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Instituto de Biociências – IBB

Departamento de Microbiologia e Imunologia

Curso de Biomedicina

Disciplina de Microbiologia Médica

Aluno (a): _________________________________

Botucatu – 2012
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ASPECTOS GERAIS DA CARACTERIZAÇÃO

MACROSCÓPICA DAS COLÔNIAS FÚNGICAS

A cultura de um microrganismo refere-se à capacidade que este

tem de crescer em meios nutritivos artificiais. Esse crescimento é
evidenciado macroscopicamente pela formação de uma unidade
estrutural, denominada colônia.
As colônias de determinados fungos geralmente apresentam
morfologias típicas, quando estes são semeados em meios com a
mesma composição química e submetidos às mesmas condições de
incubação. Através dos seus aspectos macro-estruturais de uma colônia,
é possível sugerir a espécie fúngica presente na cultura. Sendo assim, o
conhecimento do aspecto macro-morfológico das colônias é de extrema
utilidade para a sugestão da identificação preliminar de determinada
espécie fúngica.
Na observação das características culturais de determinado fungo,
devemos ressaltar os seguintes aspectos, segundo proposto por SIDRIM,
JJC, BRILHANTE, RSN, ROCHA, MFG. (Cap. 8 - Aspectos Gerais de
fungos filamentosos e dimórficos na apresentação filamentosa. In:
SIDRIM, JJC, ROCHA, MFG. Micologia Médica ‘a luz de autores
contemporâneos. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2004, p. 83-86),
com algumas modificações:
a) tamanho da colônia: pode ser bastante variável na dependência da
quantidade e qualidade de substrato ofertado e da espécie fúngica.
Por exemplo, os fungos zigomicetos apresentam velocidade de
crescimento rápido e suas colônias tendem a ocupar toda a superfície
da placa. O mesmo ocorre com as espécies do gênero Aspergillus
quando cultivadas a 35oC. Já o fungo Piedraia hortae apresenta
crescimento muito lento, sendo sua colônia restrita ao centro da placa
de Petri.
b) bordas: na periferia das colônias fúngicas podem ser observados
muitos desenhos que vão desde morfologias bem delimitadas até
achados de projeções irregulares que lembram franjas. Além disso,
também pode ser observada, nas bordas das colônias uma variação
da coloração em relação ao centro. Esse achado é peça-chave para
indicar o possível patógeno implicado, como por exemplo, nas
colônias de Sporothrix schenckii, onde se observa que as bordas
tornam-se escuras com o envelhecimento da cultura.
c) textura: é a característica mais importante utilizada na caracterização
de uma colônia fúngica. A textura descreve a altura das hifas aéreas.
As colônias podem ser classificadas quanto à textura em diversos
tipos:
colônias algodonosas: aquelas que se assemelham com
algodão,
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colônias furfuráceas: aquelas que lembram um punhado de

substância farinácea espalhada em uma
superfície,
colônias penugentas: aquelas nas quais se evidenciam
estruturas que lembram penas de aves
dispersas na superfície do meio,
colônias arenosas ou pulverulentas: aquelas que lembram areia
de praia,
colônias veludosas: aquelas que apresentam o aspecto de tecido
aveludado,
colônias membranosas: aquelas que são bem aderidas à
superfície do meio de cultura, recobrindo-o
como uma película,
colônias glabrosas: aquelas com aspecto compacto, coriáceo,
podendo ter superfície lisa ou irregular e
sempre com ausência de filamento, ou seja,
não algodonosa,
colônias cremosas: aquelas que apresentam aspecto visual
cremoso, sendo comumente observados no
grupo das leveduras e da maioria das colônias
bacterianas.
d) relevo: diz respeito à topografia da colônia e pode ser:
colônias cerebriformes: apresentam topografia de altos e baixos,
fazendo circunvoluções que lembram as
observadas no cérebro,
colônias rugosas: nada mais são do que variações da
cerebriforme, porém as pregas
topográficas são menos evidentes, sendo
as vezes radiais partindo do centro da
colônia,
colônias apiculadas: caracterizam-se pela presença de uma
saliência na parte central lembrando um
pequeno cume,
colônias crateriformes: são aquelas que se aprofundam no meio
de cultura, assumindo o aspecto de cratera.
e) pigmentação: quando se fala em pigmentação de uma colônia
fúngica deve-se levar em consideração alguns aspectos primários:
- se o pigmento é encontrado na superfície da colônia ou no
reverso,
- se o pigmento é encontrado tanto na superfície quanto no reverso
da colônia,
- se o pigmento é ou não difusível no meio de cultura,

- se o pigmento está presente apenas nos esporos e ausente nas hifas,

como observado na maioria das espécies de Aspergillus e Penicillium, ou
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em ambos (hifa e esporos), como observado nas espécies de fungos

causadores de cromoblastomicose (Ex. Fonsecae pedrosoi).
Observa-se uma grande variedade de cores na pigmentação
fúngica que passam pelos tons de verde, amarelo, vermelho e castanho
até ao preto.

Portanto, a caracterização de uma colônia visando a auxiliar a

identificação de determinada espécie fúngica, nada mais é do que um
conjunto de características subjetivas, de expressão fenotípica,
encontradas em determinada espécie. Dessa forma, deve-se sempre ter
em mente que, embora a colônia fúngica possa sugerir, indicar e muitas
vezes até acertar o caminho da identificação, não se deve, contudo,
considera-la como única ou principal forma de identificação fúngica.
Quando empregada como único critério pode levar a diagnósticos pouco
precisos ou errôneos.

PRÁTICA 1 – CARACTERÍSTICAS GERAIS

DOS FUNGOS

EXERCÍCIO 1 – ASPECTOS MACROSCÓPICOS DE CULTURAS

DE FUNGOS LEVEDURIFORME E FILAMENTOSO

a) finalidade: auxiliar na identificação das colônias fúngicas.

b) fundamento: As colônias de determinados microrganismos

geralmente apresentam morfologias típicas, quando estes são
semeados em meios com a mesma composição química e submetidos
às mesmas condições de incubação. Através do aspecto macro-
morfológico da colônia é possível sugerir a espécie fúngica presente
na cultura. Entretanto, antes de se determinar as características da
cultura de determinada colônia, é preciso certificar-se de que a cultura
está pura, ou seja, não deve ser evidenciada a presença de outros
microrganismos através da observação de colônias diferentes em uma
mesma placa ou tubo. Os estudos macroscópicos devem ser
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baseados nas seguintes características: tamanho, bordas, textura,

relevo (no verso e reverso da colônia) e pigmentação.

Exemplo:

Frente: colônia de fungo (Filamentoso ou Leveduriforme), de

textura (algodonosa, aveludada, pulverulenta, glabra, cremosa,
etc), de relevo (cerebriforme, rugoso, crateriforme, apiculado,
liso) de coloração (...), com bordos (regulares ou irregulares).

Verso: (presença ou ausência) de fendas ou dobras, coloração

(...), e (ausência ou presença) de pigmento difusível no meio de
cultura.

Descrever as características coloniais das culturas de Saccharomyces

sp. (cultura A) e Aspergillus sp. (cultura B), conforme o modelo que
acima.

Aspergillus sp.

Saccharomyces sp.
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EXERCÍCIO 2 - ASPECTOS MICROSCÓPICOS DAS CULTURAS

DE FUNGOS - COLORAÇÃO COM LACTOFENOL AZUL
ALGODÃO (LFAA)

a) finalidade: O método de coloração com Lactofenol Azul Algodão é

usado para preparar exame microscópico de colônias de fungos. É
uma técnica que tem a finalidade de visualizar o micélio vegetativo
e reprodutor de um fungo filamentoso, como também as
características da célula vegetativa e reprodução por brotamento
de leveduras.

b) técnica:

1. Colocar uma gota de lactofenol azul-algodão sobre a lâmina.

2. Retirar pequeno fragmento da cultura de bolor ou uma

alíquota da cultura de levedura, utilizando alça ou fio de
platina.

3. Colocar o fragmento da cultura ou a alíquota de levedura

sobre a gota de lactofenol e homogeneizar.

4. Cobrir com lamínula e examinar ao microscópio nas objetivas

de 10 e 40 vezes.

Desenhar as estruturas observadas:

Aspergillus sp. Saccharomyces sp.

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c) interpretação

Na coloração com lactofenol azul algodão é possível observar que

existem dois tipos morfológicos de fungos: as leveduras e os filamentos
(bolores ou micélios).
As leveduras são unicelulares e podem ter diferentes formatos (oval,
circular, naveta, etc) e se reproduzem por brotamento (únicos ou
múltiplos) ou por fissão (mais raro).
Os bolores são fungos filamentosos possuindo hifas septadas ou
cenocíticas. Na sua reprodução assexuada, é possível visualizar no
micélio vegetativo os clamidósporos e artrósporos, e no micélio
reprodutor, os esporos endógenos (esporangiósporos) em esporângios
(estrutura fechada) e esporos exógenos (conidiósporos, também
denominados simplesmente conídios ou conídias) em conidióforos.
A vantagem desta técnica é de ser fácil e rápida a sua preparação, e
a desvantagem é que em muitos fungos não se observa os órgãos de
frutificação.

PRÁTICA 2 – FUNGOS CAUSADORES DE

MICOSES SUPERFICIAIS E CUTÂNEAS

EXERCÍCIO 1 - PESQUISA DE Malassezia sp. POR CULTURA EM

MEIO SABOURAUD ADICIONADO DE CLORANFENICOL,
ACTIDIONE E 1% DE AZEITE DE OLIVA.

a) Finalidade: este meio enriquecido com substrato lipídico é

utilizado para pesquisar o fungo Malassezia furfur ou outras
espécies de leveduras lipofílicas, normalmente associadas ao
couro cabeludo e envolvidas na etiologia Pitiríase versicolor.
Pesquisa de portadores assintomáticos (couro cabeludo).

b) Procedimentos de coleta da amostra: umedecer o swab em

solução salina estéril e a seguir friccionar no couro cabeludo,
girando o swab em todos os lados.
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c) Cultura do Material Clínico

1. Abrir cuidadosamente a placa próximo ao bico de Bunsen;
2. Friccionar suavemente o swab sobre a superfície do meio de
cultura;
3. Identificar as placas com o número do grupo e data;
4. Vedar as placas com filme plástico;
5. Incubar as placas em estufa à 35ºC, por 7 dias.

d) Interpretação (a ser feita na próxima aula)

Observar as placas semeadas com o material a 35ºC por 7 dias e

verificar se houve o crescimento de leveduras. Selecione uma
colônia e faça a descrição macroscópica e preparação de lâminas
com LFAA. Observar ao microscópio e desenhar. Discutir o
significado clínico dos achados micológicos dos demais grupos.

EXERCÍCIO 2 - OBSERVAÇÃO DE CULTURAS E LÂMINAS DE

FUNGOS CAUSADORES DE MICOSES SUPERFICIAIS E CUTÂNEAS

2.1. Examinar ao microscópio material raspado de pele de pacientes com

Pitiriase versicolor: Desenhar as estruturas observadas.
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2.2. Descrever as características coloniais, observar e desenhar as

estruturas microscópicas dos seguintes fungos:

Trichosporon sp.

Hortae werneckii

Microsporum canis

Microsporum gypseum
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Trichophyton mentagrophytes

Epidermophyton flocosum

EXERCÍCIO 3 – PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS CLÍNICAS

SUSPEITAS DE MICOSES SUPERFICIAIS E/OU CUTÂNEAS. FAZER
EXAME MICOLÓGICO DIRETO E CULTIVO EM ÁGAR MYCOSEL.

Procedimento:

1 – abrir a lâmina contendo a amostra da lesão do paciente;

2 – separar metade para cultura em ágar Mycosel;
3 – adicionar uma gota de KOH 20 – 30% sobre a amostra;
4 – aquecer rapidamente na chama do Bico de Bunsen para ajudar no
processo de clareamento;
5 – observar ao microscópio para visualização de elementos fúngicos.

Amostra clínica:________________________________________

Resultado do Micológico Direto:

__________________________________________________________

Resultado da Cultura:
__________________________________________________________
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PRÁTICA 3 - FUNGOS CAUSADORES DE

MICOSES SUBCUTÂNEAS

EXERCÍCIO 1 – Observar as lâminas de cortes histológicos de pacientes

com Cromoblastomicose e Lacaziose. Desenhar as estruturas fúngicas
observadas.

Cromoblastomicose Lacaziose
coloração: HE coloração GMS

EXERCÍCIO 2. Descrever as características coloniais, observar e

desenhar as estruturas microscópicas dos seguintes fungos:

Sporothrix schenckii (Fase Micelial)

Sporothrix schenckii (Fase Leveduriforme)

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Pythium insidosum

Coloração com LFAA produção de esporângio

em material vegetal

Phialophora verrucosa

Cladophialophora carrionii

Fonsecaea pedrosoi
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PRÁTICA 4 - FUNGOS DIMÓRFICOS

CAUSADORES DE MICOSES SISTÊMICAS

EXERCÍCIO 1. Descrever as características coloniais, observar e

desenhar as estruturas microscópicas dos seguintes fungos:

Paracoccidiodies brasiliensis (Fase Micelial)

Paracoccidiodies brasiliensis (Fase Leveduriforme)

Histoplasma capsulatum (Fase Micelial)

Histoplasma capsulatum (Fase Leveduriforme)

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PRÁTICA 5 - FUNGOS CAUSADORES DE

MICOSES OPORTUNISTAS

EXERCÍCIO 1. Descrever as características coloniais, observar e

desenhar as estruturas microscópicas das espécies de Aspergillus:

Aspergillus flavus

Aspergillus fumigatus

Aspergillus niger
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EXERCÍCIO 2. Observar ao microscópio e desenhar as estruturas

visualizadas de esfregaço de secreção vaginal de paciente com
vulvovaginite por C. albicans corado pelo método de Gram ou Giemsa.

EXERCÍCIO 3. Descrever as características coloniais de cultura de

Candida albicans cultivada em agar Sabouraud, observar e desenhar as
estruturas microscópicas: esfregaço de cultura corado com LFAA,
clamidósporo e formação de Tubo Germinativo.

Candida albicans

esfregaço de cultura filamentação tubo germinativo

e clamidoconídio
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EXERCÍCIO 4. Diferenciação de Candida albicans de outras espécies de

Candida pelo método de CHROMagar-Candida®. Observar o
crescimento das colônias e diferenciar pela coloração:
Candida albicans – cor:_______________________
Candida tropicalis – cor:_______________________
Candida spp. – cor: __________________________

EXERCÍCIO 5. Descrever as características coloniais de Cryptococcus

neoformans cultivado em agar Sabouraud (SAB) e Agar Semente de
Niger (NSA). Observar as características microscópicas de esfregaço de
cultura corado pelo Nankin.

Cryptococcus neoformans

(cultivado em Agar Sabouraud) (cultivado em Agar Semente de Niger)

coloração pela tinta da China (Nankin)

EXERCÍCIO 6. Diferenciação entre C. neoformans e C. gattii pelo método

de CGB (Canavanina-Glicina-Azul de Bromotimol)

Teste CGB positivo Teste CGB negativo

Cor:____________________ Cor: _________________

Espécie: ________________ Espécie: ______________