Sunteți pe pagina 1din 39

Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”

Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 1 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

Aprobată
la şedinţa Catedrei de Chimie farmaceutică şi toxicologică
Proces-verbal № _2_ din 28.09.2017_
Şef de catedră, dr. hab. şt. farm., profesor universitar
___________________ V.Valica

Metode fizico-chimice de dozare


în controlul medicamentelor

Indicaţie metodică la «Controlul medicamentelor» pentru studenţii anului V

Autorii: V.Valica, L.Uncu, T.Treapitîna, T.Ştefaneţ, E.Donici

CHIŞINĂU – 2017
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 2 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

INTRODUCERE
Determinarea cantitativă a conţinutului de substanţă activă într-o formă medicamentoasă
este o etapă extrem de importantă în controlul medicamentelor. Utilizarea metodelor fizico-
chimice în analiza şi controlul medicamentelor este foarte actuală, aceste metode fiind accesibile
exacte şi sensibile, permit determinarea cantitativă după partea activă a moleculei de substanţă,
pot fi automatizate şi nu sunt distructive.

Scopul. A se forma deprinderi practice pentru determinarea metodelor fizico-chimice de


dozare a medicamentelor conform exigenţelor contemporane.

Scopuri determinate
1. De a însuși principalele prevederi ale parametrilor de calitate folosind metodele fizico-
chimice de dozare a medicamentelor.
2. De a determina calitatea medicamentelor folosind metodele fizico-chimice de dozare a
medicamentelor în conformitate cu cerinţele DAN.

Planul lucrării de laborator


 Controlul şi corecţia însuşirii materialului după subiectele pentru pregătirea
individuală.
 Lucrul practic al studenţilor.
 Lucrul individual.
 Recapitulare.

Subiecte pentru pregătire individuală


1. Importanţa metodelor fizico-chimice în analiza farmaceutică.
2. Clasificarea metodelor fizico-chimice de analiză.
3. Exigenţele atribuite metodelor fizico-chimice în vederea utilizării lor pentru analiza formelor
farmaceutice.
4. Domeniile de aplicare a metodelor fizico-chimice de analiză.
5. Metode optice de analiză: Refractometria, Polarimetria, Interferometria,
6. Metode, bazate pe absorbţia radiaţiei electromagnetice (metode de absorbţie): colorimetria,
fotocolorimetria, spectrofotometria, fototurbidimetria, fotonefelometria.
7. Metode, bazate pe emisie de raze – spectrofotometria flăcării, spectrofluorimetria, metoda
radiochimică.
8. Metode magnetice. Rezonanţa magnetică nucleară (RMN) și spectrometria de masă.
9. Metode electrochimice. Potenţiometria, Polarografia.
10. Metode termice de analiză. Termogravimetria.
11. Metode de separare (cromatografia). Cromatografia cu schimb ionic, de absorbţie, de
repartiţie, de precipitare; cromatografia în coloană, pe strat subţire, pe hîrtie; cromatografia
de gaze, de lichide, gaz-lichidă.
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 3 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

12. Domenii de utilizare a metodelor fizico-chimice în controlul medicamentelor.

MATERIAL INFORMATIV
Cerinţele înalte faţă de calitatea medicamentelor în conformitate cu exigenţele
contemporane faţă de metodele de analiză şi control determină o direcţie aparte de valorificare a
unor metode de analiză, care corespund întocmai principalelor criterii ale analizei farmaceutice,
şi anume a metodelor fizico-chimice de analiză.
Particularităţile de bază a metodelor fizico-chimice de analiză sunt:
 Selectivitatea analizei;
 Express analiza;
 Automatizarea procedurii de determinare;
 Analiza de la distanţă;
 Analiza nedistructivă;
 Sensibilitate maximă;
 Specificitate înaltă.
De rînd cu posibilitatea utilizării metodelor fizico-chimice de analiză pentru identificare
şi determinarea purităţii, acestea capătă o utilizare mult mai largă în analiza cantitativă.
Metodele fizico-chimice utilizate în analiza farmaceutică pot fi clasificate în felul
următor:
I. Metode optice de analiză:
 Refractometria, bazată pe determinarea indicelul de refracţie a luminii în soluţia de
substanţă analizată;
 Polarimetria, bazată pe posibilitatea unei soluţii de substanţă cu atom de carbon chiralic
în moleculă de a roti planul unui flux de lumină polarizată.
 Interferometria, bazată pe măsurarea interferenţei luminii.
II. Metode, bazate pe absorbţia radiaţiei electromagnetice (metode de absorbţie):
 Colorimetria, bazată pe măsurarea vizuală a intensităţii luminii trecute prin soluţia
analizată;
 Fotocolorimetria, bazată pe determinarea intensităţii luminii cu ajutorul fotoelementelor;
 Spectrofotometria, bazată pe proprietatea substanţelor de a absorbi radiaţia
electromagnetică;
 Fototurbidimetria, bazată pe măsurarea intensităţii luminii absorbite de către o suspensie
microdispersă;
 Fotonefelometria, bazată pe măsurarea intensităţii luminii dispersate de particulele
substanţei analizate.
III. Metode, bazate pe emisie de raze:
 Spectrofotometria flăcării, bazată pe determinarea concentraţiei elementului în soluţie
după intensitatea radiaţiei caracteristice emise de flacără;
 Spectrofluorimetria, bazată pe măsurarea fuorescenţei în regiunea UV;
 Metoda radiochimică, bazată pe măsurarea radiaţiei β sau γ cu ajutorul spectrometrelor.
IV. Metode magnetice:
 Rezonanţa magnetică nucleară (RMN), bazată pe înregistrarea interacţiunilor spinului
nuclear cu un câmp magnetic;
 Spectrometria de masă, bazată pe fragmentarea moleculelor de substanţe organice sub
acţiunea unor energii mari.
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 4 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

V. Metode electrochimice:
 Potenţiometria, bazată pe măsurarea potenţialului dintre soluţia analizată şi electrodul
introdus în ea;
 Polarografia, bazată pe măsurarea puterii curentului electric apărut la electrooxidarea sau
electroreducerea substanţelor analizate.
VI. Metode termice de analiză:
 Termogravimetria, bazată pe măsurarea modificărilor masei substanţelor în funcţie de
temperatură sau de timp.
VII. Metode de separare (cromatografia):
Metodele cromatografice se bazează pe separarea substanţelor între două faze – mobilă şi
staţionară. Metodele cromatografice pot fi clasificate după:
o Mecanismul procesului de separare:
- Cu schimb ionic
- De absorbţie
- De repartiţie
- De precipitare
- De oxido-reducere;
o Tehnica procesului de cromatografiere:
- În coloană
- Pe strat subţire
- Pe hîrtie
- Capilară;
o Starea de agregare
- De gaze
- De lichide
- Gaz-lichidă

I. METODE OPTICE DE ANALIZĂ


Refractometria
Refractometria este o metodă optică nespectrală care se bazează pe determinarea indicelui
de refracţie n a unei raze de lumină care trece dintr-un mediu cu densitatea d1 într-un alt mediu
cu densitatea d2, diferită de d1 (dj ≠ d2).
Viteza de propagare a luminii în vid este egală cu c0 = 300.000 km/sec (sau 3 • 105 km/s).
La trecerea prin orice mediu transparent (aer, solvenţi, sticlă etc.), viteza de propagare a luminii
scade, dar rămâne totuşi de acelaşi ordin de mărime. Ca urmare, la intrarea unei raze de lumină,
care vine dintr-un mediu mai puţin dens, într-un mediu mai dens, are loc o modificare a direcţiei
de propagare a luminii cu un unghi „r", numit unghi de refracţie şi se apropie de normală (linia
punctată pe suprafaţa de separare a celor două medii), aşa cum se observă din figura 1. Această
abatere a razei de lumină incidenţă de la direcţia iniţială de propagare se datorează diferenţei
dintre vitezele luminii c1, în mediul mai puţin dens din care vine raza incidenţă şi c2 în mediul
mai dens în care intră raza de lumină. Prin urmare, în mediul mai dens (cu d 2), viteza c2 a luminii
este mai mică decât viteza c1 a razei incidente (c1 > c2).
La ieşirea razei de lumină din mediul mai dens (d 2) şi intrarea în mediul mai puţin dens
(d2), unghiul de refracţie se măreşte, raza depărtându-se de normală (figura 1b):
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 5 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

Figura 1. Refracţia unei raze de lumină la trecerea ei dintr-un mediu mai puţin dens într-unul
mai dens (a) şi invers (b)
În conformitate cu legile refracţiei, raza incidenţă, raza refractată şi normala se găsesc în
acelaşi plan, deci sunt coplanare.
Pentru evaluarea refracţiei se utilizează şi se calculează indicele de refracţie ,,n” care se
exprimă prin raportul dintre sinusurile unghiurilor de incidenţă şi de refracţie:
n = sini / sinr = c0 / c1
în care: c0 – viteza luminii în vid;
c1 – viteza luminii într-un mediu anumit.
Consideraţiile de mai sus sunt valabile numai pentru cazurile în care raza incidentă cade
oblic pe interfaţa dintre cele două medii. Dacă raza incidenţă cade perpendicular pe interfaţa de
separare dintre cele două medii, unghiurile de incidenţă şi de refracţie sunt egale cu zero, iar
raportul lor este de asemenea egal cu zero, fiind vorba deci de nedeterminare care nu oferă nici o
informaţie referitoare la indicele de refracţie. Mai mult chiar, indicele de refracţie nu se poate
determina nici pentru unghiuri foarte mici, de exemplu, pentru un unghi de incidenţă apropiat de
90°, i ≈ 90°, raza incidenţă intră în mediul mai dens aproape tangent la suprafaţa de separare a
celor două medii, ca în figura 2; în acest caz, unghiul de refracţie atinge o valoare maximă, se
notează cu r1 şi se numeşte „unghi limită". La unghiuri de incidenţă mai mari decît cele care
corespund unghiurilor limită de refracţie, raza incidenţă nu poate părăsi mediul mai dens şi nu
poate intra în mediul mai puţin dens, şi se reflectă în mediul mai dens la suprafaţa de separare a
celor două medii (deci revine în mediul mai dens), ca în figura 2 b.

Figura 2. Unghiul limită de refracţie (a), şi reflexia totală (b).


Pentru determinarea practică a indicelui de refracţie se utilizează refractometrul, pentru care
se dă, în figura 3, o schemă constructivă de principiu.
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 6 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

Figura 3. Schema de principiu a unui refractometru


Cel mai utilizat tip de refractometru este cel conceput de Abbe, numit „refractometru
Abbe", care poate fi utilizat în toate tipurile de măsurători. În figura 4 este prezentată o schemă
constructivă a acestui aparat, care trebuie să fie etalonat înaintea utilizării lui astfel:
- cu soluţii etalon cu indice de refracţie cunoscut, cum sunt toluenul, tetraclorura de
carbon, monobromnaftalina, nD =1,6588 sau apa pură cu nD=l,333;
- etalonarea trebuie să fie făcută pentru fiecare produs înscris în farmacopeie cu
etalonul dat în monografie;
- etalonarea se face de regulă cu o precizie aproape de a patra zecimală, de aceea
etalonarea este o operaţie esenţială;
- uneori este greu să se găsească un etalon (substanţă de referinţă), care să aibă indice
de refracţie apropiat de acela al substanţei de analizat;
- măsurătoarea propriu-zisă se face numai după curăţirea atentă (îngrijirea
minuţioasă) a prismei, utilizînd o ţesătură curată şi uscată (ex.: şifon), care poate fi umectată într-un
colţ cu o picătură de lichid potrivit; această ţesătură nu ti să lase scame pe prismă;
- trebuie să se ţină seama de faptul, că o curăţire incorectă şi insuficientă (inclusiv după
etalonare), ca şi reglajul defectuos al temperaturii, conduce la date experimentale false,
compromiţând analiza.

Figura 4. Refractometrul Abbe - schema constructivă


Pentru determinări cantitative se selectează intervalul dependenşelor liniare între
concentraţie şi indice de refracţie. În acest interval concentraţia X % se calculează conform
relaţiei:
n  n0
X% 
F
în care: n – indicele de refracţie a soluţiei analizate;
n0 – indicele de refracţie a solventului;
F – factor, care determină creşterea mărimii indicelui de refracţie la majorarea
concentraţiei cu 1%.
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 7 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

Polarimetria
Polarimetria este metoda bazată pe posibilitatea unei soluţii de substanţă cu atom de
carbon chiralic în moleculă de a roti planul unui flux de lumină polarizată. Ca exemplu al unui
compus cu un atom de carbon asimetric este acidul lactic (hidroxipropionic):

H3C OH
C
H COOH

Valoarea devierii planului de polarizare de la poziţia iniţială se exprimă în grade. Această


mărime este numită unghi de rotaţie (α). Compuşii cu atomi chiralici pot roti planul de
polarizare în stînga – se numesc levogiri (-) şi în dreapta – dextrogiri (+):

Pentru soluţii mărimea unghiului de rotaţie este dependentă de natura solventului,


concentraţia soluţiei şi lungimea cuvei cu soluţie. Pentru identificare şi determinarea purităţii se
utilizează valoarea puterii rotatorii specifice
[ ]20
D , măsurate la 20°С şi la lungimea de undă D a spectrului natriului. Mărimea [ ] D
20

pentru soluţii de substanţe se calculează conform relaţiei:


  100
[ ]20
D 
l C
în care α — unghiul de rotaţie măsurat la polarimetru, în grade; l — lungimea cuvei, în
decimetri; С — concentraţia soluţiei de substanţă (g/100 ml).
Conţinutul de substanţă optic activă în soluţie (în %) se calculează conform relaţiei:
 100
C
[ ]20
D l
Valoarea lui α se măsoară la polarimetre cu precizie de ±0,02°.

II. METODE, BAZATE PE ABSORBŢIA RADIAŢIEI ELECTROMAGNETICE


(METODE DE ABSORBŢIE)
Metodele de analiză bazate pe absorbţia radiaţiei electromagnetice de către atomii şi
moleculele substanţelor de analizat, cuprinde în sine o vastă grupă de metode optice, care au o
foarte largă întrebuinţare atît în întreprinderile de producţie cît şi în laboratoarele de cercetări
ştiinţifice.
Fotocolorimetria şi spectrofotometria, ca de obicei, sunt unite într-o singură grupă, numită
metode fotometrice de analiză.
Din metodele moleculare de absorbţie cea mai largă întrebuinţare o au cele fotometrice.
Turbidimetria şi nefelometria au o întrebuinţare mai puţin însemnată, de obicei numai în cazurile
cînd pentru substanţa de analizat nu se găsesc reagenţi fotometrici reuşiţi. Analiza fluorimetrică
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 8 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

deasemeni poseda o întrebuinţare limitată, reeşind din aceea că numai o puţină parte din
legăturile substanţei de analizat fluorescează cu o intensitate indestulătoare.
În dependenţă de aparatura folosită în ananliza fotometrică, deosebim, metoda
spectrofotometrică de analiză bazată pe absorbţia luminii monocromatice şi metoda
fotocolorimetrică de analiză bazate pe absorbţia luminii policromatice. Ambele metode au la
bază principiul de existenţă a unei dependenţe proporţionale, dintre absorbţia luminii şi
concentraţia substanţei de analizat.
Metodele fotocolorimetrice, care folosesc o aparatură simplistă, indestulează o exactitate
relativă de apreciere, ce reprezintă 1 – 3% abatere, des utilizată pentru determinarea concentraţiei
soluţiilor.
Pentru metodele spectrofotometrice se utilizează o aparatură mult mai complicată –
spectrofotometre, care permit determinarea compuşilor atît coloraţi, cît şi incolori, în spectrul de
absorbţie vizibil, UV şi IR. Metodele spectrofotometrice sunt caracterizate printr-o exactitate
înaltă (abaterile corespund 1 - 0,5%). Necătînd la dezvoltarea intensă şi a altor metode de
analiză, pînă în prezent metodele fotometrice au o largă şi efectivă întrebuinţare. Aceasta este
determinată de următoarele:
1. Existenţa diferitor metode fotometrice de analiza practic la toate elementele sistemului
periodic şi o numeroaselor substanţe de natură organică.
2. Posibilitatea folosirii aparaturii accesibile şi relativ ieftine pentru petrecerea metodelor
fotometrice cu o exactitate foarte înaltă.
3. Alegerea multitudinilor de metode şi metodici fotometrice ce permit determinarea
elementelor în intervalul de la 100 pînă la 10 -6%, incluzînd totodată şi analiza substanţelor cu un
înalt grad de puritate.
Orientările esenţiale a perfecţionării metodelor fotometrice de analiză de ultimă oră rămîn
aceleaşi: mărirea sensibilităţii, selectivităţii şi obţinerea rezultatelor cu o exactitate înaltă. O
atenţie deosebită, se atribuie automatizării complexelor spectrofotometrice dotate cu programe
computerizate ce permit expres de analizat şi determinat sistemele multicomponente şi disperse,
determinarea urmelor de substanţă, deşeurilor ş.a.
La etapa actuală în literatura de specialitate se evidenţiază 4 direcţii de bază referitoare la
metodele fotometrice:
- metrologia măsurării şi determinării fotometrice
- dezvoltarea metodelor fotometrice de extraţie expres cu o mare sensibilitate şi
selectivitate.
- Obţinerea diferitor tipuri de spectrofotometre dotate cu computatoare şi
microprocesoare ce permit automatizarea metodelor fotometrice şi mai larg de introdus în
practică, metodele precise şi selective spectrofotometrice.
- Obţinerea noilor tipuri de aparatură: spectrofotometre fotoacustice şi ulterior a
spectrofotometriei fotoacustice, care permite micşorarea intervalului de detecţie cu două măsuri.

1. Metode spectroscopice de absorbţie în ultraviolet şi vizibil


Metodele spectrale se bazează pe determinarea şi interpretarea spectrelor, constituite din
totalitatea frecvenţelor radiaţiilor simple, componente ale unei radiaţii electromagnetice
compuse, la trecerea ei printr-un instrument optic adecvat. Spectrele pot fi studiate în absorbţie
sau emisie.
Spectrele de absorbţie se obţin la trecerea unei radiaţii continue, provenită de la o sursă
luminoasă, prin substanţa de cercetat, care absoarbe din spectru linii sau benzi (absorbţie
selectivă) sau porţiuni mai mari (absorbţie continuă).
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 9 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

Spectrele de emisie se obţin numai dacă se aplică moleculei o anumită energie, sub
acţiunea căreia substanţele solide şi lichide în stare incandescentă emit spectre continue, iar
gazele incandescente, spectre discontinue. Atomii şi moleculele substanţelor pot absorbi o
cantitate de energie dependentă de structura şi de numărul moleculelor care interacţionează cu
radiaţia electromagnetică. Studiul acestor relaţii constituie obiectul spectroscopiei de absorbţie.
Acest studiu a fost valorificat în domeniul analizei medicamentelor, prin elaborarea unor metode
rapide, simple, specifice. şi sensibile de determinare calitativă şi cantitativă.
O radiaţie electromagnetică se caracterizează prin lungime de undă — A, frecvenţă — v
(numărul de A pe secundă), număr de undă v" (inversul lungimii de undă).
Lungimea de undă se exprimă în cm, Â, nm sau pim (factorii de transformare a unităţilor de
măsură sînt redaţi în tabelul 1).
Frecvenţa se exprimă prin numărul de unde pe unitatea de timp, în cicli/ sec (eps) ori hertzi
(Hz).
Numărul de undă se exprimă în cm-1. Spectrul electromagnetic al luminii albe este format din
totalitatea regiunilor spectrale indicate în tabelul 2. Domeniile spectrale de interes analitic sînt
redate în tabelul 3.

Figura 5. Spectrul electromagnetic al luminii

Tabelul 2 Simboluri şi termeni curent utilizaţi în spectrometrie


Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 10 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

Legea fundamentală a absorbţiei. La trecerea unui fascicul luminos printr-o substanţă,


intensitatea lui scade datorită absorbţiei, reflexiei şi difuziunii. în cazul când reflexia şi
difuziunea sînt neglijabile, cauza principală a scăderii intensităţii este absorbţia. Măsura
cantitativă a efectului produs de acest proces (absorbţie) este absorbanţa sau transmitanţă.
Absorbanta se determină plecând de la o altă mărime, intensitatea (I) radiaţiei incidente care a
traversat mediul respectiv (intensitatea radiaţiei transmise). Absorbanta depinde de natura
mediului, adică de compoziţia sa (K), de grosimea stratului străbătut (b) şi de numărul centrelor
absorbante (c = concentraţie), şi se defineşte prin expresia matematică a legii lui Lambert-Beer,
care leagă absorbanţa cu grosimea stratului substanţei ce absoarbe şi se exprima prin relaţia:
I / I 0  10  kb ;

I0
lg  kb ;
I
în care: I0 – intensitatea iradierii, ce cade pe subsatnţă;
I – intensitatea iradierii, ce a trecut prin substanţă;
b – grosimea stratului de substanţă în cm;
k – mărimea absorbanţei – mărime inversă acelei grosimi a stratului de substanţă,
trecând prin care fascicolul de iradiere slăbeşte de 10 ori.
Legea lui Beer, leagă absorbanţa de concentraţie substanţei ce absoarbe şi de obicei
se foloseşte pentru soluţii:
k = χC,
în care: C – concentraţia soluţiei
χ – mărimea absorbanţei soluţiei, concentraţia căreia este egală cu о
unitate.
De obicei în practica aceste două legi se folosesc combinate - legea Bougher-
Lambert-Beer:
I0
lg   C b
I
Mărimea lg I0/I poartă denumirea de absorbanşă şi se notează prin A.
Mărimea χ este о constantă fizica specifică pentru fiecare substanţă şi poate servi în
scop de determinare. Cunoaşterea mărimii se permite determinarea conţinutului
substanţei date în soluţii cu concentraţia necunoscută pe baza determinării absorbanţei.
O constantă spectrofotometrică este mărimea absorbţiei specifice ( A1cm 1%
), care se
calculează conform relaţiei:
A
A11cm
%

C l

Absorbţia specifică 1%
A1cm prezintă mărimea
absorbanţei soluţiei cu concentraţia 1% măsurată într-o cuvă
cu grosimea 1 cm. Această valoare se calculează în urma
determinării experimentale a absorbanţei unei soluţii
standarde.
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 11 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

Cunoscând valoarea lui A1cm 1%


poate fi calculată concentraţia:
A
C  1%
A1cm  l
Legea Bougher-Lambert-Beer este veridică numai pentru iradierea monocromatică de aceia se
foloseşte strict în spectrofotometrie.
Spectrofotometria se foloseşte pentru identificarea compusilor, cercetarea componenţei,
structurii şi analize cantitative a substanţelor individuale şi sistemelor policomponente. Curba
dependenţei absorbanţei de lungimea de undă se numeşte spectru de absorbţie a substanţei şi este о
caracteristica specifica a substanţei date.
Natura benzilor de absorbţie în regiunea ultravioletă şi vizibilă a spectrului este legată de
diferite transferuri (treceri) electronice în moleculele şi ionii ce absorb (spectre electronice); în
regiunea infraroşie este legată cu treceri vibraţionale şi schimbarea stărilor vibraţionale a
nucleelor, ce intră în moleculele substanţei ce absoarbe (spectre armonioase).
Analiza spectrofotometrică după determinarea absorbanţei poate fi efectuată pentru substanţe
ce posedă anumite particularităţi structurale (compuşi cromatici, compuşi cu legături duble,
compuşi a unui şir de metale, etc.). Unele substanţe analizate trebuie preventiv de transformat în
compuşi, ce absorb radiaţia.
În unele cazuri chiar cînd folosim iradiere monocromatică pot fi observate devieri de la
legea Bougher-Lambert-Beer ce se datorează proceselor de disociere, asocierea şi formarea
complexonilor. La prezenţa de astfel de devieri trebuie să ne folosim de dependenţa experimentală a
absorbanţei de concentrate. Într-un şir de cazuri pentru identificare şi determinare cantitativă a
substanţelor prin metoda spectrofotometrică se cere compararea cu exemplare chimice standarde.

2. Fotocolorimetria
Fotocolorimetria se deosebeşte de spectrofotometrie prin faptul, că substanţa analizată
este trecută sub acţiunea diferitor reagenţi într-o forma colorată (obţinerea unui compus colorat
în urma unei reacţii chimice). Determinarea absorbanţei se realizează la fotocolorimetre.
Conţinutul cantitativ de substanţă poate fi determinat în baza unei curbe de calibrare, construite
pentru o soluţie standard de substanţă, sau după formulă, ţinînd cont de relaţia:
C x Ax Ax  Cst
 din care Cx 
C st Ast Ast
Metoda spectrofotometrică şi fotocolorimetrică diferenţiată se bazează pe determinarea
absorbanţei soluţiei analizate în raport cu o soluţie de referinţă cu conţinut anumit de substanţă
standard, ceea ce majorează exactitatea şi specificitatea metodei.
Spectrofotometria derivată este o varetate a spectrofotometriei diferenţiate. Dacă în
spectrofotometria diferenţiată se utilizează diferenţa absorbanţelor la aceiaşi lungime de undă, în
spectrofotometria derivată se măsoară absorbanţa la două lungimi de undă diferite. Această
variaţie permite selectarea unor benzi de absorbţie individuale în regiunea UV, care se prezntă
sub forma unor benzi sumare suprapuse, care nu au un maxim bine pronunţat. Astfel pot fi
identificate substanţele cu o structură asemănătoare, pot fi dozate componentele unui amestec,
mărind selectivitatea metodei.
3. Fotocolorimetria pe bază de extracţie
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 12 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

În analiza fotometrică conţinutul de substanţă (element) se redetermină după gradul de


absorbţie a luminii, compusului colorat. În dependenţă de tipul reacţiei chimice utilizate pentru
obţinerea compusului ce absoarbe lumina, metodele fotometrice ce împart în: directe şi indirecte.
În metodele directe ionul M cu ajutorul reagentului R trec într-un compus colorat MR,
după care se determină absorbanţa soluţiei compusului dat.
Pentru determinările indirecte, se folosesc adăugător compuşi coloraţi M 1R, care la
interacţiunea cu ionul cercetatori se distrug, ori formează noi compuşi ce absorb lumina. În acest
sens avem următoarele metode:
1. Formarea compusului colorat după reacţia de schimb cationic.
2. Distrugerea compusului colorat după reacţia de schimb cationic sau anionic.
3. Obţinerea ionului de determinat în formă de compus puţin solubil şi determinarea
ulterioară a cantităţii echivalente a precipitantului în formă de compus colorat.
4. Obţinerea compusului colorat a ionului de determinat după reacţia de oxido-reducere.
5. Formarea compuşilor coloraţi în rezultatul sintezei sau distrugerii compuşilor organici,
în lipsa sau prezenţa ionului de determinat.
6. Efecutarea reacţiei catalice cu indicator (cu utilizarea ionului de determinat în calitate de
catalizator) între două substanţe, una dintre care este colorata sau poate fi transformată
în compus colorat.
7. Metodele indirecte bazate pe distrugerea compuşilor coloraţi, se folosesc pentru
determinarea halogen şi sulfat – ionilor, şi cîtorva alţi ioni. Pentru determinarea
anionilor se folosesc şi alte metode.
În analiza fotometrică se utilizează diferite tipuri de compuşi coloraţi. Din acestia au o
întrebuinţare mai eficientă compuşii complecşi şi chelaţi a ionilor de metale cu reagenţi organici.
Pentru un şir de metale se întîlneşte o largă întrebuinţare utilizarea acidocomplexelor cu liganzi
neorganici (SCN- Cl-, Br-, I-), complecşi peroxidici şi heteropolicompuşi (As, Ge, Mo, P, Si, V,
W).
Absorbţia luminii de către soluţiile compuşilor coloraţi depinde de natura compuşilor ce
absorb lumina, condiţiile de obţinere a lor, şi de componenţa mediului.
Duritatea legăturii compuşilor coloraţi. Caracteristica cantitativă a stabilităţii oricărui
compus complex MRn îi revine constanţei termodinamice de stabilitate. Gradul de stabilitate a
compusului colorat în soluţiile apoase creşte odată cu mărirea constanţei de stabilitate. Cu cît mai
bine ionul de determinat M se leagă cu regentul fotometric R într-un compus colorat cu atît
precizia şi sensibilitatea metodei fotometrice va fi mai mare.
De aceea reagenţii în analiza fotometrică se cer de a fi aleşi în aşa mod, ca compusul
colorat a ionului de determinat să fie destul de stabil şi cu mult mai trainic, decît posibilitatea
unirii acestui reagent cu alţi ioni, care se conţin în soluţia de analizat.
Compusul colorat poate fi socotit comod pentru utilizarea în analiza fotometrică, dacă
posedă o componenţă stabilă, care corespunde unei anumite formule chimice. Componenţa
stabilă a compusului colorat adeseori este urmată şi de o stabilitate a intensităţii coloraţiei
compusului în soluţie şi este unul din factorii de bază, care influenţează precizia determinării
fotometrice. Însă în practică adeseori se întîlneşte o instabilitate a compusului cmplex cobrat.
Cauzele principale sunt următoarele:
o schimbarea componenţei compusului complex colorat în legătură cu obţinerea lui pe
etape sau a disocierii;
o descompunerea compusului complex colorat în timp;
o prezenţa altor compuşi în soluţie, care pot interacţiona cu ionul de determinat M sau ce
reagentul R, ales pentru fotometrare.
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 13 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

Influenţa pH – ului la formarea complexului colorat. Influenţa pH-ului asupra complecsilor


coloraţi, se exprimă în diferite forme, însă în majoritatea cazurilor se reduce la distrugerea sau
schimbarea componenţei complexului colorat. Cîteodată, pH-ul poate contribui la formarea
compuşilor coloraţi, cu ioni străini, prezenţi în soluţie, predispune la schimbarea solubilităţii
compusului colorat şi influenţează la starea de oxido – reducere de interacţiune.
Obţinerea compuşilor coloraţi cu reagenţii, care manifestă proprietăţi de indicator. Mulţi
reagenţi coloraţi, care se comportă ca acizi slabi organici, manifestă proprietăţi de indicator
(alizarina, ditizona, arsenazo, toron ş.a.). Aceşti reagenţi îşi pot schimba coloraţia odată cu
schimbarea concentraţiei ionilor de H+.
Aceasta este condiţionată de starea de echilibru în care forma acidă a reagentului indicator
HR se deosebeşte după structură şi coloraţie de forma bazică R - a aceluiaşi reagent. Odată cu
mărirea pH-ului soluţiei se petrece o transformare rapidă din forma acidă în cea bazică.
Micşorarea pH-ului soluţiei duce la mărirea concentraţiei acidului slab. În aşa fel, nerespectarea
stabilităţii pH-ului mediului va duce la schimbarea nu numai a intensităţii coloraţiei, dar şi a
însăşi culorii. Pentru ca nu să se întîmple aceasta este necesar ca reacţie de formare a compusului
complex colorat să se petreacă la un Ph bine determinat.
Cantitatea reagentului fotometric. Reacţia de obţinere a compusului colorat MRn cere un
exces de reagent fotometric. În unele cazuri pentru legarea deplină a ionului în compus colorat
este deajuns de adăugat puţin exces de reagent (20 – 30%) în comparaţie cu calculele ce au fost
efectuate steheometric. Aceasta se întîmplă cînd compuşii coloraţi posedă o stabilitate înaltă
(β1MRn CMn > 102(n+1) /Nn) şi insoluţie lipsese componenţii, care pot reacţiona atît cu ionii cît şi
cu reagenţii. În alte cazuri cînd stabilitatea compusului colorat este micşorată (β1MRn CMn <
102(n+1) /Nn) şi în urma unei disociaţii esenţiale sau sau o concurenţă altui compus complex
colorat, o oarecare cantitate de ion de determinat rămîne în stare liberă. În aşa situaţie se recurge
la adaosul unul exces de reagent, care poate întrece cu mult cantitatea steheometrică calculată de
10 ori.
Alegerea domeniului spectral pentru determinările fotometrice.
Sensibilitatea şi corectitudinea determinărilor fotometrice depind în mare măsură de
intervalul ales al lungimii de undă ai luminii absorbite. Domeniul spectral optim pentru care se
petrece fotometrarea este determinat de spectrele de absorbţie al complexului cît şi a regentului
utilizat. Reeşind din acestea, putem întîlni următoarele variante:
1. În regiunea spectrului analizat reagentul fotometric nu absoarbe lumina (spectrele de
absorbţie nu se acoperă).
În aşa situaţie măsurările densităţii optice a soluţie fotometrate este de dorit de le efectuat
în acea regiune a spectrului; în care absorbţia luminii de către compusul complex este maximă.
Aceasta dă posibilitate de a efectua determinările calitative cu rensibilitate şi corectitudine mai
înaltă.
2. Spectrele de absorbţie al compusului fotometrat şi a reagentului se acoperă.
Măsurarea densităţii optice o soluţie cercetate în regiunea maximului de absorbţie a
compusului complex MRn, în acest caz nu ne permite de a obţine rezultate satisfăcătoare,
deoarece la această lungime de undă lumina este absorbită şi de către reagentul fotometrat,
concentraţia căruia semnificativ este mai mare de cît a complexului (deoarece pentru
determinarea calitativă a fost necesar de adăugat exces de regent.) Astfel, precizia şi
sensibilitatea determinărilor cu mult se micşorează.
3. În soluţie ce formează doi compuşi coloraţi, diferiţi după componenţa, ai compusului
de determinat cu reagentul. Pentru excluderea erorilor mari, determinarea fotometrică a
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 14 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

elementului analizat în acest caz, este necesar de efectuat la lungimea de undă a punctului
izobestic a formelor fotometrate egal, unde absorbţia luminii de către aceste forme este aceeaşi.
Filtrele de lumină. Pentru mărirea sensibilităţii şi preciziei determinărilor fotometrice este
important de a utiliza nu lumina cu diferite lungimi de undă (incoloră), ci acea care maximal
poate fi absorbită de către compusul colorat. Deaceea, pentru ca din tot spectrul vizibil de lumină
de a evidenţia numai acele lungimi de undă, care sunt necesare, în faţa fescicolului de lumină se
instalează aşa numitele filtre de lumină. Filtrele de lumină permit pătrunderea luminii numai într-
un anumit interval de lungime de undă şi practic absorb complet celelalte lungimi de undă.
Cu cît este mai mică regiunea maximă de pătrundere a razelor (λ1/2max – λ1/2 max diferenţa
maximelor de pătrundere) prin filtrul utilizat, cu atît el este mai corect ales.
În calitate de filtre de lumini sunt utilizate sticlele colorate, pelicule, soluţii colorate şi filtre
interferenţiale.
Filtrele de lumină sunt alese reeşind din spectrul de absorbţie al compusului analizat, aşa
încît domeniul de absorbţie a luminii de către soluţiile colorate şi regiunea maximă de pătrundere
a luminii prin filtre să fie una şi aceeaşi. Adică maximumul de absorbţie al soluţiei trebuie să
corespundă cu maximurile de pătrundre (minimului de absorbţie) ale filtrului de lumină.
Reagenţi organici. Reagenţii organici sunt folosiţi din ce în ce mai mult în practica
analitică pentru determinările atît a substanţelor organice cît şi a celor neorganice. Au fost
cercetaţi şi recomandaţi pentru analiza o sumedenie de diferiţi compuşi organici. Regenţii
organici pot fi clasificaţi în: 1) specifici; 2) selectivi; 3) de grupă. La cei selectivi se referă aşa
compuşi, care reacţionează numai cu o grupă bine determinată de metale. Reagentul selectiv
poate fi numit specific, dacă el interacţionează numai cu un singur ion (metal). Însă în marea sa
parte reagenţii organici sunt de grupă, care interacţionează cu diferite elemente ale sistemului
periodic.
Dintre principalele grupe de reagenţi organici, care aş căpăta o vastă întrebuinţare pentru
determinarea individuală a elementelor, putem enumera: ditizona, 8-oxichinolina, dietil-
ditiocarbaminat de natriu, piridilazonaftal, piridilazorezorcina, xilen oranj, arsenazo III,
metiltimol albastru, sulfoclorfenol C, diantipirilmetan ş.a.
Solvenţi organici. Dizolvanţii organici în analiza fotometrică se utilizează pentru mărirea
solubilităţii unor reagenţi şi a compuşilor coloraţi, pentru mărirea sensibilităţii şi preciziei
determinării fotometrice. Foarte largă întrebuinţare au primit dezolvanţii organici în scopul
separării ionilor supuşi analizei fotometrice în faza organică. Pentru separarea ionilor se
utilizează solvenţi nepolari, adică insolubili în apă (benzen, cloroform tetraclorcarbon), cu
ajutorul cărora compuşii complecşi se extrag din faza apoasă în faza dezolvantului organic.
Dizolvanţii organici polari, bine se amestecă cu apa (acetona, dioxan, alcool etilic ş.a.) şi se
utilizează de obicei pentru mărirea stabilităţii relative a compuşilor coloraţi.
Influenţa dizolvanţilor, care conţin grupe hidrofile, (acetona, dioxon, alcooli), asupra
solubilităţii unor complexe in sistemele apoase, se poate uşor de înţeles, dacă se ia în consideraţii
capacitatea acestor grupe de a se comporta în calitate de donori de electroni şi de a înlocui
molecula de apă din sfera coordinativă a complexului.
Pe de altă parte adăugarea dizolvantului polar în apă, duce la micşorarea permiabilităţii
dielectrice a mediului, deaceea dizolvanţii care uşor se amestecă cu apa se utilizează în principal
pentru determinările fotometrice a compuşilor coloraţi puţin stabili, care în soluţii apoase, în
mare măsură disociază în ioni.
Dizolvanţii neapoşi micşorează gradul de disociaţie a compuşilor coloraţi şi produc condiţii
favorabile pentru utilizarea compuşilor mai puţin stabili în analiza fotometrică.
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 15 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

Sensibilitatea şi precizia determinărilor fotometrice în dizolvanţii polari, ca de obicei, este


mai mare în comparaţie cu soluţiile apoase, unde în marea sa parte ionul de determinat rămîne
nelegat, neformînd un compus colorat - CeL mai apreciabil în aşa caz poate fi acetona, care se
amestecă cu apa în orice proporţie şi disociaţia majorităţii electroliţilor în acetonă, foarte mult se
micşorează.
Extracţia compuşilor coloraţi. Extracţia compuşilor coloraţi cu ajutorul dizolvanţilor
organici reprezintă una din metodele cel mai des întîlnite în analiza fotometrică de extracţie
pentru determinările nemijlocite în faze organice.
În multe cazuri extracţia permite semnificativ de a majora sensibilitatea determinărilor
fotometrice dînd posibilitate de a concentra micile cantităţi de substanţă de analizat aflată în faza
organică.
În multe cazuri însăşi extracţia nu este altceva decît metoda, bazată pe distribuirea
compusului dizolvat între 2 faze lichide nemiscibile. Ca atare în practică sunt utilizate sistemele,
în care una dintre faze este apoasă, iar cealaltă – dizolvantul organic.
Pentru eficienţa separării, este necesar ca coeficientul de separare (S = P1 / P2) să fie diferit
pentru compusul de determinat şi a substanţei de balast.
În cazul cînd unul din coeficienţii de distribuire este foarte mic, iar altul este mare,
separarea se petrece uşor şi repede. Însă cînd factorul de separare este mărit şi coeficietul de
distribuire cel mai mic este la fel mărit, se petrece extracţia ambelor componente, adică, în aşa
caz este necesar de a stopa extracţia elementului nedorit.
Extracţia permite selectiv de separat nu numai majoritatea diferitor elemente, dar şi de a
îndepărta urmele unor elemente de microcantităţile altor şi de a le concentra în volumul mic al
dezolvantului organic, care este insolubil în apă.
În timpurile de faţă intensiv se perfecţionează metodele extractiv-fotometrice, care permit
de a uni etapele de separare şi a determinărilor fotometrice a elementelor într-o singură operaţie,
deoarece mulţi ioni ai metalelor formează compuşi coloraţi, care pot fi separaţi cu dizolvanţii
corespunzători.
Deseori se utilizează şi reextracţia, adică trecerea prin unul sau alt mod a componentului de
analizat din faza organică din nou în soluţia apoasă şi după aceeaşi tratare ulterioară, se
fotometrează.
Metoda fotometrică de extracţie în dozarea medicamentelor. Metoda fotometrică de
extracţie este bazată pe îmbinarea extracţiei compusului de determinat cu fotometrarea ulterioară
a lui.
Această metodă este utilizată în analiza amestecurilor compuse, cînd este necesar de a
determina cantităţi mici se substanţă în prezenţa unor cantităţi mai mari de altă substanţă, pentru
determinarea impurităţilor în prezenţa componenţilor de bază. La extracţia micilor cantităţi de
impurităţi se petrece nu numai extracţia, dar şi concentrarea lor. Deaceea metodele extractiv-
fotometrice capătă importanţă majoră în legătură cu determinările micilor cantităţi de impurităţi
în compuşi cu înalt grad de puritate, bine utilizate în tehnologia atomară şi de semiconducere.
Metodele extractiv-fotometrice sunt foarte sensibile avînd un temp accelerat de dezvoltare
şi cu perspectivă.
În metodele extractiv-fotometrice se utilizează diferite sisteme de extracţie diferite tipuri,
alegerea cărora depinde de natura chimică a compusului analizat, componenţei substanţelor
dizolvate şi condiţiilor de petrecere a extracţiei.
Pentru evaluarea metodei extractiv – fotometrice sunt înaintate un şir de cerinţe:
- determinarea concentraţiei optime a substanţei de analizat în soluţie şi supunerea
acesteia legii Lambert-Beer.
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 16 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

- Alegerea corectă a reagentului. În calitate de reagent pot fi utilizaţi diferiţi compuşi


chimici: bromtinol albastru, bromfenol albastru, bromcrezol verde, tropeolin 00, eozin ş.a. Astfel
trebuie de obţinut un aşa asociat, dintre substanţa de analizat şi reagent, ca să posede o anumită
intensitate a culorii, să se supuie legii Lambert-Beer, să fie stabil şi de dorit să se extragă la o
singură extracţie;
- Alegerea corectă a dizolvanţilor. Cei mai utilizaţi în practică ca extragenţi sunt
dizolvanţii organici neoxigenaţi – cloroformul, dicloretanul, clorura de metil, benzen ş.a. care
după cum se ştie duc la obţinerea unor compuşi nedisociabili.
- Determinarea absorbţiei maxime a ionului asociat, ce va corespunde unei anumite
lungimi de undă (λmax);
- Unul din factorii de bază, care influenţează asupra procesului de obţinere a ionului
asociat este determinarea precisă a pH-ului soluţiei de analizat. În acest sens se aleg soluţii
tampon corespunzătoare, care vor menţine un pH stabil.
- Timpul petrecerii extracţiei. Se îndeplinesc un şir de extracţii, după care se alege
timpul optimal de extracţie, în care a fost maximal extras, ionul asociat.
- Alegerea corectă a raporturilor de volume dintre soluţia substanţei de analizat: reagent,
solvent sisol. tampon.
4. Spectroscopia IR
Absorbanţa în regiunea infraroşu (IR) posedă moleculele, momentele dipole ale cărora se
schimba la iritarea mişcărilor vibraţionale a nucleelor. Spectrele IR pot fi primite în diferite stări
agregative ale substanţei şi servesc pentru identificarea, analiza cantitativă şi de asemenea pentru
determinarea structurii moleculelor.
Determinările se efectuiază la spectrofotometre IR monocromatice şi bicromatice, dotate cu
sisteme de dispersie în formă de prisme şi reţele de difracţie.
Cel mai des se foloseşte regiunea spectrală de la 2,5 până la 20mcm (4000 -500cm1).
Fiecare spectru infraroşu se caracterizează printr-o serie de benzi de absorbţie, maximele
cărora se determină cu numărul de undă γ sau lungimea undei λ, şi intensitatea maximelor de
absorbţie.
Numarul de unda γ, masurată în cm-1, se determinp din relaţia γ =104/ λ, unde λ -
lungimea de undă în micrometri (mcm).
De obicei, la înregistrarea spectrului pe axa abciselor se depune în scara liniară valoarea
numărului de unda γ (cm-1), pe axa ordonatelor - mărimea Т (în %).
Folosirea spectrelor IR pentru determinarea structurii substanţelor se bazează pe benzile
caracteristice de absorbţie (benzile legate de vibraţia grupelor funcţionale sau legăturilor in
molecule). Astfel de benzi de absorbţie caracteristice au grupele –OH; -NH2; - NO2; =CO; - С N; etc.
Identificarea substanţei medicamentoase poate fi efectuată prin compararea spectrului IR a
substanţei de analizat cu spectrul analog al exemplarului standard sau cu spectrul lui standard. În
primul caz spectrele IR se scot la acelaşi aparat în aceleaşi condiţii (starea de agregare a substanţei
concentraţia substanţei, viteza de înregistrare, etc.). În cazul doi ne conducem strict de condiţiile aduse
pentru spectrul standard.
De obicei, se folosesc spectrele IR, scoase de pe comprimate de KBr sau din paste în ulei de
vazelină.
Suprapunerea spectrelor IR se recomandă de început de la analiza benzelor caracteristice,
care de obicei se văd bine pe spectre, şi doar la corespunderea lor se suprapun cu regiunea joasă.
Pentru regiunea joasă în intervalul 1350-400cm-1 sunt caracteristice un set de benzi specifice,
numite regiunea "amprentelor degetare".
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 17 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

Corespunderea completă a benzilor de absorbţie în spectrul IR denotă despre identitatea


substanţei. Modificările polimorfe ale unei şi aceleaşi substanţe pot da spectre diferite. În cazul dat
pentru controlul identităţii se suprapun spectrele soluţiilor lor sau dizolvând fiecare substanţă în
acelaşi solvent, se evaporă solventul şi se compară spectrele rezidurilor solide.
De rând cu aranjarea benzilor de absorbţie, о caracteristica esenţială a substanţei este
intensitatea benzilor de absorbţie, care poate fi caracterizata în spectre de mărimea indecelui de
absorbţie (H) sau marimea intensităţii integrate de absorbţie (A), care este egală cu suprafaţa
înconjurată a curbei de absorbţie.
Intensitatea de absorbţie poate fi folosită pentru determinarea structurii substanţei şi analizei
cantitative.
Exemplu de analiză spectrală IR. Spectrele IR ale difeturului şi profeturului, determinate
la spectrofotometrul “Specord – 75”, prin metoda suspensiei în ulei de vaselină (circa 0,02 g de
substanţe s-au triturat cu ulei de vazelină). Domeniul studiat este cuprins între 4000 şi 400 cm -1
(figura 7, 8.).
Caracteristica spectrelor IR determinate s-a efectuat în baza datelor bibliografice.
Pentru analiză a fost aleasă preponderent, aşa numita “zonă a amprentelor degetale”, unde
substanţele manifestă o caracteristică spectrală individuală şi caracterul spectrului se schimbă
chiar şi la modificări ne esenţiale ale structurii.
Comune pentru ambele substanţe sunt benzile de absorbţie de intensitate slabă sub forma

Figura 6. Spectrul IR al profeturului

Figura 7. Spectrul IR al difeturului

unor coturi la 1280 – 900 cm-1 , caracteristice vibraţiilor de valenţă a grupării P–O–C. Benzile
de absorbţie în jurul la 1050 cm-1 se datorează vibraţiilor de valenţă autonome a unor fragmente
din această grupare ( P–O– şi C–O ). Gruparea –C–O pentru difetur are două benzi de absorbţie
la 1040–1050 cm-1, iar profeturul numai una la 1050 cm-1. Prezenţa benzilor simetrice şi
asimetrice în regiunea 1035 cm-1 este condiţionată de prezenţa grupării O–(P=O)–O. Pentru
difetur este caracteristică o bandă de intensitate medie la 1165 cm-1 şi un cot la 1260 cm-1, care
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 18 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

sunt atribuite grupării P–O–C2H5. Pentru profetur este caracteristică o bandă de intensitate medie
la 1130 cm-1, cauzată de gruparea –CH–O–P . Ambele substanţe în regiunea 975 – 1250 cm-1
manifestă benzi puternice de absorbţie, condiţionate de gruparea P–OH.
În ambele spectre la 3220 cm-1 apar benzi de intensitate slabă, care sunt caracteristice
vibraţiilor de valenţă a grupării N–H. Vibraţiei –C–C la difetur îi este caracteristică o bandă
intensă de absorbţie la 1000 cm-1, iar la profetur o bandă de o intensitate mai slabă la1010 cm-1.
Vibraţiile de deformare a grupelor – NH2 se manifestă în regiunea 1680 – 1500 cm-1.
Benzile de absorbţie a vibraţiilor de valenţă pentru grupa C–N se află la 1040 cm -1 în
spectrul difeturului şi la 1050 cm-1 pentru profetur.
Prezenţa benzilor de absorbţie la 900 – 670 cm-1 de o intensitate slabă este generată de
vibraţiile de deformare şi de valenţă a grupării –C-H. Benzile de intensitate slabă de la 550 –580
cm-1 le atribuim vibraţiilor de valenţa a grupării –C-S, iar benzile slab intensive de la 1430 –1480
cm-1, se datorează vibraţiilor de deformaţie a grupei –CH3 .
Benzile de absorbţie din regiunea 580 – 490 cm-1 sunt atribuite schimbării unghiurilor
legăturilor C–S–C şi N–C–N .
Frecvenţele caracteristice pentru difetur şi profetur în spectrele IR sunt redate în tab.5.

5. Fototurbidimetria şi fotonefelometria
Fototurbidimetria este o metodă bazată pe măsurarea intensităţii luminii absorbite de
către o suspensie microdispersă.

Tabelul 5 Frecvenţele caracteristice pentru difetur şi profetur în spectrele IR

Maxime, cauzate de grupele, cm-1


Substanţa P-O-C; P-O; P- NH2+ C=N - CH
C-S
OH NH C-C, C=O - CH3
1202, 1165, 1040
S-etilizotiuroniu 3220 900, 670,
1240, 1105, 1050, 1000 550, 580
dietilfosfat 1680 1430
1280, 1035 1395
Izopropilfosfit 1105, 1130 3220 1050 950, 600,
560, 570
izopropilizotiuroniu 1260, 975,1035 1680 1010, 1380 1450

Fotonefelometria este bazată pe măsurarea intensităţii luminii dispersate de particulele


substanţei analizate. Ambele metode se utilizează pentru dozarea amestecurilor medicamentoase,
care formează cu diferiţi reagenţi suspensii fine. Preventiv se determină dependenţa intensităţii
absorbţiei (sau dispersiei) luminii de concentraţie în soluţia analizată. Metodele de calcul sunt ca
şi în metoda fotocolorimetrică.

III. METODE BAZATE PE EMISIE DE RAZE


Spectrometria atomică de absorbţie se bazează pe absorbţia de către atomi a radiaţiei
cu frcvenţă egală cu cea a tranzacţiei de rezonanţă. Emisia provine de la o lampă cu catod
gol, trece prin flacără în care este pulverizată proba, trece prin fisura monocromatorului.
Linia de rezonanţă emisă din spectrul elementului determinat se măsoară prin metode
fotoelectrică. Se stabileşte dependenţa dintre micşorarea intensităţii de emisie şi concentraţia
substanţei.
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 19 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

Metodele de fluorescenţă se bazează pe proprietatea substanţelor de a poseda


fluorescenţă proprie sau în urma unor reacţii chimice, a proceselor de solvoliză, disociere.
Fluorimetria se utilizează nu numai pentru identificare, dar şi pentru determinarea unor cantităţi
mici de substanţă, deoarece intensitatea fluorescenţei este în dependenţă liniară de concentraţie.
Această dependenţă se păstrează la pentru excitaţii cuantice stabile şi intensitatea luminii de
excitare pentru concentraţii mici de substanţă. În cazul concentraţiilor mari această dependenţă
nu se respectă. Identificarea se petrece după intensitatea culorii luminii, specifice pentru
substanţele fluorescente. Spectrul este format din benzi late de emisie (de la 100 la 200 nm).
Dozarea se petrece la spectrofluorimetre. Calcularea concentraţiei se face după curba de
calibrare. Metoda este foarte sensibilă.

IV. METODE MAGNETICE


Rezonanţa magnetică nucleară (RMN). Metoda rezonanţei magnetice nucleare (RMN)
este o metodă de analiză, bazată pe proprietăţile magnetice ale nucleelor atomilor. Modul de
manifestare a acestei însuşiri este influenţat de ambianţa chimică, în care se află atomii
respectivi, putând oferi informaţii cu privire la structura compusului în care sînt înglobaţi atomii,
ale căror nuclee sînt implicate în fenomenele de magnetizare. RMN oferă informaţii de o
inestimabilă valoare analitică cu privire la atomii acestor elemente, punând la dispoziţie date
complexe şi directe cu privire la alcătuirea scheletului de atomi de carbon, hidrogen, fosfor, azot,
oxigen şi influenţa reciprocă a lor.
Spectrul RMN prezintă o totalitate de semnale, înregistrate pe spectrogramă.
Spectroscopia de masă este o metodă, ce permite determinarea masei ionilor, moleculelor
ionizate sau a fragmentelor de molecule după devierile în câmpurile magnetice sau electrice, sau
după energia cinetică. Ionizarea moleculelor are loc în rzultatul acţiunii unui flux de electroni.
Intensitatea picului în spectrul de masă este proporţional numărului de ion formaţi. Componenţa
şi numerele de masă a ionilor caracteristici permit determinarea apartenenţei compusului studiat
către o clasă anumită de compuşi, permite identificarea acestuia. Spectroscopia de masă este o
metodă informativă şi sensibilă.
V. METODE ELECTROCHIMICE
Potenţiometria este o metodă bazată pe măsurarea potenţialului apărut între soluţia
analizată şi electrodul scufundat în ea. În analiza farmaceutică se utilizează pe larg titrarea
potenţiometrică. Aceasta se bazează pe determinarea volumului echivalent de soluţie titrantă prin
măsurarea forţei electromotoare apărute în urma diferenţei de potenţial între electrodul indicator
şi cel de comparare, scufundaţi în soluţia analizată.
Metoda potenţiometrică este folosită la determinarea pH-ului soluţiilor şi la determinarea
concentraţiilor unor ioni. Avantajele determinării pH-ului soluţiilor prin metoda potenţiometrică
în comparaţie cu cea colorimetrică se lămuresc prin posibilitatea titrării unor soluţii colorate, a
amestecurilor de mai multe substanţe în solvenţi apoşi şi anhidri. Metoda potenţiometrică poate
fi folosită în procese de titrare cu diferite mecanisme: oxido-reducere, neutralizare, sedimentare.
Măsurarea forţei electromotoare se execută la potenţiometre. Titrantul este adăugat uniform în
cantităţi egale. În punctul de echivalenţă se petrece o variaţie bruscă de potenţial. Rezultatel
titrării se prezintă grafic prin indicarea punctului de echivalenţă pe curba de titrare, sau prin
calcule.
Ionometria se bazează pe determinarea depenenţei dintre forţa electromotoare a unei pile
galvanice ionselective şi concentraţia ionului analizat. Metoda este sensibilă, reproductivă, nu
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 20 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

necesită utilaj şi reagenţi speciali. Se utilizează la determinarea ionilor de sodiu, potasiu,


halogeni în amestecuri complexe, inclusiv în forme farmaceutice.
Polarografia este bazată pe măsurarea puterii curentului electric apărut la electrooxidarea
sau electroreducerea substanţelor analizate. Dizolvantul este apa, solvenţii organici sau mixti.
Electroliza se petrece în celula polarografică, ce constă din electrolizer, punte salină şi doi
microelectrozi: electrod picătură de mercur şi un electrod indicator. Pentru identificare se
utilizează valoarea potenţialului semiundei, iar pentru dozare – înălţimea undei (măsurarea
intensităţii curentului de difizie limită). Analiza cantitativă se face în baza curbelor de calibrare
cu utilizarea soluţiilor standard de referinţă.

VI. METODE TERMICE DE ANALIZĂ


Metodele termice se bazează pe schimbările apărute la încălzire substanţei în funcţie de
natura substanţei, temperatură, condiţii de încălzire. In procesul de incălzire se petrec schimbări
polimorfe, înlăturarea apei absorbite şi a celei de cristalizare, sublimarea, topirea, fierberea,
descompunerea. Procesul de descompunere este urmat de transformări chimice, în urma cărora
se petrec variaţii termice şi eliminări de gaze. Aceste procese stau la baza termografiei –
aprecierea stabilităţii termice după temperatura efectului termic rezultat din destrucţia substanţei.
Analiza termică presupune înregistrarea exactă a stării de echilibru dintre faza cristalină şi
lichidă a substanţei la încălzire sau răcire lentă. O interpretare mai reuşită manifestă analiza
termică diferenţiată, bazată pe înregistrarea variaţiei energiei în funcţie de temperatură.
Derivatografia prezintă o variaţie a acestei metode şi constă în înregistrare variaţiilor de
temperatură în urma descompunerii, topirii, dehidratării şi a altor procese ce se petrec la
încălzire. Metodele termice au o întrebuinţare destul de largă, în special la studierea stabilităţii
substanţelor.
VII. METODE DE SEPARARE
În analiza farmaceuticcă a amestecurilor multicomponente se utilizează extracţia, metodele
cromatografice, electroforezul.
1. Extracţia
Extracţia este o metodă de separare, bazat pe folosirea unui extragent ce nu se amestecă cu
faza iniţială, se separă uşor de ea şi de componentele extrase. Deosebim extracţii din faza solidă şi
din faza lichidă. Extracţia poate fi unică şi multiplă şi este folosită pe larg în analiza formelor
farmaceutice multicomponente. În cuplaj cu fotometria este folosită în metoda fotocolorimetrică pe
bază de extracţie.
2. Metode cromatografice de analiză
Cromatografia este o parte distinctă, un domeniu vast al metodelor de analiză. Metodele
cromatografice se numără printre cele mai eficiente, mai selective şi mai sensibile metode de
separare şi de detecţie. Prin cuplarea lor cu detectori automatizaţi, metodele cromatografice pot fi
utilizate şi la determinarea cantitativă a analiţilor separaţi.
Diagrama semnal, funcţie de timp sau de volumul de eluent se numeşte cromatogramă.
Pe cromatogramă distingem o serie de maxime, numite picuri (peak = vîrf în l. engleză), care se
produc deasupra liniei de bază sau a porţiunii orizontale a curbei, paralelă cu axa timpului.
Aceasta apare ori de cîte ori în detector nu apare nici un component, în afara eluentului evident.
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 21 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

Oricare pic are, în cazul ideal, forma distribuţiei normale Gauss. Să considerăm cea mai
simplă cromatogramă posibilă: cazul introducerii unui singur component, într-un gaz, C, care
conţine urme de aer - aerul fiind un component inert. Pe axa absciselor s-a considerat timpul (sau
volumul) de eluent scurs, cu debit cunoscut, de la introducerea (injectarea) probei, iar pe cea a
ordonatelor, semnalul detectorului - în unităţi arbitrare. Distingem următoarele elemente de bază:
 Picurile cromatografice. În cazul prezentat în fig.9, cele două semnale sau vîrfuri sunt
denumite picuri. Acestea sunt semnalele valorificabile în analiza calitativă şi cantitativă în toate
metodele cromatografice. Primul pic, mai mic, corespunde unui component inert (aerul de
exemplu în CG) - care nu este reţinut de loc - iar cel de-al doilea, notat cu C, corespunde
componentului (unic în cazul de faţă) al probei considerate şi este datorat moleculelor care se
distribuie pe parcursul migrării prin coloană între faza mobilă şi cea staţionară şi care, în
consecinţă, ies mai tîrziu din coloană.
 Timpul mort, tM - este timpul în care un component, complet nereţinut de către faza
staţionară, parcurge coloana şi tuburile de legătură pînă la detector. Acesta nu poate fi zero. În
cazul CG timpul mort, de exmplu, este egal cu timpul de retenţie al aerului: tM = tR (R =
Retenţie). Deci, cu alte cuvinte, reprezintă timpul scurs de la injectarea (introducerea) probei în
coloană şi apariţia maximului de concentraţie în detector, pentru componentul nereţinut.
 Timpul de retenţie, tR - o mărime caracteristică pentru fiecare component al amestecului
separat de coloană - reprezintă timpul scurs de la injectarea probei şi apariţia maximului de
concentraţie în detector. De exemplu, în cazul prezentat anterior în fig. 9, acesta este distanţa de
la axa ordonatelor (începutul cromatogramei) pînă la verticala prin vîrful picului C. Acest timp,
pentru un component şi o coloană (plus condiţii experimentale) date este constant, indiferent
dacă componentul respectiv este singur sau în amestec.
 Volumul de retenţie, VR este volumul de eluent corespunzător timpului de retenţie (legat
de timpul tR prin intermediul debitului eluentului, Fe):
VR = tR·Fe (1)
 Timpul de retenţie ajustat, tR'- introdus în cromatografie pentru a se putea compara timpii
măsuraţi pe coloane diferite, în cazul aceluiaşi component - este dat de diferenţa:
tR' = tR - tM (2)
 Corespunzător există şi un volum de retenţie ajustat, VR' = VR - VM unde VM este
volumul mort; acest volum mort este legat de debitul eluentului coloanei, Fe, prin
produsul: VM = tM·Fe, şi reprezintă volumul golurilor din coloană plus volumul
tuburilor de legătură de la coloană la detector.
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 22 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

O importanţă deosebită în prezentarea teoretică a procesului cromatografic de separare o


au două teorii. Teoria „Talerului teoretic” şi teoria cinetică.
Teoria „talerului teoretic” a fost propusă de Martin şi Synge. Conform acestei teorii
coloana cromatografică se împarte imaginar într-un şir de segmente elementare – talere – şi se
presupune, că pe fiecare taler se realizează un act elimentar de echilibru la distribuţia substanţei
în faza staţionară şi faza mobilă. Fiecare porţie nouă de fază mobilă purtătoare (gaz sau lichid)
provoacă o deplasare a acestui echilibru, în urma căruia o parte de substanţă se deplasează pe
următorul taler, pe care la rândul său, se stabileşte un nou echilibru distributiv şi are loc trecerea
substanţei pe următorul taler. În urma acestor procese substanţa supusă cromatografiei se
distribuie pe câteva talere. Concentraţia substanţei pe talere din mijloc este maximă în
comparaţie cu talerele invecitate.
Talerul teoretic poate fi definit ca un segment imaginar din coloana cromatografică în
care se realizează un echilibru elementar complet de distribuţie a componentului dintre cele două
faze nemiscibile, care vin în contact în procesul separării cromatografice.
Talerul teoretic din coloana cromatografică este analogic talerului teoretic dintr-o coloană
pentru distilare fracţionată. Deosebirea constă în aceea, că componenţa amestecului, care ese de
pe coloana cromatografică încontinuu se schimbă dar în procesul de extracţie ori distilare se
poate de obţinut pe parcursul întregului proces una şi aceeaşi substanţă.
Numărul talerelor teoretice pentru componentul dat şi pentru lungimea coloanei date
diferă de numărul talerelor teoretice pentru alţi componenţi în aceleaşi condiţii. Numărul
talerelor teoretice este direct proporţional cu lungimea şi diametrul coloanei.
Numărul de talere N este un număr adimensional şi se numeşte eficienţa coloanei
cromatografice, H şi n – parametrii teoretici, care caracterizează eficacitatea de separare a
coloanei cromatografice şi determină dispersia zonelor de component.
Cu cât coloana va avea mai multe talere teoretice pe o unitate de lungime şi cu cât
înălţimea echivalentă unui taler teoretic va fi mai mică, cu atât mai efectivă va fi coloana pentru
separare în condiţiile date. Aşa dar, condiţiile eficacităţii de separare pe coloana cromatografică
sunt:
L
N ,
H
în care: H să obţină valori cât mai mici şi N – cât mai mari.
Dacă vom raporta lungimea stratului de fază staţionară (L) în care s-a produs separarea
amestecului de substanţe la înălţimea talerului teoretic, vom obţine numărul de talere teoretice
(N) necesare pentru separarea amestecului dat de coloana dată.
Teoria talerelor teoretice presupune realizarea procesului cromatografic în trepte, dar în
realitate procesul decurge incontinuu. Această teorie ne permite să se calculeze parametrului
cantitativi importanţi pentru caracterizarea procesului cromatografic de separare. Aceşti
parametri îşi menţin importanţa şi în teoria cinetică a cromatografiei, care ţine cont de viteza de
migrare a substanţei, difuzie şi alţi factori cinetici, care caracterizează cantitatea procesului.
2
 t 
2
t 
N = 16 R   5,54 R 
W   W1 / 2 
O altă măsură a eficienţei coloanei, folosită curent în cromatografie este dată de înălţimea
unui taler H (înălţimea echivalentă a unui taler teoretic):
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 23 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)
2
 VR   L  L 2
2
LW 2
N=   
    , H  N  L , H = 16t 2
 V     R

unde L este lungimea coloanei cu umplutură.


Pentru caracterizarea separabilităţii a doi componenţi s-a introdus noţiunea de rezoluţie,
notată RS. În expresia rezoluţiei s-a căutat să se lege mărimile care caracterizează proprietăţile
termodinamice ale fazelor şi componenţilor precum şi mărimile care caracterizează dinamica
proceselor din coloană. Rezoluţia este o noţiune mai cuprinzătoare, conţinând şi mărimile care
caracterizează eficacitatea coloanei precum şi selectivitatea ei.

2t R ( B )  2t R ( A )
R=
WA  WB

2.1. Cromatografia pe strat subţire


Aparatură Plăci cromatografice din sticlă sau din alte materiale, de dimensiuni diferite,
cu lungimea, de obicei, de 20 cm şi lăţimea variabilă, pe care se aplică un strat subţire de
adsorbant de puritate cromatogra-fică (silicagel, kieselgur, celuloză microcristalină, oxid de
aluminiu etc), la care se pot adăuga lianţi (sulfat de calciu, amidon, carboximetilce-luloză etc.)
sau agenţi fluorescenţi.
Vase cromatografice din sticlă, cu posibilitatea de închidere etanşă, de dimensiuni
convenabile, pentru a asigura menţinerea plăcilor în poziţie aproape verticală.
Micropipete, microseringi sau alte dispozitive.
Prepararea plăcilor cromatografice. Se prepară o suspensie omogenă din adsorbant şi
apă în proporţie de 1:2 m/V, dacă nu se prevede altfel în monografia respectivă sau de către
producătorul adsorbantului. Suspensia obţinută se aplică pe plăci, în prealabil bine curăţate, cu
ajutorul unui dispozitiv, într-un strat uniform de 0,25 mm grosime. Plăcile cromatografice se
usucă la aer timp de 30 min (silicagel G, silicagel GF254 şi kieselgur G) sau cel puţin timp de 2 h
(silicagel H şi silicagel HF^), apoi, în etuvă, la 105 — 110 °Q (silicagel G, silicagel GF2g4 şi
kieselgur G) sau la 120 °0 (silicagel H şi silicagel HF254) timp de 1 h. Se recomandă îndepărtarea
unei fîşii de 2 — 5 mm adsorbant de-a lungul marginilor verticale ale plăcii. Plăcile
cromatografice se păstrează în exsicator cu clorură de calciu anhidră. Dacă sînt folosite după mai
mult de 3 zile de la preparare, plăcile cromatografice se reactivează în etuvă, conform prevede-
rilor anterioare, sau, după caz, conform prevederilor din monografia respectivă. Se pot folosi şi
plăci realizate industrial.
Tehnica de lucru. Dacă nu se prevede altfel, înaintea determinării cromatografice
respective, vasul cromatografie se saturează cu vaporii developantului prin următorul procedeu:
se căptuşesc cu hîrtie de filtru trei pereţi ai vasului şi se introduce developantul, astfel încît acesta
să formeze, de obicei, un strat cu grosimea de 10 mm, se acoperă vasul şi se lasă, dacă nu se
prevede altfel, timp de 30 min pentru saturare. Saturarea vasului cromatografic şi determinarea
cromatografică se efectuează la o temperatură cuprinsă între 20°C şi 25°C. O diferenţă de
temperatură între pereţii vasului cromatografic conduce la perturbări ale procesului de migrare în
stratul adsorbant. în cazul substanţelor fo-tosensibile, developarea trebuie efectuată ferit de
lumină.
În cazul în care faza staţionară este formată dintr-un adsorbant impregnat cu un lichid
care îmbibă adsorbantul, înainte de aplicarea soluţiilor-probă şi a soluţiilor-etalon pe placa
cromatografică, aceasta este introdusă într-un vas cromatografic în care se află un strat cu
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 24 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

grosimea de aproximativ 10 mm din lichidul de impregnare (eventual diluat cu un solvent volatil,


dacă se prevede astfel în monografia respectivă) şi se lasă pînă cînd acesta a parcurs distanţa
prevăzută în monografia respectivă.
Natura adsorbantului, solventul sau amestecul de solvenţi care constituie developantul (în
mililitri), modul de preparare al soluţiilor de aplicat (probă, etalon), volumele aplicate pe placa
cromatografică şi distanţa parcursă de developant sînt prevăzute în monografia respectivă.
Linia de start trebuie situată la o distanţă de 2 cm de marginea plăcii. Distanţa dintre două puncte
de aplicare a soluţiilor trebuie să fie de cel puţin 1,5 cm, distanţa dintre punctele marginale şi
laturile plăcii trebuie să fie de cel puţin 2 cm.
Soluţiile se aplică pe placa cromatografică în pete circulare, cu diametrul de 2 — 6 mm,
sau în benzi, conform prevederilor din monografia respectivă. Dacă este cazul, soluţia se aplică
în fracţiuni, aşteptând de fiecare dată evaporarea solventului, eventual cu ajutorul unui curent
moderat de aer. După evaporarea solventului, placa cromatografică se introduce în vasul
cromatografic cu developant, pe cît posibil în poziţie verticală. Petele de pe linia de start nu
trebuie să atingă suprafaţa stratului de developant. După ce developantul a parcurs distanţa
prevăzută, de obicei 10 — 15 cm, placa cromatografică se scoate din vasul cromatografic, se
usucă şi se pun în evidenţă petele, conform prevederilor din monografia respectivă.
De obicei, punerea în evidenţă a petelor de pe cromatogramă se efectuează prin
examinarea acestora ca atare sau după tratare cu reactivi potriviţi, în lumina vizibilă sau în
lumina ultravioletă la 254 nm sau la 366 nm.
Pentru identificarea substanţelor, se compară pe aceeaşi cromatogramă valoarea Rf şi
culoarea sau fluorescenta petei obţinute cu soluţia-probă, cu valoarea Rf şi culoarea sau
fluorescenta petei obţinute cu soluţia-etalon; cele două pete trebuie să fie asemănătoare.
Valoarea Rf a unei substanţe este:
a
Rf  ,
b
în care: a – distanţa parcursă de substanţă de la punctul de aplicare al soluţiei pînâ la
centrul petei (în centimetri) ; b – distanţa parcursă de developant de la punctul de aplicare aî
soluţiei pînă la frontul developantului, trecînd prin centrul petei (în centimetri).
Identificarea unei substanţe se efectuează, în anumite cazuri, faţă de o substanţă de
referinţă, cu ajutorul valorii Rf.
Compararea vizuală a dimensiunii petelor şi a intensităţii coloraţiei sau fluorescentei se
foloseşte pentru evaluarea semicantitativă a impurităţilor.
Dozarea substanţelor separate pe cromatogramă se efectuează, după răzuirea petelor
respective şi eluarea substanţelor de pe adsorbant cu un solvent potrivit, prin spectrofotometrie
sau direct pe placă, de obicei, prin densitometrie.
Adsorbanţii, lianţii şi solvenţii folosiţi trebuie să fie de puritate cromatografică.
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 25 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

Figura 9. Placă cu strat subţire (a), cameră sandwich (b) şi camera de developare cu
placa şi cuva cu faza mobilă (c)
Alegerea fazelor mobile pentru cromatografia pe strat subţire trebuie să ţină seama de
aceleaşi reguli ca şi în cazul cromatografiei pe coloană. Timpul de developare este de 10-60 min,
deci mai mic decît pe hîrtie şi mai ales pe coloană, iar reproductibilitatea este mai mare.
Mărimea probei ce se aplică cu microseringi Hamilton, cu micropipete automate cu memorie sau
cu simple tuburi capilare gradate în 5, 10, 25, 100 μl, este de 10-100 μg/spot, în 1-10 μl soluţie
1%. Diametrul spotului unei probe nu trebuie să fie mai mare de 5 mm, dar nici mai mic de 2
mm.
Pentru detecţia spoturilor incolore sau nefluorescente, acestea se expun acţiunii
vaporilor de iod care reacţionează cu componenţii separaţi prin developare, dînd compuşi
coloraţi. Se pot utiliza plăci gata preparate al căror strat subţire conţine un colorant fluorescent,
spoturile datorate analiţilor apărînd prin expunerea plăcilor la radiaţii UV, sub forma unor pete
de culoare închisă, nefluorescente.
Detecţia compuşilor organici se poate face şi prin pulverizarea cu acid sulfic a plăcii,
urmată de încălzire. Se pot pulveriza de asemenea diverşi reactivi de culoare sau se pot răzui
spoturile, iar după eluţie să se facă măsurătorile necesare prin metode instrumentale adecvate.
Prin urmare, în procedeele cromatografice pe strat subţire trebuie să se parcurgă mai multe etape,
după cum urmează:
- tratamentul pregătitor, deci activarea stratului
subţire;
- aplicarea probei şi a soluţiilor de standarde;
- developarea care produce separarea propriu
zisă (unidimensională şi/sau bidimensională);
- revelarea sau vizualizarea spoturilor de analiţi;
- interpretarea rezultatelor analitice, atît pentru
detecţie, cît şi pentru determinările cantitative.
Componenţii se dispun de jos în sus sub
forma unor spoturi. Pentru o separare mai netă a
componenţilor se poate face şi o developare
bidimensională, una pe înălţime cu o anumită fază
mobilă (a) şi apoi pe orizontală (b), cu o altă fază
mobilă (de fapt şi în acest caz developarea este pe
verticală, deoarece se roteşte placa cu 90˚, figura
Figura 10. Developarea unidimensională 10).
(a), bidimensională (b) şi calcularea R f (c)
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 26 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

H1
Rf  <1
H2
t
R f  1 <1
t2

H1 = distanţa parcursă de analit


H2 = distanţa parcursă de solvent (faza mobilă)
t1 = timpul necesar pentru eluarea analitului
t2 = timpul necesar pentru ca eluentul să ajungă la front

Pentru determinări cantitative se utilizează un fotodensitometru care măsoară densitatea


optică a spoturilor, parametru care este proporţional cu concentraţia fiecărui analit. Se poate
măsura fluorescenţa sau se poate măsura transmiţia fiecărui analit. Se poate măsura fluorescenţa
sau se poate măsura transmiţia sau lumina reflectă. Instrumentele moderne înregistrează spectrul
complet al substanţei, iar cele cu detector cu diode în serie pot scana placa cu lungimi de undă
multiple.
Există şi tehnici cromatografice pe strat subţire de înaltă performanţă, (HPTLC) care
execută pe straturi subţiri formate din particule foarte fine de suport, cînd separarea este mai
rapidă şi mai eficientă pe probe mai mici de substanţe.
2.2. Cromatografia în fază gazoasă
Cromatografia în fază gazoasă (CG) este o tehnică foarte răspândită, primele ei aplicaţii
datând de la începutul anilor 1940, cu aplicabilitate în separarea fracţiunilor uşoare în rafinăriile
petroliere. Dezvoltarea sa ulterioară s-a datorat unor avantaje pe care le prezintă:
• sensibilitate mare
• aplicabilitate pe scară largă
• elaborarea rapidă a unei proceduri analitice
• posibilitatea automatizării procesului analitic
CG este o variantă a cromatografiei pe coloană în care separarea componentelor dintr-un
amestec complex se realizează între o fază mobilă gazoasă şi o fază staţionarălichidă
(cromatografie gaz-lichid, CGL) sau solidă (cromatografie gaz-solid, CGS).
în CGL faza staţionară este un suport solid inert, ce poate fi chiar peretele coloanei
cromatografice, impregnat cu un lichid. Cromatografia gaz-solid se realizează cu faze staţionare
solide poroase de tipul carbon - grafit, silicagel sau alumină.
Tehnica cromatografiei de gaze
Un gaz-cromatograf cuprinde schematic (figura 11) trei module specifice:
• un injector
• coloană
• un detector
Faza mobilă care antrenează proba în coloană este un gaz numit graz vector. Debitul
controlat cu precizie permite o mare repetabilitate a timpilor de retentie.
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 27 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

Figura 11. Schema unui gaz cromatograf


Analiza începe în momentul în care o cantitate foarte mică din proba de analizat este
introdusă sub formă lichidă sau gazoasă în injector care are un rol dublu: transformarea probei
probei lichidă (cromatografie gaz-lichid, CGL) sau solidă (cromatografie gaz-solid,
CGS).
În CGL faza staţionară este un suport solid inert, ce poate fi chiar peretele coloanei
cromatografice, impregnat cu un lichid. Cromatografia gaz-solid se realizează cu faze staţionare
solide poroase de tipul carbon - grafit, silicagel sau alumină. Coloana este plasată într-o incintă
cu temperatură reglabilă. Moleculele componente ale probei, ajungând în contact cu f a staţionară
din coloană, vor interacţiona în funcţie de tăria forţelor ce se stabilesc între componente şi
adsorbanţi (CGS) sau în funcţie de repartiţia lor între faza mobilă şi lichidul staţionar (CGL).
Viteza de deplasare a componentelor de-a lungul coloanei este diferită, fapt care duce la
separarea şi eluarea lor din coloană într-o anumită ordine. La ieşirea din coloană componentele
eluate succesiv de gazul vector sunt decelate de un detector care p va sesiza proprietăţile ce
deosebesc componentele de gazul vector şi produc un semnal care se înregistrează şi care este
apoi transformat în cromatogramă. Vârful cromatografic sau „picul" corespunde componentului
separat în coloană şi trecut prin detector iar înălţimea lui este proporţională cu concentraţia
acestuia în fază gazoasă, întocmai ca la cromatografia de lichide pe coloană.
În gaz-cromatografie se defineşte, de asemenea, „linia de bază a cromatogramei", linia
trasată la baza ei atunci când, în condiţii stabilite de lucru, din coloană iese numai gazul vector,
fără componente.
în cromatografia în fază gazoasă, există patru parametri operaţionali pentru o fază staţionară
dată:
• lungimea coloanei L
• viteza fazei mobile u (care condiţionează numărul de talere teoretice)
• temperatura în coloană T
• raportul fazelor (care condiţionează k")
Aparatul permite reglarea temperaturii şi a vitezei fazei mobile, putându-se acţiona astfel
asupra eficacităţii şi a factorilor de retenţie.
A. Gazul vector. Se utilizează ca fază mobilă, cel mai adesea, unul din gazele vectoare:
heliu (He), azot (N2), hidrogen (H2), fie provenind din cilindri sub presiune, fie obţinute pe loc
pornind de la un generator de gaz (N2, H2) care are şi avantajul de a furniza un gaz foarte pur.
Mai rar se utilizează Ar, Ne.
Gazul vector trebuie să fie lipsit de urme de hidrocarburi, de vapori de apă sau de oxigen,
prezenţa acestora reducând sensibilitatea unor detectori. Dacă gazul vector are provenienţă
industrială, este indicată ataşarea unui filtru dublu (deshidratant şi reducător) la intrarea acestuia
în injector.
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 28 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

Natura gazului vector nu modifică într-o manieră semnificativă valorile coeficienţilor de


distribuţie a compuşilor analizaţi datorită absenţei interacţiunilor între gaz şi solut, temperatura
este singurul factor de modificare important.
Vâscozitatea şi viteza gazului într-o coloană influenţează dispersia compuşilor în fază
staţionară şi difuzia acestora în fază mobilă (vezi curba van Deemter), prin urmare acţionează
asupra parametrilor de efidacitate N şi asupra sensibilităţii detecţiei (figura 2.3.36). Curbele
tipice van Deemter demonstrează că dintre cele 3 gaze studiate, hidrogenul este cel care permite
separarea cea mai rapidă. Se constată, de asemenea, o creştere a vâscozităţii cu temperatura,
heliul fiind mai vâscos decât azotul la aceeaşi temperatură.

În cromatografia de gaze, faza mobilă fiind compresibilă, debitul măsurat la ieşirea din
coloană trebuie corectat prin factorul de corecţie de compresie J care ţine cont de suprapresiunea în
partea de sus a coloanei.
Dacă pe cromatogramă apare un pic datorat unui compus nereţinut, este posibilă
calcularea vitezei medii de înaintare a gazului vector în coloană, u. Pe de altă parte adaptând un
debitmetru cu bulă de săpun la ieşirea din coloană, cunoscându-i diametrul se poate deduce
viteza gazului vector u0 la ieşirea din aparat, la presiunea atmosferică Do- Raportul între cele două
viteze este egal cu J, factorul de compresie, raportat la presiunea relativă p/p0 (p presiunea în capul
coloanei):
u 3( p / p0 ) 2  1
J  .
u0 2( p / p0 )3  1
B. Introducerea probei şi camera de injectare. Proba sub formă de soluţie, de un volum
foarte mic (de exemplu, 0,5 \i\), este introdusă în aparat cu ajutorul unei nicroseringi existente sub
forma a numeroase modele adaptate diverselor injectoare şi coloane. Pentru probele gazoase se
utilizează injectoare cu bucle asemănătoare celor din cromatografia de lichide.
Injectorul este poarta de intrare a probei în cromatograf având în acelaşi timp şi alte funcţii:
vaporizează şi antreneazi amestecul probă - gaz vector în capul coloanei. Caracteristicili
njectoarelor ca şi modul de injectare diferă în funcţie de coloanele cu care sunt asociate.
Calitatea separărilor depind de această fază a analizei.
C. Incinta termostatată. Gaz-cromatograful este dotat cu o incintă încălzită, .
termostatabilă, cu dimensiuni adecvate pentru instalarea injectorului, coloanei şi
detectorului.
D. Detectorii. Se subîmpart în două clase:
o universali - sensibili practic la toate componentele eluate
o specifici - sensibili numai la un tip particular de molecule, grupări funcţionale sau
legături chimice
La baza detecţiei stă, în principiu, orice proprietate care deosebeşte componenta de
detectat de eluent, răspunsul depinzând de concentraţia molară sau masică a solutului în gazul
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 29 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

vector. După modul în care înregistrează răspunsul se disting: detectori diferenţiali - indică
concentraţia compusului în eluent în momentul intrării acestuia în detector detectori integrali -
indică concentraţia compusului în eluent la momentul t R
Detector de conductibilitate termică. Detectorul de conductibilitate termică sau catarometru este
un detector universal care se bazează pe măsurarea diferenţei de conductibilitate termică între
eluentul care conţine componenţii de analizat şi eluentul pur (H2, N2, He). Este un detector cu
sensibilitate medie.

2.3. Cromatografia lichidă de înaltă presiune (HPLC)


Cromatografia lichidă de înaltă presiune (HPLC) se deosebeşte de cromatografia de gaze
prin utilizarea în calitate de fază mobilă a unui lichid, care trece prin coloana umplută cu un
adsorbant solid cu o viteză mare în urma uneei presiuni aplicate. HPLC permite separarea
amestecurilor multicomponente. Metoda este selectivă şi sensibilă, rapidă şi reproductivă.
Identificarea medicamentelor se face după timpul de retenţie a fiecărui component.
Dozarea se efectuează după aria picului, care este proporţională cu cantitatea de medicament
în probă.

Figura 12. Schema de lucru a unui


cromatograf de lichide
Exemplu de utilizare a metodei HPLC.
Metoda HPLC de dozare a difeturişui şi profeturului
Metoda este bazată pe folosirea în calitate de reagent pentru formarea perechilor de ioni a
anionilor anorganici cu dimensiuni mari, de exemplu percloratul, în concentraţii destul de mari
(circa 0,1 M). Folosirea în acelaşi timp unei coloane scurte a permis elaborarea unei metode
expres pentru determinarea compuşilor nominalizaţi din grupul alchilizotiuroniului: timpul de
echilibrare a coloanei cu faza mobilă constituie 5-10 min; durata eluării unei probe la analiza
difeturului este de 2,5 min., a profeturului – 4,5 min.
Condiţiile separării cromatografice: cromatograf Jasco seria 1500, dotat cu detector UV cu
lungime de undă variabilă; coloana Hypersil BDS C18, 4x75 mm, 3 μm; lungimea de undă a
detectorului 222 nm; faza mobilă: sol perclorat de sodiu 0,1M, ajustată până la pH 3,0-3,3 cu
acid o-fosforic : acetonitril (96 : 4) debitul 1 ml/min; temperatura coloanei 30C.
În fig. 12. este redat un exemplu de cromatogramă a amestecului model. Identificarea
compuşilor determinaţi se face prin comparare cu mostrele standard după timpul de retenţie a
picurilor cromatografice corespunzătoare.
Astfel, difeturul manifestă un pic, corespunzător cationului de etilizotiuroniu. Liniaritatea
curbei de calibrare se păstrează pentru concentraţiile de până la 100 mg/l (fig. 13).
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 30 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)
3 000 100
Pe cromatograma profeturului, în afară
tu
r
fe
2 500 50 Dide picul de bază a substanţei active, a
ur
fet
fost obţinut încă un pic, care posedă un
o
0 Pr
2 000
timp de retenţie, analogic cu cel al
S, mAU∙s

1 500
0 2 4 difeturului. Acest fapt ne permite să
concluzionăm, că profeturul conţine
1 000 impurităţi de difetur (fig. 2.14.).
În urma cercetărilor efectuate şi
500 rezultatelor obţinute se propun
0
următoarele metodele de determinare
cantitativă a difeturului şi profeturului în
0 20 40 60 80 100 substanţe, soluţiei difetur 10%,
C, mg/l comprimatelor filmate cu difetur şi a
Figura.13. Curba de calibrare pentru metoda impurităţii de săruri de etilizotiuroniu în
HPLC de determinare a difeturului şi profeturului. profetur.
Pregătirea soluţiilor standard. Se
cântăresc 0,05-0,1 g (masă exactă) de mostră standard a compusului determinat (corespunzător
difetur sau profetur), se pun într-un balon cotat de 50 ml, se dizolvă în 30 ml apă şi se aduce
până la cotă cu acelaşi solvent (soluţia A). 0,5 ml soluţie obţinută se transferă în alt balon cotat
de 50 ml şi se aduce până la cotă cu faza mobilă (soluţia B). Se cromatografiază 20 μl de soluţie
în condiţiile indicate mai sus.
Determinarea cantitativă a principiilor de bază în substanţele difetur şi profetur şi a
impurităţii de săruri de etilizotiuroniu în profetur. 0,05-0,1g (masă exactă) de substanţă cercetată
se prepară analogic mostrei standard şi se injectează în cromatograf proba în volum de 20 μl. La
analiza substanţei profetur se cromatografiază şi soluţia standard de difetur pentru determinarea
impurităţii de etilizotiuroniu.
40
1 Conţinutul substanţei de bază X
% în compuşii analizaţi, recalculat
30
pentru substanţă uscată se calculează
conform relaţiei:
A, mAU

2
20

10

0 S p  mst  (100  u st ) 100  50  0.5  50 100 S p  mst  (100  u st ) 100


X 
0 1 2 3 4 5 S st  m p  (100  u p ) 100  50  0.5  50 S st  m p  (100  u p )

T, min în care: Sp şi Sst – ariile picurilor


Figura 12. Cromatograma soluţiei de calibrare, cu substanţelor analizate pe
conţinut de difetur (1) şi profetur (2) a câte 6,25 cromatogramele probei cercetate şi a
mg/l. soluţiei standard; mp şi mst – masele
luate pentru analiză a substanţei
analizate şi a mostrei standard, g; up şi ust – umiditatea substanţei analizate şi a mostrei standard,
%.
Conţinutul impurităţii de săruri de etilizotiuroniu, recalculat pentru difetur în substanţa
profetur se determină conform aceleaşi relaţii, folosind în calitate de standard soluţia de difetur şi
introducând în calitate de Sp aria picului impurităţii de pe cromatograma profeturului.
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 31 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

Lucrare practică de laborator individuală


Sarcină individuală 1. Dozarea Izoniazidei din comprimate 0,1 şi 0,3 g.
Tehnica de lucru. 0,1 g (probă exactă) de pulbere triturată de comprimate cu doza 0,l g
sau 0,05 g pentru doza de 0,3 g se trece într-un balon cotat cu capacitatea de 100 ml, se dizolvă
în apă purificată, apoi se completează cu acelaşi solvent pînă la cotă, se agită.
1 ml de soluţie obţinută se trece într-un balon cotat cu capacitatea de 50 ml, se adaugă
1,5 ml de soluţie de acid clorhidric 0,1 mol/l, se aduce volumul soluţiei cu apă pînă la cotă şi se
agită minuţios.
Se citeşte absorbanta soluţiei obţinute la spectrofotometru la lungimea de undă 266 nm
în cuva cu grosimea stratului 10 mm, utilizînd în calitate de soluţie de referinţă apa, ce conţine
3% de soluţie de acid clorhidric 0,1 mol/l.
Paralel se citeşte absorbanta soluţiei standard de Izoniazidă.
Cantitatea de Izoniazidă (X) într-un comprimat în grame se calculă după formula:
A1  m0 100  50 1  b A1  m0  b
X2   ,
A0  m 1 100  50 A0  m
în care: A1 – absorbanţa soluţiei analizate;
A0 - absorbanta soluţiei standard de Izoniazidă;
m - masa probei de cercetat, g;
m0 - masa izoniazidei standard în g, folosită pentru prepararea soluţiei
standard;
b - masa medie a unui comprimat, g.
Conţinutul C6H7N30 (Izoniazidă), trebuie să fie corespunzător 0,095g - 0,105g sau
0,285g - 0,315g, recalculat la masa medie a unui comprimat.
Prepararea soluţiei standard de Izoniazidă. 0,10 g (proba exactă) de izoniazidă (Ph. Eur.,
FR X p. 558 ) se trec într-un balon cotat cu capacitatea 100 ml, se dizolvă în 60 ml apă, se
completează volumul soluţiei cu apă până la cotă şi se agită. 1 ml de soluţie obţinută se trece
într-un balon cotat cu capacitatea 100 ml, se adaugă 3 ml soluţie de acid clorhidric 0,1 mol/l, se
completează soluţia cu apă pînă la cotă şi se amestecă. Soluţia se foloseşte proaspăt preparată.
Pregătirea apei, care conţine 3% de soluţie de acid clorhidric 0,1 mol/l
3 ml soluţie de acid clorhidric 0,1 mol/l se trec într-un balon cotat cu capacitatea 100 ml,
se completează volumul soluţiei cu apă pînă la cotă şi se amestecă. Soluţia se pregăteşte proaspăt
preparată.
Sarcină individuală 2. Determiarea cantitatiă a Clorhidratului de piridoxina.
Tehnica de lucru. 1 ml preparat se aduce intr-un balon cotat 50 ml cu apă purificată
(soluţia A). În alte trei baloane cotate a cîte 50 ml se pune:
- în primul balon cotat: 5 ml soluţia A;
- în al doilea balon cotat: 5 ml soluţie standard de Clorhidrat de piridoxină;
- în al treilea balon cotat: 5 ml apă.
Apoi, în toate trei baloane cotate se adaugă 2,5 ml soluţie de clorură de fier (III) 2,7%.
Peste 5 minute se aduce cu apă purificată pînă la cotă.
Se măsoară absorbanţa soluţiilor la 455 nm, în calitate de soluţie de compensare va servi
soluţia din al treilea balon cotat.
Conţinutul Clorhidratului de piridoxinei în 1 ml preparat se calculează conform formulei:
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 32 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

A1  50  m
X ,
A2  V  200
în care: A1 - densitatea optică a soluţiei de analizat;
A2 - Densitatea optică a soluţiei standard de clorhidrat de piridoxină;
V- volumul soluţiei de clorhidrat de piridoxină luat pentru analiză.
Conţinutul C8H11NO3·HCl în 1 ml preparat trebuie să fie nu mai puţin 0,0485 g şi nu mai
mult 0,0515 g.
Pregătirea soluţiei standard de Clorhidrat de piridoxină: 0,2 g masă exactă de substanţă
standardă de clorhidrat de piridoxină se dizolvă cu apă purificată într-un balon cotat de 200 ml.
1 ml soluţie standard conţine 0,001 g clorhidrat de piridoxină. Soluţia este valabila 1 lună.
Pregătirea soluţiei de clorură de fier (III) 2,7%: 2,7 g masă exactă clorură de fier (III) se
trec într-un balon cotat de 100 ml, apoi se adaugă 1 ml acid clorhidric, 5 ml apă purificată, se
dizolvă şi soluţia se completează pînă la cotă cu apă purificată. Soluţia este valabilă 5 zile.
Pregătirea soluţiei de acid clorhidric: 9,3 ml acid clorhidric concentrat se dizolvă în 30 ml
apă purificată, apoi soluţia se completează pînă la volumul 50 ml cu apă purificată.
Sarcină individuală 3. Dozarea Cloramfenicolului (Levomicetinei). 0,1 g preparat
(masă exactă) se introduce într-un balon cotat cu capacitatea 100 ml şi se dizolvă la încălzire
(circa 500С) cu apă purificată. Apoi se răceşte şi se aduce cu apa pînă la cotă.
1 ml din soluţia obţinută se transferă într-un balon cotat de 100 ml, se aduce cu apa pînă la
cotă.
Se citeşte absorbanţa soluţiei obţinute la lungimea de undă 278 nm. Absorbanţa specifică
este egală cu 298.
Sarcină individuală 4. Dozarea Sulfosalazinei. 0,15 g preparat (masă exactă) se trec
într-un balon cotat cu capacitatea de 100 ml, se dizolvă şi se aduce pînă la cotă cu soluţie
hidroxid de sodiu 0,1 mol/l (soluţia A). 5 ml de soluţie A se trec într-un balon cotat cu
capacitatea 1000 ml, care conţine 750 ml apă, se agită, se adaugă 20 ml soluţie acid acetic 0,1
mol/l şi se aduce cu apa pînă la cotă.
Se determină absorbanţa soluţiei obţinute şi a soluţiei standart cu concentraţia 7,5 mкg/ml
sulfasalazină standard, la lungimea de undă 359 nm.
Calculul conţinutului se face după formula:
Ax  20  Cst
X ,
Ast
în care: Ах,, Аst – absorbanţa soluţiei cercetate şi a soluţiei standard, corespunzător.
Сst – concentraţia soluţiei standard, în mkg/ml
Sarcină individuală 5. Dozarea derivaţilor furanului.
5.1. Dozarea Nitrofuraului (Furacilinei).
5.1.1. Dozarea Nitrofuraului (Furacilinei) prin metoda fotocolorimetrică. 0,02 g preparat
(masă exactă) se dizolvă în 70-80ml apă într-un balon cotat cu capacitatea 100 ml la încălzire pe
baia de apă la 70-800С. După răcire, se aduce cu apă pînă la cotă. La 0,5 ml soluţie obţinută se
adaugă 7,5 ml apă, 2 ml soluţie hidroxid de sodiu 0,1mol/l şi se amestecă. Peste 20 minute se
măsoară densitatea optică a soluţiei obţinute (А1) la fotocolorimetru la lungimea de undă circa
450 nm (filtru de lumină albastru) în cuva cu grosimea stratului 3 mm. În calitate de soluţie de
referinţă se foloseşte apă purificată. Paralel se efectuează reacţia cu 5 ml soluţie furacilină 0,02%
şi se măsoară densitatea optică (А2).
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 33 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

Conţinutul de Nitrofural în procente (Х) se determină după formula:


A1  ast 100  0,5 100
X ,
A2  a  0,5 100
în care: а, аst – masa preparatului şi standardului în grame.
5.1.2. Dozarea Nitrofuraului (Furacilinei) prin metoda fotocolorimetrică. 0,75 g
preparat (masă exactă) se ia într-un balon cotat cu capacitatea 250 ml, se dizolvă în 30 ml
dimetilformamidă. Se aduce volumul soluţiei cu apa pînă la cotă. 5 ml soluţie obţinută se ia într-
un balon cotat cu capacitatea 250 ml, se aduce volumul soluţiei cu apa pînă la cotă. Se măsoară
densitatea optică a soluţiei obţinute la spectrofotometru la lungimea de undă 375 nm în cuva cu
grosimea stratului 10 mm.
În calitate de soluţie de referinţă se foloseşte apă purificată.
Paralel se determină densitatea optică probei standard de nitrofural.
Conţinutul de Nitrofural în procente (X) se determină după formula:
A1  ast 100 100
X ,
Ast  a  (100  b)
în care: А, Аst – densitatea optică a soluţiei cercetate şi standard;
а, аst – masa preparatului şi standardului în grame;
b – conţinutul de apă în preparat.
Conţinutul de C6H6N4O4 la recalculare în substanţa uscată trebuie să fie nu mai puţin de
98% şi nu mai mult de 102,0%.
5.2. Dozarea Nitrofurantoinei (Furadoninei).
5.2.1. Metoda fotocolorimetrică. 0,1 g preparat (masă exactă) se ia într-un balon cotat cu
capacitatea 100 ml, se adaugă 50 ml apă şi 2,5 ml soluţie hidroxid de sodiu 1 mol/l, se dizolvă la
amestecare, se aduce volumul soluţiei cu apa pînă la cotă. 0,6 ml soluţie obţinută se ia în balon
cotat cu capacitatea 100 ml, se aduce volumul soluţiei cu apă pînă la cotă şi peste 20 minute,
calculînd timpul de la momentul adăugării soluţiei hidroxid de sodiu 1 mol/l, se determină
densitatea optică a soluţiei obţinute la fotocolorimetru în cuva cu grosimea stratului 1 cm şi cu
filtru de lumină violet cu lungimea de undă 360 nm. În calitate de soluţie de referinţă se foloseşte
apa purificată.
Conţinutul procentual de Furadonină (Х) se determină după formula:
A  100 100
X ,
Ast  a  0,6
în care: А – densitatea optică a soluţiei cercetate;
Аst – indicele de absorbţie a probei standard, determinat în aceleaşi condiţii;
а – masa preparatului în grame.
Conţinutul С8H6N4O4·Н2О la recalculare în substanţa uscată trebuie să fie nu mai puţin
de 98% şi nu mai mult de 102,0%.
5.2.2. Metoda spectrofotometrică. 0,120 g preparat (masă exactă) se plasează într-un
balon cotat cu capacitatea 1000 ml, se dizolvă în 50 ml dimetilformamidă. Se aduce volumul
soluţiei pînă la cotă. 5 ml soluţie obţinută se plasează într-un balon cotat cu capacitatea de 100
ml, se aduce volumul soluţiei pînă la cotă cu soluţie care conţine acetat de sodiu 1,8% şi acid
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 34 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

acetic anhidru 0,14%. Se determină densitatea optică a soluţiei obţinute la lungimea de undă 367
nm.
În calitate de soluţie de referinţă se foloseşte soluţia care conţine acetat de sodiu 1,8% şi acid
acetic anhidru 0,14%.
Conţinutul С8H6N4O5 în procente se calculează după formula:
A  1000  100
X ,
765  a  5
în care: А – densitatea optică a soluţiei cercetate;
765 – indicele de absorbţie (Аst) probei standard de nitrofurantoină;
а – masa preparatului în grame.
Соnţinutul de С8H6N4O5 la recalculare în substanţa uscată trebuie să fie nu mai puţin de
98% şi nu mai mult de 102,0%.
5.3. Dozarea Furazolidonei prin metoda fotocolorimetrică. 0,1 g preparat (masă exactă)
se plasează într-un balon cotat cu capacitatea 50 ml. Se adaugă 30 ml dimetilformamidă şi după
dizolvarea preparatului se adaugă soluţie alcoolică hidroxid de sodiu 0,05 mol/l, se amestecă, se
răceşte pînă la 200С, se aduce volumul soluţiei dimetilformamidă pînă la cotă. 0,6 ml soluţie
obţinută se plasează într-un balon cotat cu capacitatea 100 ml, se aduce volumul soluţiei cu apă
pînă la cotă, exact peste 20 minute din momentul adăugării soluţiei alcoolice de hidroxid de
sodiu 0,05 mol/l. Se măsoară densitatea optică a soluţiei obţinute la fotocolorimetru în cuva cu
grosimea stratului 0,5 cm şi cu filtru de lumină violet cu lungimea de undă circa 360 nm.
În calitate de soluţie de referinţă se foloseşte apa purificată.
Conţinutul Furazolidonei în % (Х) se calculează după formula:
A  50  100
X ,
Ast  a  0,6  0,5
în care: А – densitatea optică a soluţiei cercetate;
Аsт – indicele de absorbţie a probei standard, se determină în aceleaşi condiţii;
а – masa preparatului în grame.
Conţinutul С8H7N3O5 la recalculare în substanţa uscată trebuie să fie nu mai puţin de 98% şi
nu mai mult de 102,0 %.
Sarcină individuală 6. Dozarea Rutozidei (Rutină). 0,025 g preparat (masă exactă) se
dizolvă în 10 ml alcool fierbinte absolut şi se filtrează prin filtrul de sticlă №4 . Filtrul se spală
cu alcool fierbinte absolut de 2 ori cu cîte 10 ml. Filtratele unite se trec în balonul cotat cu
capacitatea 100 ml, se răceşte şi se aduce volumul soluţiei cu acelaşi alcool pînă la cotă. 5 ml
soluţie alcoolică se ia în balonul cotat cu volumul 50 ml şi se aduce volumul soluţiei cu alcool
absolut pînă la cotă. Se determină absorbanţa soluţiei obţinute la spectrofotometru la lungimile
de undă 375 nm (A1) şi 362,5 nm (A2) în cuva cu grosimea 1 cm.
Dacă raportul A1/A2 se află în limitele 0,875±0,004, atunci conţinutul de Rutină în
procente (Х) se calculează după formula:
A2 1000
X ,
325,5  a
în care: 325,5 – absorbanţa specifică a Rutinei pure (anhidre) în alcool absolut la lungimea de
undă 362,5nm
а – proba în grame.
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 35 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

Dacă raportul A1/A2 este mai mare de 0,879, atunci conţinutul procentual de Rutină (Х)
se determină după formula:
14,60  A2  13,18  A1
X ,
a
Conţinutul С27Н30О16 la recalculare în substanţa uscată trebuie să fie cel puţin de 95,0%.
Sarcină individuală 7. Dozarea Clorhidratului de platifilină din comprimate prin
metoda fotometriei extractive. 0,1 g pulbere ( masă exactă) de comprimate triturate se introduc
în pîlnia de separare cu capacitatea 50 ml şi se agită cu 2,5 ml apă purificată. Apoi se adaugă 0,4
ml soluţie tropolionă 00 1%, 3 picături soluţie acid clorhidric 0,5 mol/l, 20 ml cloroform şi se
agită conţinutul pîlniei timp de 1 minut. Stratul de cloroform se trece în balonul cotat cu
capacitatea 200 ml. Extracţia se repetă încă de 4 ori, folosind de fiecare dată cîte 20 ml cloroform
şi agitând timp de 1 minut. Extracţiile de cloroform se trec în acelaşi balon cotat, volumul
soluţiei se aduce cu cloroform pînă la cotă. Se măsoară absorbanţa soluţiei obţinute la
fotocolorimetru, cu filtrul de lumină violet în cuva cu grosimea stratului 5 mm. Soluţie de
referinţă este cloroformul.
Paralel se face proba de control cu 2,5 ml soluţie de substanţa standard de Hidrotartrat de
platifilină.
Conţinutul de Hidrotartrat de platifilină în grame (X) se determină după formula:
A1  b  0,002  2,5
X ,
A0  a
în care: А1– absorbanţa a soluţiei cercetate;
А0- absorbanţa probei standard;
0,002 – conţinutul de Hidrotartrat de platifilină în 1ml soluţia soluţiei standard, g;
а – masa preparatului în grame;
b – masa medie a comprimatului în grame.
Conţinutul С18H27NO5 · С4Н6О6 trebuie să fie 0,0045-0,0055 g, calculînd la masa medie a
comprimatului.
Sarcină individuală 8. Dozarea Cianocobalaminei prin metoda spectrofotometrică
UV-VIS. 0,1 g preparat (masă exactă) se dizolvă în apă într-un balon cotat cu capacitatea de 500
ml şi se aduce volumul cu apă pînă la cotă. 25 ml de această soluţie se trece în balonul cotat cu
volumul 250 ml şi se aduce volumul soluţiei cu apă pînă la cotă. Se determină absorbanţa optică
a soluţiei obţinute la spectrofotometru la lungimea de undă 361 nm în cuva cu grosimea de 1 сm.
Conţinutul de Cianocobalamină în % (X) se determină după formula:
A  500  10
X ,
207  a
în care: А – absorbanţa soluţiei cercetate;
207- absorbanţa specifică Е1cm1% a Cianocobalaminei pure (anhidre) la lungimea de
undă 361 nm;
а – masa preparatului în grame.
Conţinutul С63H88СоN14Р la recalculare în substanţa uscată trebuie să fie nu mai puţin de
95,0 %.
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 36 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

Sarcină individuală 9. Dozarea Metilsulfat de neostigminei (Prozerinei) prin metoda


cromatografiei cu schimb de ioni. 0,03 g (masă exactă) preparat se dizolvă în 10 ml apă, se
trece prin coloana cu cationi CU-2 de forma H (RH) cu viteza 20-25 picături pe minut. Apoi
coloana se spală cu apă (30-50 ml) până la reacţie neutră după metiloranj. Lichidul obţinut la
spălare se trece la filtratul bazic şi se titrează din semimicrobiuretă cu soluţie hidroxid de sodiu
0,1 mol/l (indicator metiloranj).
1 ml soluţie hidroxid de sodiu 0,1 mol/l corespunde la 0,03344 g Metilsulfat de
neostigmină.

Parametrii necesari pentru dozarea unor substanţe medicamentoase.

Lungimea de 1%
A1cm
Preparatul Solventul
undă, nm
Nicotinamida Soluţie de acid clorhidric 0,1 mol/l 261 438
Acid nicotinic Apă 262 309,7
Soluţie de acid clorhidric 0,1 mol/l 260 246,9
Piridoxal fosfat Soluţie tampon fosfat, рН ≈ 7,0 388 201
330 –
Clorhidrat de Apă
292 312,93
piridoxină
Izoniazidă Soluţie de acid clorhidric 0,01 mol/l 266 –
Ftivazidă Soluţie de acid clorhidric 0,1 mol/l 267 –
Parmidin Soluţie de acid clorhidric 0,1 mol/l 268 –
Sulfat de chinină Alcool etilic 234 860,0
Alcool etilic 278 98,7
Alcool etilic 331 125,1
Soluţie de acid clorhidric 0,1 mol/l 318 115
Soluţie de acid clorhidric 0,1 mol/l 318 112
Soluţie de acid clorhidric 0,1 mol/l 347 140,3
Clorhidrat de chinină Alcool etilic 234 880,03
Alcool etilic 278 98,00
Alcool etilic 331 127,98
Apă 272 530,6
Clorhidrat de
Apă 270 512,3
apomorfină
Soluţie de acid clorhidric 0,1 mol/l 272 531,75
Alcool etilic 284 50,11
Codeină Soluţie de acid clorhidric 0,1 mol/l 285 55,62
Soluţie tampon рН 2,0-4,0 285 53,04
Alcool etilic 284 40,56
Fosfat de codeină Apă 285 37,01
Apă 285 39,9
Clorhidrat de morfină
Soluţie de acid clorhidric 0,1 mol/l 285 39,7
Clorhidrat de
Apă 255 6,30
trimepiridină
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 37 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

Apă 234 282,5


Clorhidrat de tiamină Apă 262 197,5
Soluţie de acid clorhidric 0,1 mol/l 260 246,9
Clorhidrat de tiamină Apă 274 212,3
Fosfotiamină Soluţie tampon fosfat рН7,0

Control de totalizare
1. Controlul cunoştinţelor teoretice după întrebările pentru pregătirea individuală.
2. Controlul dărilor de seamă despre efectuarea lucrului practic și individual.

Întrebări pentru control și probleme individuale


1. Cal
culaţi conţinutul Cafeinei-benzoat de sodiu în soluţie, dacă indicele de refracţie este 1,3593.
Valoarea incremenentului (F) este – 0,00192.
2. Cal
culaţi conţinutul de Metenamină în soluţie, dacă indicele de refracţie este 1,3474, valoarea
incrementului (F) este 0,00168.
3. De
ce concentraţie trebuie preparată soluţia de Clorhidtat de bendasol (Dibazol) în acid
clorhidric 0,1 mol/l pentru efectuarea dozării prin metoda spectrofotometrică UV la
lungimea de undă max. 243 nm, dacă valoarea absorbanţei specifice ( A1cm
1%
) esta de 243,5.
4.
Calculaţi intervalele posibile a valorilor unghiului de rotaţie conform DAN. Puterea rotatorie
specifică a soluţiei de mentol de 10% în alcool etilic de 95% trebuie să fie de la –490 până
la –510. Grosimea cuvei este de 20 cm.
5. Cal
culaţi valoarea (medie) absorbţiei specifice a riboflavinei( A ) (valoarea medie).
1%
1cm

Tehnica de lucru: 0,1005 g substanţă s-au dizolvat în apă într-un balon cotat de 500 ml
(sol. A). În trei baloane cotate de 200 ml s-au introdus sol. A consecutiv câte 1,0 ml; 2,0 ml;
3,0 ml, s-a adus până la cotă cu apă purificată. Absorbanţele soluţiilor înregistrate la
lungimea de undă 267 nm sunt corespunzător 0,088; 0,184; 0,255. Grosimea cuvei 10 mm.
6. Cal
culaţi valoarea Rf, dacă distanţa parcursă de substanţă este 4,52 cm, iar distanţa parcursă de
solvent este 7,75 cm.
7. Izo
merizarea remediilor medicamentoase poate să se petreacă în cazul prezenţei în structură a
..... .
8. Me
toda fotometrică de analiză se bazează pe ..... .
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 38 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

9. Ab
sorbanţa poate fi exprimată ..... .
10. Ale
geţi expresiile matematice corecte pentru legea Bugher-Lambert-Beer ..... .
11. Sp
ectrul de absorbţie poate fi definit ca ..... .
12. Pentru calcularea concentraţiei prin metoda spectrometrică UV-VIS folosim formulele ..... .
13. Pentru determinările cantitative spectrele de absorbţie trebuie să respecte condiţiile ..... .
14. Metoda fotocolorimetrică de analiză se bazează pe ..... .
15. Indicaţi factorii care determină condiţiile optime de dozare a substanţelor medicamentoase
prin metoda spectrometrică în UV-VIS ..... .
16. Mărimea absorbanţei este direct proporţională cu ..... .
17. Absorbanţă specifică depinde de ..... .
18. Pentru calcularea conţinutului de substanţă analizată prin metoda fotometrică se utilizează
formulele ..... .
19. Metoda bazată pe refracţia luminii este ..... .
20. Conţinutul de substanţă prin metoda refractometrica se calculează prin formula ..... .
21. Puterea rotatorie specifică a soluţiilor se calculează prin formula ..... .
22. Conţinutul substanţei în soluţie, prin metoda refratometrică, se calculează prin formula ..... .
23. Valoarea puterii rotatorii specifice pentru substanţele lichide se calculează după formula .....
.
24. Părţile principale ale polarimetrului sunt ..... .
25. Pentru identificarea spoturilor pe cromatogramă se calculează R f după formula ..... .

Rezultatele vor fi transmise la adresa de e-mail indicată de profesor.

Notă. Sarcinile individuale ale studenților se distribuie de către profesori.

BIBLIOGRAFIA
1. Conspectul lecţiei.
2. Babilev F.V. Chimie farmaceutică, Chişinău: Universitas, 1994.- 675 р.
3. Bojiţă M., Roman L., Săndulescu R., Oprean R. Analiza şi Controlul medicamentelor.Vol.
I. - Cluj-Napoca: Editura Intelcredo, 2003. – 495 p.
4. Bojiţă M., Roman L., Săndulescu R., Oprean R. Analiza şi Controlul medicamentelor.Vol.
II. - Cluj-Napoca: Editura Intelcredo, 2003. –768 p.
5. Ducă A., şi a. Chimie analitică şi analiză instrumentală.-Bucureşti: Ed. Didactică şi
pedagogică, 1983.
6. Farmacopea European Ediţia 7.0, 2010.
Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”
Facultatea Farmacie
Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică Pag. 39 / 39
09.3.1-12
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Controlul medicamentelor)

7. European Pharmacopoeia. Ediţia a 8,0. 2014.


8. Farmacopea Română. Ediţia X-a –Bucureşti: Editura medicală, 1993.-1315 p.
9. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия.- М.: МЕДпресс-Информ, 2007. – 624 с.