1. INTRODUCERE..................................................................................................................2
BIBLIOGRAFIE....................................................................................................................20
1
1. INTRODUCERE
2
În România (conform OG nr.49/2000), „organismul modificat genetic” este un
organism care conţine o combinație nouă de material genetic, obţinut prin tehnicile
biotehnologiilor moderne care îi conferă noi caracteristici”.
Aplicat recoltelor, termenul de OMG se referă la plantele la care una sau mai multe
gene de la specii diferite au fost introduse stabil într-un genom gazdă folosind tehnici de
transfer genetic şi unde, în multe cazuri, asemenea gene introduse au fost capabile de a
produce o proteină. Acest proces de introducere a genelor în specii diferite (neînrudite) şi de
punere a lor în funcţiune este cunoscut sub numele de „transformare genetică”.
Obiectivul principal a fost acela de protejare a culturilor, prin crearea rezistenţei
împotriva bolilor şi dăunătorilor la plante (insecte şi virusuri) sau prin crearea unei mai bune
toleranţe la erbicidele utilizate în agricultură.
Rezistenţa împotriva insectelor s-a obţinut prin încorporarea în planta utilizată ca
materie primă pentru alimente, a unei gene ce induce producerea unei toxine, genă prelevată
de la un microorganism (Bacillus thuringiensis-Bt). Această toxină este utilizată de mult timp
ca un insecticid convenţional în agricultură, fiind netoxic pentru consumul uman. Culturile
modificate genetic care produc permanent această toxină, s-au dovedit a avea nevoie de
cantităţi mult mai mici de alte insecticide, folosite pentru situaţii specifice, când presiunea
unor populaţii mari de dăunători este mare.
Rezistenţa împotriva virusurilor se obţine prin introducerea de gene de la anumite
virusuri care provoacă bolile plantelor. Creşterea rezistenţei împotriva virusurilor face
plantele mai puţin vulnerabile la boli cauzate de acestea, mărind astfel productivitatea.
Toleranţa la erbicide se obţine prin introducerea unei gene de la o bacterie care
manifestă rezistenţă la unele erbicide. În situaţiile în care a fost imperativă utilizarea
erbicidelor, cantităţile necesare de erbicid au fost mult mai mici.
3
2. TEHNOLOGII UTILIZATE PENTRU TRANSFORMAREA
GENETICĂ A PLANTELOR
5
Informaţia genetică transferată de bacterii este conţinută, după caz, de o plasmidă Ti
(Tumor-inducing, la Agrobacterium tumefaciens) sau de o plasmidă Ri (Root-inducing, la
Agrobacterium rhizogenes). Regiunea specifică de ADN transferată (ADN-T), care se
integrează în genomul celulei vegetale, conţine gene ce codifică enzime implicate în
biosinteza fitohormonilor.
Expresia acestor gene determină formarea tumorilor sau a rădăcinilor firoase,
adevărate nişe ecologice ale bacteriilor. De asemenea, ADN-T conţine şi gene care codifică
enzime implicate în producerea şi secreţia opinelor (derivaţi ai aminoacizilor), opine pe care
bacteriile le utilizează ca surse de carbon şi azot. Agrobacterium rhizogenes mai posedă în
ADN-T genele rol, a căror funcţionare este mai puţin cunoscută (Tepfer D., 1990). Nici una
dintre aceste gene nu este implicată în transferul şi integrarea ADN-T în genomul celulei
vegetale (fig. 3). În excizia şi transferul ADN-T sunt implicate extremităţile lui, în lungime de
câte 25 de perechi de baze şi regiunea vir (regiunea de virulentă) (Hamilton C. M., 1996).
Genele din regiunea vir sunt activate de un „mesager chimic” – acetosiringona - emis
de o plantă ranită. Unul dintre produşii acestor gene este o endonuclează, care va decupla o
singură catenă din ADN-T, operând două tăieturi, la nivelul celor două extremităţi. Acest
segment de ADN-T monocatenar va fi transferat în celula vegetală (Bulman M. P., Neill S. J.,
1996).
6
funcţională şi atunci când este plasată pe un replicon diferit de cel care conţine ADN-T. Cu
alte cuvinte, ADN-T şi regiunea vir se complementează în poziţie trans pentru a determina
apariţia fenotipului de oncogenitate. Dar plasmidele Ti, de mari dimensiuni (140 - 235 kb),
sunt greu de manipulat, iar din celule tumorale nu pot fi regenerate plante normale. Pentru
valorificarea acestui sistem natural de transfer de gene, au fost deci necesare câteva
modificări. Mai precis, s-a procedat la:
dezarmarea plasmidelor Ti, prin eliminarea ADN-T;
construirea unor vectori binari, din plasmide de mici dimensiuni provenite de la
bacteria Escherichia coli;
transferul vectorilor binari în tulpini de Agrobacterium cu plasmide Ti dezarmate, dar
capabile să exercite funcţia de virulenţa în poziţie trans.
Cei mai cunoscuţi vectori de transformare sunt plasmide de mici dimensiuni, existente
într-un număr mare de copii/celulă, ce conţin gene marker pentru bacterie (gene care
determină rezistenţa la ampicilină), plasmide care sunt folosite ca vectori de clonare la
Escherichia coli (pBR 322 şi pUC).
Genele de interes codifică proteine a căror sinteză conferă plantelor transformate
caractere importante din punct de vedere economic (toleranţa la erbicide, rezistenţa la
salinitate, rezistenţa la dăunatori şi/sau agenţi patogeni etc.).
Genele marker selectabile codifică proteine care detoxifică substanţe chimice incluse
în mediul de cultură, permiţând selecţia celulelor în ai căror nuclei au fost integrate. Cele mai
folosite codifică enzime ce conferă celulelor rezistenţa la antibiotice şi erbicide.
Genele raportor (gene marker identificabile) codifică proteine care determină
formarea unui produs vizibil, ce permite identificarea celulelor transformate.
Promotorii constitutivi cei mai utilizaţi la plante sunt: 35S (de la virusul mozaicului
conopidei), pentru dicotiledonate, cel al genei actinei (de la orez) şi cel al genei ubiquitinei
(de la porumb) pentru monocotiledonate.
În construcţiile genetice folosite pentru transformare cu ajutorul sistemului
Agrobacterium se introduc şi cele două extremităţi, în lungime de 25 de perechi de baze,
provenite de la ADN-T din plasmida Ti (fig. 4), amplasate astfel încât să delimiteze
segmentul de ADN care trebuie să ajungă în genomul celulei vegetale ce trebuie transformată
(Raicu P. şi colab., 1999).
Pentru ca Agrobacterium să constituie un sistem eficient de transfer al genelor la
plante, trebuie:
7
să existe compatibilitate între tulpina bacteriană şi genotipul la care se intenţionează
transferul genelor (există tulpini cu spectru de gazde specific);
să se aplice o presiune de selecţie în favoarea celulelor transformate;
să fie regenerate plante din celulele transformate (celulele să fie competente atât
pentru transformare cât si pentru regenerare).
Rata transformării, evaluată, în final, prin numărul de plante transgenice obţinute, este
influenţată de mulţi factori, cum ar fi:
genotip;
tip de explant (embrioni imaturi, hipocotile, cotiledoane, discuri foliare etc.);
tulpină de Agrobacterium;
tip de vector;
condiţii de cultură.
Pentru fiecare specie vegetală, trebuie elaborat un sistem de transformare care să
permită obţinerea unui număr mare de plante. Indiferent de specie, etapele unui protocol de
transformare sunt:
incubarea ţesutului vegetal în suspensia bacteriană (timp de câteva minute, până la
câteva ore);
cocultura ţesutului vegetal cu bacteria (timp de 48 de ore, până la 7-8 zile);
selecţia celulelor transformate pe medii de cultură care conţin două antibiotice (unul
pentru eliminarea bacteriei şi altul pentru eliminarea celulelor netransformate);
8
regenerarea plantelor, fie direct, din celulele explantului, fie indirect, via calus.
Comparativ cu A. tumefaciens, A. rhizogenes prezintă două avantaje:
spectrul său de gazde este foarte mare;
fiecare rădăcină derivă dintr-o celulă iniţială transformată şi, fiind uşor de recunoscut,
face inutilă utilizarea markerilor de selectie.
Virusurile – vectori pentru transferul genelor la plante
Virusurile fitopatogene au ca material genetic ARN (ribovirusurile) sau ADN
(adenovirusurile) şi se transmit prin intermediul insectelor sau prin contactul cu zonele rănite
ale plantelor. Majoritatea (75 %) sunt ribovirusuri. ARN viral poate funcţiona ca ARNm (la
virusurile ARN+) sau poate servi ca matriţă pentru ARNm (la virusurile ARN-).
Adenovirusurile pot avea ADN monocatenar (geminivirusurile) sau dublu catenar
(caulimovirusurile, dintre care, cel mai cunoscut este virusul mozaicului conopidei).
Genomurile virale codifică patru sau mai multe proteine, care funcţioneaza în diferite etape
ale ciclului de infecţie. Toate codifică însă proteinele implicate în replicarea acidului nucleic
viral. ARN viral este replicat cu ajutorul unor ARN polimeraze dependente de ARN numite
replicaze. Geminivirusurile se replică via ADN complementar. Caulimovirusurile se replică
via intermediari ARN, care sunt transcrişi în ADN de către revers transcriptazele codificate de
virusuri. Majoritatea celorlalte gene virale intervine în adaptarea repliconului viral la planta
gazdă. Proteina învelişului viral, numit capsidă, protejează acidul nucleic viral în timpul
deplasării virusului de la o plantă la alta. La unele virusuri, ea poate determina şi
specificitatea vectorului. Alte virusuri codifică însă una sau mai multe proteine care
facilitează transmiterea prin intermediul vectorilor. Multe virusuri codifică şi proteine care le
faciliteaza deplasarea de la o celulă la alta, interacţionând specific cu plasmodesmele. Există,
de asemenea, şi produşi ai genelor virale ale căror funcţii nu sunt cunoscute. Sinteza
proteinelor virale de către ribozomii celulelor infectate se poate face pe două căi. Calea cea
mai frecvent folosită presupune translarea informaţiei genetice virale sub forma unei unei
singure poliproteine, care este ulterior clivată cu ajutorul proteazelor, codificate şi ele de gene
virale (Badea E. M. si colab, 2001).
Utilizarea virusurilor ca vectori nu a depăşit stadiul de „studiu de fezabilitate”,
deoarece acest sistem prezintă, pe lângă avantaje, şi unele limite.
Avantaje:
9
infecţia sistemică determină formarea unui număr mare de copii ale transgenei în
fiecare celulă (cele ce echivalează cu sinteza unei cantităţi mari de produs genetic);
nu se mai pune problema regenerării plantelor din celulele transformate.
Limitele acestui sistem de transformare a plantelor sunt legate de specificitatea de
gazdă; neintegrarea stabilă a genei transferate în genomul plantei nu asigură transmiterea
la descendenţi; riscul inducerii simptomelor bolii virale; imposibilitatea tranferării unor
fragmente de ADN de mari dimensiuni; în cazul ribovirusurilor, imposibilitatea utilizării
directe ca vectori (în asemenea situaţii, ARN viral trebuie transformat, în prealabil, în
ADN complementar).
10
În cazul aplicării electroporării, eficienţa transformării depinde de: durata şi numărul
impulsurilor electrice; tensiunea folosită (200-600 V/cm2); mediul utilizat; concentraţia ADN
plasmidial (1-10 mg/ml); dimensiunile şi configuraţia plasmidei (superrăsucită sau
linearizată); densitatea protoplaştilor în mediu (0,5 – 106/ml).
Ca şi celelalte metode de modificare genetică, transformarea protoplaştilor prezintă
atât avantaje cât şi limite.
Avantaje:
permite manipularea unui număr mare de celule;
asigură obţinerea unui număr mare de plante transformate;
nu necesită echipamente speciale.
Limite:
existenţa unui protocol reproductibil protoplast → plantă-condiţie încă neîndeplinită
la multe plante importante din punct de vedere economic;
integrarea frecventă a ADN plasmidial în genom sub formă trunchiată şi într-un mare
număr de copii.
11
condiţiile de cultură a explantelor pre-şi postbombardament;
profunzimea la care pătrund particulele în explantele bombardate.
Tabel 6. Plante modificate genetic aflate în testele de câmp în UE, SUA şi Canada, până în
anul 1999 (după Badea E. M. şi colab., 2001)
Arbori,
Plante
Plante arbuşti Plante
Cereale tehnice şi Legume Arbori
medicinale fructiferi şi ornamentale
furajere
viţa de vie
Orz Lucernă Belladonna Brocolli Măr Mestea Violete
Porumb Bumbac Mustar Varză Vişin căn africane
Ovăz In Negru Morcov Cafea Eucalip Garoafe
Orez Sfeclă Calendul Conopidă Afin t Crizanteme
Grâu furaj. Mustar alb Cicoare Kiwi Pin Gladiole
Cartof Castraveţi Măslin Plop Petunia
Rapiţă Vinete Portocal Molid
Sfeclă de Linte Papaya
zahar Salată Arahide
Trestie de Pepene Păr
zahar Ceapă Ananas
Fl.soarelui Mazăre Prun
Cartof Ardei Zmeur
dulce Dovleac Capşun
Tutun Tomate Nuc
Soia Pepene verde Viţa de vie
Zucchini
Plantele transgenice fac obiectul a 98,3% dintre testele experimentale ale unor
organisme modificate genetic. În fruntea listei se află Zea mays (38%), Brassica sp. (13%),
13
Solanum tuberosum (12%), Lycopersicon aesculentum (10%), Glicine max (9%), Gossypium
hirsutum (7%), Nicotiana tabacum (5%), Beta vulgaris (2%) şi altele.
Primele teste de câmp în condiţii de izolare au avut ca obiect plante care sintetizau
proteine marker, în special proteinele codificate de genele GUS şi NPT II, ca şi de genele care
conferă rezistenţă la erbicide (Badea E.M. şi colab., 1999). Rezultatele acestor teste
preliminare au stabilit măsura în care procedeul de transformare genetică a modificat
creşterea, dezvoltarea şi biologia reproducerii plantelor la care a fost aplicat. Cu excepţia
tomatelor, la care a fost modificat un caracter - procesul de coacere - în beneficiul
consumatorilor, la toate celelalte specii transformările au urmărit conferirea de noi caractere
agronomice în beneficiul producţiei agricole şi industriei de prelucrare a acesteia.
În majoritatea cazurilor, sunt supuse testelor de câmp soiuri transgenice caracterizate
printr-o nouă rezistenţă la erbicide, insecte, virusuri, plante transgenice androsterile, utile în
procesul de producere a seminţei hibride şi linii transgenice de tomate cu procesul de coacere
modificat (Dale P. J., 1993). Avizele referitoare la comercializarea plantelor transgenice şi a
produselor derivate din acestea se bazează pe evaluarea impactului lor asupra mediului, ca şi
asupra sanatăţii omului şi animalelor (James C., 2000). Începând din 1996, ISAAA
(International Service for the Acquisition or Agri-biotech Application) publică anual un raport
referitor la suprafeţele alocate plantelor modificate genetic pe glob. Conform raportului din
anul 2007 aceste suprafeţe însumează 114,3 milioane ha.
În intervalul 1996-2007, suprafaţa totală pe care au fost cultivate plante modificate
genetic a crescut de 67 de ori, de la 1,7 milioane ha (în 1996) la 114,3 milioane ha (în 2007).
Această creştere reflectă faptul ca tot mai mulţi fermieri, atât din ţările puternic industrializate
cât şi din ţările în curs de dezvoltare, acceptă această tehnologie. În acelaşi interval de timp a
sporit şi numărul ţărilor în care se cultivă OMG, de la 6 (în 1996) la 23 (în 2007).
La începutul anului 2008 ISAAA a emis un raport conform căruia suprafaţa globală
cultivată cu plante modificate genetic nu s-a modificat faţă de anul precedent, rămânând în
cuantum de 114,3 milioane ha. Analiştii anticipează o extindere a suprafeţei cultivate cu
plante modificate genetic, la sfârşitul anului 2020, la aproximativ 350 milioane ha (Dunwel J.
L., 1999). Potrivit ISAAA, în anul 2007 SUA deţinea cea mai mare suprafaţă cultivată cu
plante transgenice (57,7 mil ha), ceea ce reprezintă aproximativ 50% din suprafaţa globală.
Urmează Argentina (19,1 mil ha), Brazilia (15,0 mil ha), Canada (7,0 mil ha), India (6,2 mil
ha), China (3,8 mil ha), Paraguay (2,6 mil ha), Africa de Sud (1,8 mil ha) şi celelalte ţări care
14
cultivă suprafeţe <1 mil ha (Uruguay, Filipine, Australia, Spania, Mexic, Columbia, Chile,
Franţa, Honduras, Republica Ceha, Portugalia, Germania, Slovacia, România şi Polonia).
În perioada 1996-2000, cea mai mare parte din suprafaţa globală pe care au fost
cultivate plante modificate genetic a fost ocupată de soia rezistentă la erbicide. Concret, în
anul 2007:
soia transgenică a fost cultivată pe 58,6 milioane ha (64% din suprafaţa globală
cultivată cu plante modificate genetic), suprafaţă neschimbată faţă de anul precedent.
Ţările cele mai mari cultivatoare de soia modificată genetic au fost: Brazilia (15 mil
ha) şi Paraguay (2,6 mil ha);
porumbul transgenic a fost cultivat pe o suprafaţă de 35,2 milioane ha (cu 10
milioane ha mai mult decât în anul 2006) preponderent în America de Sud, Africa de
Sud şi Filipine;
bumbacul transgenic a ocupat o suprafaţă de 15 milioane de ha (faţă de 13,4
milioane ha, în 2006). India a cultivat în 2007 o suprafaţă de 2,4 milioane ha, iar
China 0,3 milioane ha de bumbac;
suprafaţa cultivată cu rapiţă modificată genetic a crescut de la 4,8 milioane ha în
2006, la 5,5 milioane ha. Zonele de cultură se găsesc predominant în Canada şi SUA.
15
„revoluţii verzi”, care să determine creşterea productivităţii agriculturii în condiţiile
conservării agroecosistemelor. Cu alte cuvinte, se impune practicarea unei agriculturi
durabile, o agricultură care, conform definiţiei FAO, presupune schimbări tehnologice şi
instituţionale orientate spre satisfacerea continuă a nevoilor întregii populaţii umane a Terrei,
atât ale generaţiilor prezente, cât şi ale celor viitoare, ceea ce presupune conservarea
pământului, a apei, a resurselor genetice animale şi vegetale, prezervarea mediului, adecvare
tehnologică, viabilitate economică şi acceptabilitate socială. Altfel spus, practicarea
agriculturii durabile înseamnă trecerea de la agricultura „proces industrial” la agricultura
„proces ecologic” (Ellstrand N. C. şi colab., 1999).
17
Legislaţia europeană referitoare la OMG şi la alimentele derivate din acestea
cuprinde:
Directiva 90/219 EEC, amendată, „Utilizarea micoorganismelor modificate genetic,
în condiţii de izolare”;
Directiva 90/220 EEC, amendată, „Introducerea deliberată a OMG în mediu
( pentru cercetare , dezvoltare şi în scop comercial )” ;
Reglementarea nr. 258/97, „Noi alimente şi ingrediente alimentare” ;
Reglementarea nr. 1139/98, „Etichetarea alimentelor produse din soia Roundup
Ready şi porumb Bt” .
18
1.946/2003 din 15 iulie 2003 privind mişcarea transfrontieră a organismelor
modificate genetic;
OM nr. 923/2005 (MO nr. 937/20.10.2005) pentru aplicarea Formularului de
prezentare a rezumatului notificării privind introducerea pe piaţă a organismelor
modificate genetic, ca atare sau în produse;
OM nr. 1295/2005 (MO nr. 42/17.01.2006) pentru aprobarea Formularului de
prezentare a rezumatului notificării privind introducerea deliberată în mediu a
organismelor modificate genetic, în alte scopuri decât introducerea pe piaţă;
OM nr. 606/2005 (MO nr. 704/04.08/2005) privind aprobarea Formularului pentru
prezentarea rezultatelor introducerii deliberate în mediu a plantelor superioare
modificate genetic, în alte scopuri decât introducerea pe piaţă;
OM nr. 55/2007 (MO nr. 81/01.02.2007) pentru înfiinţarea Registrului naţional al
informaţiei cu privire la modificarile genetice din organismele modificate genetic şi
transmiterea înformaţiei către Comisia Europeana;
OM nr. 1.829/2007 (MO nr. 856/13.12.2007) al Ministerului Mediului şi Dezvoltarii
Durabile pentru aprobarea Îndrumarului privind evaluarea riscului asupra mediului şi
sănătăţii umane ,datorate introducerii deliberate în mediu şi pe piaţă a organismelor
modificate genetic.
19
BIBLIOGRAFIE
20