Universidade Tecnológica Federal do Paraná

Departamento Acadêmico de Química e Biologia

Disciplina: Biologia Celular e Microbiologia

Cultivo e Controle de Microrganismos

Profa. Lucia Regina R. Martins

novembro/2009
 Cultivo de Microrganismos

na natureza e em materiais infecciosos os microrganismos existem como culturas mistas

colônia: visível crescimento

 a partir de 1 célula vegetativa, 1 esporo ou
grupo de microrganismos

Meios de cultura:
• material nutriente apropriado para o cultivo de microrganismos
• pode ser preparado em laboratório ou comercial
• composição depende das necessidades nutricionais/tipo de microrganismo
 Material inoculado no meio de cultura (inóculo)

Incubação em estufa microbiológica

Multiplicação celular

células individuais formam grande número de células = colônia

cultura pura = colônia formada a partir de ancestral único,

característica homogênea

característica macroscópica da colônia = típica da espécie

 Meios de cultura
Critérios:

- nutrientes necessários
- água
- ajuste de pH
- presença de oxigênio
- temperatura ótima

-Inicialmente deve ser estéril: proliferação apenas de microrganismos do inóculo

Ágar:

polissacarídeo complexo de algas marinhas, agente solidificante para os meios de cultura

 não-degradável pela maioria de microrganismos
 liquefaz a 100oC, solidifica a 40oC
 tubo (ágar inclinado ou em coluna) e placas de Petri
 Meios de cultura
I – Meios Quimicamente Definidos
Composição definida;
Fonte de energia, fatores orgânicos e inorgânicos de crescimento
- Organismos exigentes = “fastidiosos” (ex.: Neisseria gonorrhoeae, Lactobacillus)

II – Meios Complexos

- nutrientes: extratos de carne, plantas, leveduras, produtos de digestão protéica (peptonas)

- pequenas variações na composição química exata
- usado de forma geral para bactérias heterotróficas e fungos
- pode ser: caldo nutriente ou ágar nutriente
Meios de cultura e Métodos para Anaeróbios
Meios de cultivo = Redutores:
reagentes que retiram oxigênio dissolvido (tioglicolato de sódio)
• recipientes fechados
• aquecimento dos tubos antes da utilização (elimina O2 dissolvido)
• em Placa de Petri: sistema fechado (jarras)
 retirada de oxigênio: reações químicas (NaHCO3 + NaBH4)
 enzima (oxirase)
 câmara com gás inerte
Técnicas Especiais de Cultivo
- Cultura de células: organismos intracelulares obrigatórios (riquétsias e clamídias)
- em organismos vivos (ex.: Mycobacterium leprae)
- capnofílicos (estufas de CO2 ou jarra com vela, reagentes em embalagens):
-Ex.: algumas bactérias patogênicas do TGI (Campylobacter)
 Meios de cultura
1. Seletivo
2. Diferencial
utilizados para a determinação da presença de microrganismos específicos

1. MEIOS SELETIVOS
- Favorece o crescimento apenas do microrganismo de interesse
- ex.: ágar sulfeto de bismuto → isolamento de Salmonella typhi em fezes
ágar verde brilhante (corante que inibe Gram-positivas, seletivo para Salmonella)
ágar Sabouraud dextrose pH 5,6: favorece fungos e inibe bactérias
2. MEIOS DIFERENCIAIS

- permite identificação de colônias de bactérias de interesse, em meio a outras espécies

- quando cultura pura: reações características

- ex.: ágar sangue→ identifica bactérias capazes de hemólise

Streptococcus são classificados como alfa-hemolíticos (halo esverdeado de
metemoglobina), beta-hemolíticos (halo claro de hemólise ao redor da colônia),
não-hemolíticos (sem alteração)

beta-hemólise alfa-hemólise
3. MEIOS SELETIVOS + DIFERENCIAS

 favorece o isolamento e reconhecimento de espécies de interesse

 requer conhecimento de peculiaridades de cultivo, características bioquímicas, etc.

Staphylococcus aureus – ↑ tolerância a NaCl, fermenta manitol produzindo ácido

→ Meio Ágar Sal Manitol

7,5% NaCl = seletivo

indicador de pH = diferencial
3. MEIOS SELETIVOS + DIFERENCIAS

Ágar MacConkey:

- contém sais biliares e cristal violeta: inibe Gram-positivas (seletivo)

- lactose: diferencia Gram-negativas fermentadoras (rosa) de não-fermentadoras (incolor)
- caracteriza salmonellas patogênicas
 Meios de enriquecimento

estimula o crescimento da bactéria de interesse (estão em menor quantidade)

normalmente líquido

pode ser considerado seletivo

transferência de inóculo → estágio de crescimento → transferência de inóculo

ex.: amostras de solo e fezes (caldo enriquecido com fenol)

caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonelas
caldo Tioglicolato para Clostridium perfringens
 Obtenção de culturas puras:
 utilizada na obtenção de colônias individualizadas
 características homogêneas
 permite a caracterização e identificação
 método de semeadura é fundamental

Método de esgotamento por estrias superficiais

alça de inoculação estéril e meio nutriente sólido

padrão de espalhamento do inóculo
após incubação = colônias isoladas → transfere para meio nutriente = cultura pura
Conservação de culturas puras
curto período (dias) = refrigerador (4 a 10oC)

 longo período: congelamento rápido em líquido (freezer -50 a -95oC)

liofilização (ampolas acondicionadas em temperatura ambiente)
retomam a viabilidade pela adição de meio líquido nutriente

• coleções de culturas puras (padrão) : American Type Culture Collection (ATCC)

Acompanhamento do crescimento de culturas bacterianas

Pode ser representado por gráficos de crescimento X tempo

 número de microrganismos: métodos diretos (contagem)
métodos indiretos (medida da atividade metabólica)

Tipos de divisão celular bacteriana:

- fissão binária
- brotamento
- conidiósporos (Actinomicetes)
- fragmentação de filamentos
Acompanhamento do crescimento de culturas bacterianas

Tempo de Geração
- é o tempo necessário para uma célula se dividir
- número de bactérias dobra a cada geração
- número de células = 2n (n =número de gerações)
- tempo de geração médio = 1 – 3 horas
- números muito grandes → usa-se escala logarítmica
Escala logarítimica X aritmética para crescimento de
populações bacteriana
 Fases do Crescimento

 demonstrado pela Curva de Crescimento bacteriano

 experimentalmente: contagem da população em intervalos regulares de tempo
 inóculo = pequeno número de células → meio líquido → acompanhamento
 Fases do Crescimento

1. Fase Lag
- pouca divisão celular → estado de latência
- duração: horas a dias
- metabolismo celular é ativo → enzimas e proteínas

2. Fase Log (crescimento exponencial)

- divisão celular ativa e intensa

- tempo de geração é constante
- maior atividade metabólica
- grande sensibilidade a alterações ambientais
 Fases do Crescimento

3. Fase estacionária
- velocidade de divisão celular decai
- número de células mortas = número de células novas
- atividade metabólica decresce
- fatores que contribuem para seu início: escassez de nutrientes, acúmulo de metabólitos,
alterações de pH
- fermentadores industriais: substituem o meio de crescimento constantemente = fase Log
é indefinida

4. Fase de declínio (morte celular)

• número de céls mortas > > número de céls novas
• população se reduz a uma fração mínima ou é
completamente exterminada
Quantificação do Crescimento Microbiano

utiliza amostras pequenas (~ 1 ml de meio líquido, 1 g de meio sólido)

diluições seriadas de alíquotas de material (material concentrado)

tamanho total da população microbiana = extrapolações matemáticas

Métodos

a) Contagem em Placa
1. Quantificação Direta b) Método do número mais provável
c) Contagem ao microscópio

a) Turbidimetria
2. Quantificação Indireta b) Peso seco
c) Atividade metabólica
 a) Contagem em Placa
1. Quantificação Direta b) Método do número mais provável
c) Contagem ao microscópio

Quantificação Direta do Crescimento Microbiano

1. Contagem em placa
- contagem do número de colônias (unidades formadoras de colônias - UFC)
- sujeito a erros: considera cada colônia proveniente de 1 bactéria
- vantagem: quantifica células viáveis
- desvantagem: tempo de espera (~24h) → produção de alimentos perecíveis
- padronização (FDA): somente placas com 25 – 250 colônias → diluição seriada da amostra
1. Contagem em placa – diluição seriada
Quantificação do Direta Crescimento Microbiano
1. Contagem em placa – técnicas para semeadura

pour plate (em profundidade)

espalhamento em placa

pour plate (em profundidade)

ágar fundido a 50oC

- volume do inóculo: 0,1 - 1,0 mL;

- desvantagens: bactérias sensíveis ao calor;
aspecto das colônias pode auxiliar no
diagnóstico
1. Contagem em placa – técnicas para semeadura

espalhamento em placa

- volume do inóculo: 0,1 mL

- placa com ágar solidificado
- espalhamento homogêneo com alça de vidro
- crescimento apenas superficial
1. Contagem em placa – técnicas para semeadura

 quando a amostra contém poucas bactérias: método de filtração

Ex.: água
- bactérias são concentradas na superfície de membranas filtrantes especiais
- volume amostra: ~100 mL
- filtro é transferido para Placa de Petri contendo meio nutriente líquido: formação de
colônias na superfície da membrana
 a) Contagem em Placa
1. Quantificação Direta b) Método do número mais provável
c) Contagem ao microscópio

Quantificação Direta do Crescimento Microbiano

2. Método do Número Mais Provável (MNP)

- método estatístico (95% de probabilidade)
- princípio: ↑ no bactérias = ↑ no diluições para crescimento negativo
- aplicação: bactérias que não crescem em meio sólido; uso de meio líquido diferencial
 a) Contagem em Placa
1. Quantificação Direta b) Método do número mais provável
c) Contagem ao microscópio
Quantificação Direta do Crescimento Microbiano
3. Contagem direta ao Microscópio
- utiliza lâmina especial (Petroff-Hausser) → 25 quadrados grande “quadriculados”
- pequeno volume de amotra: preenchimento da câmara (pode utilizar corantes)
- contagem em quadrados grandes e média
- volume no quadrado grande = 1/1,25 X 106 mL
- no de bactérias = no contado X 1,25 X 106 (para 1mL de amostra)

desvantagens:
• bactérias móveis
• céls. mortas
• necessário grande no

vantagens:
• não precisa incubação
• resultado imediato
Quantificação do Crescimento Microbiano
a) Turbidimetria
2. Quantificação Indireta b) Peso seco (bactérias/fungos filamentosos)→ filtração
c) Atividade metabólica → determinação do metabólito
Aplicação: pesquisa e indústria

a) Turbidimetria
- proliferação de bactérias em meio líquido = ↑ densidade células = ↑ turbidez
- utiliza espectrofotômetro (colorímetro): quantidade de bactérias é inversamente
proporcional à quantidade de luz que atinge o detector
- pode ser usado para gráficos de crescimento bacteriano X tempo (associado à contagem)
- desvantagem: insensível a pequena quantidade de bactérias.
Controle do Crescimento Microbiano
Medidas utilizadas para prevenir contaminações que
podem ter consequências danosas à saúde...

Você sabe o que é....

Esterilização?
Desinfecção?
Degerminação?
Sanitização?
Anti-sepsia?
 ... alguns conceitos:

1. Esterilização:

destruição de todas as formas de vida microbiana (vegetativa e esporos)

métodos: aquecimento, filtração (líquidos e gases), gases esterilizantes (óxido de etileno)

2. Esterilização comercial:
não é completa;
utiliza técnica para destruir endosporos de Clostridium botulinum (calor)
esporos de bactérias termofílicas permanecem

3. Desinfecção:
- destrói formas vegetativas de microrganismos patogênicos em superfícies ou
substâncias inertes
- não atinge esporos
- métodos: substâncias químicas (“desinfetante”), radiação UV, água fervente
ou vapor

4. Anti-sepsia
- destruição de formas vegetativas de microrganismos em tecido vivo
- substâncias químicas: “anti-séptico”

Sepse = contaminação bacteriana; Asséptico = objeto/área livre de patógenos

 ... alguns conceitos:
5. Degerminação
- remoção mecânica de microrganismos em uma área delimitada
- ex.: limpeza de pele com álcool antes da aplicação de injeção

6. Sanitização
- processo utilizado para reduzir a contagem microbiana a níveis seguros
- minimiza chances de transmissão de doenças
- ex.: lavagem de talheres, copos e pratos em água quente ou seguido de
aplicação de desinfetante químico

PRODUTOS

Biocida/germicida: substância que leva à destruição de microrganismos

 fungicida, bactericida, viricida

Bacteriostático, fungistático: substância que inibe o crescimento de bactérias

Taxa de Morte Bacteriana
- é a percentagem de bactérias que morrem por unidade de tempo
normalmente: tratamento com substâncias antimicrobianas → taxa de morte constante
Fatores de Influenciam a efetividade de antimicrobianos:

1. Carga microbiana (↑ no bactérias = ↑ tempo)

2. Ambiente: presença de matéria orgânica, temperatura, pH
3. Tempo de exposição
4. Características microbianas
 Métodos de Controle Microbiano

1. Físicos

• Calor (úmido, seco, pasteurização)

• Filtração
• Baixas temperaturas
• Alta pressão
• Dessecação
• Pressão osmótica 2. Químicos
• Radiação
• desinfetantes e anti-sépticos
• halogênios
• álcoois, fenóis
• agentes tensoativos
• compostos quaternários de amônio
• conservantes de alimentos
• antibióticos
• esterilizantes gasosos
• agentes oxidantes
• aldeídos
Métodos de Controle Microbiano

1. Físicos

• Calor (úmido, seco, pasteurização)

Ação: desnaturação de proteínas (enzimas)

aplicação: considerar degradação de outras substâncias/danos a materiais

Resistência ao calor tem grande variabilidade → parâmetros para esterilização:

• Ponto de Morte Térmica (PMT): menor ToC que destrói todos em 10 minutos (susp.líq)
• Tempo de Morte Térmica (TMT): menor tempo necessário para a destruição de todos
em uma certa ToC (cult. Líq.)
• Tempo de Redução Decimal (TRD): tempo necessário para destruição de 90% das
bactérias em uma certa ToC
Métodos Físicos de Controle Microbiano

Calor úmido
- Fervura: destrói formas vegetativas de bactérias patogênicas, fungos (e esporos) e
grande parte de vírus em 10 minutos
alguns vírus (hepatite) e endosporos resistem por mais tempo...

- Autoclave: maior temperatura devido à pressão (esterilização efetiva)

1 atm = 14,7 lb/pol2

 destrói todos os microrganismos e

endosporos em 15 min
 danifica alguns materiais
Métodos Físicos de Controle Microbiano

•Autoclave

tempo de esterilização depende do volume, permeabilidade e conteúdo do material

Marcadores de esterilização:
etiquetas, marcadores de temperatura e tempo, uso de endosporos.
Métodos Físicos de Controle Microbiano

Calor úmido
- Pasteurização:

-objetivo: eliminar microrganismos patogênicos;

utilizado em alimentos perecíveis (leite, sorvete, iogurte, cerveja)
- tempo de pasteurização diferente

Pasteurização do leite: (teste de fosfatase)

- clássica: 63oC por 30 min

- alta temperatura e tempo curto (HTST): 72oC por 15 s (serpentina)

Esterilização do leite: (armazenagem posterior sem refrigeração)

-Tratamento de temperatura ultra-elevada (UHT)
- câmara de vapor: de 74oC a 140oC → 3 s → resfriamento rápido

Tratamentos equivalentes:

↑ ToC ↓tempo = mesma eficiência

Métodos Físicos de Controle Microbiano

Calor seco
 Destruição por oxidação (combustão direta ou carbonização lenta)
Tipos:

- chama direta (bico de Bunsen)

- incineração
- em ar quente (estufa): 170oC por 2h
Métodos Físicos de Controle Microbiano

Filtração:
- Membranas especiais (porosidade): 0,45 μm; 0,22 μm; 0,01μm
- uso em materiais sensíveis ao calor: meios de cultura, vacinas, enzimas, etc.

Para o ar: filtros HEPA (0,3 μm)

Métodos Físicos de Controle Microbiano

Baixas Temperaturas:

- Refrigeração comum = bacteriostáticos (0 – 7oC)

Listera monocytogenes: bastonete gram-positivo;
infecta adultos (assintomático ou meningite – letalidade
50%); transmissão pelas fezes; em gestantes
(assintomático na mãe, meningite após nascimento,
natimorto)

- Congelamento rápido: formas latentes (ainda viáveis)

- Congelamento lento: mais letal→ ciclos congelamento-descongelamento são usados
Métodos Físicos de Controle Microbiano

Dessecação:

-liofilização: microrganismos permanecem viáveis, porém latentes na ausência de água

- aplicação: preservação de espécies microbianas em laboratório,
conservação de alimentos (café)

- resistência microbiana à dessecação é variável

ex.: Mycobacterium tuberculosis (meses)
Neisseria gonorrhoeae (1 hora)
endosporos: indefinido
vírus são resistentes
Métodos Físicos de Controle Microbiano

Radiação:
os efeitos sobre os microrganismos dependem:
- comprimento de onda
- intensidade
- duração da exposição

Radiações esterilizantes: - ionizante

- não-ionizante
Métodos Físicos de Controle Microbiano

Radiação ionizante
• raios gama, raios X, feixes de elétrons de alta energia
• comprimento de onda menor que 1nm
Poder de penetração:
raios gama (elementos radioativos) > raios X > feixes de elétrons

Principal efeito da radiação = ionização da água → radicais hidroxila reativos e tóxicos

reação com componentes celulares = morte microbiana

Tempo de esterilização:
feixes de elétrons (segundos de exposição) > raios gama (horas)

Aplicações:
Conservação de alimentos (carnes, vegetais, etc.)
Produtos farmacêuticos, materiais descartáveis de uso odontológico/médico:
-seringas, luvas, cateteres, suturas...
Métodos Físicos de Controle Microbiano

Radiação não-ionizante
• comprimento de onda acima de 1nm: luz UV
 mecanismo: danifica estrutura do DNA, inibem a replicação
 comprimento de onda mais eficaz ± 260 nm
Aplicação:
• lâmpadas germicidas (microrganismos do ar):
-Salas cirúrgicas, enfermarias, câmaras microbiológicas
• desinfecção de produtos médicos

Desvantagem:
• baixo poder de penetração: a exposição deve ser direta
• lesão à retina humana;
• exposição prolongada = queimaduras e câncer de pele.

Efeito antimicrobiano da luz solar (> 280nm):

leva à formação de oxigênio livre no citoplasma (tóxico)

pigmentos = proteção
Microondas:
• não apresentam efeito direto sobre microrganismos (efeito indireto, pelo calor)