies were
carried out. The same processes were studied in neonatal and more adult mice in order to
asses if their behaviour in response to PDE7 inhibition was the same.
138
First, a proliferation assay carried out with P0 and P15-derived OPCs revealed that the
number of Olig2+/BrdU+ cells respect to the total number of Olig2+ cells did not change in
response to PDE7 inhibition (FIGURE 10a,c) but survival did at both ages studied, decreasing
the number of apoptotic cells (A2B5+/Casp3+ cells respect to the total number of A2B5+) in the
presence of TC3.6 and VP1.15 (1µM) but not with BRL (FIGURE 10b,d). Moreover, a
differentiation study revealed that in the presence of both TC3.6 and VP1.15 (1µM) in the
cultures the number of CNPase+/Olig2+ cells respect to the total number of Olig2+ cells
differentiated from P0-derived OPCs was higher than in control conditions (FIGURE 11a-f,m-
r,y) and also the number of mature oligodendrocytes (MBP+/Olig2+ cells respect to the total
number of Olig2+ cells; FIGURE 11g-l,s-x,z). However, BRL did not induce any significant effects
on these cells (FIGURE 11y,z). Finally, the same effect on the differentiation than on P0-derived
OPCs was also observed on OPCs derived from P15 mice (FIGURE 12).
FIGURE 10. TC3.6 and VP 1.15 favour neonatal and adult OPC survival without affecting their
proliferation. (a) BrdU quantification in OPCs from P0 mice characterized by the expression of the
oligodendroglial marker Olig2. The presence of BRL, TC3.6 or VP1.15 (1 μM) did not modify the number of
+ +
OPCs BrdU /Olig2 after 3 days in culture compared with their respective controls. (b) Determination of
+ +
the number of apoptotic OPCs (casp3 active /A2B5 ) from P0 mice respect to the total number of OPCs
after 2 days in culture in the presence of PDE7 inhibitors. With TC3.6 and VP1.15 OPC survival increased,
while the commercial inhibitor BRL did not exert effect. (c) Quantification of BrdU incorporation by double
immunocytochemistry on OPCs from P15 mice characterized by the oligodendroglial marker Olig2. As at
+ +
P0, the presence of TC3.6, VP1.15 or BRL (1 μM) did not modify the number of BrdU /Olig2 cells respect
+ +
to their respective controls. (d) Determination of the number of apoptotic cells (casp3 active /A2B5 ) from
P15 mice. OPC survival increased in the presence of PDE7 inhibitors (1 μM). Values are showed as the
mean ± SEM and the statistical significance was set at p < 0.05: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001
Summary 139
FIGURE 11. Both, TC3.6 and VP1.15 promote differentiation of OPCs derived from P0 mice cerebral cortex.
(a–l) Immunofluorescence images showing Olig2 and CNPase (a–f) or Olig2 and MBP expression (g-l) on
OPCs isolated from P0 brains cultured for 5 days in the presence of 1 μM of TC3.6 (d–f, j–l). (m–x) Images
show the expression of Olig2 and CNPase (m–r) or Olig2 and MBP (s–x) when the differentiation was studied
in control conditions (m–o, s–t) or in the presence of 1 μM of VP 1.15 (p–r, v–x). (y) Number of
+ + +
CNPase /Olig2 respect to the total number of oligodendroglial cells (Olig2 ). In the presence of both newly
generated inhibitors (TC3.6 and VP1.15), the number of differentiated cells was higher than in control
conditions and this effect was not observed with the commercial inhibitor BRL. (z) Quantification of mature
+ + +
oligodendrocytes (MBP /Olig2 ) respect to the total number of Olig2 cells. Both new inhibitors enhanced
OPC differentiation but not BRL. Scale bar represents 50 μm in a–x. Values are represented as the mean ±
SEM and the statistical significance was set at p < 0.05: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001
140
FIGURE 12. PDE7 inhibitors TC3.6 and VP 1.15 increased the differentiation of OPCs from P15 mice. (a–l)
Immunofluorescence images for detecting Olig2 and CNPase expression in OPCs from P15 mice maintained
for 7 days in differentiation medium (a–c, g–i) or in the presence of 1μM of TC3.6 (d–f) or 1μM of VP1.15 (j–
l). (m–x) Images show mature oligodendrocytes from OPCs derived from P15 mice after 7 days in culture in
+ +
control conditions identified as MBP /Olig2 cells (m–o, s–u) and in the presence of 1μM of TC3.6 (p–r) or
+ +
1μM of VP1.15 (v–x). (y) Quantification of the number of CNPase /Olig2 cells respect to the total number of
+
Olig2 cells revealed that in the presence of the two newly generated inhibitors the number of differentiated
+ +
cells was higher than in control conditions. (z) Quantification of mature oligodendrocytes (MBP /Olig2 ). In
the presence of TC3.6 and VP1.15 the number of mature oligodendrocytes was also higher than in controls.
The commercial inhibitor BRL did not modify OPC maturation. Scale bar represents 50 μm in a–x. Values are
given as the mean ± SEM and the statistical significance was set at p < 0.05: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p <
0.001.
In order to identify the intracellular pathways implicated, first ERK activation was
measured, since it is known that this pathway play an essential role when OPCs stop
their proliferation and start the differentiation process and on myelination (Joubert et
al., 2010; Xiao et al., 2012; Ishii et al., 2013) and it is also implicated in the increase of
remyelination induced by the inhibition of PDE4 (Sun et al., 2012). Cultures were treated
for 10 minutes with PDE7 inhibitors and an increase in the active form of ERK (pERK) was
triggered in respect of the total amount of ERK in the presence of the three inhibitors on
both, P0 and P15-derived OPCs (FIGURE 13a,b). These data confirms that PDE7 action is
very similar between the two ages studied. On the other hand, the implication of PKA
Summary 141
was also studied because it is the enzyme by which cAMP acts most commonly and it
was observed that, PKA inhibition by a cAMP antagonist made disappear the effect
showed by PDE7 inhibitors on OPC differentiation indicating the implication of this
pathway in the enhancement of this process (FIGURE 13c). This fact was corroborated
with the measurement of CREB activation because as it is known, activated PKA goes
into the nucleus and activates CREB, which is implicated on the regulation of specific
genes expression. As expected, activated CREB (pCREB) levels were increased with PDE7
inhibition bearing out the implication of PKA/CREB pathway in the effects carried out by
these compounds (FIGURE 13d). Curiously, the higher rate of activation of both ERK and
CREB was observed with BRL, a drug that had not any effect on OPC differentiation or
survival, indicating the possible implication of other pathways in the effects observed.
FIGURE 13. PDE7 inhibition on OPCs activates ERK and PKA/CREB intracellular pathways. (a) p-ERK/ERK
estimation by measuring the fluorescence intensity on OPC cultures obtained from P0 mice. ERK pathway
was activated with BRL, TC3.6, and VP1.15 (30 μM). (b) p-ERK/ERK quotient measured by fluorescence
intensity in OPCs from P0 mice. This protein was also activated after the exposition to the three inhibitors
+ +
(BRL, TC3.6, and VP 1.15; 30 μM). (c) Detection and quantification of oligodendrocytes CNPase /Olig2 in the
cultures treated with PDE7 inhibitors and a cAMP antagonist, Rp-cAMP (100 μM), which inhibits PKA. The
beneficial effects observed after PDE7 inhibition on OPC differentiation disappeared when PKA was
inhibited, suggesting the implication of cAMP/PKA pathway on this process. (d) Determination of
pCREB/CREB. An increase of this quotient was also observed in OPCs isolated from P0 mice in the presence
of PDE7 inhibitors, being higher with BRL. Values are represented as the mean ± SEM and the statistical
significance was set at p < 0.05: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
142
In spite of all these interesting results in mice, maybe the most important added value of
this in vitro study were the experiments carried out with OPCs derived from cortical biopsies
from epileptic adult humans, since the behaviour of the human cells could not be the same as
in mice and the extrapolation of the results from mice to human could be wrong. In this case,
after checking that adult human OPCs also expressed PDE7 together with the molecular
marker PDGFRα characteristic of these cells (FIGURE 14a-f), a conserved effect between both
species could be supposed in response to PDE7 inhibition by TC3.6 and VP1.15. Therefore, as in
mice, an increase of the differentiation process mirrored the enhanced number of
CNPase+/Olig2+ cells in respect to the total number of Olig2+ cells in the treated cultures
compared with control conditions (FIGURE 14g). The difficulty to obtain human samples did
not allow us to perform a more exhaustive study, but these data was very relevant because we
could ensure an effect of PDE7 inhibitors in the maturation of these cells and this fact suggests
that the mechanism of action of PDE7 is conserved between both species.
FIGURE 14. All adult human OPCs express PDE7 and their differentiation is increased when this enzyme is
inhibited. (a-f) Immunocytochemistry of PDE7A/PDGFRα (a–c) or PDE7B/PDGFRα (d–f) in OPCs cultured
from adult human biopsies. Both isoenzymes were expressed by human OPCs. (g) The number of
+ + +
differentiated cells (CNPase /Olig2 ) relative to the total Olig2 cells, respect to their relative controls, in the
presence of TC3.6 or VP1.15 (1 μM) after 5 days in culture was higher suggesting a similar behavior
between mice and human. Scale bar represents 25 μm in a–f. Values are represented as the mean ± SEM
and the statistical significance was set at p < 0.05: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
Summary 143
Once finished this part a new PDE7 inhibitor was provided (VP3.15), with improved
pharmacokinetic and pharmacodynamic properties as drug respect to the previous inhibitors.
Moreover, a GSK-3 specific inhibitor (TDZD8) was added to the study in order to clear up the
influence of this inhibition in the biology of OPCs given that both, VP1.15 and VP3.15, are dual
inhibitors of PDE7 and GSK-3. OPC survival was checked and, on this occasion, the decrease on
the number of A2B5+/Casp3+ cells respect to the total number of A2B5+ cells was lower but not
statistically significant in the presence of VP3.15. However, TDZD8 showed a significant
decrease of the apoptotic cells (FIGURE 15a). OPC proliferation, as observed previously with
the other inhibitors, remained unchanged also with VP3.15 and TDZD8 (FIGURE 15b).
Regarding the OPC differentiation, an increase was also seen with VP3.15 (1µM) and no effect
was observed in this case in the presence of TDZD8 (1µM), discarding the implication of GSK-3
inhibition in this process (FIGURE 15c-g). Finally, the effect of these new inhibitors on adult
human OPC differentiation was studied. VP3.15 showed an influence on this process increasing
the number of CNPase+/Olig2+ cells respect to the total number of Olig2+ compared with the
control cultures and, once again, TDZ8 did not exert any effect on OPC differentiation (FIGURE
16).
With these promising results from the in vitro experiments it was necessary to test if the
improvement of OPC survival and overall on OPC differentiation would be translated into an
increased remyelination. For this purpose, an ex vivo model was first used in order to quantify
the myelination index after injury in the presence of PDE7 inhibitors. This model previously
described (Zhang et al., 2011) consists in the measurement of myelinated axons (colocalisation
of MBP and neurofilament staining) after LPC induced demyelination (0.5 mg/ml for 15 hours;
FIGURE 17a) on cerebellar slices and allows the quantification of remyelination after the
addition of the inhibitors to the culture medium (normalized myelination index: colocalisation
area/total area of neurofilament, normalised respect to CT values). PDE7 inhibitors used on
this study were VP1.15 and VP3.15, which had a higher effect on OPC differentiation in vitro
and TDZD8, again for discarding the effect due to GSK-3 inhibition itself. Demyelinated slices
were treated with inhibitors for 24 hours (1 day post lesion; DPL) or 72hours (3DPL). After
1DPL, no treatment induced changes in remyelination (FIGURE 17b,c,f,g,j,k,n). However, the
outcome of VP1.15 or VP3.15 addition for 72 hours (3DPL) was the increase on remyelination
being higher in the presence of VP1.15 than with VP3.15 (FIGURE 17d,e,h,i,n). TDZD8 did not
show any effect on remyelination (FIGURE 17j-n).
144
FIGURE 15. The dual inhibitor of PDE7 and GSK-3, VP3.15, favored the differentiation of murine OPCs
+ +
without affecting their survival or proliferation. (a) Determination of apoptotic cells (Casp3 /A2B5 ) after 2
days in vitro. OPC survival was enhanced in the presence of the GSK-3 inhibitor but this enhancement was
not statistically significant with the dual inhibitor in this case (1 μM). (b) Quantification of BrdU
incorporation by double immunocytochemistry on OPCs from P0 mice characterized by the oligodendroglial
+ +
marker Olig2. The presence of VP3.15 or TDZD8 (1 μM) did not modify the number of BrdU /Olig2 cells
after 3 days in culture compared with their respective controls. (c–f) Immunofluorescence images to detect
the expression of Olig2 and CNPase on OPCs from P0 mice which were kept for 5 days in differentiation
medium in the presence or not of 1 μM of the PDE7 and GSK-3 inhibitor, VP3.15 (c-d), or the inhibitor of
GSK-3, TDZD8 (e-f). (g) The quantification of CNPase+/Olig2+ cells respect to the total number of Olig2+ cells
revealed that in the presence of the dual inhibitor, VP3.15, the number of differentiated cells was
significantly higher than in control conditions while the GSK-3 inhibition, itself, did not induce changes on
OPC differentiation. Scale bar represents 25μm in c–f. Values are represented as the mean ± SEM and the
statistical significance was set at p < 0.05: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
Summary 145
FIGURE 16. VP3.15 favored the adult human OPC differentiation. (a–d) Immunofluorescence images shown
the expression of CNPase and Olig2 on adult OPCs from human cerebral cortex, after 5 days cultured in
differentiation medium in the presence of VP3.15 (a-b) or TDZD8 (1 μM) (c-d). (e) The quantification of
+
CNPase cells on cultures showed that in the presence of the dual inhibitor VP3.15, the number of
differentiated cells was higher than in control conditions while GSK-3 inhibition by TDZD8 did not produce
this effect. Scale bar represents 25 μm for a-d. Values are represented as the mean ± SEM and the statistical
significance was set at p < 0.05: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
146
FIGURE 17. PDE7 inhibition favors remyelination after demyelination by LPC on cerebellar slices. (a)
Protocol and images showing a 3D reconstruction of cerebellar slices. Non-lesioned tissue shows most of
axons (green) wrapped by oligodendrocytes (red). After induction of demyelination for 15 h with LPC (0.5
mg/ml) the loss of most of oligodendrocytes was observed. (b-m) Images show tissue after 1 and 3 days
post-lesion (DPL) where oligodendrocytes (red) and axons (green) can be observed and the overlapping
areas (white) show myelinated fibers after the treatment with 5 μM of VP1.15 (b-e), VP3.15 (f-i) or TDZD8 (j-
m). (n) Plot showing the normalized myelination index which represents the co-localization area respect to
the total area occupied by fibers and normalized respect to the control values which was assigned a value of
1 (red line). The treatment with inhibitors for 24 h (1DPL) didn´t induce an observable effect on
demyelinated slices, but when the treatment was extended for 48 hours more (3DPL) a positive effect on
remyelination was observed with PDE7 inhibition. After 3 days of treatment, VP1.15 and VP3.15 induced an
Summary 147
increase of remyelination respect to their controls. TDZD8 showed no effect. Scale bar represents 50 μm in
b–m. Values are represented as the mean ± SEM and the statistical significance was set at p < 0.05: *p <
0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
Once assessed the improvement of remyelination ex vivo the next step was to check the
effect in vivo on the mouse model of demyelination induced by LPC. 2µl of 1% LPC was
stereotactically injected into the corpus callosum of 8-week-old C57/BL6 male mice (1.2 mm
posterior, 0.5 mm lateral, 1.4 mm deep to the bregma; Boyd et al., 2013). 9 days post LPC
injection (9 dpi) a first dose of inhibitors was injected intraperitoneally (10mg/kg of animal of
VP1.15, VP3.15 or the vehicle), 11 dpi a second dose was administered and mice were
sacrificed at 14 dpi. Another group received a third dose at 15 dpi and was sacrificed at 21dpi.
The ultrastructure of the corpus callosum in the indicated coordinates of at least three mice
per group was analysed and compared with control mice. First, the percentage of myelinated
fibres in the sections (10 sections per mouse) was calculated. This percentage was increased
after demyelination with the treatment with VP1.15 (LPC+VP1.15) in both groups (11 and 14
dpi) respect to non treated group (LPC). This effect is not significant with VP3.15 in any case
(LPC+VP3.15). Again, in vivo the effect of VP1.15 on remyelination was higher than the
observed for VP3.15 (FIGURE 18a-h). In the case of VP1.15, values reached by the 21 dpi group
regarding to this percentage, were similar to those observed in normal mice (CT) whose corpus
callosum was not injured (FIGURE 18h).
Respecting to the myelin sheaths thickness after lesion, represented as G-ratio (axon
perimeter divided by myelinated fibre perimeter measured on at least 100 fibres per animal)
respect to axon diameter (FIGURE 18i), it could be assessed that myelin thickness was
increased by both treatments (LPC+VP1.15 and LPC+VP3.15) showing a smaller G-ratio than
untreated mice (LPC) and being closer to the CT values (FIGURE 18i). G-ratio averages per
mouse corroborated this observation. Myelin was thinner in LPC groups than in those treated
and the values of G-ratio for both treated groups (LPC+VP1.15 and LPC+VP3.15) was similar to
the observed in the CT group as revealed the ANOVA test (FIGURE 18a-g, j).
These findings result very promising, since PDE7 inhibition increased remyelination and
this fact together with the previous works showing a decrease of the immune response point
this inhibition such an important process to be considered as a potential treatment for
diseases such as MS where both mechanisms are implicated.
148
Summary 149
FIGURE 18. The percentage of myelinated fibers and the myelin thickness increased after PDE7 inhibition
with VP1.15 and VP3.15 after demyelination by LPC in vivo. (a-g) Images of electronic microscopy showing
the ultrastructure of the corpus callosum of adult control mice (a) and corpus callosum of mice
demyelinated by the injection of LPC (b-g) and later intraperitoneally injected with the vehicle (b, e) or the
PDE7 inhibitors, VP1.15 (c, f) or VP3.15 (d, g). Mice perfused 14 days post-injection (14 dpi) were treated
with two injections (b-d) while mice perfused 21 dpi received one more injection (e-f). (h) Histogram shows
the percentage of myelinated axons in the corpus callosum of control mice and mice whose corpus callosum
has been lesioned with LPC and sacrificed 14 dpi or 21 dpi. Some of these mice did not receive the
treatment (LPC), although they were injected with the vehicle, and the other ones were intraperitoneally
injected with PDE7 inhibitors VP1.15 (LPC+VP1.15) or VP3.15 (LPC+ VP3.15). The percentage of myelinated
axons was increased on mice treated with VP1.15 and those that received three injections of this inhibitor
(21 dpi) reached a percentage similar to that observed in control mice (non-lesioned). (i) Dot plot showing
the value of the G-ratio respect to the axon diameter of each measured fiber. The tendency lines show that
the G-ratio is lower in mice treated with PDE7 inhibitors (LPC+VP1.15 or LPC+VP3.15) respect to non-treated
(LPC), i.e. they have thicker myelin sheets, and their values are closer to that showed by control mice (non-
lesioned). (j) The plot represents the averages of the G-ratio for each mouse and the average for each group
showing an increase of myelin thickness (decrease of G-ratio) in mice treated with PDE7 inhibitors respect to
non-treated groups (LPC). The myelin thickness in treated mice approached but never reached the values of
G-ratio of control mice (CT) discarding a hypermyelination. The comparison of each group with control was
made using one-way ANOVA and Tukey’s post test (*p < 0.05) and treated groups were compared with
groups injected with the vehicle using a Student’s t test (or Mann–Whitney rank-sum test). Values are given
as mean ± SEM and the results of Student’s t test are represented as *p < 0.05, **p < 0.01, and ***p <
0.001.
Discussion
In the last few years, new methods for OPC isolation have been developed or adapted
from existing ones for the isolation of rat OPCs from cerebral cortex or optic nerve such as
shake-off, immunopanning, FACS, MACS or density gradient (McCarthy and de Vellis, 1980;
Szuchet and Yim, 1984; Behar et al., 1988; Gard and Pfeiffer., 1993; Shi et al., 1998; Mayer-
Proschel, 2001; Colello and Sato-Bigbee, 2001; Vitry et al., 2001; Dugas and Emery, 2013). This
adaptation has been necessary because of mice and rats show interspecific differences
regarding the antigen expression or their adhesion, proliferation or differentiation capability
(Fanarraga et al., 1995; Chen et al., 2007). Moreover, the need of OPC cultures from mice has
increased because of the development of transgenic and animal models in mice.
Both, new and adapted methods aim to improve the efficiency and purity of the
cultures. However, all of them mainly provide OPCs from embryonic or perinatal mice (Chew et
al., 2014), but the isolation of these cells from adult mice is not effective and it also results
essential as they can behave in a different way depending on their age (Brockes et al., 1980;
Wolswijk and Noble, 1989; Wolswijk et al., 1991; Wren et al., 1992; Marchionni et al., 1993;
Engel and Wolswijk, 1996; Canoll et al., 1996; Shi et al., 1998; Kessaris et al., 2006; Richardson
et al., 2006; Psachoulia et al., 2009; de Castro et al., 2013; Young et al., 2013). Recently, our
group have detected that the migratory response to the extracellular matrix protein, Anosmin-
1, is different depending on the age of mice from of which OPCs are obtained (Clemente et al.,
2011; Murcia-Belmonte et al., 2014, Bribián*, Medina-Rodríguez* et al., submitted).
The developed method introduces some modifications to previous protocols like the use
of papain for meniges disaggregation that allows to remove them more quickly, reducing cell
death, the adjust of conditions for each age and the addition of growth factors to the primary
150
mixed glial culture which facilitate their evolution, allowing the isolation of adult OPCs in 15-
25 days which express the same molecular markers as their embryonic or perinatal
counterparts (NG2, A2B5, PDGFRα; Raff et al., 1983; Hart et al., 1989; Pringle et al., 1992;
Richardson et al., 2011) and the oligodendroglial marker Olig2 (FIGURE 2, 3) and they are
viable and able to differentiate and to form oligodendrocytes (FIGURE 4). The viability of the
cells obtained with the newly developed method has been corroborated in other studies of our
group making chemotaxis assays (Clemente et al., 2011). The new protocol allows us to obtain
similar numbers of OPCs from neonatal mice to others previous protocols such as the
oligodendrocyte selection kits (Pesheva WO/2006/067094 A1) or MACS (Dincman et al., 2012).
However, although the number of OPCs obtained decreases with age (TABLE 4), when adult
OPCs are isolated the efficiency of this new method is 7-10 times higher than that of FACS or
the oligodendrocyte selection kit and it is also 30 times higher than that of described for the
isolation by immunopanning from adult rat optic nerve (Shi et al., 1998; TABLE 5), involving a
reduction of the number of animals used, the spent time and the cost. In addition to the
interspecific and age-dependent differences already mentioned, this protocol has showed
strain-dependent differences in mouse in respect to the number of OPCs obtained from adult
individuals. The higher efficiency was obtained from CD1 mice (FIGURE 5). It is not the first
time that differences between different mouse strains have been showed. For example, it is
known that the C57/BL6 and BALB/cJ strains differ in the cortical demyelination on the
cuprizone model. The cerebral cortex of C57/BL6 is fully demyelinated after 6 week of
cuprizone feeding, while in BALB/cJ the demyelination observed in the same time is partial.
Moreover, there is an accumulation of microglial cells in the cortex of BALB/cJ mice which is
not observed on C57/BL6 mice (Skripuletz et al., 2008). It is also known that the number of
TNF-producing microglia-macrophages present in the brain after an ischemic injury also differs
between strains. BALB/c mice, which develop larger infarcted areas, show a lower number of
these cells than the SJL or C57/BL6 mice (Lambertsen et al., 2002).
Nevertheless, the most important part of this protocol is that, with slight adjustments, it
also allows the isolation of adult human OPCs, which involves a breakthrough. The progression
of perinatal OPCs from mice is not the same as from humans (Dean et al., 2011; Barateiro and
Fernandes, 2014) and very little is known about adult human OPCs, which can show
differences respect to their homologues in mouse (Chen et al., 2007). In fact, the
transcriptional profile of neonatal and adult human OPCs is different (Othman et al., 2011).
The new protocol will allow the study of its behaviour and the comparison with previous
results in mice.
Nowadays, there are very few publications isolating OPCs from adult human cerebral
cortex which permit to compare their efficiency with that of our new protocol. A published
study suggests that only 1% of the isolated cells were A2B5+ and most of the cells were mature
oligodendrocytes (Targett et al., 1996). There are more studies isolating cortical OPCs also by
A2B5 selection (Cui et al., 2010, 2013), however, the OPC identification just by A2B5 is not
specific enough because A2B5 staining can be seen in neurons, astrocytes or oligodendrocytes
in the adult human CNS (Satoh and Kim, 1995; Zhang, 2001). Another work, isolating NG2+ cells
from subcortical white matter, had shown a low percentage of OPCs too (16%) and a majority
of mature oligodendrocytes (84%; Othman et al., 2011). Another group has been able to
isolate A2B5+PSA-NCAM– cells from adult human cortex by FACS, but this selection is not
Summary 151
totally specific neither (Windrem et al., 2004), as a current study using O4 and A2B5 selection
by FACS for adult human OPC isolation (Leong et al., 2014). Neither shows efficiency and
purity data which allow us to compare with our results and, anyway, we could say that our
work characterizes the OPCs in a more selective manner than all these examples.
Our protocol permits to obtain OPC cultures from human biopsies expressing not only
A2B5 but also NG2, PDGFRα and Olig 2 (FIGURE 6, 8), with a purity of 70% and in a large
number compared with that obtained from C57/BL6 adult mice, although it is lower than the
obtained from CD1 mice (FIGURE 8). Curiously, the number of OPCs obtained from tumour
resection margins, although they did not proceed from the tumour itself, was much higher
than the number obtained from non tumoral samples (FIGURE 8). These tumoural cells showed
a higher proliferation rate, which made us to discard them for the rest of the experiments, in
order to avoid the possibility that these cells were altered, thus margins of tumours are usually
difficult to determinate (Shinoura et al., 2005; Price and Gillard, 2011; Fillon, 2013). OPCs
obtained from non tumoural samples were, as mouse OPCs, viable and able to mature and to
form oligodendrocytes (FIGURE7).
Therefore, the newly generated protocol allows the isolation of adult OPCs from mice
and humans in sufficient numbers to carry out cellular studies which allow us to know more
about their biology and give us an idea of how we could potentiate certain behaviours of adult
endogenous OPCs or to propose cell therapies aimed to repair the damage in diseases such as
MS.
In the case of human OPCs, those derived from human embryonic stem cells (hESC-
OPCs) or those from human induced pluripotent stem cells (hiPSC-OPCs) seemed to be an
alternative source for these cell therapies (Keirstead et al., 2005; Izrael et al., 2007; Hu et al.,
2009; Sundberg et al., 2010; Najm et al., 2013; Wang et al., 2013; Yang et al., 2013). Indeed,
these cells represent a promising therapeutic option because they have been able to restore
the locomotor function and to enhance the myelination in rats with spinal cord injury
(Keirstead et al., 2005), as well as restoring myelination in the hypomyelinated shiverer mouse
brain (Izrael et al., 2007; Najm et al., 2013; Wang et al., 2013; Yang et al., 2013). However, in
preclinical trials using hESC-OPCs, non-proliferative epithelial cysts occasionally appeared that
were confined to the injury site (Keirstead et al., 2005). Moreover, experimental data suggests
that the differentiation of enough numbers of oligodendrocytes for transplantation from
hiPSCs or hESCs is difficult (Duncan, 2005) and it can carry ethic problems, overall by the
controversy aroused by the use of human embryos, and technical problems, because the use
of these kind of cells can trigger cysts and tumours formation. Furthermore, the
transplantation of more differentiated cells will not necessarily produce a pool of stem cells
with the capacity to continually supply newly differentiating cells if the transplanted cells die.
Also this type of cell graft may also be subject to immune rejection (Gruen and Grabel, 2006;
Noble et al., 2013). Such problems could be avoided by using endogenous OPCs that could be
isolated using the protocol presented here. Moreover, this new protocol will allow the analysis
of the effects of the current treatments for MS such as Natalizumab or Fingolimod (Gilenya®)
on adult human OPCs, because until today, they have been studied just on human foetal OPCs
(Miron et al., 2008). Furthermore, this new protocol will allow to look for new treatments
which could favour remyelination joined to immunossuppresion and to facilitate the search for
152
alternative therapeutic treatments for demyelinating diseases, advancing their testing in

clinical trials by potentiating them as endogenous OPCs or by using these cells in cell therapy,
avoiding the ethical implications of using hESCs or hiPSCs. Thus, our protocol will undoubtedly
contribute to improve the understanding of the molecular and cellular mechanisms involved in
demyelinating diseases and to advance in the search of potential treatments for MS.
After the development of the protocol, which has allowed the isolation of viable adult
mice and human OPCs, different studies were started with drugs that could favour the survival
of these cells and their maturation to form myelinating oligodendrocytes able to induce an
effective remyelination in MS.
PDE7 inhibitors have a neuroprotective effect and they favour the diminution of the
immune response in vitro and in vivo in animal models of spinal cord injury, stroke, Parkinson´s
and Alzheimer´s diseases and MS (Castaño et al., 2009; Morales-García et al., 2011; Paterniti et
al., 2011; Redondo et al., 2012a,b,c; Pérez-González et al., 2013; González-García et al., 2013)
but their effects on oligodendrocytes and remyelination, the other problem of MS, remain
unknown.
PDE7 expression varies between species and for this reason it is necessary to localize it
in OPCs from both species, mice and humans (Michaeli et al., 1993; Han et al., 1997; Hetman
et al., 2000; Gardner et al., 2000; Miró et al., 2001; Pérez-Torres et al., 2003; Smith et al., 2003;
Reyes-Irisarri et al., 2005; Johansson et al., 2012). Regarding to its expression on CNS cells it
has been demonstrated the expression of several PDEs in neural populations, including PDE3,
4, 7 and 9 (van Staveren et al., 2002; Reyes-Irisarri et al., 2005; Castro et al., 2010; Nunes et al.,
2012) and PDE9 has been found on a astrocyte subpopulation (Susin et al., 2012). On myelin
forming cells, it has been just demonstrated the PDE4 expression on Schwann cells and
oligodendrocytes (Walikonis and Poduslo, 1998; Whitaker et al., 2008) and the PDE3
expression on OPCs (Mitome-Mishima et al., 2013). So, this is the first study demonstrating
that adult murine and human OPCs express PDE7 and therefore, they are susceptible of the
inhibition of this enzyme (FIGURE 9, 14)
In contrast to PDE3, which is also expressed by OPCs, PDE7 takes over of cAMP
degradation exclusively. The enhancement of intracellular levels of cAMP by PDEs inhibition
(such as PDE4) or by the addition of analogous, in addition to participate in the reduction of
the immune response, (Lonze and Ginty, 2002; Volakakis et al., 2010), blocks OPC proliferation
and enhances their differentiation (McMorris, 1983; Raible and McMorris, 1993; Afshari et al.,
2001; Clark et al., 2002). The results of the present study after inhibiting PDE7 in OPCs by
several molecules (BRL, commercial inhibitor, and TC3.6, VP1.15 or VP3.15, newly generated
inhibitors) are in agreement with those previous observations. It has been shown that the new
PDE7 inhibitors increase neonatal and postnatal OPC survival, without affecting their
proliferation, thus avoiding problems by tumour formation in the case of their use in clinical
assays (FIGURE 10, 15). There are a lot of molecules which take part on these processes such
as the T3 hormone which seems essential on OPC survival, proliferation and maturation (Jones
et al., 2003), the neurotrophic molecules segregated by the endothelial cells of the brain, such
as FGF2 and BDNF, which form the “oligovascular niche” and also protect to these precursors
(Arai and Lo, 2009) or antibiotics such as minocycline which protects them in oxidative stress
Summary 153
conditions (Schmitz et al., 2012). The increase of survival observed with PDE7 inhibition by
TC3.6 or VP1.15 in this work (20-40%) outgoes those described by minocycline (10 %
approximately; Schmitz et al., 2012) and it is similar to that produced by the “oligovascular
niche” molecules (Arai and Lo, 2009). Moreover, it has been shown that PDE7 inhibition also
induces OPC maturation both in mice (FIGURE 11, 12) and adult humans (FIGURE 14, 16). As
mentioned above, there are many molecules involved in OPC differentiation, but few of them
have been tested on human OPCs. On foetal human OPCs it is known, for example, that the
cytokine CXCL1 promotes foetal human OPC proliferation but it does not affect their
maturation (Filipovic and Zecevic, 2008), the protein Gas6 (growth-arrest specific protein 6)
enhances the survival and differentiation of these cells (O'Guin et al., 2014) and Fingolimod
decreases their differentiation rate (Miron et al., 2008). However, as far as we know, there are
few studies demonstrating the differentiation and myelination capability of adult human OPCs.
In vitro, it has been observed that these cells, in response to different combinations of growth
factors (BDNF, IGF-1, PDGF-AA, FGF2), extend their processes and enhance the number of
contacts with the axons, in co-cultures with dorsal root ganglion neurons (DRG; Cui et a.,
2010), and they have the ability to myelinate when they are transplanted ex vivo and in vivo
(Windrem et al., 2004; Leong et al., 2014). The present study is the first one that have shown
the behaviour of these adult human cells in response to PDE7 inhibition and this behaviour
corresponds to that observed on mice. These results lead us to believe that PDE7 activity is
conserved between both species and the results could be extrapolated between mice and
humans.
The implication of ERK pathway activation in the effects observed by PDE7 inhibition has
been showed in the present work (FIGURE 13) and, since the OPCs from P0 and P15 mice
showed the same response regarding ERK activation, we could suggest that the mechanism of
action of PDE7 inhibition on OPCs is conserved with age. Previous data have demonstrated the
involvement of ERK pathway on the output of the proliferative process and on the
differentiation and myelination stimulation (Joubert et al., 2010; Xiao et al., 2012; Ishii et al.,
2013) and it has been even showed the implication of the ERK pathway on the effect carried
out by other PDEs, such as PDE4. It is known that Rolipram, a PDE4 inhibitor, promotes
remyelination in the cuprizone model by MEK-ERK pathway (Sun et al., 2012). Nevertheless, it
is striking that the highest rate of ERK activation was seen with BRL which did not exert any
effects on OPC survival or differentiation, indicating the implication of others proteins or a
negative feedback.
PKA enzyme is also implicated on PDE7 inhibition as results showed. When PKA was
inhibited, by a cAMP antagonist, we could see how the effects exerted by PDE7 inhibition on
OPC differentiation disappeared (FIGURE 13). This implication was as expected given that PKA
is the main target of cAMP and it was known that other inhibitors of both PDE4 and PDE7 act
through this protein (Morales-García et al., 2011). One of the main mechanisms of PKA action
is going into the nucleus and activating CREB. CREB activation has also been checked when
PDE7 was inhibited with these inhibitors (FIGURE 13) and it is in accordance with previous
observations using other PDE7 inhibitors (Morales-García et al., 2011). Once again, BRL
showed a stronger activation of this protein confirming the implication of other pathways.
cAMP can also act through Epac/PKC pathway. Depending on its relative abundance, cAMP can
participate in one way or another independently, synergistically or oppositely, in order to
154
regulate a specific function (Cheng et al., 2008). For example, it is known that Epac activity
instead PKA is required for Schwann cells differentiation and myelin formation (Bacallao and
Monje, 2013). Epac has no effect on CREB activation and reduces those PKA-mediated (Garay
et al., 2010). One possibility is that TC3.6 and VP1.15 act through Epac pathway moreover PKA
pathway and it was for that, levels of CREB activation was not as higher as the produced by
BRL, which could act mainly activating the PKA pathway, inducing a higher activation of CREB.
In order to ascertain the pathways activated by PDE7 inhibition, a deeper study would be
required, investigating the implication of other pathways such as Epac/PKC, given that this
study is not the first showing a differential effect of BRL compared with those produced by
other inhibitors. For example, it is known that BRL is not able to prevent the development of
EAE in mice, unlike TC3.6, which is as efficient as Rolipram (PDE4 inhibitor) in this aspect
(González-García et al., 2013). Another aspect to consider for explaining that question is that,
although the IC50 value is similar for TC3.6, VP1.15 and BRL, the chemical structure is very
different and that could lead to different pharmacokinetic properties, such as the ability to
penetrate the cell or to cross the blood brain barrier (González-García et al., 2013).
In addition to these differences regarding to the intracellular signalling, VP1.15 and

VP3.15 showed, as a rule, a stronger effect on OPC differentiation than TC3.6, even having it
a lower IC50. Again, the molecular structure, their pharmacokinetic properties and the
intracellular pathways implicated could be the resposibles of these differences. It is known
that VP1.15 and VP3.15 also inhibit GSK-3 and, for that reason, it was thought that this dual
inhibition could potentiate the effect on differentiation. Other studies support these
differences, while VP1.15 and VP3.15 are also more efficient in the decrease of the
inflammation measured by nitrites reduction after the addition of LPS to glial cultures
(Morales-García et al., 2014). By using a GSK-3 inhibitor (TDZD8), the effect of GSK-3 inhibition
itself on OPC proliferation or differentiation was discarded, but not on their survival (FIGURE
15). Nevertheless, GSK-3 inhibition with other molecules and in a higher concentration (ARA-
014418; 20 µM and LiCl; 30 mM), promotes OPCs differentiation in rat and mouse optic nerve
(Azim and Butt, 2011). It cannot be ruled out, therefore, that in combination with PDE7
inhibition, GSK-3 inhibition could help to OPC differentiation.
The beneficial results on OPC survival and, overall, on their differentiation, especially
which were carried out by VP1.15 and VP3.15, are very important since not only have been
seen in mice at different ages but also on adult human OPCs. Therefore VP1.15 and VP3.15
deserve to be considered for subsequent ex vivo and in vivo studies that allow us to verify
whether this improvement in survival and differentiation into myelinating oligodendrocytes
translates into more effective remyelination. That could make these inhibitors take hold in the
approach to clinical trials, especially VP3.15 whose improved pharmacodynamic characteristics
compared to VP1.15 make it a good candidate for being considered as a therapeutic agent
(Redondo et al., 2012b).
PDE7 inhibitors selected for subsequent remyelination studies on cerebellar slices

injured by LPC (VP1.15 and VP3.15), showed a positive effect after 3 days of treatment,
increasing the myelination index. On the other hand, GSK-3 inhibition itself through TDZD8 did
not show a significant effect either (FIGURE 17), although in a previous study it has been
showed an improvement of remyelination in vivo in the LPC demyelination model treated with
Summary 155
ARA-014418 or LiCl much more concentrated (Azim and Butt, 2011). The increase on
remyelination observed here, is very sharp and very fast, especially in the case of VP1.15. We
can compare our results with a similar study performed with Fingolimod (Miron et al., 2010),
which is one of the few drugs accepted for the treatment of MS. That work showed that
Fingolimod promotes remyelination on cerebellar slices injured by LPC but it takes 14 days to
reach similar levels of remyelination those observed in the present work just 3 days after the
addition of PDE7 inhibitors (at the same concentration). This stronger effect could involve a
decrease of the dose used.
With so promising results the remyelination study in vivo was raised. Demyelination
was induced by LPC in mice, which allows the focused study of remyelination in response to
drugs. Demyelination starts few hours after LPC injection, increases up to 7-10 days and then a
slow spontaneous remyelination begins which is completed after 4 weeks, allowing us to study
the effects of the drugs on remyelination during this time frame, with little involvement of the
immune system. Although certain macrophage infiltration and microglia activation appears, T-
cell involvement is minimal (Waxman et al., 1979; Imai et al., 2008). The results of the present
study showed an increase on the percentage of myelinated axons and the myelin thickness
after the treatment with PDE7 inhibitors VP1.15 and VP3.15. Therefore, a becoming effect on
remyelination was observed, in accordance to the effects observed in vitro and ex vivo, which
resembles the corpus callosum of normal mice, without hypermyelination in any case (FIGURE
18). That is important because other works have showed a disproportioned myelin thickness
related to axon diameter when the transgenic mouse CnpCre;MekDD, which shows a
constitutive activation of ERK pathway on Schwann cells and oligodendrocytes, was studied
(Ishii et al., 2013). In the present study, as we said before, this undesirable hypermyelination
was not observed, although, as we have seen previously, ERK pathway was activated in
response to PDE7 inhibition. That could be because the activation of ERK was not made so
hard, allowing the differentiation but not in a disproportioned way, because it is also known
that ERK signaling is essential for myelination and it fails in ERK knockout mice on OPCs and
oligodendrocytes. ERK signaling has been also showed to be essential in myelin maintenance
and axonal integrity in the adult CNS of a conditioned transgenic mouse wherein ERK ablation
can be induced on oligodendrocytes by tamoxifen (Ishii et al., 2012, 2014).
The importance of the enhance on remyelination observed is that currently, despite the
many studies on the subject, treatments for MS, just manage to reduce the immune response
but they do not produce an effective repair of CNS lesions. As mentioned, Fingolimod has
showed a remyelinating effect ex vivo (Miron et al., 2008, 2010; Kim et al., 2011; Sheridan and
Dev, 2012; Kipp and Amor, 2012). However, this effect is not clear because other studies in
vivo contradict it, showing that the treatment with Fingolimod does not affect to remyelination
after demyelination by cuprizone or LPC on the rat spinal cord (Kim et al., 2011; Hu et al.,
2011) and it is not enough to prevent secondary progressive neurodegeneration in the EAE
model (Al-Izki et al., 2011). On the other hand, the becoming effects of another treatment, the
glatiramer acetate (Copaxone®), are also being studied showing an increase on remyelination
28 days after demyelination by LPC in the spinal cord, later than our PDE7 inhibitors did
(FIGURE 18; Aharoni et al., 2008; Skihar et al., 2009; Kipp et al., 2012; Aharoni, 2014). In
addition to these studies to see if existing treatments promote remyelination, the search of
agents for the treatment of this disease, acting at both immune and nervous system,
156
continues. Currently, there are some clinical trials with drugs whose preclinical potential has
been demonstrated such as the monoclonal antibody BIIB033 directed to block LINGO-1,
whose effects on oligodendrocyte differentiation and remyelination has been showed in the
EAE animal model (Mi et al., 2013; Tran et al., 2014).
Although these treatments used to be well tolerated, they can induce side effects as
chest pressure, palpitations, dyspnoea and anxiety, in the case of glatiramer acetate,
diarrhoea, bradycardia, dizziness, vomiting, weakness, fever and respiratory distress, in the
case of Fingolimod, and headache, respiratory and urinary tracts infection, nasopharyngitis
and gastroenteritis, in the case of LINGO-1 inhibitor, which require a patient monitoring
(Behjati et al., 2014; Tran et al., 2014). However, PDEs inhibitors are harmless molecules which
are present in substances commonly consumed such as coffee, tea, cocoa, cola or energy
drinks, as already stated, and they are also taking a great importance, in the last years, as
agents which reduce the immune response and promote remyelination. Regarding to PDEs
inhibition it is known that Ibudilast, for example, which is a non selective inhibitor of this
family, blocking mainly PDE3A, PDE4, PDE10 and PDE11 (Gibson et al., 2006), shows
neuroprotective effects in MS patients, possibly by regulating the Th1/Th2 cytokines balance
(Barkhof et al., 2010). Rolipram, a PDE4 inhibitor, has shown beneficial effects regarding to the
inflammation and symptoms in the EAE model on mice, rat and non human primates (Genain
et al., 1995; Folcik et al., 1999; Martínez et al., 1999; González-García et al., 2013) and, on the
same model, it reduces the axonal loss and demyelination (Paintlia et al., 2008). Recently, it
has been shown that Rolipram promotes OPC maturation and remyelination both, ex vivo on
organotypic cerebellar cultures demyelinated by LPC, and in vivo in the cuprizone and ethidium
bromide demyelination models (Sun et al., 2012; Syed et al., 2013). However, when both
inhibitors have been tested in clinical trials, side effects such as gastrointestinal pain, nausea or
vomiting have been observed (Bielekova et al., 2009; Barkhof et al., 2010).
In the search of alternative PDE inhibitors that can avoid these side effects PDE7
inhibitors are being studied. Some of the inhibitors used in the present work (BRL, TC3.6 and
VP1.15) have showed no emetic effects, a great advantage respect to PDE4 inhibitors (García
et al., 2014). Moreover, their immunomodulatory and neuroprotective effect has been seen in
a large number of animal models such as spinal cord injury, stroke, Parkinson´s and
Alzheimer´s diseases or MS (Morales-García et al., 2011; Paterniti et al., 2011; Redondo et al.,
2012a,b,c Pérez-González et al., 2013; González-García et al., 2013) but there is no study
showing their effect on remyelination. The results of the present study show for the first time
its beneficial effects on this process (ex vivo and in vivo).
Therefore, PDE7 inhibitors used in this study (VP3.15 and VP1.15) had previously shown
an immunomodulatory effect in spinal cord injury models and EAE, showing on the latter an
attenuation of symptoms (Paterniti et al, 2011; Redondo et al., 2012a,b). Moreover, as we said
above, they do not induce emetic effects (García et al., 2014). Now, in the present study, they
have shown to promote OPC survival, maturation and an effective remyelination in two
demyelination models. Therefore, we could propose them as candidates with great potential
for the treatment of MS and, although it could be necessary to deepen in preclinical studies
with these inhibitors, these findings should open the door to their possible inclusion in clinical
trials as treatments that eventually could benefit MS patients, not only reducing symptoms but
Summary 157
also repairing CNS lesions, especially the improved VP3.15 with pharmacodynamic
characteristics which make it particularly interesting as a drug.
Conclusions
1. The newly designed protocol to isolate adult oligodendrocyte precursor cells

from mice cerebral cortex allows to obtain a great number of cells with a high purity, beating
the efficiency of other methods such as FACS, immunopanning or oligodendrocyte selection
commercial kit.
2. The number of oligodendrocyte precursor cells obtained decreases with age in

mice and it is strain-dependent, obtaining the greater efficiency with CD1 mice.
3. Oligodendrocyte precursors obtained by this new method are viable and able
to differentiate into mature myelinating oligodendrocytes and this allows to study the biology
of this kind of cells.
4. Our new protocol allows the isolation of oligodendrocyte precursor cells from
adult human cerebral cortex (from different types of neurosurgery), with a high efficiency.
5. The purity of oligodendrocyte precursor cultures from adult human samples is

similar to that obtained from adult mice; while the efficiency is lower to that reached with CD1
mice, it is similar or even higher to that obtained with C57/BL6 mice.
6. The human oligodendrocyte precursors obtained were viable to be studied in

vitro and able to differentiate into mature oligodendrocytes. This allows a comparative study
between mice and human OPC behavior, and would represent a great step forward for their
use as cell therapy to effectively remyelinate lesions in Multiple Sclerosis and other
demyelinating diseases.
7. All oligodendrocyte precursor cells from both mice and humans, express the
enzyme phosphodiesterase-7, whose inhibitors, which induce an enhancement of cAMP
intracellular levels, are reaching a great importance in the last years as drugs that reduce the
immune response and could favour remyelination.
8. Newly-synthesized phosphodiesterase-7 inhibitors used in this study (TC3.6,

VP1.15 and VP3.15) favor neonatal and adult oligodendrocyte precursors survival and their
differentiation into mature oligodendrocytes, and they do it stronger than the commercial
inhibitor more studied until now (BRL) and without affecting the proliferation of the cells. The
greatest effects on the OPC differentiation into mature phenotypes were observed with
VP1.15 and VP3.15.
9. ERK and PKA/CREB signaling pathways are implicated in the mechanism of

action of phosphodiesterase-7 inhibitors.
158
10. Adult human oligodendrocyte precursors, as those in mice, also show an

increase of differentiation into oligodendrocytes in response to phosphodiesterase-7
inhibition, an important fact because it evidences the potential of this inhibition as drugs for
being used as therapeutic agents for demyelinating diseases and because a conserved process
between both species is suggested, which facilitates the pharmacological studies.
11. Phosphodiesterase-7 inhibition by VP1.15 and VP3.15 favor remyelination on

organotypic cerebellar cultures demyelinated by LPC.
12. In vivo remyelination on the LPC demyelinating model in the mouse is also
potentiated by phosphodiesterase-7 inhibitors: the treatment with VP1.15 and VP3.15 after
demyelination increases the percentage of myelinated axons and the thickness of myelin
sheaths, with values that practically reach those observed in the corpus callosum of normal
mice.
13. The remyelinating potential of phosphodiesterase-7 inhibition observed in

vitro and corroborated in vivo, joined to the effect on the attenuation of the immune response
previously shown, their pharmacodynamic characteristics and the lack of side effects induced
by phosphodiesterase-4 inhibition, make this approach a potential therapy for Multiple
Sclerosis. Phosphodiesterase-7 inhibitors not only reduce the symptoms of the disease but
they are also able to regenerate the damaged tissue due to demyelination.
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Fisiología de los precursores de

oligodendrocitos murinos y humanos

Eva María Medina-Rodríguez

Fisiología de los precursores de

Universidad de Castilla la Mancha

Eva María Medina-Rodríguez

CERTIFICAN que el presente trabajo, titulado “Fisiología de los precursores de

Para que así conste, lo firmamos en Toledo a 11 de Mayo de 2015.

Fdo.: Fernando de Castro Soubriet. Fdo.: Ana Bribián Arruego.

“Imagina si no lo hubiera intentado…”

En primer lugar, a Fernando de Castro y Ana Bribián, al primero por confiar en mí y

Espero no dejarme a nadie pero, por si acaso, ¡¡¡¡gracias a todos!!!!

1. Los oligodendrocitos y el linaje oligodendroglial 3

2. Los precursores de oligodendrocitos en el adulto 6

3. La Esclerosis Múltiple como paradigma de las enfermedades desmielinzantes 9

4.1. Métodos para el estudio de los precursores de oligodendrocitos y la

4.2. Factores involucrados en la remielinización 20

5. El AMPc y su implicación en la diferenciación de los precursores de

6. Las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos y sus inhibidores 27

7. Características y antecedentes de los inhibidores de fosfodiesterasa-7 34

3. Aislamiento de precursores de oligodendrocitos de corteza cerebral de ratón a

5. Inhibidores de fosfodiesterasa-7 utilizados 47

7. Ensayos de proliferación de precursores de oligodendrocitos 48

8. Estudios de diferenciación de precursores de oligodendrocitos 48

9. Estudio de la señalización intracelular en cultivos primarios de precursores de

11. Inmunohistoquímica y toma de imágenes 50

12. Desmielinización in vivo por inyección de lisolecitina en el cuerpo calloso y

13. Procesamiento del tejido para microscopía electrónica de transmisión 51

14. Toma y análisis de imágenes 52

15. Análisis estadístico 52

1. Desarrollo de un método mejorado para el aislamiento de precursores de

1.1. Mejoras introducidas en el protocolo previamente descrito 55

1.2. Caracterización de los precursores de oligodendrocitos murinos aislados 57

1.3. Eficacia del nuevo protocolo descrito 58

1.4. Influencia de la estirpe en el rendimiento del proceso de aislamiento 61

1.5. Viabilidad y capacidad de diferenciación de los precursores de

1.6. Aislamiento y caracterización de precursores de oligodendrocitos de corteza

1.7. Eficacia del método en el aislamiento de precursores de oligodendrocitos

1.8. Estudio de la viabilidad y capacidad de diferenciación de los precursores de

2. Análisis de la expresión de la enzima fosfodiesterasa-7 y de los efectos de su

2.1. Expresión de la fosfodiesterasa-7 en precursores de oligodendrocitos murinos 65

2.2. Efectos de la inhibición de la fosfodiesterasa-7 sobre la supervivencia y la

2.3. Efectos de la inhibición de la fosfodiesterasa-7 sobre la diferenciación de

2.4. Vías intracelulares implicadas en la inhibición de la fosfodiesterasa-7 70

2.6. Diferenciación de los precursores de oligodendrocitos murinos y humanos en

3. Análisis de la inhibición de la fosfodiesterasa-7 en la remielinización 76

3.1. Estudio de la inhibición de la fosfodiesterasa-7 sobre la remielinización ex vivo 76

3.2. Efectos de la inhibición de la fosfodiesterasa-7 sobre la remielinización in vivo 76

1. El nuevo protocolo desarrollado permite aislar un mayor número de precursores de

2. La inhibición de la fosfodiesterasa-7 favorece la supervivencia y la diferenciación de

3. La inhibición de la fosfodiesterasa-7 favorece la remielinización in vitro e in vivo 89

El sistema nervioso central (SNC) adulto, por norma general, no es capaz de

En el presente trabajo se ha estudiado la influencia de diferentes moléculas sobre la

1. Los oligodendrocitos y el linaje oligodendroglial.

Los oligodendrocitos maduros capaces de producir dicha mielina se generan a partir de

Numerosos estudios han determinado la generación de OPCs durante el desarrollo

Después de su generación en lugares concretos del SNC, los OPCs migran y se

Los OPCs, se caracterizan por su morfología generalmente bipolar o con un árbol

característica de los OPCs la expresión en membrana de distintos marcadores, entre otros, el

La maduración de los oligodendrocitos se produce en roedores y humanos en

2. Los precursores de oligodendrocitos en el adulto

son menores y la respuesta a factores de crecimiento determinados puede variar (Brockes et

La función de estos OPCs adultos está estudiándose en profundidad pero aún no se ha

de sus circuitos y contribuyendo, de alguna manera, a la plasticidad neural, por ejemplo, en el