Manual

alpha-1-Antitrypsin ELISA

α1-Antitrypsin ELISA Kit

Para la determinación in vitro de la α1-antitripsina en las heces

EU: IVD / CE
US: Sólo para uso en investigación. No debe utilizarse en los procedimientos de
diagnóstico.

Valido desde 03.09.2014

+8 °C

K 6750
+2 °C
96

Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, D-64625 Bensheim

Tel.: +49 6251 70190-0 Fax: + 49 6251 849430
e.mail: info@immundiagnostik.com www.immundiagnostik.com
Manual α 1-antitrypsin

Tabla de Contenidos
1. INTENCIÓN DE USO 02
2. INTRODUCCION 02
3. MATERIAL SUMINISTRADO 03
4. MATERIAL REQUERIDO PERO NO SE INCLUYE_ 03
5. ALMACENAMIENTO Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS 04
6. ALMACENAMIENTO Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS 05
Almacenaje 05
Extracción de muestras de heces 05
Dilución de muestra 06
7. PROCEDIMEINTO DE ENSAYO 06
Principio del test 06
Procedimiento del Test 07
8. RESULTADOS 08
9. LIMITACIONES 08
10. CONTROL DE CALIDAD 09
Rango de referencia 09
11. CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO 09
Precision y reproducibilidad 09
Recuperación final 10
Recuperación de dilución 10
Sensibilidad Analítica 10
Especificidad 11
12. PRECAUCIONES 11
13. CONSEJOS TÉCNICOS 11
14. NOTAS GENERALES SOBRE EL TEST Y PROCEDIMIENTO DEL TEST 12
15. REFERENCIAS 12

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 Manual α 1-antitrypsin

1. INTENCIÓN DE USO
El Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) está pensado para la
determinación cuantitativa de α1-antitripsina en heces. Es sólo para uso
diagnóstico in vitro.

2. INTRODUCCIÓN
La pérdida de proteína intestinal es una grave consecuencia de diversas
enfermedades sistémicas o locales gastrointestinales (por ejemplo, alergias,
inflamación crónica, tumores malignos). Estas patologías dañan la integridad de la
mucosa y / o causan limfostasis, lo que conduce a un aumento de la transferencia
de las proteínas del plasma en el lumen del intestino. Posteriormente, hipo-
proteinemia acompañado con edema. Esta condición se diagnostica por exclusión
de otras fuentes de pérdida de proteínas y de la prueba de una concentración
elevada de α1-antitripsina en las heces.
En el suero, el α1-antitripsina representa la mayoría de los inhibidores de la
proteasa de serina y protege a los tejidos de los daños de la proteasa durante la
inflamación. La proteína se sintetiza principalmente en el hígado, pero también en
una pequeña cantidad en los macrófagos intestinales, monocitos, y células
epiteliales intestinales. La α1-antitripsina es relativamente resistente contra la
digestión enzimática, la cantidad secretada en las heces refleja la concentración
interna de la proteína. Por lo tanto, una concentración elevada de α1-antitripsina
en heces es un marcador ampliamente reconocido para la pérdida de proteína
intestinal y por un aumento de la permeabilidad de la mucosa.
En la rutina clínica, el clearence de α1-antitripsina (una relación de los valoresα1-
antitripsina ELISA de muestras de heces y suero) se ha establecido a lo largo, con
la única determinación de la secreción de la α1-antitripsina en las heces en 24h.
Así, el grupo de JS Fordtran informa que la única determinación de la
concentración de α1 -antitripsina en heces arrojó resultados falsos negativos ó
falsos positivos en el 21% de los pacientes en comparación con la medición del
clearence α1-antitripsina (Strygler et al., 1990). La calidad analítica de α1-
antitripsina de Immundiagnostik ELISA supera, con mucho, la técnica de
inmunodifusión radial convencional (RID) en la determinación de suero, heces y
sobrenadantes de cultivo de tejidos. En comparación directa, las concentraciones
medidas con el ELISA fueron aproximadamente un 30% por encima de los
niveles correspondientes del RID. Los sobrenadantes de cultivo de células de una
línea celular intestinal, así como muestras fecales de pacientes con limfostasis,
dieron resultados negativos con RID. Nuestra ELISA podría detectar α1-
antitripsina en todas estas muestras, en algunos de ellos incluso en
concentraciones muy altas. Estos resultados demuestran claramente que la α1-
antitripsina ELISA es mucho más sensible que el método convencional y que
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 Manual α 1-antitrypsin

reconoce no sólo la α1-antitripsina hepática sino también a la enteral. La

discrepancia de los dos métodos y, por tanto, la superioridad de la prueba ELISA
para RID es especialmente llamativo en el análisis de las extremadamente altas
pérdidas de proteína enteral. La combinación de anticuerpos específicos en
nuestra α1-antitripsina ELISA excluye ampliamente la posibilidad de resultados
falsos negativos permitiendo, de este modo, un diagnóstico fiable de la pérdida de
proteína enteral.
Indicaciones
• Sospecha de pérdida de proteínas entéricas
• Enfermedad de Crohn
• Enterocolitis necrótica
• Isquemia mesentérica crónica
• Inflamación gastrointestinal inducida autoinmune-viral, bacteriana, o alérgica

3. MATERIAL SUMINISTRADO
Cat. No. Etiqueta Componentes del Kit Cantidad
K6750 PLATE PLATE alpha-1-Antitrypsin ELISA PLATE 12 x 8
(pocillos)
K6750 WASHBUF WASHBUF ELISA WASHBUF 2 x 100 ml

K6750 CONJ CONJ alpha-1-Antitrypsin ELISA CONJ 200 µl

K6750 STD STD alpha-1-Antitrypsin ELISA STD 5 viales

(500µl lyo.)
K6750 CTRL 1 CTRL 1 alpha-1-Antitrypsin ELISA CTRL 1 1 vial (500µl lyo)
K6750 CTRL 2 CTRL 2 alpha-1-Antitrypsin ELISA CTRL 2 1 vial (500µl lyo)

K6750 SUB SUB ELISA SUB 1 x 15 ml

K6750 STOP STOP ELISA STOP 1 x 15 ml

K6750 IDK Extract IDK Extract® ELISA IDK Extract 2 x 100 ml

4. MATERIAL REQUIRIDO PERO NO SUMINISTRADO

• Agua Ultra pura *
• Balanzas de laboratorio
• Pipetas de precisión calibradas y 10-1000 µl
• Papel de aluminio para cubrir la placa de microtitulación
• Placa agitadora de microtitulación horizontal
• Pipetas multicanal o pipetas repetidoras
• Centrífuga, 3000 g 03
 Manual α 1-antitrypsin
• Vortex
• Vidrios de laboratorio estándar o de plástico: frascos, vasos, etc.
• Lector de placas de microtitulación (filtros necesarios véase el capítulo 7)
* Immundiagnostik AG recomienda el uso de Ultra Pure Water (Agua Tipo 1; ISO 3696), que está libre de
iones disueltos y coloidales y las moléculas orgánicas (libre de partículas> 0,2 micras) con una conductividad
eléctrica de 0.055 S / cm a 25 ° C (≥ 18,2 MΩ cm).

5. ALMACENAMIENTO Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS

• Para ejecutar la prueba más de una vez, asegúrese de que los reactivos se almacenen en
las condiciones indicadas en la etiqueta. Preparar sólo la cantidad adecuada necesaria
para cada ejecución. El kit se puede usar hasta 4 veces dentro de la fecha de caducidad
indicada en la etiqueta.

• Los reactivos con un volumen inferior a 100 µl deben ser centrifugados antes de su uso
para evitar la pérdida de volumen.

• El Buffer concentrado de lavado ELISA (WASHBUF) debe ser diluido 1:10 en agua
ultrapura antes de su uso (100 ml de concentrado + 900 ml de agua ultrapura), mezclar
bien. Podrían aparecer cristales debido a la alta concentración de sal en las soluciones de
stock. Los cristales deben volverse a disolver a temperatura ambiente o 37 ° C antes de la
dilución de las soluciones Buffer. El concentrado de Buffer es estable a 2-8 ° C hasta la
fecha de caducidad indicada en la etiqueta. La solución Buffer diluida (Buffer de lavado)
se puede almacenar en un matraz cerrado a 2-8 ° C durante un mes.
• El Buffer concentrado de extracción IDK Extract® debe diluirse con agua ultrapura
1: 2,5 antes de su uso (100 ml concentrado + 150 ml de agua ultrapura), mezclar bien.
Podrían ocurrir cristales debido a la alta concentración de sal en las soluciones de stock.
Antes de la dilución, los cristales deben volver a disolver a 37 ° C en un baño de agua. El
Buffer de extracción concentrado IDK Extract® es estable a 2 - 8 ° C hasta la fecha de
caducidad indicada en la etiqueta. La solución Buffer diluida (Buffer de extracción) se
puede almacenar en un matraz cerrado a 2 - 8 ° C durante tres meses.

• Los Estandar (STD) y controles (CTRL) son estables a 2-8 ° C hasta la fecha de
caducidad indicada en la etiqueta.

• El conjugado concentrado (CONJ) debe ser diluido 1: 101 en buffer de lavado (100
µl de CONJ + 10 ml de Buffer de lavado). El concentrado es estable a 2-8 ° C hasta la
fecha de caducidad indicada en la etiqueta. El conjugado diluido no es estable y no se
puede almacenar.

• Todos los demás reactivos están listos para usar. Los reactivos de prueba son estables
hasta la fecha de caducidad (ver etiqueta del paquete del test) cuando se almacena a 2-8 °
C.

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6. ALMACENAMIENTO Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS
Almacenamiento

La estabilidad de la muestra es la siguiente:

Heces primas: toda la noche a temperatura ambiente (15-30 ° C), 3 días a 2-8
°C ó por lo menos 4 semanas a -20 ° C
Extractos de heces: 9 días a temperatura ambiente, 2-8 ° C o -20 ° C,
máximo 3 ciclos de congelación y descongelación

Extracción de las muestras de heces

El Buffer de extracción diluido IDK Extract® se utiliza como un Buffer de
extracción de la muestra. Recomendamos la siguiente preparación de la muestra:

Sistema de Aplicación de la muestra de heces (SAS) (Cat. No.: K 6998SAS)

Tubos de muestra de heces - Instrucciones de uso:

Tenga en cuenta que el factor de dilución de la suspensión de heces final depende de la
cantidad de muestra de heces utilizado y el volumen del Buffer.

SAS con 1,5 ml de tampón de extracción:

Aplicada cantidad de heces: 15 mg
Buffer Volumen: 1,5 ml
Dilución Factor: 1: 100

Por favor, siga las instrucciones para la preparación de muestras de heces utilizando el
SAS de la siguiente manera:
a) La muestra de heces en bruto tiene que ser descongelados. Para muestras
particularmente heterogéneas, se recomienda una homogeneización mecánica usando un
aplicador, bucle de inoculación o un dispositivo similar.
b) Llenar el tubo de muestra vacío con 1,5 ml de Buffer de extracción IDK Extract®
listo para usar la antes de utilizarlo con la muestra. Importante: Deje que el Buffer de
extracción alcance la temperatura ambiente.
c) Desenrosque el tubo (parte de color naranja de la tapa) para abrir. Inserte la varilla de
medición de color naranja en la muestra. La parte inferior de la varilla tiene muescas que
deben ser cubiertos por completo con las heces después de insertarlo en la muestra.
Coloque la varilla medidora en el tubo. Al poner la palanca en el tubo, el exceso de
material se retira, dejando 15 mg de muestra para ser diluida. Atornillar firmemente para
cerrar el tubo.

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 Manual α 1-antitrypsin
d) Agitar bien el tubo hasta que no haya muestra de materia fecal que permanece
en las muescas. Importante: Por favor, asegúrese de que usted tiene una
suspensión homogénea al máximo después de la agitación. Especialmente con
muestras más sólidas, sumergiendo la muestra en el tubo con tampón ~ 10
minutos, mejora el resultado.
e) Permitir que la muestra esté en reposo durante unos 10 minutos, hasta que los
sedimentos se han asentado. El material flotante como cáscaras de los granos
puede ser omitido.
f) Desenroscar con cuidado la tapa completa del tubo incluyendo el anillo azul
más la varilla de nivel. Descartar tapa y la varilla de medición. Asegúrese de que
el sedimento no se disperse de nuevo.
Dilucion I: 1:100
Dilución de muestras
El sobrenadante del procedimiento de preparación de la muestra (dilución I)
además se diluye 1: 250 en Buffer de lavado. Por ejemplo:
20 µl sobrenadante (dilución I) + 980 µl de Buffer de lavado, mezclar bien =
dilución II (1:50)
200 µl de dilución II + 800 µl de Buffer de lavado, mezclar bien = dilución III
(1: 5).
Esto da como resultado una dilución final de 1:25000.
Para el análisis, pipeta 100 µl de dilución III por pocillo.

7. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO
Principio de la prueba
El ensayo utiliza la técnica de sándwich con dos anticuerpos policlonales seleccionados
que se unen a α1-antitripsina humana.
Los estandares, controles y muestras pre-diluidas que se ensayaron para determinar la α1-
antitripsina humana se añaden en los pocillos de una micro placa recubierta con un
anticuerpo policlonal de α1-antitripsina anti-humana. Durante la primera etapa de
incubación, la α1-antitripsina está ligada por el anticuerpo inmovilizado. A continuación,
un anticuerpo policlonal de α1-antitripsina anti-humana conjugada con peroxidasa se
añade en cada pocillo de microtitulación y se forma un sándwich de anticuerpo de captura
- α1-antitripsina humana con peroxidasa conjugada. La tetrametilbencidina se utiliza
como sustrato de la peroxidasa. Finalmente, se añade una solución ácida de parada para
terminar la reacción. El color cambia de azul a amarillo. La intensidad del color amarillo
es directamente proporcional a la concentración de α1-antitripsina. Se genera una curva
de respuesta a la dosis de la unidad de absorbancia (densidad óptica, DO a 450 nm)
frente a la concentración, usando los valores obtenidos del estándar, la α1-
antitripsina presente en las muestras se determina directamente a partir de esta
curva.

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Procedimiento del Test

Lleve todos los reactivos y muestras a temperatura ambiente (15-30 ° C) y mezcle
bien.

Tome la cantidad de tiras de microtitulación según sea necesario del kit. Las tiras no
utilizadas se almacenan de 2-8 ° C. Las tiras son estables hasta la fecha de caducidad
indicada en la etiqueta.
Marque las posiciones de STD (Estandard) Sample (Muestra) CTRL (Controles) en una
hoja de protocolo.
Se recomienda llevar a cabo las pruebas por duplicado.
Lavar cada pocillo 5 veces por dispensación de 250 µl de Buffer de lavado diluido
en cada pocillo. Después de la etapa de lavado final, eliminar el Buffer residual
1. tocando la placa sobre papel absorbente.

Añadir 100 µl de STD (estándar), SAMPLE(muestra) y CTRL (controles)

2. en el pocillo respectivo.
Cubrir la placa con fuerza y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente
3. (15-30 ° C) en un agitador horizontal.
Desechar el contenido de cada pocillo. Lavar cada pocillo 5 veces por dispensación de
250 µl de Buffer de lavado diluido en cada pocillo. Después de la etapa de lavado
4. final, eliminar el Buffer residual tocando la placa sobre papel absorbente.

5. Añadir 100 µl CONJ (conjugado) en cada pocillo.

Cubrir la placa con fuerza y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente
6. (15-30 ° C) en un agitador horizontal.
Desechar el contenido de cada pocillo. Lavar cada pocillo 5 veces por dispensación de
250 µl de Buffer de lavado diluido en cada pocillo. Después de la etapa de lavado
7. final, eliminar el Buffer residual tocando la placa sobre papel absorbente.

8. Añadir 100 µl de SUB (sustrato) en cada pocillo.

Incubar durante 10-20 minutos a temperatura ambiente (15-30 ° C) en la oscuridad *.
9.

10. Añadir 100 µl de STOP (solución de parada) en cada pocillo, mezclar bien.
Determinar la absorción inmediatamente con un lector de ELISA a 450 nm frente a
620 nm (o 690 nm) como referencia. Si no hay ninguna longitud de onda de referencia
disponible, sólo lectura a 450 nm. Si la extinción del más alto nivel supera el rango del
11. fotómetro, la absorción se debe medir inmediatamente a 405 nm frente a 620 nm
como referencia.

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 Manual α 1-antitrypsin

* La intensidad del color cambia por sensibilidad a la temperatura. Se recomienda observar el

cambio de color y detener la reacción de la buena diferenciación.

8. RESULTADOS
Los siguientes algoritmos pueden ser usados alternativamente. Recomendamos
usar el algoritmo de “4 parámetros “
1. Algoritmo de 4 parámetros
Se recomienda utilizar una ordenada lineal de la densidad óptica y una abscisa
logarítmica de la concentración. Cuando se utiliza un eje de abscisas logarítmica, el
estándar cero debe ser especificado con un valor menor que 1 (por ejemplo, 0.001).
2. Cálculo de punto a punto
Recomendamos una ordenada lineal de la densidad óptica y una abscisa lineal de la
concentración.
3. Algoritmo Spline
Recomendamos una ordenada lineal de la densidad óptica y una abscisa lineal de la
concentración.
La plausibilidad de los valores duplicados deben ser examinados antes de la evaluación
automática de los resultados. Si esta opción no está disponible con el programa utilizado,
los valores duplicados deben ser evaluados de forma manual.

Muestras de heces
Multiplique los resultados obtenidos por el factor de dilución de 25 000 para obtener la
concentración real.

9. LIMITACIONES
Las muestras con concentraciones por encima del rango de medición deben
diluirse más y re-ensayadas. Por favor, considere esto una mayor dilución en el
cálculo de los resultados.
Las muestras con concentraciones inferiores al rango de medición no pueden ser
claramente cuantificados.
El límite superior del rango de medición se puede calcular como:
Concentración más alta de la curva estándar × factor dedilución de la
muestra que se utilizará

El límite inferior del rango de medición se puede calcular como:

límite de detección × factor de dilución de la muestra que se utilizará

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Manual α 1-antitrypsin

10. CONTROL DE CALIDAD

Immundiagnostik recomienda el uso de controles externos para el Control de
Calidad interno, si es posible.
Las muestras de control se deben analizar con cada ejecución. Resultados,
generados a partir de la lisis de las muestras de control analógica, deben ser
evaluados para la aceptabilidad utilizando métodos estadísticos apropiados. Los
resultados de las muestras de los pacientes pueden no ser válidas si dentro del
mismo ensayo uno o más valores de la muestra de control de calidad están fuera
de los límites de la mesa aceptaciones.

Rango de referencia
Basado en estudios Immundiagnostik de muestras de heces de personas
aparentemente sanas (n = 76), se estimó un valor de corte de <26,8 mg / dl.
Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de
referencia.

11.CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO

Precisión y reproducibilidad

Intra-Ensayo (n = 20)
La precisión (variación intra-ensayo) de la prueba Immundiagnostik α1-
antitripsina ELISA se calcula a partir de 20 determinaciones repetidas en cada
una de las dos muestras.

Muestra α1 -antitrypsina CV [%]

[mg/dl]
1 15.2 4
2 42.2 13

Inter-Ensayo (n = 20)
La precisión total (variación inter-ensayo) de la prueba de ELISA
Immundiagnostik α1-antitripsina se calcula a partir de datos sobre 2 muestras
obtenidas en 20 ensayos diferentes por tres técnicos en dos lotes diferentes de
reactivos durante un período de tres meses.

Muestra α1 -antitrypsina CV [%]

[mg/dl]
1 16.15 9.8
2 54.46 14.8
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 Manual α 1-antitrypsin

Recuperación final
Dos muestras fueron sobrecargadas con diferentes cantidades y medidas de α1-
antitripsina estándar con el ensayo.

Muestra no
Espiga α1 -antitripsina α1 -antitripsina
Muestras enriquecida esperada medida [µg/l]
[µg/l] [µg/l]
[µg/l]
1.65 7.95 7.2
5.0 11.3 11.4
A 6.3
15.0 21.3 20.9
45.0 51.3 46.7
1.65 7.3 7.0
5.0 10.6 10.9
B 5.6
15.0 20.6 17.5
45.0 50.6 46.7

Recuperación de la Dilución
Dos muestras de suero de pacientes se diluyeron con Buffer de lavado. Los
resultados se muestran a continuación (n = 2):
α1 -antitripsina α1 -antitrypsina
Muestra Dilución esperada medida [mg/dl]
[mg/dl]
1:12500 48.0 48.88
1:25000 24.5 23.25
A
1:50000 12.3 11.9
1:100000 6.1 6.0
1:12500 158.4 158.4
1:25000 79.3 99.0
B
1:50000 39.6 33.0
1:100000 19.8 22.1

Sensibilidad Analítica
El estándar Zero se midió 20 veces. El límite de detección se estableció como Bo
+ 2 SD y estima en 1,8 mg / dl.
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Especificidad
No se observó reactividad cruzada con otras proteínas del plasma en las heces.
No se observó reactividad cruzada con alfa-1-antitripsina en el suero del ratón.
12. PRECAUCIONES
• Todos los reactivos en el paquete del kit son para uso diagnóstico in vitro.

• Los materiales humanos usados en los componentes del kit pasaron pruebas que
demostraron ser negativas para el VIH, la hepatitis B y la hepatitis C. Sin
embargo, por razones de seguridad, todos los componentes del kit deben ser
tratados como potencialmente infecciosos.

• Los reactivos del kit contienen azida de sodio o Proclin como bactericidas. La
azida sódica y Proclin son tóxicos. Los sustratos para las reacciones enzimáticas
de color son tóxicos y cancerígenos. Evite el contacto con la piel o las
membranas mucosas.

• La solución de parada consiste en ácido sulfúrico diluido, un ácido fuerte.

Aunque está diluido, aún debe ser manejado con cuidado. Puede causar
quemaduras y debe ser manejado con guantes, protección ocular y ropa de
protección adecuada. Cualquier derrame debe limpiarse inmediatamente con
abundante cantidad de agua. No respirar los vapores y evitar la inhalación.

13. CONSEJOS TÉCNICOS

• No intercambie diferentes números de lote de ningún componente del equipo en
el mismo ensayo. Además se recomienda no junte los pocillos de diferentes
placas de microtitulación para el análisis, incluso si son del mismo lote.
• Las muestras de control se deben analizar con cada ejecución.
• Los reactivos no deben utilizarse después de la fecha de caducidad indicada en
la etiqueta del kit.
• La solución de sustrato debe permanecer incolora hasta su uso.
• Para asegurar resultados exactos, es necesaria una adecuada adherencia de los
selladores de placas durante los pasos de incubación.
• Evite la formación de espuma al mezclar los reactivos.
• No mezclar los tapones y tapas de diferentes reactivos.
• El ensayo debe realizarse siempre según el manual adjunto.

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 Manual α 1-antitrypsin
14. NOTAS GENERALES DEL TEST Y PROCEDIMIENTOS DEL TEST

• Este ensayo se produce y se distribuye de acuerdo a las directrices IVD de

98/79 / CE.

• Deben ser seguidas las directrices para los laboratorios médicos.

• Tiempo de incubación, temperatura de incubación y volúmenes de pipeteados

de los componentes se definen por el productor. Cualquier variación del
procedimiento de prueba, que no está coordinado con el productor, puede influir
en los resultados de la prueba. Immundiagnostik AG, por tanto, no se hace
responsable de cualquier daño causado por uso incorrecto.

• Las reclamamos de garantía y quejas con respecto a las deficiencias debe ser
registrado dentro de los 14 días después de la recepción del producto. El producto
se debe enviar a Immundiagnostik AG junto con una queja por escrito.

15. REFERENCIAS
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complementary feeding period in healthy breast-fed infants. Journal of pediatric
gastroenterology and nutrition, 42(5), pp.488–95.
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zyme linked immunosorbant assay in feces, serum and an enterocyte-like cell
line. Zeitschrift für Gastroenterologie,39(9), pp.769–74.
3. Faust, D. et al., 2002. Regulation of alpha1-proteinase inhibitor release by proin-
flammatory cytokines in human intestinal epithelial cells. Clinical and experimen-
tal immunology, 128(2), pp.279–84.
4. Hsu, P.-I. etal., 2010. Diagnosis of gastric malignancy using gastric juice alpha1-
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5. Lamprecht, M. et al., 2012. Probiotic supplementation affects markers of intestinal
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ded, placebo-controlled trial. Journal of the International Society of Sports Nutriti-
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 Manual α 1-antitrypsin

Journal of paediatrics and child health, Epub ahead of print.

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Símbolos Usados:

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