Determinación de la actividad sobre papel de filtro.

a) Reactivos:

- Tira de papel de filtro Whatman n° 1 (1x 6 cm).

- Tampón citrato 0,05 M, pH 4,8. - DUS.

- Solución de glucosa en tampón citrato (10 mg/ml).

b) Procedimiento:

b.l.) Deben hacerse al menos dos diluciones en tampón citrato de la solución de enzima cuya
actividad se quiere medir. Una de ellas debe liberar en el medio de reacción algo menos de dos mg
y la otra algo más de dos mg de azucares reductores expresados como glucosa. Aunque las
diluciones que liberan esta cantidad de reductores deben ser estudiadas para cada caso particular,
se puede deducir de nuestras experiencias con distintas soluciones de celulasas, que estas
corresponden, generalmente, a concentraciones de proteínas solubles (calculadas según el
método de Lowry) comprendidas entre — Img/ml y 0,1 mg/ml.

b.2.) Los patrones de glucosa se preparan a partir de una solución de glucosa, en tampón citrato
0,05M, pH 4,8, de lOmg/ml de concentración. Las diluciones, realizadas con el mismo tampón
citrato, deben tener una concentración final de 3,3, 2,5, 1,65 y 1,0 mg en 0,5 mi respectivamente. -
10-

b.3.) La reacción enzimática se lleva a cabo en tubos de ensayo de unos 25 mil de capacidad. En la
siguiente tabla, se detallan los volúmenes de reactivos que deben incorporarse en las distintas
muestras.

MUESTRA PATRONES DE BLANCO CERO

PROBLEMA GLUCOSA ENZIMA
TAMPÓN DE CITRATO 1ml 1ml 1ml 1,5 ml
SOLUCIÓN DE ENZIMA ( 0,5 ml ---- 0,5 ml ----
2 SOLUCIONES)
GLUCOSA ----- 0,5 ml * ---- ----
TIRA DE PAPEL FILTRO 1 ---- ---- ----

* De la dilución de glucosa correspondiente.

b.4.) Las muestras problema se atemperan a 50 °C antes de añadir la tira de papel de filtro. Es
importante que el papel quede sumergido, en su mayor parte, en la mezcla de reacción. La
incubación de las muestras se realiza durante 60 minutos a 50 °C en un baño con agitación.

b.5.) Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se añaden 3 ml del reactivo DNS a todos los
tubos, incluyendo muestras problema, patrones de glucosa, blanco de enzima y cero. Después de
agitar se introducen durante cinco minutos en un baño con agua hirviendo y se transfieren
posteriormente a un baño de agua fría. Se añaden 20 ml de agua destilada a cada tubo y, se agitan
invirtiéndolos varias veces hasta que la mezcla sea uniforme. Luego se dejan reposar unos 20
minutos para que la pulpa de papel se deposite en el fondo de los tubos y se lee la densidad óptica
del sobrenadante a 540 nm. Frente a la muestra cero.

c) cálculo de la actividad:

c.l.) Definición de la unidad de papel de filtro (UPF):

La UPF está basada en la Unidad Internacional (Ul), que corresponde a una conversión de sustrato
de 1 mol en un minuto. En el caso de actividad enzimática sobre papel de filtro, la UPF se define
como la formación de 1 umol/min de azucares reductores medidos como poder reductor de
glucosa, en las condiciones de ensayo descritas previamente. Debido a la ausencia de linealidad
entre la dilución de enzima y los azucares reductores liberados durante el ensayo , la actividad
enzimática sobre papel de filtro debe medirse a diluciones de la solución de enzima tales que
liberen en el medio de reacción una cantidad absoluta de 2 mg de azucares reductores,
expresados como glucosa, que es el punto en donde la relación entre ambas variables se hace
razonablemente lineal Haciendo las transformaciones correspondientes se comprueba que 2 mg
de glucosa en las condiciones de ensayo descritas corresponden a 0,37 pmoles de glucosa
liberados por minuto y por ml de la dilución enzimática ensayada o lo que es lo mismo 0,37 UI por
ml de dilución.

c.2.)Calculo de las UPF de la solución enzimática:

l.Ajustar los valores de absorbancia obtenidos para los distintos patrones de glucosa a una recta.
2. Calcular sobre la ecuación de esa recta los valores de glucosa que corresponderían a las
absorbancias obtenidas para las muestras problema (después de deducir el valor del blanco de
enzima correspondiera te) .

3. Representar en papel semilogarítmico los valores de glucosa obtenidos frente a las

concentraciones (inversas de las diluciones) de solución de enzima correspondiente, y estimar el
valor de la concentración que liberaría exactamente 2 mg. de azucares reductores:
𝑈𝐹𝑃 0,37
=
𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑐
‘C’= Concentración de enzima que liberaría 2,0 mg. de glucosa. Cuando se trata de soluciones de
baja actividad enzimática, puede ser que ¿Incluso la muestra no diluida libere en el ensayo menos
de los 2 mg. de azucares reductores. En este caso, el cálculo de actividad se realiza a partir de la
cantidad de glucosa liberada empleando la siguiente expresión:
𝑈𝑃𝐹 0,185𝑢𝑖
= 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠 ∗ 0,185 ∗ 1𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑎𝑑𝑎 𝑒𝑞𝑢𝑖𝑣𝑎𝑙𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑎
𝑚𝑙 𝑚𝑙
1,0 𝑢𝑚𝑜𝑙 0,185𝑢𝑖
1𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 = = =
0,18 ∗ 0,5 ∗ 60 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑜𝑠 ∗ 𝑚𝑙 𝑚𝑙