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RESUMO 3ª PROVA DE BIOLOGIA MOLECULAR – BIOMEDICINA.

Francine Ramos

PCR – REAÇÃO DA CADEIA POLIMERASE

Relembrando a replicação do DNA:


 DNA polimerase, molécula de DNA (molde), primer RNA (oligonucleotídeos), dNTPs
(dATP, dCTP, dGTP,dTTP), Mg+2, helicase, SSBs, DNA girase, primase, DNA ligase.

Existem aproximadamente 23000 genes no genoma humano. Genes raros são de difícil
localização. Em resumo, a técnica de PCR é uma ferramenta de biologia molecular que permite
a replicação in vitro de DNA de forma rápida a partir de quantidades muito pequenas de
amostra sem a utilização de clonagem.

Reagentes da reação:
 H2O → agente de solubilização.
 DNA molde → DNA alvo não precisa ser isolado (definição se dá pelos primers), uma
única molécula de DNA é suficiente, as amostras podem ser de várias fontes (exceto
hemácias, pois são anucleadas). A amostra pode ser acondicionada em parafina e ser
viável por milhares de anos.
 Taq DNA polimerase → enzima responsável pela síntese de DNA, direção 5’→3’,
sequências muito longas ou ricas em CG a enzima comete erros que precisam ser
reparados, temperatura ótima de atividade = 72°C.
 Mg+2 → cofator enzimático da taq, auxilia nas transformações bioquímicas.
 Primers → se anelam na fita simples para dar início à reação complementando as
extremidades 5’ das regiões de interesse.
 dNTPs (deoxinucleotídeo trifosfato) → “tijolinhos” para síntese das bases
nitrogenadas, concentrações equivalentes.
 Tampão (10x) → mantém o pH ótimo para atividade enzimática.

Faz- um mix com todos os reagentes em um eppendorf e leva-se ao termociclador. A reação é


feita em três fases:

 Desnaturação → ocorre a 94°C. Separação das duplas-fitas pela ação do calor (DNA
melting).
 Anelamento → ocorre a 57°C. Ligação dos primers nas suas sequências alvo. Melting
point dos primers: temperatura na qual 50% dos templates alvo estão pareados com
os primers.
 Extensão → ocorre a 72°C. Taq polimerase inicia sua atividade sintetizando novas fitas
de DNA.

Cinética da PCR:
A amplificação é geométrica → após n ciclos, 2n moléculas de DNA fita dupla. Na prática,
somente de 10 a 30% é a quantidade de amplificação, mas ainda assim é visível no gel de
agarose.
 Fase de screening → ciclos iniciais.
 Fase intermediária → acúmulo exponencial de fragmentos de DNA.
 Fase de amplificação linear → amplificação atinge nível sub-ótimo.
 Fase de platô → a quantificação de produto é estável. Over amplification. 10 8 ou 1012
moléculas de DNA/100 µL

Causas do platô → perda da atividade enzimática, nenhuma enzima disponível,


pareamento dos produtos amplificados entre si e não com os primers gerando produtos
inespecíficos, quantidade insuficiente de reagentes, acúmulo de pirofosfato.

Visualização/avaliação é feita em gel de agarose através de eletroforese.

Cuidados com a reação → como a reação é muito sensível (amplifica a partir de pouca
amostra) contaminação vai afetar o resultado final. É necessário adicionar dois controles:
negativo (mix sem DNA molde → será sempre o último tubo, representativo dos demais) e
um positivo (DNA contendo a sequência alvo → pode ser comprado).
Amplificação inespecífica → região do DNA molde que não a de interesse onde também
ocorre anelamento dos primers (pode ser a causa de bandas “arrastadas”).

PCR – OTIMIZAÇÃO DAS REAÇÕES

A reação padrão ocorre da seguinte maneira:


 Desnaturação inicial → 40 segundos a 5 minutos a 96°C.
 Desnaturação → 30 segundos a 96°C.
 Anelamento → 30 segundos a 55°C. 25-35 ciclos
 Extensão → 30 segundos a 1 minuto a 72°C.
 Extensão final → 2 a 10 minutos a 72°C.
 Finalização da reação → a 4°C ou com adição de EDTA.

Variações possíveis:
 Anelamento dos primers → a temperatura e o tempo dependem da composição
das bases (quantidade de CG), tamanho e concentração dos primers na reação. A
temperatura aplicável é 5°C abaixo da Tm (temperatura de melting) dos primers
que pode variar entre 55 e 72°C. Aumento da temperatura → aumento da
ESPECIFICIDADE!
 Extensão → a temperatura e o tempo dependem do tamanho e da concentração
dos fragmentos na reação. 72°C é a temperatura ótima da atividade da Taq
polimerase. Extensão de 1 minuto = 2Kb.
 Desnaturação → temperatura recomendada é na faixa de 94-97°C, temperaturas
mais altas são recomendadas para fragmentos ricos em CG, porém temperaturas
altas em tempo demais diminuem a atividade enzimática.

A DNA polimerase mais utilizada é a Taq que em altas concentrações gera produtos
inespecíficos e em baixas concentrações gera quantidade insuficiente de produto desejado.

 dNTPs → quantidade recomendável para reação padrão é de 200 µM de cada dNTP,


devem ser utilizados em concentrações equivalentes, 200-250 µM são suficientes para
sintetizar aproximadamente 6-6,5 µg de DNA. Baixas concentrações de dNTPs
aumentam a especificidade e fidelidade → adaptar para o tamanho e composição do
fragmento.
 Cátions divalentes → Mg+2 concentração influencia o anelamento dos primers,
temperatura de desnaturação, formação de dímeros, fidelidade e atividade da enzima.
É necessário titular a quantidade de Mg+2 da reação.
 Primers → alta concentração de primer gera produtos inespecíficos e há formação de
dímeros. Regras para desenho dos primers: 18-28 nucleotídeos, 50-60% C+G. Cálculo
de Ta (°C) → 2 (A+T) + 4 (G+C) – 5 para sequências específicas.
 Outros reagentes → cátions monovalentes KCl para melhorar o anelamento. Co-
solventes e aditivos: aumentam a eficiência da amplificação de fragmentos ricos em
CG e reduzem a formação de dímeros de primers (sendo eles glicerol, DMSO,
formamida, enhancer, detergentes catiônicos, etc.)

Execução da PCR:

Áreas diferentes de manipulação do DNA pré e pós amplificação desejáveis para evitar
contaminação.

Sempre utilizar os dois controles.

APLICAÇÕES DA PCR

Áreas de pesquisa:
 Genética molecular → análise de polimorfismos, mutações gênicas.
 Análise de expressão de RNA (rt-PCR).
 Micro e virologia → investigação da presença de micro-organismos, determinação de
cepas ou análise filogenética.

Genética molecular:
Extração de DNA, amplificação de determinadas regiões do DNA (para isso é necessário
desenho de primers específicos), análise dos fragmentos amplificados para conhecer a
sequência de DNA (clivagem com enzimas, sequenciamento ou hidridização).

Diagnóstico:
Doenças genéticas, infecciosas (presença ou ausência do patógeno. Para isso, os primers
devem ser específicos anelando unicamente no genoma do patógeno de suspeita), análises
forenses.
Mas e se houver um inibidor da Taq na amostra? → A reação não ocorrerá, não aparecerá
banda no gel = falso-negativo. Possibilidade de melhora → inclusão de mais um par de primers
que anele apenas no DNA do hospedeiro.
E se a investigação for de um vírus com genoma de RNA? → Aí será necessário usar a
transcrição reversa para transformar este genoma de RNA em DNA.
Cuidados para utilizar a PCR em diagnóstico: cuidado com contaminação das amostras tendo
atenção à manipulação e trabalho em fluxo laminar horizontal com higienização prévia.
Pode-se fazer o diagnóstico de qualquer micro-organismo por PCR? → A princípio sim, mas a
técnica apresenta limitações e é indicada quando: a cultura é difícil, presença de anticorpos é
inconclusiva, necessário quantificar a carga viral, necessário determinar o subtipo devido ao
prognóstico.
Alguns exemplos de diagnóstico por PCR: HPV, infecções por Chlamydia sp., hepatite C (quanti
e qualitativo utilizando-se a transcrição reversa), HIV (quanti e qualitativo utilizando-se a
transcrição reversa), herpes humana, infecções por Micobacterium tuberculosis, análise de
resistência a antivirais por mutações no vírus.

VARIAÇÕES DA PCR

 rt-PCR → é uma amplificação onde o molde para amplificação é RNA e não DNA, por
isso é necessário transformar o RNA em cDNA. É baseado em uma transcrição reversa
seguida de uma PCR. Aplicações → detecção e quantificação da expressão de mRNAs
em tecidos diferentes ou no mesmo tecido submetido a tratamentos diferentes, em
tecidos normais ou alterados. Primers poli-T → reconhecimento da cauda poli-A.
 PCR convencional alelo-específico → para diferenças na sequência de DNA, utiliza 3
pares de primers.
 PCR multiplex → análise de diversos genes. Usado para diagnóstico de doenças
infecciosas.
 PCR-RFLP → PCR seguido de clivagem com enzimas de restrição.
 Nested PCR → “PCR da PCR”.

REAL-TIME PCR

Limitações da PCR convencional:


 Não quantitativa;
 Contaminação por brometo;
 Discriminação baseada somente no tamanho do amplicon (baixa);
 Não automatizada;
 Pós-processamento (clivagem).

REAL-TIME PCR (PCR em tempo real):


 Variação da PCR convencional → sistema de detecção de sinais fluorescentes;
 Análise dos dados em tempo real → monitoramento contínuo do sinal fluorescente;
 Detecção, quantificação e amplificação do DNA em uma etapa;
 Agilidade na obtenção dos resultados;
 Quantificação do número de moléculas produzidas a cada ciclo.

Vantagens da PCR em tempo real:


 Sem manipulação pós PCR;
 Resultados quantitativos;
 DNA/cDNA em concentração 1000X menor;
 Maior reprodutibilidade, precisão e sensibilidade.

Aplicações:
 Todas as aplicações da PCR convencional;
 Quantificação de carga viral;
 Quantificação de expressão gênica;
 Testes de eficiência terapêutica;
 Detecção de agentes infecciosos;
 Caracterização do agente (genotipagem).

Reagentes da qPCR: mix convencional + sonda/corante fluorescente.

Baseline → intensidade de sinal produzido é menor do que a intensidade da fluorescência do


meio. Ciclos iniciais da PCR com poucas mudanças na fluorescência.

Sistemas de detecção → detecção não específica (agentes intercalantes/ligantes de DNA) e


detecção específica (sondas de hidrólise).
 Detecção não específica → SYBR Green: liga-se a qualquer dupla fita de DNA emitindo
fluorescência, quanto maior o número de cópias maior a fluorescência emitida,
permite a quantificação do DNA e somente emite fluorescência quando ligado ao DNA.
Possui baixo custo, boa sensibilidade e é de fácil uso, mas não permite PCR multiplex,
necessária uma curva de dissociação e é inespecífico!
 Detecção específica → TaqMan: detecta apenas o DNA com a sequência da sonda,
primers + sonda conjugada (fluorocromo reporter e molécula quencher), sonda intacta
não emite fluorescência. Baseia-se na atividade 5’→3’ exonuclease da Taq polimerase,
emissão de luz só ocorre se há hibridização e degradação da sonda, alta especificidade
e sensibilidade, 1 a 5 bases do primer Forward, permite PCR multiplex, sem curva de
dissociação e detecta produtos específicos.
 Detecção específica → Molecular beacons: oligonucleotídeos/sondas que formam
estrutura secundária haste/loop. Haste = anelamento de sequências complementares
nas extremidades. Loop = sequência complementar à sequência-alvo. Precisam de
fluóroforo e quencher. São altamente específicos, diferem sequências-alvo que
possuem apenas um nucleotídeo diferente.

Threshold → limiar de detecção. Nível de fluorescência acima do Baseline e dentro da região


de crescimento exponencial.
Threshold cicle (Ct) ou quantification cicle (qC) → número do ciclo da PCR que a fluorescência
atinge o threshold.

Sistema TaqMan para análise de polimorfismos → dependendo do genótipo do indivíduo a


fluorescência emitida será diferente.

ELETROFORESE

Aplicações → “quantificação” do DNA total extraído, verificar se a PCR funcionou


adequadamente, verificar a presença de sítios de restrição em DNA total e produto
amplificado pela PCR, verificar o sucesso na produção de uma molécula de DNA recombinante,
busca inicial de mutações, sequenciamento pelo método manual.

Princípio da técnica → separação de moléculas carregadas eletricamente. DNA = carga


negativa.

Fragmentos menores, migram mais rápido que fragmentos maiores.

Tipos de eletroforese:

 Horizontal → utiliza gel de agarose. Usada para DNA total ou fragmentos grandes,
ideal para separação de fragmentos com diferença superior a 20 pares de bases.
 Vertical → utiliza gel de acrilamida. Usada para fragmentos menores (apresenta maior
sensibilidade), ideal para separação de fragmentos com diferença inferior a 20 pares
de bases.
Materiais necessários para eletroforese:

 Cuba;
 Fonte → dispositivo necessário para produção do campo elétrico, proporciona uma
diferença de potencial entre os polos negativo e positivo. É necessário ajustar a
intensidade do campo (W = V. A).
 Tampão → uma solução tampão é composta por um aceptor e um doador de prótons,
permitindo assim, o fluxo de elétrons. TBE, EDTA.
 Suporte ou gel → é um material poroso que permite a migração diferencial das
moléculas. Agarose (polissacarídeo, possui grau de pureza variável, diversas variações
para aumentar a resolução, diminuir ponto de fusão, etc.)
 Corantes → para migração (azul de bromofenol, xileno cianol. É necessário adicionar
uma substância de alta densidade como sucrose ou glicerol para permitir a aplicação
no gel), para visualização do DNA (brometo de etídeo que é mutagênico, prata, SYBR
safe, Gel Red → ultrassensível, não citotóxico nem mutagênico, não apresenta risco
ambiental, detecta vários tipos de material genético, visualização no transiluminador.

Fatores que influenciam a migração no gel de agarose:

 Tamanho e forma do fragmento;


 Concentração de agarose;
 Voltagem aplicada;
 Direção do campo elétrico;
 Presença de corantes intercalantes;
 Composição do tampão.

Fatores que influenciam a migração no gel de acrilamida:

 Tamanho do fragmento de DNA – detecta diferenças menores;


 Concentração de acrilamida – 3 a 10%;
 Voltagem aplicada;
 Presença de corantes intercalantes;
 Composição do tampão;
 Temperatura e composição das bases;
 Conformação da dupla-fita.

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO – DNA METILASES E DNA LIGASES

Nucleases e ribonucleases (RNases) → são responsáveis pela quebra enzimática de ligações


fosfodiéster do DNA e RNA, podem ter atividade exonucleásica ou endonucleásica.

Endonuclease de restrição → reconhecem pequenas sequências de DNA fita-dupla (4-8pb) –


sítios de restrição. Após reconhecimento, são capazes de clivar as duas fitas, os sítios de
restrição são normalmente sequências palindrômicas (leitura igual em sentidos contrários →
AGCT – TCGA). São extraídas de bactérias com resistência viral. Como as bactérias protegem
seu genoma de endonucleases de restrição? → sistema de restrição-metilação! Para cada
enzima de restrição é necessária uma DNA metilase, que irá metilar a mesma sequência que é
reconhecida pela endonuclease de restrição. A metilação impede a clivagem!
Classificação das enzimas de restrição:

 Tipos I e III → clivam o DNA fora do sítio de reconhecimento.


 Tipo II → cliva o DNA dentro do sitio de restrição (garante um padrão de clivagem
previsível), sítios de reconhecimento geralmente são palindrômicos.

Sistema de restrição do tipo II:

 Enzima de restrição e de metilação separadas → enzimas de restrição necessitam de


Mg+2 como co-fator, enzimas de metilação necessitam de S-adenosilmetionina como
co-fator e adicionam grupamentos metila nas duas fitas.

Regras para nomenclatura das enzimas de restrição:

 Gênero → primeira letra.


 Espécie → segunda e terceira letras.
 Linhagem → quarta letra maiúscula.
 Se a bactéria tiver mais de uma enzima de restrição seguem em números romanos na
ordem de descobrimento.

Aplicações das enzimas de restrição:

 Detecção de alteração de um sítio de restrição (mutação ou polimorfismo);


 Mapa de restrição → por Southern blot (clivagem de DNA total, eletroforese,
comparação do padrão de bandas).

A DNA ligase é “adicionada” para ligar as extremidades pós-clivagem.

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Exemplos de aplicações práticas/clínicas:

 Terapia gênica;
 Vacinas gênicas;
 Animais e plantas transgênicas;
 Produção de proteínas raras (insulina, hormônio do crescimento, vacina para hepatite
B);
 Construção de bibliotecas de DNA para sequenciamento genômico.

Visão geral → o processo ocorre em 4 fases:

 Construção do recombinante → enzimas especiais são usadas para cortar o


plasmídeo, o gene de interesse é inserido no plasmídeo e o plasmídeo recombinante é
formado;
 Transformação → o plasmídeo recombinante é inserido na célula bacteriana;
 Amplificação → o plasmídeo inserido começa a se reproduzir e quando a célula
bacteriana se divide, os plasmídeos são compartilhados com as células-filhas;
 Expressão → análise se o gene de interesse foi expresso ou não.

O que são vetores? → veículos. Transportam o inserto de DNA para dentro da célula
hospedeira onde será replicado e/ou expressado em alguns casos. Devem possuir capacidade
de replicação autônoma.
Características necessárias dos vetores:

 Deve possuir um ou mais genes que confiram propriedades particulares, como


resistência a antibióticos o que servirá como indicador selecionável;
 Deve possuir uma sequência que funcione como origem de replicação. Alguns
plasmídeos utilizam as enzimas da própria bactéria para replicação, alguns possuem
genes de enzimas e outros ainda se inserem no DNA da bactéria;
 Ter um sítio para clivagem com enzima de restrição.

Principais vetores:

 Plasmídeos → são moléculas de DNA circular, fita-dupla, extracromossômico, ocorrem


em bactérias e têm capacidade autônoma de replicação.
 Vetores virais → adenovírus, retrovírus modificados.

Transformação → transferência do DNA recombinante para célula hospedeira através de


leveduras ou outras bactérias.

Métodos utilizados para transformação:

 Tratamento com CaCl2 → parece estabilizar as cargas negativas do DNA e da


membrana celular;
 Eletroporação → pulsos elétricos induzem a formação de poros na membrana celular;
 Sonicação → sons muito altos vibram a membrana celular.

A partir do DNA recombinante, é realizada a clonagem que possibilita a obtenção de muitas


cópias de um fragmento de DNA, construção de bibliotecas de cDNA, obtenção do produto da
expressão, a célula hospedeira pode funcionar como uma “fábrica” de proteína, vetores de
expressão.

Vetores de expressão procarióticos → um vetor de expressão deve conter:

 Promotor forte;
 Sítios de ligação ao ribossomo;
 Vários sítios de clonagem imediatamente a jusante destes sinais;
 Os promotores podem ser induzíveis.

SEQUENCIAMENTO

O que é o sequenciamento? → método que permite conhecer a sequência de um fragmento


de DNA, ou seja, desvendar a informação contida no fragmento.

Método enzimático (método manual):

 É baseado na replicação de DNA in vitro por término de cadeia.


 Utiliza didesoxinucleotídeos (ddNTPs, didNTPs).
 Molde → um grande número de cópias de apenas um fragmento. Deve ser executado
um processo de limpeza do produto inicial da PCR.
 Quais são os reagentes adicionados em cada tubo? → desoxinucleotídeos “normais”,
um didesoxi (um diferente para cada tubo), um primer, um didesoxi marcado, DNA
polimerase, tampão e MgCl2. Marcação com radioisótopos!
Por aleatoriedade, os didesoxi são incorporados em diferentes posições gerando fragmentos
de diversos tamanhos. Importante → antes de aplicar a amostra no gel é preciso desnaturar!

Sequenciamento automatizado:

 Diferenças → todos os didesoxi são adicionados na mesma reação com os


nucleotídeos normais. A eletroforese é capilar. Ocorre em termociclador, a marcação é
feita com fluoróforos, leitura é feita por laser em diferentes comprimentos de onda,
necessita análise por bioinformática.

Problemas no sequenciamento:

 Erros de leitura pela DNA polimerase;


 Contaminação da amostra;
 DNA de baixa qualidade ou quantidade;
 Com o polímero.

Aplicações do sequenciador:

 Análise de microssatélites → pesquisa de variantes genéticas, análises forenses.

HIBRIDIZAÇÃO

Uma sonda de DNA é um DNA fita simples, de tamanho pequeno (50-300pb) que é marcado
com uma substância radioativa ou conjugado com um produto que permita sua visualização. O
objetivo de uma sonda é encontrar (hibridizar com) um trecho de DNA para o qual ela seja
pelo menos parcialmente complementar e permitir sua localização em outro ensaio como
Southern Blot, ELISA, etc.

Southern blotting → uma das primeiras técnicas de biologia molecular a utilizar a hibridização.
Utilizada para DNA.

Northern blotting → para RNA.

Western blotting → para proteínas.

Aplicações:

 Diagnostico padrão para doenças genéticas associadas a grandes inserções ou


deleções.

Sondas podem ser:

 Unilocais → hibridizam em um só local.


 Multilocais → hibridizam em vários locais dispersos no genoma. Permitem DNA
fingerprinting → auto-radiografia. Aplicação em uma membrana tipo folha de raio X.

Microarranjos de DNA (microarray) → clones de DNA aplicados em micro-pontos (chips) sobre


uma membrana com auxílio de um robô.

Aplicações:

 Estudo em grande escala de expressão gênica → método de triagem.


 Estudo em grande escala de variações no DNA.
 Permite dois tipos de informações simultâneas → qual é o mRNA expresso em maior
quantidade e quais são os mRNAs expressos nos diferentes tipos celulares.

Tecnologia de microarray:

 Retrato completo da expressão gênica → identificação de genes com funções


relacionadas, classificação molecular dos tecidos, redes genéticas ativas em
determinadas condições fisiológicas.
 Deve ser revalidado por rt-PCR quantitativo.

Pode ser utilizado para genotipagem → para isso utilizam pequenas sondas com a sequência
de cada alelo, ou seja, para cada gene duas sondas. Amplificação de vários sítios por PCR, a
verificação não é feita em gel, mas sim no próprio chip, permite a genotipagem de um grande
número de variantes simultaneamente.