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espectrofotometría UV-Vis
La amilasa es una enzima hidrolasa que cataliza la hidrólisis del glucógeno y el almidón en azúcares simples.
El almidón es una macromolécula formada por dos polisacáridos (amilosa y amilopectina) que se utiliza
como sustrato para la amilasa y que, en
presencia de ésta, se hidroliza
fundamentalmente en glucosa
(monosacárido) y maltosa (disacárido).
Una aplicación importante de la amilasa
es su utilización en la industria de
detergentes para eliminar de la ropa
restos de alimentos que contengan
almidón.
La eficacia de las enzimas se evalúa a través de su actividad enzimática, que se define como la cantidad de
enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto. Es importante indicar que la
actividad enzimática está influenciada por diversos factores entre los que cabe destacar: pH del medio,
temperatura, concentración de sustrato y de enzima, así como la presencia de inductores o inhibidores
enzimáticos.
En esta práctica se pretende determinar la actividad enzimática de la amilasa presente en una muestra de
detergente de lavadora (polvo). El método utilizado para esta determinación es un método
espectrofotométrico basado en la formación de un producto coloreado (3-amino-5-nitrosalicilato) con un
máximo de absorción a 540 nm. Dicho compuesto se obtiene mediante la reacción de la maltosa (azúcar
reductor generado por la hidrólisis del almidón) con el reactivo 3,5-dinitrosalicílico (DNS). La reacción que
tiene lugar es la siguiente:
Material:
- Espectrofotómetro UV-Vis equipado con cubetas de 1 cm de camino óptico.
- Agitador magnético y barras magnéticas.
- Baño de agua termostatizado.
- Micropipetas de diferentes volúmenes.
- Tubos de ensayo Pyrex con tapón de rosca (12 mL) y gradilla.
- Material de vidrio y plástico de uso común en el laboratorio.
Reactivos y muestra:
- Disolución de almidón: preparar 100 mL de una disolución que contenga 1 % (m/v). La cantidad de
almidón pesada se disuelve en aproximadamente 50 mL de agua ultrapura caliente (cuando
comienza a hervir). Posteriormente, se completa el volumen hasta 100 mL con agua fría.
- Disolución patrón de maltosa: preparar 50 mL de una disolución 4 mM, disolviendo el reactivo
comercial en agua ultrapura. - Reactivo dinitrosalicílico (DNS): preparar 50 mL de este reactivo
disolviendo 0.5 g de ácido 3,5- dinitrosalicílico en 10 mL de NaOH 2 M y 25 mL de agua. Puede
utilizarse el baño de ultrasonidos para favorecer la disolución del reactivo sólido. A continuación, se
añaden 15 g de tartrato sódico-potásico tetrahidratado y se completa el volumen hasta 50 mL con
agua ultrapura. Guardar en un frasco de plástico que permitan proteger de la luz.
- Muestra: preparar 50 mL de una disolución de detergente de lavadora (polvo) que contenga 1 %
(m/v).
Procedimiento:
Recta de calibrado
A partir de la disolución patrón de maltosa preparada se preparan en tubos de ensayo Pyrex, los
patrones de calibrado en el intervalo de trabajo que se indica en la tabla que está a continuación. Una
vez realizada la mezcla, los tubos se incuban en un baño a 90 °C, durante 15 minutos, para favorecer la
formación del compuesto coloreado que se cuantificará posteriormente. Tras este tiempo, se añaden a
cada tubo 4 mL de agua ultrapura, se agita y se miden las absorbancias a una longitud de onda de 540
nm. Esto nos permitirá obtener una recta de calibrado. La pendiente de esta recta de calibrado
(Pendiente 1) se utilizará posteriormente para determinar la actividad enzimática.
Tratamiento de la muestra
Se lleva a cabo un estudio de la actividad enzimática de la muestra de detergente. Para ello se realizará
una incubación a 40 ºC de las disoluciones preparadas en tubos Pyrex en las proporciones de almidón y
detergente que muestra en la siguiente tabla, así como los tiempos de reacción utilizados. En el
momento que se produce la mezcla detergente-almidón se inicia la reacción y se considera como
tiempo cero. En ese momento se toma 1mL de la mezcla y se deposita en otro tubo de ensayo. Esta
operación se repetirá a los 15, 30, 45 y 60 minutos del inicio de la reacción. A continuación se añadirá a
cada tubo de ensayo: 1 mL del reactivo DNS y se incuba durante 15 minutos a 90ºC para formar el
compuesto coloreado. Finalmente se añade a cada tubo 4 mL de agua ultrapura, se agita y se miden las
absorbancias a una longitud de onda de 540 nm.
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5
Disolución detergente 1% (m/v) (mL) 1 1 1 1 1
Disolución almidón 1% (m/v) 4 4 4 4 4
Tiempo incubación a 40ºC (min) 0 15 30 45 60
Reactivo DNS (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Agua ultrapura (mL) 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0
Representando los valores de absorbancia frente al tiempo de reacción (minutos), se debe de obtener
una recta con pendiente positiva (Pendiente 2).
La actividad enzimática de la amilasa se puede definir como la cantidad de enzima que se necesita para
generar un μmol de maltosa por minuto, en las condiciones experimentales utilizadas. En la siguiente
ecuación se muestra la expresión que permite calcularla:
𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 1
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 (µ𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎/𝑚𝑖𝑛) = x 6mL
𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 2
Resultados:
Para la determinación de la actividad enzimática en la muestra de detergente, es necesaria la
representación de una recta de calibrado, elaborada midiendo la absorbancia de patrones de
concentración de maltosa conocida. La recta de calibrado obtenida es la siguiente:
0,2055 0,4095
1.2
0,343 0,6545 1
0,48 0,95 0.8
0,62 1,2035 0.6
0.4
0.2
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8
[maltosa]
El experimento se realiza dos veces: a temperatura de 40ºC y a temperatura de 60ºC. Las representaciones
obtenidas para cada una de las temperaturas son las siguientes:
Muestra a 40ºC:
30 0,221 0.3
45 0,266 0.25
60 0,284 0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (min)
Pendiente 2= 0,0019
Muestra a 60ºC:
y = 0.0017x + 0.0793
tiempo A 60º C R² = 0.9738
0 0,086 0.2
Absorbancia
15 0,102
30 0,1215 0.15
45 0,1525
0.1
60 0,187
0.05
0
0 10 20 30 40 50 60 70
tiempo (min)
Pendiente 2= 0,0017
Para calcular las actividades enzimáticas utilizamos la fórmula anterior:
𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 2
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 (µ𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎/𝑚𝑖𝑛) = x 6mL
𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 1
0,0019
A.E=( ) x 6= 0,00605481
1,8828
0,0017
A.E=( ) x 6= 0,00541746
1,8828
40ºC 60ºC