Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Departamento de Orgánica
Métodos de instrumentación y separación analítica

PRÁCTICA 1:
FACTORES QUE INFLUYEN EN LAS
SEPARACIONES CROMATOGRAFICAS

GRUPO: 6FM1
28 de febrero de 2018
 OBJETIVOS:
GENERAL:
 Analizar la influencia de algunos factores que afectan las separaciones
cromatográficas.
ESPECÍFICOS:
 Demostrar el efecto de la polaridad del disolvente.
 Demostrar el efecto del volumen de muestra aplicada.
 Demostrar el efecto de concentración de la muestra.
 Demostrar el efecto de la naturaleza del disolvente de la muestra.
 Analizar la presencia de otros analitos.

RESULTADOS:
POLARIDAD DEL VOLUMEN DE CONCENTRACIÓN DE EFECTO DE
DISOLVENTE MUESTRA LA MUESTRA MATRIZ

Disolvente 𝑹𝒇 𝑹𝒇 µL Ancho de µg/mL A B

(Sn I)
(RM) banda (mm)
AcOEt. 0.65 0.92 1 0.575 1 0.43 0.56 -
AcOEt:Hex 0.51 0.75 2 0.65 5 0.43 0.56 -
(1:1)
AcOEt:Hex 0.14 0.78 4 0.65 10 0.43 0.66 -
(3:7)

FIGURA
FIGURA1:3:Efecto
Efectodedelalapolaridad
concentración
del disolvente,
de analito.
Rojo
Aplicaciones
de metilodey2sudan
µL de 1,I en
5 y diferentes
10 mg/mL fases FIGURA
FIGURA 4: Efecto
2: Efecto de matriz,
del volumen rojo de1,metilo
de muestra, 2y
móviles. AcOEt, AcOEt:Hexano (3:7), (1:1) disuelto en; CH3CN, metanol y agua.
4 µL de rojo de metilo
 DISCUSIÓN:
En la primera experiencia se midió el efecto de la polaridad del disolvente. Para realizar ésta
experiencia se procedió a utilizar acetato de etilo y una mezcla de hexano/acetato de etilo en 2
diferentes concentraciones como fases móviles para observar el efecto que tendrá cada fase
móvil al momento de eluir rojo de 3 metilo y sudan 1. Después de correr las placas se pudo
observar que en todas las fases móviles empleadas el sudan I fue el que más corrió. El sudan I
es un compuesto orgánico que contiene 3 anillos de benceno, en los cuales 2 de ellos están
unidos mediante un doble enlace entre 2 nitrogenos, y en uno de los bencenos tiene un grupo
hidroxilo. El rojo de metilo es un compuesto orgánico compuesto de 2 anillos de benceno unidos
por un doble enlace entre 2 nitrogenos; uno de los anillos contiene un grupo amino terciario,
mientras que el otro benceno contiene un grupo carboxílico. El sudan I, al tener un grupo
hidroxilo unido a dos anillos de benceno le confiere una naturaleza más cercana a la no polar en
comparación al rojo de metilo, por lo que, la retención que tendrá el sudan I a la fase
estacionaria es mucho menor que la del rojo de metilo debido a que el gel de sílice tiene una
naturaleza polar (1). El acetato de etilo es un disolvente medianamente polar, con un carácter
más a lo polar que a lo no polar, por lo que la afinidad por el sudan I es mucho mayor que la que
éste tiene por la fase estacionaria. El rojo de metilo tiene un carácter más polar que el sudan I,
por lo que éste es más a fin a la fase estacionaria; por lo tanto, su retención en la fase
estacionaria es mucho mayor y su afinidad por el acetato de etilo ligeramente menor que la del
sudan I.
Al emplear una mezcla de hexano/acetato de etilo (1:1) se logra que la fase móvil obtenga una
naturaleza un poco menos polar. Debido a ésta naturaleza, el rojo de metilo comienza a ser
retenido con mayor fuerza a la fase móvil debido a que su afinidad por la fase estacionaria es
mayor que a la que tiene por la fase móvil; el sudan I al ser más no polar que el rojo de metilo
sigue teniendo una mayor afinidad por la fase móvil que por la fase estacionaria. Al modificar
las proporciones de la mezcla de disolvente hexano/acetato de etilo (7:3), se logra obtener una
fase móvil con un carácter mucho más no polar lo cual provoca que el rojo de metilo pierda aún
más la afinidad por la fase móvil, por lo que es retenido con mayor fuerza por la fase estacionaria
(2)
. El sudan I, con un carácter más no polar que el rojo de metilo, comienza a perder un poco de
afinidad por la fase móvil debido a que ésta tiene un carácter más no polar que las otras dos
fases móviles empleadas, por lo que empieza a ser más retenido por la fase estacionaria (3).
En la segunda experiencia variamos el volumen que se le agrega a la muestra en la
cromatografía, para observar cual es el efecto que se encuentra al desarrollar nuestro
cromatofolio, en una placa cromatográfica de 3x5 cm se agregaran 1 2 y 4 µL de rojo de metilo
disuelto en CH3CN a una concentración de 1 mg/mL, 0.5 mg/mL y 0.25mg/mL por lo que la
cantidad de muestra en cada punto será exactamente la misma, con esto nos aseguramos de
que el efecto que se observe será únicamente el de el aumento del volumen de forma
ascendente en cada punto, desarrollamos nuestra placa en una fase eluyente de acetato de
etilo:hexano (1:1), al observar nuestra placa pudimos observar que los puntos se encuentran en
el mismo nivel, y no se observo un efecto demasiado notable al variar el disolvente, esto es
porque los cromatofolios se desarrollan una vez que el disolvente se ha evaporado, sin embargo
esto no significa que no debemos cuidar el volumen de muestra que se ponga porque si llegase
a ser excesivo, podría hacer que nuestro analito se extienda mucho en la placa, y en caso de
tener algún punto cercano, mezclarse con este, lo que haría que nuestra placa no nos sirva o no
podamos usarla de referencia para reportar ningún tipo de resultado debido a que este no será
del todo confiable.
En el tercer experimento variamos la concentración de la muestra que se le aplicó a nuestra
placa , se aplicaron 3 puntos de 2 µL de 1, 5 y 10 mg/mL como podemos observar en esta
experiencia a diferencia de anterior el volumen es el mismo, lo que varía únicamente es la
cantidad de muestra, es decir nuestra concentración, una vez desarrollado el cromatofolio con
una fase eluyente de acetato de etilo:hexano (1:1) se pudo observar que conforme se aumenta
la concentración de nuestro analito nuestra mancha se hace cada vez más grande como se
observa entre la primera y segunda mancha, esto se debe a que al existir más analito este mismo
requiere más superficie para adherirse pues como sabemos en este tipo de cromatografía el
efecto que sucede es el de adsorción, que es la aderencia de nuestro analito en la superficie, a
su vez se observa de mejor manera en la tercera mancha, el efecto de coleo, que es presencia
de analito en el área que pareciera inferior a la mancha formada, esto es debido al mismo
fenómeno, al no tener el espacio suficiente nuestro analito se queda en donde si tiene espacio
libre para ser adsorbido dándonos el efecto del coleo, obviamente se observa mejor en la
tercera mancha, pues al ser la más concentrada esta contenía una mayor cantidad de analito
que requería ser adsorbido.

La última experiencia realizada fue la del efecto de la matriz, el cual se dividió en dos partes: a)
Efecto de la naturaleza del disolvente; b) Presencia de otros analítos. Para la primera parte, se
utilizó el rojo de metilo, el cual se encontraba en 3 disolventes diferentes: 𝐶𝐻3 𝐶𝑁, Metanol y
agua; las 3 muestras se corrieron en una cámara cromatográfica con un sistema de elución
hexano/acetato de etilo (1:1). Al correr las 3 muestras se puede observar que el rojo de metilo
disuelto en agua y metanol corrieron a la misma distancia. Esto se debe a que el metanol es un
compuesto orgánico formado por un carbono primario unido a un grupo hidroxilo, mientras que
el agua es una molécula de oxígeno unida a dos átomos de hidrógeno. El metanol, aún al poseer
un átomo de oxígeno, tiene un carácter ligeramente polar debido a que el grupo metilo con el
que está unido es un grupo donar de densidad electrónica, el cual provoca que el oxígeno no
presente una polaridad tan alta (4), comparable a la polaridad que tiene la molécula de agua. Por
lo tanto, al no presentar una diferencia significativa entre la polaridad del metanol y el agua,
provoca que su corrimiento en la placa cromatográfica sea prácticamente el mismo debido a
que ambas moléculas presentan prácticamente el mismo carácter medianamente polar (más
polar que no polar). En el caso del rojo de metilo disuelto en acetonitrilo presenta una mayor
polaridad debido a que el acetonitrilo (𝐶𝐻3 𝐶𝑁) presenta un enlace triple entre el carbono y el
nitrógeno, el cual es muy polarizado (5), pero la presencia del metilo provoca que esa
polarización sea menos marcada debido a que éste dona densidad electrónica a ese triple enlace
muy polarizado (5). Debido a este efecto que provoca el grupo metilo el carácter de ésta molécula
es medianamente polar, con un carácter más no polar que polar, y esto le ayuda a que su
afinidad por la fase estacionaria sea mucho menor que por la fase móvil, haciendo que su
elución sea mayor en comparación a las otras 2 muestras (agua y metanol).

La segunda parte ya no se realizó debido a que las muestras de sacarosa y cloruro de sodio
estaban deterioradas, presentando un color violeta y café respectivamente.

CONCLUSIONES:
La elección de la fase móvil es de suma importancia, pues está servirá para la correcta
identificación del analito. Una fase móvil ideal nos da un Rf de 0.2 – 0.8
La concentración afecta la forma de las manchas en una cromatografía en placa fina, para que
sea correcta no se debe pasar la cantidad de analito.
El volumen también puede afectar una cromatografía pero la cantidad debe ser muy grande
para poder observar su interferencia.
Al desarrollar la placa, se deben dejar secar los disolventes del analito para que estos no
interfieran.
CUESTIONARIO:
1. Defina brevemente los siguientes términos:
* Tipos de interacciones moleculares
El proceso de adsorción se debe a interacciones intermoleculares de tipo dipolo-dipolo, o
enlaces/puentes de hidrógeno entre el soluto y el adsorbente.
 * Resolución
La resolución cromatográfica constituye una medida cuantitativa de la capacidad de una
∆𝑍 2∆𝑍 𝑡2 −𝑡1
columna para separar dos analitos. 𝑅𝑠 = 𝑊𝑎 = y 𝑅𝑠 = 1 donde
𝑊𝑎 +𝑊𝑏 (𝑊1 +𝑊2 )
2+ 𝑊𝑏 2
2
𝑊1 𝑦 𝑊2 son el ancho de dichas bandas; 𝑡1 𝑦 𝑡2 son los tiempos de retardo (𝑡𝑅 )
Cuanto mayor sea 𝑅𝑠 mejor separados estarán los picos cromatográficos de los componentes A
y B. La resolución de una columna aumenta al aumentar el número de platos teóricos de la
misma y al aumentar la longitud.
* Coeficiente de partición
El coeficiente de partición (k) es la constante de equilibrio para la distribución de las moléculas
entre la fase móvil y la fase estacionaria; éste es el equilibrio para la separación de los
[𝑎𝑛𝑎𝑙í𝑡𝑜] 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑚ó𝑣𝑖𝑙
componentes. 𝑘 = [𝑎𝑛𝑎𝑙í𝑡𝑜]
𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑟𝑖𝑎

* Asimetría de pico
La asimetría del pico es la plasmación de la desviación del comportamiento de un soluto
respecto al modelo teórico; así, existen picos con desviaciones frontales o en la cola.
* Efecto de Matríz
consiste en una disminución o aumento de la respuesta instrumental del analito debido a la
presencia de otros componentes. En otras palabras, para la misma concentración de analito,
el análisis de una muestra real o de una disolución estándar del analito puro no proporciona
la misma respuesta instrumental. Este efecto provoca un error sistemático proporcional.
b) Investiga dos aplicaciones de la cromatografía en placa fina en el área farmacéutica:
1.- La cromatografía en placa fina (TLC) ya sea en fase directa o reversa se usa para los estudios
toxicológicos en la medicina deportiva, por medio de los antidoping, para determinar la
presencia de diversas drogas en el organismo.
2.- Es el principal método de detección que se utiliza actualmente para determinar si un
producto cumple con las especificaciones de drogas de etiqueta y es legal, ayuda a detectar
sustancias presentes en los fármacos que pueden ser denominadas impurezas.
c) Investiga los mecanismos de separación cromatografía en capa fina:
 Cromatografía de adsorción
 Cromatografía de reparto
 Cromatografía de exclusión
 Cromatografía de Afinidad
 BIBLIOGRAFÍAS:
1. Cromatografía en capa fina. Se pude consultar en
https://www.uam.es/docencia/jppid/documentos/practicas/actuales/guion-p6.pdf
(consultado el 26/02/18)
2. Técnicas cromatográficas. Se puede consultar en
http://www4.ujaen.es/~mjayora/docencia_archivos/Quimica%20analitica%20ambiental
/Tema6.pdf (consultado el 25/02/18)
3. Técnicas cromatográficas. Facultad de química, Química Analítica Instrumental II.
Universidad Autónoma de México. Se puede consultar en
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf (consultado
el 25/02/18)
4. M. Valcárcel Cases, A. Gómez Hens. Técnicas analíticas de separación. Reverté, 1988.
Páginas 356 – 359.
5. .-Fried.B., Sherma J., “Practical thin-layer chromatography a multidisciplinary
approach”CRC PRESS 1996 USA pág: 240
6. .- Dr. Gary witman Dr. Mark Moskovitz “Dynamic adsorbents” consultado el 27-02-18
14:34 p.m. se puede consultar en:
http://www.dynamicadsorbents.com/spanishweb/counterfeit.htm