CONTEO DE CÉLULAS

Herrera Zuleima1, Rivera Jesús1, & Tovar Valentina1

1. Estudiante del programa de Biología, Facultad de Ciencias Básicas, Universidad Del Atlántico,
Barranquilla, Colombia.

Informe de Laboratorio

Profesora Carmiña Vargas Zapata

Universidad del Atlántico

Facultad de ciencias
Programa de Biología
Métodos básicos en biotecnología

24 de Noviembre del 2017

1
 CONTENIDO

1. Resumen……………………………………………………………...……..…….3
2. Introducción………………………………………………………………..………3
3. Objetivos……………………………………………………………...……………4
3.1 General…………………………………………………...………..………….4
3.2 Específicos……………………………………………......……………….....4
4. Marco teórico…………………………...………………………..………………..4
4.1 Conteo de células: cámara de Neubauer………………………………… 4
4.2 La cámara de Neubauer……………………………………………………..4
4.3 Conteo celular………………………………………………………………...5
4.4 Métodos de conteo celular…………………………………………………..5
4.41 Microscópico………………………………………………….……………..5
4.42 Electrónico……………………………………………………………..…….5
4.43 Campo oscuro……………………………………………………………….6
4.44 Rayo láser……………………………………………………………………7
4.5 Importancia de la determinación de la concentración celular de una
solución biológica…………………………………………………………………7
5. Materiales………………………………………………..………………………...8
6. Metodología…………………………………………..……………………………8
6.1Preparación de la muestra…………………………………………………...8
6.2 Introducción de la muestra en la cámara de Neubauer………………….9
7. Resultados………………………………………..……………...………………..9
7.1 Cálculo de la concentración…………………………………………………9
8. Discusiones……………………………………………………...……………….13
9. Conclusiones……………………………………………………...……………..13
10. Bibliografías………………………………………………………………………14

2
 RESUMEN
Durante esta práctica se realizó el conteo de células de una muestra de origen
vegetal. Se llevó a cabo una dilución seriada que fue desde 10 -1 hasta 1012. Con
cada una de las muestras se tomaron 10 microlitros para poder depositarlos
dentro de las cámaras y evitar que la muestra se saliera del espacio determinado.
Se utilizó una cámara con escala 104 con una matriz central de 25 cuadricula. Se
estimó la cantidad de células por campo utilizando una Cámara de Neubauer y se
calculó matemáticamente la cantidad de células en 10 microlitros de la solución.
Palabras Clave: conteo, células, cámara de Neubauer, dilución seriada.

INTRODUCCIÓN
En microbiología y otras ramas de la biología conocer el número de células en
una muestra permite estimar el total de una población de una solución
previamente diluida con el fin de facilitar el conteo. El conteo de células es una
técnica que se ha usado desde hace mucho tiempo por varias ramas del
conocimiento y permite estimar la tasa de crecimiento de una colonia de
organismo, ya sea alga, bacteria, protozoo, entre otros. A pesar del enorme
desarrollo tecnológico que ha tenido lugar en los laboratorios científicos, el conteo
visual con hematocitómetro sigue siendo el método de conteo más extendido
desde el siglo XIX (Bastidas, 2017). Las cámaras de recuento se utilizan para
determinar el número de partículas por unidad de volumen de un líquido. Las
partículas leucocitos, eritrocitos, trombocitos, bacterias, esporas, polen etc. se
cuentan visualmente con un microscopio [1]. La placa base en vidrio óptico
especial tiene el tamaño de un portaobjetos. Las ranuras fresadas en la superficie
de la placa base la dividen en dos zonas anchas exteriores y 3 campos pequeños
interiores. A diferencia de las zonas exteriores, que se utilizan para rotulación, los
campos interiores están esmerilados y pulidos. En el campo central (= fondo
cámara) están grabadas dos cuadrículas de recuento separadas una de otra por
una ranura. El fondo de la cámara del campo central es usualmente 0,1 mm más
bajo (= profundidad cámara) que ambos campos adyacentes [2]. Entre campo
central y cubreobjetos ya colocado existe por tanto una ranura de 0,1 mm. La
limitación lateral del volumen a contar se forma mediante las superficies
imaginadas por la proyección vertical sobre las líneas exteriores de la cuadrícula
de recuento. Desde un punto de vista estadístico, el conteo celular se basa en
tomar una muestra de una población existente (la concentración original),
mediante la extracción de una cantidad reducida de dicha población (la muestra),
con el objetivo de estimar el tamaño original de la población [3]. Es importante que
los conteos celulares sean precisos, consistentes y rápidos, en particular cuando
se monitorean las respuestas celulares cuantitativas.

3
 OBJETIVOS
General

 Realizar el conteo células usando una cámara de Neubauer

Específicos

 Calcular la concentración del número celular en las distintas disoluciones

 Adquirir destreza al momento de manejar implementos para el conteo de
microorganismos
 Construir una curva patrón y correlacionar absorbancia/dilución de la
muestra del cultivo

MARCO TEÓRICO
Conteo de células: cámara de Neubauer
En Biología celular es muy común encontrarse con la necesidad de conocer el
número de células que podemos encontrar presentes en un volumen determinado;
por ejemplo, cuando se realizan cultivos celulares, ya que se necesita saber
cuántas células se encuentran en el momento y compararlos con el número de
células que se encontraban inicialmente [4]. En este caso se necesita un
instrumento que permita contar directamente, o bien, calcular la concentración
celular en un medio. Para resolver este problema de conteo celular, se ha
utilizado, en algunos casos, el sistema de espectrofotometría, cuyo fundamento se
basa en las propiedades de absorción de la luz por partes de las células; sin
embargo, este sistema es poco exacto y los resultados que se obtienen son
difíciles de repetir [5]. Una alternativa a este problema es el contar directamente
el número de células presentes en un volumen conocido. Esto puede resultar un
gran trabajo considerando el tamaño de algunas células, sin embargo, la cámara
de Neubauer permite contar células de distintos tamaños de manera muy práctica
[6].
La cámara de Neubauer
Las cámaras de recuento se utilizan para determinar el número de partículas por
unidad de volumen de un líquido bajo el microscopio. Se utiliza principalmente
para el análisis de partículas como leucocitos, eritrocitos, trombocitos, bacterias,
esporas, polen etc. [5].

4
Conteo celular: Desde un punto de vista estadístico, el conteo celular está
basado en toma de una muestra de una población existente (la concentración
original), mediante la extracción de una cantidad reducida de dicha población (la
muestra), con el objetivo de estimar el tamaño original de la población. 3
Métodos de conteo celular:
1. Microscópico: Es una técnica común, rápida y barata que utiliza un
equipamiento fácilmente disponible en un laboratorio. Para estos recuentos se
utilizan generalmente cámaras de conteo celular, aunque también pueden
realizarse a partir de muestras filtradas en membranas y transparentadas o
teñidas con colorantes fluorescentes (Naranja de acridina).
La mayor dificultad del recuento en cámara es obtener reproducibilidad en el
llenado de la cámara con líquido. Otra dificultad es la adsorción de las células en
las superficies del vidrio, incluyendo pipetas. Esta adsorción es crítica en el
proceso de dilución de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en
medios de alta fuerza iónica (solución fisiológica o medios mínimos sin fuente de
carbono) [5].
Las cámaras más utilizadas son las de Hawksley, Petroff-Hausser y Neubauer.
La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersión,
aunque la mayoría de los recuentos se realizan con objetivos secos. Una de las
mayores ventajas del recuento microscópico es brindar información adicional
sobre el tamaño y la morfología de los objetos contados. 3

Figura 1: Cámara de recuento de Petroff-Hausser

2. Electrónico: Los contadores electrónicos permiten realizar recuentos de
bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y
microorganismos filamentosos o miceliares.

5
Estos instrumentos constan básicamente de dos compartimientos comunicados a
través de un pequeño conducto. En ambos compartimientos hay electrodos que
miden la resistencia eléctrica del sistema, y como el orificio del conducto es muy
pequeño y su resistencia es muy alta, la resistencia eléctrica de cada
compartimiento es independiente. F
Funcionamiento: Un volumen fijo de una suspensión bacteriana es forzado a
pasar desde un compartimiento al otro a través del pequeño conducto, en un muy
breve intervalo de tiempo. Cuando un microorganismo pasa al nuevo
compartimiento, la resistencia de éste se incrementa debido a que la
conductividad de la célula es menor que la del medio. Estos cambios en la
resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y contados [4].
Este tipo de conteo celular presenta algunos inconvenientes. Ciertas bacterias
muy pequeñas producen cambios en la resistencia que son comparables al "ruido"
generado por la turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido por el orificio. No
pueden medirse células que formen filamentos o agregados o soluciones muy
concentradas de microorganismos, debido a que el pasaje de más de una célula
en un breve período de tiempo va a ser tomado como una célula más grande. Es
común la obstrucción del orificio por microorganismos muy grandes. 1
3. Campo oscuro:
El dispositivo de medida consiste en un capilar por el que circula la sangre diluida
y que es atravesado por un haz de luz halógena. Cuando no pasan células a lo
largo del capilar, el haz de luz incide sobre una zona no sensible (disco de campo
oscuro); pero si una célula pasa a través del capilar, dispersa los rayos del haz
luminoso hacia afuera del disco, donde son captados por un foto-detector. El
número de señales lumínicas detectado indica el número de células presentes en
la sangre, y la intensidad de la dispersión lumínica producida por cada una de
ellas es directamente proporcional al tamaño de éstas 1

6
 Figura 2: Esquema del dispositivo de medida basado en el método del campo
oscuro
4. Rayo láser:
El dispositivo de medida consta de un detector situado detrás de un capilar por el
que circula un flujo continuo de sangre diluida. Un rayo láser atraviesa el capilar y
se dirige hacia el detector. Cuando no pasan células a lo largo del capilar, el rayo
láser incide sobre el detector, pero si una célula pasa a través del capilar, el rayo
láser es interceptado por ella y deja de incidir sobre el detector. El número de
interferencias indica el número de células presentes en la sangre, y el grado de
interferencia que produce cada célula a su paso es directamente proporcional a su
tamaño. En este método se basa en los auto-analizadores Technicon de la serie
H. 2

Figura 3: Esquema del dispositivo de medida basado en el método del rayo láser
Importancia de la determinación de la concentración celular de una solución
biológica
Es importante ya que es utilizado cuando se efectúan siembras o subcultivos
celulares, o cuando se preparan experimentos para ensayos basados en células.
Estas concentraciones nos sirven para monitorear la salud de los cultivos, los
niveles de proliferación, así como para evaluar la inmortalización para la
transformación.
En este caso trabajamos con microalgas y conocer su concentración ayuda a
determinar su curva de crecimiento en las condiciones en las cuales se está
trabajando, ya que estos datos se podrán utilizar para establecer los tiempos en
los cuales es necesario cosechar la biomasa, lo cual permite comparar
organismos en fases de crecimiento conocidas [7].

7
 MATERIALES
 Cámara de Neubauer (Figura 4)
 Muestra Problema
 Micro pipeta de 5 microlitros (Figura 4)
 Microscopio Óptico
 Gradilla
 12 tubos de ensayo (Figura 4)

Figura 4: Materiales del laboratorio

METODOLOGÍA
1. Preparación de la muestra

 Se agito la muestra con el cultivo para permitir que las células tengan una
distribución homogénea
 La muestra se preparó con diferentes concentraciones aptas para su
conteo (Figura 5)

8
 Tubos Disolución

1 9 mL de agua + 1 mL de sustancia 10 -1
2 9 mL de agua + 1 mL del tubo 1 10 -2
3 9 mL de agua + 1 mL del tubo 2 10 -3
4 9 mL de agua + 1 mL del tubo 3 10 -4
5 9 mL de agua + 1 mL del tubo 4 10 -5
6 9 mL de agua + 1 mL del tubo 5 10 -6
Tabla 1. Dilución de cada tubo

Figura 5. Tubos de las Soluciones

2. Introducción de la muestra en la cámara de Neubauer

 Se tomaron de los tubos de ensayo 10 µL de la mezcla preparada,

utilizando una micropipeta
 Se colocó el cubreobjetos sobre la cámara de Neubauer
 Se utilizó la punta de la micropipeta para cargar la cámara, esto se realizó
colocando la punta de la micropipeta en el borde del cubreobjetos, en el
extremo de la cámara de Neubauer (El líquido penetro entre la cámara y el
cubreobjetos desde el lateral, por capilaridad)
 Se cargó la cámara de Neubauer, se llevó al microscopio óptico y en el
objetivo de 10x se hizo el conteo de células (este paso se realizó 3 veces)

RESULTADOS

Cálculo de la concentración.
Como las células se contaron en el cuadro central (1mm) y se trabajó con
disoluciones, entonces:

9
 1mm = 0.1 cm (0,1cm x 0,1 cm = 0,01 cm2 de superficie)

(Profundidad 0,01 cm2 x 0,01 cm = 0,0001 cm3 = 0.0001 mL)

La concentración celular se calcula de acuerdo a la siguiente fórmula:

A partir de una solución madre (Figura 6) se obtuvieron una serie de diluciones de

las cuales se determinó el siguiente conteo (Tabla 2):

Figura 6: Población en la solución madre

Tubos Núm. de células en cada observación

A B C D
1 751 877 823 911

2 99 77 66 78
3 10 20 13 5
4 5 14 10 8
5 12 17 9 8
6 1 1 5 2
Tabla 2: Conteo Celular Por dilución

Para cada tubo se calculó la concentración de células y se obtuvo lo siguiente:

Tubo 1
(751+877+823+911)X25X104 = 840.500.000 cel/mL

10
Tubo 2
(99+77+66+78)X25X104= 80.000.000 cel/mL

Tubo 3
(10+20+13+5)X25X104= 12.000.000 cel/mL

Tubo 4
(5+14+10+8)X25X104= 9.250.000 cel/mL

Tubo 5
(12+17+9+8)X25X104= 11.500.000 cel/mL

Tubo 6
(1+1+5+2)X25X104= 2.250.000 cel/mL

Para la concentración total de la solución madre se usa la siguiente expresión

(Arredondo et al, 2010):

C = [N /(4x10-6 )] • dil.

C = cél/mL
N = promedio de células presentes en los 5 cuadros pequeños del cuadro central
4 x 10-6 = corresponde al volumen de la muestra expresado en cm3 (mL) sobre el
área de los cuadros pequeños la cual equivale a 0.004 mm3 (0.004 µL) (0.2 x 0.2 x
0.1)
dil = factor de dilución; como se trabajó con una dilución 1:10 el factor de dilución
seria sencillamente 10.
Como resultado de la concentración total de celulas se obtuvo que:

( )

La absorbancia total de cada dilución es la siguiente:

TUBO ABS
1 0,708
2 0,043
3 0,003
4 0,01
5 0,009
6 0,06
Tabla 3: Absorbancia de las diluciones

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 Curva patrón de las absorbancias
0,8
0,7 y = -0,0953x + 0,4723
0,6 R² = 0,4061
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
-0,1 0 1 2 3 4 5 6 7
-0,2

Curva patrón de las absorbancias de cada dilución con su línea de tendencia y

ecuación de línea

Se determinó gráficamente la relación entre el número de células de cada tubo y la

absorbancia del mismo (Tabla 4):

Tubo # de Células Absorbancia

1 840,500,000 0,708
2 80,000,000 0,043
3 12,000,000 0,003
4 9,250,000 0,01
5 11,500,000 0,009
6 2,250,000 0,06
Tabla 4: # de células VS Absorbancia

Debido a que el valor de las concentraciones es tan alto, se realizó una

transformación de datos utilizando el logaritmo natural de cada cantidad, dando
como resultado lo siguiente (Tabla 5):

Tubo Ln [Células] ABS

1 20,5495075 0,708
2 18,1975372 0,043
3 16,3004172 0,003
4 16,0401341 0,01
5 16,2578576 0,009
6 14,6264408 0,06
Tabla 5: Transformación de datos

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 Absorbancia vs [] Celular
0,8
0,7
0,6
Absorbancia 0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 5 10 15 20 25
-0,1
Concentracion Celular de cada tubo

Relación de la absorbancia medida en cada tubo con la concentración calculada

matemáticamente

DISCUSIONES

Según los resultados obtenidos en el laboratorio, se puede observar que el los

primeras muestras del conteo de crecimiento celular existe un patrón de
decrecimiento; pero la muestra tomada del tubo numero 5 (tabla 4), se observa
una asincrónica con respecto a las otras muestras ya que las proporciones lo
ubican una escala de concentración por encima de la cual se encuentra, esto
podría deberse a que no se hicieron cambios de gotero o un mal manejo de la
muestra por parte de los estudiantes.
En lo que respecta a los análisis de absorbancia (tabla 3) [8], los resultados en la
mitad de las muestras presentan poca fiabilidad ya que probablemente por errores
de pipeteo las muestra presentaran ese tipo de absorbancias y otro factor seria
que el equipo con el cual se trabajó (espectrofotómetro) estuviera des-calibrado;
ya que a la hora de tomar las lecturas, se le notaban las falencias en el
funcionamiento.
Existe una relación en las cuatro primeras muestras, en donde la absorbancia
disminuye con la concentración de las muestras, pero en los siguientes no se
aprecia ese modelo, y mientras que la concentración disminuye, la absorbancias
muestra datos completamente diferentes a los que se esperaban.

CONCLUSIONES

 El conteo de células utilizando la Cámara de Neubauer, y como apoyo el

uso del espectrofotómetro es un método muy eficaz si se trabaja con cuidado y el
equipo adecuado. Con los datos obtenidos en la práctica, se logró calcular las

13
concentraciones de cada una de las muestras y un estimado del número de
células presentes en cada una.
 Debido a que teóricamente, la absorbancia disminuye a medida que
también lo hace la concentración por los valores de la transmitancia de la luz, los
resultados obtenidos en laboratorio no coinciden lo esperado pero algunos
patrones indican que en realidad la realidad de la afirmación anterior.
 A la hora de realizar este tipo de ejercicios se debe tener presente todos los
cuidados necesarios para para llevar la práctica de la mejor manera posible y
haciendo buen uso de los materiales presentes y verificando la veracidad de los
resultados arrogados por los equipos de lectura.

BIBLIOGRAFÍA

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[4] Bastidas, o. (2017). Conteo de células de cámara de Neubauer. [online]

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