“UNIVERSIDAD POLITÉCNICA

DE TLAXCALA”

ING. EN BIOTECNOLOGÍA

Materia: Biotecnología aplicada

Reporte de práctica: “Efectos de temperatura y pH en la

fermentación alcohólica”

Alumnos:
Cuatecontzi Muñoz Israel
Pérez Muñoz Miriam Lucero
Quiroz Albor Diego
Rojas Reyes Eduardo
Mendieta Jasso Carmen Shanik
Munive Colín Eber
Núñez Escobar Mónica

Grado y grupo: 8° “B”

Fecha de realización: 19 de Febrero del 2018
Fecha de entrega: 2 de marzo del 2018
Objetivo

Determinar experimentalmente la óptima temperatura y pH en la que

Saccharomyces cerevisiae llevara a cabo la fermentación alcohólica con mayor
eficiencia.

Introducción

La levadura se encuentra en la naturaleza, son seres vivos que se encuentran en

nuestro entorno: en el agua, la tierra, en las frutas y en las hojas de las plantas. Se
conocen unas 500 especies de levaduras. Su nombre científico, Saccharomyces
cerevisiae, significa “floritura que fermenta el azúcar de un cereal para producir
alcohol y dióxido de carbono”. Una célula de levadura tiene unos 6000 genes
diferentes. También tiene cromosomas, como cualquier organismo vivo. Una
célula de levadura tiene solo 16 cromosomas, siete menos que los seres
humanos, que tenemos 23. La célula de la levadura tiene un diámetro que varía
entre 5 y 10 micrómetros.
La duración de una generación puede variar entre una y siete horas, en función de
las condiciones y la edad de las células madre; después de tres horas la célula se
divide en dos y así sucesivamente. En 24 horas, una célula madre da 256 células.
El agua facilita la actividad de la levadura, todo mejorando la movilidad de la
célula, en encontrarse en un medio con una disolución más grande gracias al
sustrato de la enzima. Aunque su movilidad sea más grande, su actividad
aromática se reduce y por ese motivo en las masas con mucha hidratación (más
de un 75%) se recomienda equilibrar agua y tiempo de reposo de la masa.
También disminuye la actividad aromática cuando a la masa se le añaden
ingredientes como la grasa o el azúcar.
Se puede decir que el pH óptimo para una buena actividad fermentativa de la
célula de levadura estaría entre 4,5 y 6. En las masas de fermentación directa, el
pH se acostumbra a situar entre un 5,2 y un 5,7. Estos datos varían en función de
la masa madre que se use y de su acidez.
El incremento de la temperatura acelera la fermentación de los azucares de la
levadura. Esta aceleración es tres veces más significativa a 30ºC que a 20ºC.
Justo al llegar a los 38-40ºC la actividad se incrementa cerca del 8% por cada
grado suplementario. Progresivamente, según se va pasando de los 40ºC,
igualmente asistimos a una disminución de la actividad fermentativa, aún mayor
cuando se llega a los 50ºC. A los 55ºC la acción de la levadura termina. A baja
temperatura (0ºC) la levadura disminuye su actividad casi totalmente.
El aumento de la concentración de alcohol durante la fermentación frena
progresivamente la actividad fermentativa. Esto se nota en las masas F.C. o
cuando se utilizan masas madres muy ácidas. En las formulaciones de ciertos
brioches de productos regionales, la introducción de vino u otros tipos de alcohol
acentúan estos fenómenos (Cortes, Carlos; 2015).
MARCO TEÓRICO

Fermentación alcohólica

La fermentación alcohólica es una bioreacción que permite degradar azúcares en

alcohol y dióxido de carbono. La conversión se representa mediante la ecuación:
C6H12O6 2C2H5OH + CO2

Las principales responsables de esta transformación son las levaduras.

Saccharomyces cerevisiae, es la especie de levadura usada con más frecuencia.
Por supuesto que existen estudios para producir alcohol con otros hongos y
bacterias, como la Zymomonas mobilis, pero la explotación a nivel industrial es
mínima.

El primer paso en el proceso de fermentación, tiene lugar en igual forma que en la

respiración aeróbica. En vez de que el ácido pirúvico formado en el ciclo de Krebs
sea oxidado completamente, en la fermentación alcohólica ocurre una
descarboxilación de este ácido, formándose acetaldehído; en lugar del oxígeno
gaseoso del aire como aceptor de hidrogeno y se forma alcohol etílico.
Como materia prima para la fermentación alcohólica se utiliza generalmente jugos
de frutas, las cuales contienen glucosa y fructuosa; igualmente es fácil fermentar
el azúcar corriente (Muller, S.F.).

Limitantes de la fermentación alcohólica

Temperatura

Las temperaturas comprendidas entre 5° a 40°C son posibles para el inicio y

desarrollo de la una fermentación alcohólica, encontrándose entre 30 y 35°C es la
temperatura optima de fermentación, mientras que por encima de 40°C se produce
la mortandad celular debido a la desnaturalización de sus proteínas. (Togores,
2011)

Por otra parte, las bajas temperaturas pueden inhibir la fermentación alcohólica,
sin llegar a producir la muerte de las levaduras, debido a un funcionamiento
deficiente de la ATPasa como bomba de protones, produciéndose una
acidificación del citoplasma celular. Las bajas temperaturas tienen su principal
efecto en la membrana plasmática de las levaduras, reduciendo su fluidez y
dificultando el transporte de sustancias (Togores, 2011).
Acidez del sustrato

El pH es un factor limitante en el proceso de la fermentación debido a que las

levaduras se ven afectadas por el ambiente en el cual se desarrollan es decir
alcalino o acido. Las levaduras tienen rango óptimo de pH que va desde 3.5 hasta
5.5. En el proceso de fermentación, el pH tiende a disminuir debido a la
producción de ácidos, formados al tomar los nitrógenos de los aminoácidos
perdiendo su carácter anfótero. En los procesos industriales, se hace uso de
soluciones tampón para mantener niveles óptimos de acidez. (Garzón, 2009)

Concentración de Azúcares

Las concentraciones altas de azúcares afectan los procesos de osmosis dentro de

la membrana celular, el rango óptimo de concentración de azúcar es de 10 a 18%,
puesto que a concentraciones de 22% las levaduras empiezan a tener problemas
en su proceso de respiración celular (Garzón, 2009)

Concentración de producto

Las levaduras, presentan cierta resistencia a las concentraciones de alcohol que

se producen durante la fermentación, debido a que el etanol, inhibe el transporte
de D-xilosa, amonio, glicina y algunos aminoácidos, así como afecta la función y
estabilidad de algunas enzimas citoplasmáticas como la hexoquinasa, debido a
que, a concentraciones críticas de etanol, se presenta la formación de un complejo
hexoquinasa-etanol el cual puede detener la reacción glucosa a glucosa-6 fosfato.
La célula modifica la composición en ácidos grasos de la membrana para
minimizar los efectos de la fluidez que produce el etanol, de la misma manera la
adaptación de las levaduras al etanol también obedece a una modificación de la
composición lipídica de las membranas debido básicamente a un enriquecimiento
de las mismas en esteroles y acido grasos de cadena larga, de esta manera para
las levaduras poder adaptarse a altas concentraciones de alcohol debe existir un
aumento del contenido de ácidos grasos insaturados con respecto a los saturados
y un aumento en la longitud de las cadenas carbonadas de los ácidos grasos.
(Tomasso, 2004)

Rendimientos teóricos de la biotransformación

Para evaluar esta transformación, se usa el rendimiento biomasa/producto y el

rendimiento producto/ substrato (Dacosta, 2007).
  Rendimiento biomasa/sustrato (Yx/s): es la cantidad de levadura producida
por cantidad de sustrato consumido
 Rendimiento sustrato/producto (Yp/s): es la cantidad de producto
sintetizado por cantidad de sustrato consumido

Microorganismo de estudio

Saccharomyces cerevisiae

Es la especie de levaduras utilizada por excelencia para la obtención de etanol a

nivel industrial puesto que es un microorganismo de fácil manipulación y
recuperación, no es exigente en cuanto a su cultivo, no presenta alto costo , tolera
altas concentraciones de etanol , en la fermentación produce bajos niveles de
subproductos, es osmotolerante, capaz de utilizar altas concentraciones de
azúcares, presenta alta viabilidad celular para el reciclado y características de
floculación y sedimentación para el procesamiento posterior (Garzón, 2009).

Cuando S. cerevisiae se encuentra bajo condiciones de alta concentración de

oxígeno disuelto y la concentración de azúcares supera 0,16g/L o 9g/L, la levadura
convierte su metabolismo oxidativo a oxidoreductivo o fermentativo
incrementándose la producción de etanol. Dicho fenómeno se conoce como efecto
Crabtree. (Arango, 2008)

Ruta metabólica de la glucosa en Saccharomyces cerevisiae

La levadura empleada para llevar a cabo el proceso de fermentación alcohólica,

requieren, que la glucosa sea catabolizada mediante glucolisis o ruta de Embden-
Meyerhof, para obtener el piruvato el cual posteriormente por la acción de enzimas
específicas, se convierte anaeróbicamente en etanol y dióxido de carbono. La
glicolisis es una ruta catabólica en la cual la glucosa es convertida a dos
moléculas de piruvato, las cuales, dependiendo de las condiciones, pueden tomar
rutas diferentes. Posteriormente el piruvato se descarboxila debido a la presencia
de la enzima piruvato descarboxilasa que se encuentra en todos los organismos
que metabolizan alcohol, para formar acetaldehído el cual se reduce a etanol por
la presencia de NADH como agente reductor, a través de la acción de la enzima
alcohol deshidrogenasa, la cual está en todos los organismos capaces de dar
lugar a la fermentación alcohólica. (Garzón, 2009)
Factores de crecimiento óptimos en Saccharomyces cerevisiae

pH optimo

El crecimiento de Saccharomyces cerevisiae se ve favorecido por un pH

aproximado de 4.0 a 5.0 y no se desarrollan bien en medio alcalino a menos que
se hayan adaptado al mismo. A pesar de la tolerancia bastante amplia de esta
para las variaciones de pH a partir de los sustratos habitualmente usados en los
medios de cultivo forman productos en especial ácidos que influyen en el
crecimiento celular, producción enzimática y utilización de glucosa. Así, por
ejemplo, algunas investigaciones han observado que con un pH inicial del medio a
valores entre 4.0 y 4.5 se obtiene mejor crecimiento (Garzón, 2009)

Efecto del pH en la levadura Saccharomyces cerevisiae

El pH del citoplasma se sitúa en un valor cercano a la neutralidad a pesar de que

en el medio la acidez es bastante más elevada, por lo que a través de la
membrana plasmática se produce una difusión pasiva de protones hacia el interior
de la célula, además de una acumulación de ácidos orgánicos sintetizados, que
tienden a que el citoplasma se acidifique con el riesgo de bloquear su metabolismo
y paralizar la fermentación alcohólica. Par evitar este fenómeno, la célula elimina
el exceso de acidez en su interior, utilizando la ATPasa como bomba de protones
de la membrana plasmática. (Togores, 2011)

Temperatura optima

Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo mesófilo, por lo tanto su

temperatura no puede sobrepasar lo 50ºC, puesto que a esta temperatura o
temperaturas superiores se produce su muerte. Por lo tanto debido a que la
fermentación es un proceso exotérmico, se debe mantener en el mismo un control
de temperatura para mantener la temperatura en su valor optimo que es de 30 ºC.
(Garzón, 2009)
Equipo necesario para el desarrollo de la práctica

Vaso de
Picnómetro
precipitado

Matraz
Probeta
Erlenmeyer

Parrilla de
Rotavapor
calentamiento

Charolas Espátula

Sustancias o insumos
 Levadura comercial
 Na2HPO4-7H2O
 KH2PO2
 NaCl
 Nh2Cl
 C6H12O6
 Agua destilada
Metodología

Preparación de medios

Medir 600ml de agua

destilada en una
Añadir 38.4 g de
probeta y vaciar en un Añadir 9 g de KH2PO4
NaHPO4
vaso de precipitaos de
1000ml.

Añadir 60 g de
glucosa. Añadir 3 g de NH4Cl 1.5 g de NaCl

Fig. 1 Diagrama de proceso de preparación de medio de cultivo.

Preparación de levadura

Medir 100ml de
agua destilada y Pesar 10gr de Pesar 3 g de
vaciar en un vaso glucosa y añadir. levadura, añadir y
de precipitados Disolver disolver.
de 150ml.

Fig. 2 Preparación de inóculo de levadura.

Preparación de soluciones con temperaturas y pH diferentes

Vertir 50ml de medio Preparar una solución

en cada matraz y
adicionar 5ml de
inóculo.
Calibrar el
de HCl al 1% para
potenciómetro y medir
ajustar el pH de el
el pH del medio.
medio.

Agitar a 200 rpm y

Añadir HCl poco a
Pasadas 36hrs de ajustar a la
poco hasta ajustar pH
cultivo, centrifugar a temperatura
a 3 y a 4 (hacer por
5,000 rpm durante 30' correspondiente (25°C
triplicado).
Y 36°C)

Cuantificar la cantidad
Recuperar
de alcohol, para cada
sobrenadante
experimento.

Fig. 3 Diagrama de proceso para la obtención de etanol con microorganismos a diferente pH y

temperatura.

Pesar el mismo
Pesar un picnómetro
picnómetro del paso
vacío
anterior con agua.

Colocar el
Hacer el cálculo de
sobrenadante obtenido
etanol obtenido a partir
de la centroguación y
de la densidad
completar el volumen
obtenida.
con agua y pesar.

Fig. 4 Diagrama de proceso de cuantificación de etanol por el método del picnómetro.

Resultados

Los datos obtenidos de acuerdo a las variaciones de temperatura y pH se

concentran en la siguiente tabla.

Etanol obtenido Peso de picnómetro

Matraz Temperatura pH
(ml) (g)
1 20 °C 3 0.5 82.84
2 20 °C 4 0.5 82.82
3 37 °C 3 1 82.80
4 37 °C 4 2 82.76

Picnómetro seco 31.22 g

Picnómetro con agua 82.85 g

Picnómetro con etanol 77.08 g

Discusión

Con la finalidad de obtener la temperatura más apropiada para el proceso

fermentativo de la muestra con Saccharomyces cerevisiae, se determinaron las
concentraciones de etanol que se produjeron en el transcurso de la fermentación
alcohólica para cada una de las temperaturas probadas (Tabla de resultados).

-No se presenta una diferencia significativa en el rendimiento del peso en el

picnómetro debido a la baja concentración de etanol obtenido, esto generado
debido al uso de otra sal, por lo se puede trabajar indistintamente con cualquiera
de los dos tipos de sulfatos.
-Los diferentes niveles de concentración de etanol obtenidos durante la etapa de
fermentación no ejercen un efecto significativo en la actividad de crecimiento de la
cepa para la producción de más etanol y así de igual manera evitar la inhibición
por producto.
-Tanto la temperatura como el pH, proporcionan resultados significativamente
diferentes en sus distintos niveles, por lo que son factores muy importantes en el
proceso de fermentación.
-Para aumentar el rendimiento de etanol, la mejor combinación de niveles es una
temperatura de fermentación de 37 °C y un tiempo fermentación de 24 h.
-Los resultados de concentración de etanol obtenidos son comparables con
valores de concentración de (6,0 a 7,5) % v/v usuales en la industria.
-Para mejorar los niveles de concentración de etanol se recomienda realizar el
crecimiento del microorganismo en un medio igual al sustrato hidrolizado a
fermentar para evitar el tiempo de adaptación al medio por parte de la levadura y
trabajar con una concentración de levadura alta (50-70 millones/mL).
-Se recomienda utilizar un sistema totalmente hermético al cual se le haya
evacuado el oxígeno mediante el burbujeo de nitrógeno al medio, con el fin de
comprobar si se da una mayor producción de etanol por parte del microorganismo.

Conclusión

El pH óptimo para una buena fermentación alcohólica de la levadura

Saccharomyces cerevisae se encuentra en un pH de 4.0 en base a los resultados
obtenidos pero este dato puede variar de 0.3± y la temperatura óptima para la
fermentación de azucares de la levadura es de 37 °C, obtenido 2 ml de etanol a
las condiciones ya mencionadas.

Bibliografía

Arango, R. y. (2008). Evaluación de la producción de etanol utilizando cepas

recombinantes de Saccharomyces Cerevisiae a partir de melaza de caña
de azúcar. Obtenido de http://www.scielo.org.co/pdf/dyna/v76n159/a16v76n
159.pdf

Cortes, Carlos. (18/09/2015). Levadura (Saccharomyces cerevisiae).

Obtenido de Noticias relacionadas con las Artes blancas:
(http://www.artesblancas.com/la-levadura-saccharomyces-cerevisiae/

Dacosta, H. J. (2007). Fermentación alcohólica: Una opción para la producción de

energía. INGENIERIA Investigación y Tecnología, 249 - 259.

Garzón, S. y. (2009). Estudio comparativo para la producción de etanol entre

Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisia ATCC 9763 y
Candida utilis ATCC 9950. Obtenido de Universidad Tecnologica de Pereira

Muller, L. E. (S.F.). Manual de Laboratorio de Fisiología Vegetal. Costa Rica:

Editorial SIC.

Togores, J. H. (2011). Enologia 1 Tratado de Enología (Segunda ed.). España:

Ediciones Mundi-Prensa.

Tomasso, M. (2004). Tolerancia de las levaduras al etanol . Obtenido de

Universidad de la República Uruguay