BIOTEHNOLOGII DE OBŢINERE

A SUBSTANŢELOR BIOLOGIC
ACTIVE
BIOTEHNOLOGII DE OBŢINERE
A ACIZILOR ORGANICI

Obţinerea acidului lactic –

Fermentaţia lactică
 Microorganisme care produc
fermentaţia lactică
Bacteriile producătoare de acid lactic au fost
utilizate la prepararea şi prelucrarea alimentelor
din timpuri istorice.

Bacteriile lactice (capabile să transforme

substraturi de natură glucidică până la acid lactic)
sunt implicate în obţinerea alimentelor fermentate
din materii prime agricole, cum sunt: laptele,
carnea şi produsele vegetale, care deţin o
pondere importantă în industria alimentară.
În ultimii ani, bacteriile lactice au fost
folosite şi ca produse de tip probiotic.

Probioticele sunt microorganisme care, după

o administrare orală, sunt capabile să
colonizeze tractul digestiv şi să păstreze sau
să determine o creştere a florei
naturale digestive, prevenind
aderarea microorganismelor
patogene la peretele
intestinului, asigurând astfel
securitatea utilizării optime a
hranei.
Unele tulpini de bacterii lactice inhibă proliferarea
bacteriilor patogene prin producerea de acizi
organici şi prin scăderea pH-ului.

De asemenea, unele bacterii lactice produc

peroxidul de hidrogen şi previn aderarea
bacteriilor patogene la peretele intestinului.

Prin enzimele proprii, bacteriile lactice măresc

utilizarea digestivă a hranei precum şi procesele
de detoxifiere. Astfel, produc cantităţi mari de p-
galactozidază, contribuind la ameliorarea digestiei
lactozei.
Bacteriile lactice stimulează activarea sistemului
imunologic acţionând ca barieră de protecţie a
tubului digestiv.

Unele tulpini de bacterii lactice au capacitatea de

a cataboliza colesterolul şi, ca urmare, aceste
tulpini bacteriene au activitate
hipocolesterolemiantă.

Lactobacilii sunt folosiţi pentru prevenirea

infecţiilor urogenitale datorită proprietăţii acestor
tulpini bacteriene de a intra în competiţie cu
microorganismele patogene în ceea ce priveşte
aderenţa la epiteliul urogenital.
Grupul de bacterii lactice este, în general, puţin
definit, însă se acceptă că toţi membrii grupului
au drept caracteristică producerea de acid lactic
din hexoze.

Pe baza produşilor finali ai metabolizării

glucozei, bacteriile lactice care produc acid lactic
ca unic produs major se numesc
homofermentative, iar cele care produc cantităţi
egale de acid lactic, etanol, CO2 se numesc
heterofermentative.

Pentru producţia de acid lactic prezintă

importanţă numai microorganismele
homofermentative.
•Streptococcus cremoris şi Streptococcus lactis
sunt cele mai importante bacterii lactice folosite în
industrie.

Speciile preferate din punct de

vedere comercial pentru
producţia de acid lactic aparţin
grupului Lactobacillus (ex. L.
bulgaricus).
Caracteristicile bacteriilor lactice din genurile
Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus
homofermentative
temperatura optimă de creştere > 40° C
pH-ul optim este între 5 şi 7
facultativ anaerobe
randamentul producţiei de acid lactic din glucoza
este > 90 % (g/g)
pot produce acid lactic în concentraţie >3%
pot produce unul sau ambii izomeri
sunt slab proteolitice sau lipolitice
cu capacităţi sintetice foarte limitate, necesitând
prezenţa în mediu a vitaminelor din complexul B,
aminoacizilor, bazelor purinice şi pirimidinice
 Căi metabolice la bacteriile lactice
Bacteriile lactice reprezentate prin genurile:
Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus,
Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus şi
Bifidobacterium folosesc una din următoarele căi
fermentative:

1. calea homofermentativă [calea Embden-Meyerhof-

Parnas (EMP)]
2. calea heterofermentativă [calea pentozo-
fosfocetolazei (PPC)]
3. calea bifidobacteriilor [calea fructozo 6-
fosfocetolazei]
Bacteriile lactice homofermentative

Pot converti 90-95 % din cantitatea de

glucoză la acid lactic.

specii de streptococi (Streptococcus. mutans,

S. termophilus), enterococi, lactococi
(Lactococcus lactis ssp. lactis), pediococi
(Pediococcus pentosaceus, P. halophilus),
lactobacili (Lactobacillus casei, L. plantarum).
 Pediococcus
Streptococcus pentosaceus
mutans
Lactococcus lactis

Lactobacillus Lactobacillus
casei plantarum
 Glucoza este transportată şi fosforilată
rezultând glucozo-6-P care prin calea EMP
este transformat în acid lactic.

Fructozo-1-6-difosfat aldolaza, prezentă la

toate speciile homofermentative este
indispensabilă pentru funcţionarea căii EMP;
ea catalizează reacţia prin care fructozo-1,6-
difosfat este scindat în două fragmente, fiecare
fragment având câte trei atomi de carbon:

1. dihidroxiacetonfosfat (DHAP)
2. gliceraldehid 3-fosfat (GA3P).
Bacteriile lactice heterofermentative
Transformă glucoza în acid lactic (1,8 moli acid
lactic/mol glucoza) etanol, acetat şi CO2.
Nu posedă aldolază şi nu pot scinda fructozo-
bifosfatul în triozofosfat.
Leuconostoc mesenteroides

Lactobacillus brevis,
L. buchneri
Oxidează glucozo-6-fosfatul în 6-fosfo
gluconat, decarboxilat la pentozofosfat, iar
acesta va fi scindat într-o moleculă de
triozofosfat şi acetilfosfat prin intermediul
fosfocetolazei.

În final, triozofosfatul va fi convertit la acid

lactic cu formarea unei molecule de ATP, în
timp ce acetilfosfatul acceptă electroni de la
NADH generat în timpul formării pentozelor,
fiind astfel convertit la etanol, fără producere
de ATP
 Bifidobacteriile
Constituie un grup de bacterii Gram-pozitive,
strict anaerobe, care nu formează spori şi
care nu sunt patogene.

Au forma unor bastonaşe neregulate şi sunt

prezente în flora intestinală normală.

Sunt prezente în număr foarte mare în

intestinul copiilor nou-născuţi la care produc o
rezistenţă mare la infecţii şi se opun apariţiei
de agenţi patogeni.
Bifidobacterium
bifidum Bifidobacterium
breve

Bifidobacterium Bifidobacterium
longum infantis
Prin metabolizarea glucozei se produc 1
mol lactat şi 1,5 moli acetat fără formare
de CO2.

La bifidobacterii proporţia de acizi organici

obţinuţi în urma metabolizării glucozei,
absenţa aldolazei ca şi procentul foarte
scăzut de fosfofructokinază nu sunt în
conformitate cu calea heterofermentativă
şi nici cu cea homofermentativă.
Tehnologii de obţinere a acidului lactic

Acidul lactic se poate obţine prin fermentaţie, cu

bacterii selecţionate, pe medii de cultură având la
bază materii prime naturale: făină de porumb,
cartofi, melasă, zer de lapte.

Fermentaţia lactică a glucidelor decurge

după următoarea reacţie:

C6H1206 → 2 C3H603
Glucoza Acid lactic
Acidul lactic se obţine în bioreactoare cu strat
filtrant echipate cu membrane filtrante care
imobilizează bacteriile lactice.

Deoarece bacteriile producătoare de acid lactic

sunt sensibile în mediu acid, se adaugă în timpul
fermentaţiei carbonat de calciu.

În urma fermentaţiei lactice rezultă un amestec

de acid lactic şi lactat de calciu.

Pentru obţinerea lactatului de calciu se

efectuează o neutralizare completă cu carbonat
de calciu, urmată de izolarea şi purificarea
lactatului prin diferite procedee.
 Materii prime utilizate

Diferite varietăţi de glucoză precum şi materii

prime ce conţin amidon: făina de porumb, terciul
de cartofi.

Melasa fermentată cu Lactobacillus salivarius.

Parametrii optimi: pH = 5,6 şi la 46°C. Adăugarea
de 0,5% extract de drojdie reduce timpul de
fermentaţie şi creşte producţia de acid lactic cu
30%.

Zerul – se utilizează Lactobacillus bulgaricus; în

mediul de cultură se adaugă extract de drojdie şi
săruri minerale.
 Procedeul de obţinere a acidului lactic cu
tulpini de Lactobacillus delbrueckii
Descris în cadrul Institutului de Cercetări Chimico
Farmaceutice Bucureşti (ICCF) (Jurcoane Şt. şi colab.,
1994).

Procedeul cuprinde:

1. faza de hidroliză enzimatică a materiilor

prime
2. fermentaţia propriu-zisă
3. purificarea acidului lactic şi a sărurilor sale.
 Materii prime utilizate: mălai furajer, fosfat
de amoniu şi carbonat de calciu.

Pentru hidroliza amidonului s-au utilizat 2

preparate enzimatice comerciale:

1. Thermamyl 120L – conţine α-amilază

termorezistentă din Bacillus licheniformis;
enzima produce o lichefiere a amidonului
din porumb transformându-l într-un
amestec de dextrine solubile, gradul de
hidroliză al amidonului fiind de cca. 20%.
2. SAN Super 240 L – conţine β-amilază ce
hidrolizează amidonul dextrinizat cu Thermamyl,
până la maltoză şi glucoză.

Dextrinizarea (lichefierea)

Prima fază a hidrolizei amidonului se efectuează

stabilindu-se următorii parametri de lucru:
- concentraţia enzimei Thermamyl: 0,46 %
- pH optim de acţiune: 6,5
- temperatura de lucru: 800 C / 110 0 C
- timpul de acţiune: 3 ore / 30 min
Menţinerea amestecului de reacţie timp de 30
de minute la 110°C se efectuează pentru
sterilizarea mediului şi inactivarea enzimei,
înaintea celei de a doua faze de hidroliză.
 Hidroliza până la glucoză şi maltoză
(zaharificarea)

A doua fază a operaţiei de hidroliză a amidonului

se efectuează după răcirea amestecului de
reacţie rezultat la faza de dextrinizare până la
65°C.

condiţiile optime:
- concentraţia enzimei SAN: 0,61 %
- pH optim de acţiune: 5,5
- temperatura de lucru: 650 C
- timpul de acţiune: 10 ore
 Fermentaţia
Experienţele de fermentaţie se efectuează în
condiţii statice, la temperatură constantă
(42°C), pe un mediu de cultură cu
următoarea compoziţie:
- glucoză (din hidrolizatul de mălai): 10-12%
(ca glucide reducătoare)
- fosfat diamoniacal: 0,1 %
- carbonat de calciu 1%.

pH-ul s-a menţinut în intervalul 3,8-5,2 prin

corecţie cu suspensie de CaCO3.
Pe parcursul fermentaţiei (durata totală: 96 ore)
se determină concentraţia în glucide
reducătoare, concentraţia acidului lactic format
şi concentraţia lactatului de calciu.
După faza de biosinteză în mediul de
fermentaţie se acumulează acid lactic în
concentraţie de 9-10 %.
Mediul de cultură filtrat de corpii bacterieni se
concentrează până la 50 % acid lactic, produsul
rezultat fiind numit "acid lactic de uz tehnic",
utilizat în industria pielăriei ca mordant.
Purificarea acidului lactic, până la calitatea de uz
farmaceutic se realizează printr-un procedeu cu
schimbători de ioni.
 Aplicaţii practice ale acidului lactic

Este un hidroxiacid organic natural cu multe utilizări

în procese alimentare, chimice, farmaceutice,
industriale.

Aproximativ jumătate din acidul lactic produs este

utilizat în industria alimentară ca acidulant.

Acidul lactic există în două forme optic active:

izomerul L (+) este cel mai important pentru
industria alimentară, fiind singurul pe care
organismul uman îl poate asimila sub acţiunea (L+)
lactat dehidrogenazei.
Acidul lactic poate fi transformat în produse
chimice importante: etanol, propilen glicol,
polimeri acrilici şi poliesteri.

Dintr-un copolimer al acidului lactic pot fi produse

ambalaje de plastic biodegradabil sau materiale
plastice biodegradabile.

În zootehnie lactatul de calciu se foloseşte ca

aditiv furajer în amestec cu porumb, carbonat şi
fosfat de calciu.

Obţinerea de aditivi pentru hrana animalelor prin

amestecarea acidului lactic cu pulbere de zeolit,
zahăr, aminoacizi şi H2O.
 Probiotice
Termenul de probiotic a fost utilizat pentru prima dată în
1965 de Lilly şi Sillwell pentru a defini "organisme sau
substanţe care contribuie la echilibrul microbian al
intestinului".

Probioticele sunt culturi selecţionate şi concentrate de

bacterii lactice, aparţinând tulpinilor de Lactobacillus,
Enterococcus, Bacillus şi eventual drojdii din genul
Saccharomyces.

Lactobacillus şi Enterococcus sunt genuri bacteriene

prezente în cantităţi importante (104 - 108/g) în microflora
digestivă a porcilor, vacilor şi păsărilor.

Tulpinile din genurile Bacillus şi Saccharomyces nu fac

parte din microbiota digestivă normală.
 Pentru ca un microorganism să poată fi
utilizat ca probiotic trebuie să îndeplinească o
serie de criterii:

- condiţii specifice de implantare

- rezistenţă la lizozim
- toleranţă la aciditatea gastrică
- rezistenţă la săruri biliare
 Condiţii de implantare a
microorganismelor probiotice

Microorganismele utilizate ca probiotice trebuie să

depăşească trei obstacole majore în scopul tranzitării
digestive şi multiplicării în intestin:

1. în gură ele sunt supuse acţiunii litice a lizozimului,

prezent în cantitate mare în salivă
2. în stomac trebuie să reziste la acţiunea unui pH
foarte acid;
3. în intestinul subţire trebuie să reziste la acţiunea
sărurilor biliare.
 Rezistenţa la enzimele litice

Lizozimul este o β 1-4-glucanază care scindează

legăturile β 1-4 dintre acidul muramic şi resturile
glucozaminice din structura peptidoglicanului
(principala componentă a peretelui celular la
bacteriile Gram pozitive).

Bacteriile lactice posedă însă o rezistenţă naturală la

efectul litic al lizozimului, ceea ce permite trecerea lor
prin bariera bucală.

Rezistenţa naturală a bacteriilor lactice poate fi

explicată prin modificarea structurală a pereţilor
celulari, semnalată la Lactobacillus bulgaricus, la
care peretele celular este sensibil la activitatea
enzimelor autolitice.
 Rezistenţa la pH-ul gastric

Pentru evaluarea toleranţei la activitatea

stomacală, tulpinile microbiene sunt supuse
acţiunii unui suc gastric artificial, la pH = 3 şi la
temperatura de 37° C.

În aceste condiţii, bacteriile lactice au prezentat

o viabilitate de 100 %, timp de 3 ore, în timp ce
Bacillus subtilis şi drojdia metilotrofă Hansenula
polymorpha au prezentat o viabilitate cuprinsă
între 50 şi 70%
 Rezistenţa la sărurile biliare

Rezistenţa bacteriilor faţă de sărurile biliare se

determină pe medii selective conţinând bilă.

Tulpinile care se dezvoltă pot fi considerate

gazde obişnuite ale intestinului.

Există o relaţie strânsă între rezistenţa tulpinii la

sărurile biliare şi capacitatea de a coloniza
intestinul subţire.
 Modul de acţiune al probioticelor

inhibă proliferarea bacteriilor patogene prin

producerea de acizi organici şi prin reducerea
pH-ului;

produc apă oxigenată şi previn aderarea

bacteriilor patogene la peretele intestinului;

prin enzimele proprii, probioticele măresc

utilizarea digestivă a hranei, precum şi
procesele de detoxifiere;
probioticele stimulează producţia sistemului
imunologic, acţionând ca barieră de protecţie
a tubului digestiv, fiind demonstrat că
administrarea de preparate cu Lactobacillus
poate stimula producţia de gamaglobuline;

probioticele stimulează producţia de vitamine

aparţinând în general grupului B şi determină
creşterea activităţii lactozei şi maltozei;

proliferează în tractul digestiv şi sunt în

competiţie cu bacteriile patogene.
 Efectele probioticelor
Pot fi clasificate în efecte directe şi efecte indirecte.

Efecte directe:

- acidifierea mediului
- eliberarea de substanţe antibiotice şi alţi metaboliţi
cu acţiune antibacteriană
- efecte enzimatice
- efecte parietale
- efecte imunomodulatoare
- efecte de excludere competitivă a florei patogene
- efecte nutriţionale (sursă in vivo de proteine,
vitamine, aminoacizi).
Acidifierea mediului la nivelul intestinului
inhibă formarea de amine toxice şi permite
producerea de substanţe antibiotice.

Este inhibată, de asemenea, multiplicarea

germenilor patogeni de tipul colibacililor şi
salmonelelor.

Enzimele conţinute în probiotice pot

ameliora digestia propriu-zisă şi pot
corecta unele deficienţe digestive ca, de
exemplu, cele apărute în digestia lactozei.
 Efecte indirecte

Mecanismele lor sunt încă neelucidate:

- efecte asupra tranzitului intestinal

- protecţie ecologică de echilibrare a florei
endogene
- efect sanitar (refacerea apărării naturale
şi a sănătăţii în condiţii de stres)
 Microorganisme utilizate în producţia
industrială de probiotice
Lactobacilii necesari probioticelor sunt prezenţi
în: produsele lactate acide, unt, brânzeturi,
smântână, bere, vin, suc de legume, plămezi de
la fabricarea spirtului.

Cele mai utilizate microorganisme ca probiotice fac

parte din genurile Lactobacillus, Streptococcus,
Bacillus, Saccharomyces, Enterococcus.

Bacteriile lactice fermentează următoarele zaharuri:

glucoza, fructoza, galactoza, manoza, ramnoza,
arabinoza, xiloza.
 Obţinerea acidului citric

Este un acid monohidroxi-tricarboxilic, solubil în

apă și solvenți organici, care cristalizează sub
formă de cristale rombice; la temperaturi mai mari
de 175°C este convertit în acid itaconic, acid
aconitic sau alți compuși.

Aplicații practice
Acidul citric are o importanță economică deosebită,
fiind folosit frecvent în diferite industrii (alimentară,
farmaceutică, cosmetică etc.).
 Utilizări în industria alimentară:

este principalul acidulant folosit la prepararea

jeleurilor, gemurilor, dulciurilor și băuturilor
răcoritoare;

utilizat ca aromă artificială pentru diverse alimente

inclusiv băuturi răcoritoare;

previne oxidarea și râncezirea grăsimilor și

uleiurilor;

folosit în producerea brânzeturilor procesate.

Utilizări în medicină și industria farmaceutică:

sub forma citratului de sodiu este utilizat în

transfuzii pentru prevenirea coagulării sângelui;

fiind rapid metabolizat de organismul uman,

acidul citric este utilizat ca sursă de energie.
 Utilizări în industria cosmetică:

datorită pH-ului scăzut este utilizat la

prepararea soluțiilor astringente (ex. after-
shave);

intră în compoziția unor produse destinate

clătirii părului sau perucilor.
 Utilizări în alte industrii:

datorită tendinței de a forma complexe în

condiții neutre sau de pH scăzut, acidul citric
este folosit în galvanizare sau în tăbăcirea
pieilor;

intră în compoziția detergenților, înlocuind

fosfații care determină apariția fenomenului de
eutrofizare în apele efluente.
 Producerea acidului citric pe calea
fermentației

Acidul citric a fost produs inițial din sucul de lămâi.

În anul 1917, chimistul american James Currie

descoperă câteva tulpini aparținând ciupercii
Aspergillus niger (numită inițial Citromyces) care
aveau capacitatea de a sintetiza acest acid organic.

Doi ani mai târziu, compania farmaceutică Pfizer

produce pentru prima dată acidul citric la nivel
industrial.
 Microorganisme utilizate

În prezent acidul citric este obținut prin fermentație

folosind Aspergillus niger datorită ușurinței de
cultivare, randamentului ridicat (peste 80% din
substratul glucidic utilizat este convertit în acid
citric) și absenței produșilor finali nedoriți.

Se pot utiliza și levuri de tipul Candida catenula, C.

guilliermondii, C. tropicalis și Yarrowia lipolytica,
însă în amestecul final se regăsește și acidul
izocitric în proporție de 50%.
Mecanismul biosintezei acidului citric la A. niger

Calea metabolică de sinteză a acidului citric

implică catabolizarea glucozei până la doi moli
de piruvat prin reacțiile ciclului acizilor
tricarboxilici.

Spre deosebire de etanol, acidul citric nu este un

produs rezidual al metabolismului energetic, fiind
un intermediar care de obicei este degradat
complet până la CO2 și apă.
Din acest motiv, sinteza acidului citric la
microorganisme ca A. niger este o chestiune
neobișnuită cu atât mai mult cu cât
mitocondriile acestei ciuperci conțin toate
enzimele implicate în ciclul acizilor
tricarboxilici.

O parte din moleculele de piruvat pătrund în

mitocondrii unde sunt transformate în acetil-
CoA printr-o reacție catalizată de piruvat-
dehidrogenază.
Condensarea acetil-CoA cu oxaloacetat duce
la formarea citratului, exportat din
mitocondrie simultan cu introducerea
malatului prin sistemul antiport citrat/malat.

Ulterior moleculele de malat sunt convertite

intra-mitocondrial la oxaloacetat, sinteza
citratului fiind reluată.

Moleculele de piruvat rămase sunt convertite

la oxaloacetat de către piruvat carboxilaza
localizată la A. niger în citoplasmă.
Ulterior, oxaloacetatul este redus de către
malat dehidrogenază la malat care pătrunde
în mitocondrie prin sistemul descris mai sus.

Citratul produs în celulă este exportat printr-

un sistem activ ce implică proteine de
transport în afara celulei unde este
transformat în acid citric.
 Parametrii procesului de biosinteză

În timpul dezvoltării A. niger pe medii de

cultură obișnuite folosite la cultivarea fungilor,
se sintetizează cantități foarte mici de acid
citric.

Acumularea în cantități mari se realizează

doar în anumite condiții de cultivare.
concentrație ridicată de glucide (120 - 250 g/l);
concentrații mari de NH4+ (> 2 g/l) care
împiedică inhibarea fosfofructokinazei de către
citratul obținut prin transformarea piruvatului;
absența Mn; concentrații foarte scăzute de Zn
și Fe;
oxigen dizolvat >140 mbar;
pH acid (1,6 - 2,2);
concentrația fosfatului 0,2 - 1,0 g/l;
prezența unor stimulatori de biosinteză;
timp: 160 - 240 ore.
Sursa de carbon

Tipul și concentrația sursei de carbon

reprezintă cei mai importanți parametri pentru
biosinteza acidului citric.

Se utilizează doar glucide rapid catabolizate

de către fungi așa cum sunt sucroza, maltoza
și glucoza care permit obținerea cu
randamente ridicate a acidului citric.
La nivel industrial se utilizează melase provenite
din procesarea sfeclei sau trestiei de zahăr sau
parafinele, caz în care fermentația este realizată
de microorganisme ca Arthrobacter paraffineus,
Candida lipolytica și C. oleiphila.

Concentrația sursei de carbon trebuie să fie

ridicată (în general peste 200 g/l), fiind necesară
acumulării fructozo-2,6-bisfosfatului – unul din cei
mai puternici activatori ai fosfofructokinazei
(enzimă cheie în glicoliză).

La concentrații mai mici de 100 g/l randamentul de

biosinteză scade semnificativ.
Sursa de azot

Este reprezentată de sărurile de amoniu, nitrați,

uree.

În cazul utilizării melaselor din sfecla de zahăr ca

sursă de carbon care au conținut ridicat de azot,
adăugarea acestor compuși nu este necesară.

Aportul exogen de ioni de amoniu în timpul

fermentației poate stimula producerea acidului citric.
În aceste situații se recomandă ca suplimentarea
mediilor de cultură să se realizeze cu surse de azot
care să nu ducă la creșterea pH-ului.
Sursa de fosfor

Este reprezentată de melasele folosite,

diferența fiind asigurată de regulă prin
suplimentarea mediului de cultură cu fosfor
monopotasic sau acid fosforic.

Fosforul reglează atât procesul de creștere al

masei celulare cât și utilizarea glucidelor în
vederea sintezei de acid citric
Prezența unor metale (Fe, Zn, Cu, Mn, Co)
în cantități mici este esențială dezvoltării
ciupercii A. niger.

Unele dintre ele pot inhiba acumularea

acidului citric, fiind obligatorie absența (Mn2+)
sau prezența lor în concentrații care limitează
creșterea (Fe3+ și Zn2+).

Concentrații de doar 2 μg/l Mn în mediul de

cultură pot reduce acumularea acidului citric
cu peste 20%.
Nu se cunosc cu exactitate mecanismele
biochimice responsabile de inhibarea
biosintezei.

În cazul Mn se pare că reducerea acumulării

de acid citric este determinată de mai multe
cauze: inhibarea transportului activ al citratului
în mediul extracelular, alterarea compoziției
membranei celulare, scăderea sintezei de
ADN și proteinelor implicate în respirația
celulară, modificarea morfologiei hifelor
De cele mai multe ori concentrația acestor ioni
metalici în mediul de cultură este crescută
prin aportul adus de melasele folosite ca
sursă de carbon care pot conține cantități mari
de Fe3+, Mn2+ și Zn2+ → inhibă atât creșterea
masei celulare cât și procesul de biosinteză.

Din aceste motive este necesară o purificare

a melaselor, cele mai bune rezultate
obținându-se cu ferocianura de potasiu care
permite sedimentarea ionilor de fier și a altor
metale grele
Obținerea acidului citric cu randamente
superioare se poate realiza doar în condiții de
aerare.

Întreruperea aportului de oxigen, chiar și pentru

perioade scurte de timp duce la scăderea
ireversibilă a biosintezei, deși creșterea miceliului
nu este afectată.

Procesul de fermentație decurge cu eliberare de

căldură, astfel încât producerea acidului citric
necesită răcirea permanentă, ceea ce duce la
creșterea costurilor de producție
pH-ul

Producerea cu randamente superioare decurge

la un pH acid (< 2,5), ușor de menținut datorită
acumulării produsului final în mediul de cultură
pe măsura biosintezei.

Există și situații când glutamatul prezent în

melasele utilizate ca surse de carbon
funcționează ca sistem tampon, modificând pH-ul
mediului de cultură la 4 - 5. În aceste cazuri nu
se mai obține acidul citric, ci alți acizi organici:
gluconic sau oxalic (toxic pentru A. niger).
 Procesul tehnologic de fermentație

Din punct de vedere tehnologic, procesul de

fermentaţie a acidului citric cu Aspergillus
niger poate fi realizat la suprafaţă (10-11 zile)
sau în profunzime (6-7 zile).

Însămânţarea se realizează la 36 - 42°C,

după care temperatura coboară la 34 - 36°C
şi se menţine la această valoare timp de 24-
36 ore, cât durează dezvoltarea masei
microbiene.
Pe toată durata elaborării acidului citric
temperatura se menţine la 30 - 32°C.

Acumularea acidului citric, începe după 25 - 30

ore de fermentaţie, iar viteza maximă de
acumulare se atinge în zilele a 5-a şi a 6-a.

Din cantitatea totală de sursă de carbon, 10 -

15% se foloseşte pentru dezvoltarea biomasei.

În final, se obţine un amestec de acizi organici, în

care acidul citric reprezintă 80 - 95%.
 După terminarea fazei de fermentaţie şi
filtrarea miceliului, soluţia apoasă se supune
prelucrării pentru separarea acidului citric
cristalin.

Separarea acidului citric sub formă de cristale

se bazează pe proprietatea unor săruri ale
sale (sare de calciu) de a nu se dizolva în apă
şi se realizează în următoarele etape:

1. precipitarea acidului citric sub formă de sare

de calciu şi filtrarea acestuia;
2. tratarea cu acid sulfuric şi separarea
sulfatului de calciu precipitat;

3. decolorarea cu cărbune activ,

demineralizarea şi concentrarea soluţiei de acid
citric;

4. cristalizarea şi filtrarea;

5. uscarea (în strat fluidizat).

Din procesul de obţinere a acidului citric
rezultă soluţii apoase (conţinând zahăr,
aminoacizi, acizi carboxilici) şi miceliu.

Soluţiile apoase pot fi utilizate ca medii de

cultură pentru biostimulatori, iar miceliul uscat
poate fi utilizat ca adaos în hrana păsărilor,
având un efect stimulator în procesul de
creştere.
 Biotehnologia obţinerii acidului
gluconic

Se utilizează în industria farmaceutică pentru

prepararea gluconatului de calciu (utilizat în
tratamentul rahitismului, hipo-calcemiei şi
spasmofiliei.

Se poate obţine prin oxidarea glucozei pe cale:

- chimică: ca agenţi de oxidare se folosesc apa de

clor şi apa oxigenată; nu se obţine un produs pur,
întrucât molecula de glucoza se rupe nespecific,
rezultând un amestec de acizi organici.
- electrochimică: se foloseşte oxigenul rezultat în urma
electrolizei apei şi procedeul este foarte scump
datorită consumului de energie electrică; oxidarea
este, de asemenea, nespecifică.

- biochimică: cel mai comod şi ieftin de obţinere a

acidului gluconic; reacţia este specifică, fiind
realizată de enzima glucozoxidază; din reacţie nu
rezultă produşi secundari.
Pentru oxidarea biochimică a glucozei la acid gluconic
au fost descrise procedee de fermentaţie de suprafaţă,
care durează 11-12 zile şi au loc cu randamente mici,
de 70-80%.

Cu timpul, aceste procedee au fost înlocuite cu

procedee de fermentaţie în profunzime (adică
procedee submerse), care utilizează microorganisme
din genul Aspergillus.

În mediul de cultură, conţinând 20-30% glucoză, sursa

de azot organic (extract de porumb), uree, substanţe
minerale (MgSO4 • 7 H20, KH2PO4, NH4H2PO4) se
cultivă microorganisme din clasa fungilor, de obicei
Aspergillus niger, la temperaturi între 25 şi 28°C şi la
un pH de 6,5.
 Pe parcursul fermentaţiei, pH-ul se corectează cu NaOH
40%, dacă se doreşte obţinerea gluconatului de sodiu sau
cu Ca(OH)2, dacă se intenţionează obţinerea gluconatului de
calciu.

Acid gluconic
Instalaţie de producere a acidului gluconic prin biosinteză: 1- compresor; 2 -
filtru de aer; 3 - rezervor mediu de cultură; 4 - rezervor soluţie NaOH;
5 - rezervor antispumant; 6 - fermentator; 7 - filtru-presă; 8 - pompă; 9 - rezervor;
10 - concentrator; 11 - condensator; 12 - reactor neutralizare; 13 - cristalizator;
14 - moară cu bile
La finele fermentaţiei mediul se filtrează pe filtrul-
presă pentru separarea biomasei.

Soluţia obţinută se concentrează în evaporatorul

pelicular, după care este trimisă în aparatul de
neutralizare cu NaOH sau Ca(OH)2, iar de aici la
cristalizare într-un cristalizator răcit la 2-3° C.

Sarea acidului gluconic se purifică suplimentar prin

recristalizare.

Pentru obţinerea acidului gluconic s-au pus la punct

şi procedee de cultivare cu Acetobacter oxydans şi
Acetobacter gluconicum.
Biotehnologia obţinerii
acidului itaconic

Este o substanţă cristalină, solubilă în apă şi în unii

solvenţi organici.

Descoperit de Konishita în anul 1929, are în prezent

o deosebi importanţă practică pentru industria
materialelor plastice, industria detergenţilor şi a
fibrelor sintetice, fiind utilizat şi ca aditiv la fabricarea
de lubrifianţi.

Pentru obţinerea acidului itaconic au fost studiate

atât procedee chimice cât şi procedee biochimice,
însă aplicabilitate în industrie o au numai cele
biochimice.
 Biosinteza acidului itaconic se realizează prin
cultivarea microorganismului Aspergillus terreus, pe
un mediu conţinând glucoza sau alţi hidraţi de carbon
capabili a se oxida până la acid itaconic.

Prin studiul dinamicii acumulării acidului itaconic, într-un

proces de biosinteză care utilizează ca substrat glucoza,
s-a pus în evidenţă faptul că iniţial se formează acizii
aconitic, succinic, tartric, iar apoi acidul itaconic.
Mecanismul de biosinteză al acidului itaconic
folosind Aspergillus terreus nu este elucidat pe
deplin.

La nivel industrial se utilizează numai procesele de

fermentaţie în profunzime.

Un prim procedeu de obţinere a acidului itaconic

prin fermentaţie în profunzime a fost brevetat de
Kane în 1945.

Conform acestui brevet, randamentul de obţinere a

acidului itaconic este 25-28 %, iar durata de
fermentaţie este cuprinsă între 7 şi 14 zile la 34-38°
C.
Extractul de porumb adăugat în mediile de
cultură constituie un excelent stimulator pentru
creşterea microorganismelor.

Factori care influenţează procesul de biosinteză

al acidului itaconic:

- concentraţia zahărului (minim 20-25 %)

- natura şi cantitatea sărurilor minerale (sulfatul
de magneziu)
- pH-ul (2,1 – 2,4 pentru medii pe bază de
glucoză)
- aeraţia
- temperatura
- durata fermentaţiei.
 Dinamica procesului de biosinteză a
acidului itaconic
Dacă la însămânţare se foloseşte o cantitate de
0,5 g/m3 spori de Aspergillus terreus atunci
durata fazei g de creştere este de 24 de ore, iar
viteza maximă de acumulare a biomasei se
obţine după 60 de ore de fermentaţie.

Procesul de fermentaţie se conduce sub agitare

(110-120 rot/min) şi o bună aeraţie la temperatura
de 33-34° C în primele 24 de ore (creşterea
biomasei) şi apoi 70 de ore la 34-36° C, când are
loc formarea acidului itaconic.
 Separarea acidului itaconic
Folosind solvenţi organici, tehnologia este foarte scumpă,
iar metoda precipitării nu poate fi aplicată deoarece
majoritatea sărurilor sunt solubile.

1) tratarea biomasei cu cărbune activ şi filtrarea ei

2) evaporarea sub vid a soluţiei apoase şi cristalizarea
acidului itaconic
3) filtrarea acidului itaconic
4) recristalizarea acidului itaconic
5) prelucrarea soluţiilor apoase.

Utilizarea schimbătorilor anionici permite separarea acidului

itaconic din apele reziduale, mărindu-se randamentul de
separare până la 90-92%