26-2-2018

PRACTICA #2

LABORATORIO DE METABOLISMO INTERMEDIARIO

Experimentar en el metabolismo anaeróbico en la producción de piruvato a partir de
la utilización de glucosa como fuente de hidrato de carbono

La fermentación es la primera etapa del catabolismo de glucosa es la producción de

piruvato. Este proceso, que se efectúa mediante una serie de reacciones que
involucran un número considerable de intermediarios, se conoce como glucólisis.
La reacción total de una molécula de glucosa produce dos moléculas de piruvato,
dos moléculas de ATP y dos moléculas de NADH. Este cofactor se encuentra en
cantidades catalíticas (es necesario reoxidarlo para que el proceso no se suspenda),
y es utilizado por la cadena respiratoria para obtener ATP dando así NAD+. Esto no
es posible en condiciones anaeróbicas y en este caso la Re oxidación se efectúa
cuando el piruvato se convierte en acetaldehído, y luego en alcohol. Los
intermediarios metabólicos son metabolitos como el piruvato y acetaldehído se
encuentran presentes normalmente en muy baja concentración, por lo tanto, para
demostrar su existencia como intermediarios en el camino metabólico, es necesario
impedir que sean transformados en otros compuestos. Este procedimiento se usa
mucho para estudiar caminos metabólicos y se puede realizar:
Bloqueando la enzima que cataliza la conversión del compuesto que se está
investigando mediante inhibidores.
Cambiando las condiciones fisiológicas para que la enzima funcione a una velocidad
muy por debajo de su actividad máxima. Usando un agente que atrape el
intermediario y que forme un compuesto que no pueda metabolizarse. El piruvato
descarboxilasa noes activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera que el
piruvato se acumula y su presencia puede demostrarse por la reacción con
nitroprusiato de sodio o 2,4dinitrofenilhidrazina.

 Matraces Erlenmeyer  Solución de Malonato

 Pipetas Pasteur
 Gradilla
 Tubos de ensayo
 Pipetas de vidrio
 Baño maría
 Incubadora
 Levadura fresca
 Solución de fosfato de potasio
 Solución de fosfato de sodio
 Glucosa
 Hidróxido de amonio concentrado
 Hidróxido de amonio granular
 Solución de nitroprusiato
 Solución saturada de 2-4 dinitrofelnilhidrazina
 Solución de NaOH
 Regulador de
Regulador de
fosfato de
fosfato de sodio
potasio

Condicion aerobia Comdicion aerobia

Condicion aerobia + Condicion aerobia +

malonato malonato

Condicion anaerobia Condicion anaerobia

+ aceite mineral + aceite mineral

Condicion anaerobia
+ aceite + malonato Condicion anaerobia
+ aceite + malonato

4-
Acetaldehido
8- Regulador
fosfato Sodio
4- Piruvato
16 Tubos
4-
Acetaldehido
8- Regulador
fosfato Potasio
4- Piruvato
 Figura 1. Prueba piruvato con glucosa 1%

Regulación fosfato de sodio Regulación fosfato de potasio

Figura 1. Prueba PIRUVATO con glucosa al 1% (Reacción 0.5 Sulfato de amonio) donde se observa una coloración
o anillo rojo en la superficie lo que indica que la prueba es negativa ya que una muestra positiva muestra una
coloración o anillo verdoso azulado.

Figura 2. Prueba piruvato con glucosa 2%

Regulación fosfato de sodio Regulación fosfato de potasio

Figura 2. Prueba PIRUVATO con glucosa al 2% (Reacción 0.5 Sulfato de amonio) Donde se observan positivas las
muestras ya que se puede distinguir un pequeño anillo verdoso sobre el color rojo en la superficie (a excepción
del tubo 4 de regulación con fosfato de sodio), el tubo número 4 de la parte de regulación de fosfato de sodio se
agito por lo que se mezclaron los reactivos y por eso se ve como una mezcla homogénea color rojo.
 Figura 3. Prueba piruvato con glucosa 0.5%

Regulación fosfato de potasio Regulación fosfato de sodio

Figura 3. Prueba PIRUVATO con glucosa al .5% (Reacción 0.5 sulfato de amonio) donde ninguna de las muestras se
observa que sea positiva ya que no presenta la coloración de un anillo verde o azulado por lo que la en estas
muestras se estima que no hay presencia de piruvato no metabolizado.

Figura 4. Prueba acetaldehído con glucosa 1%

Regulación fosfato de sodio Regulación fosfato de potasio

Figura 4. Prueba ACETALDEHIDO con glucosa 1% (Reacción 2,4 dinitrofelnilhidrazina) en la cual se observan todas las
muestras positivas, las de regulador fosfato de potasio tanto como las de regulador fosfato de sodio, se observa la
formación de un precipitado en forma de anillo color rojo en el fondo del tubo, lo que indica la presencia de grupos tioles
en la muestra. El ultimo tubo se mezcló por lo que el reactivo se disolvió, pero su hubo formación de precipitado rojo.
 Figura 5. Prueba acetaldehído con glucosa 2%

Regulación fosfato de potasio Regulación fosfato de sodio

Figura 5. Prueba ACETALDEHIDO con glucosa 2% (Reacción 2,4 dinitrofelnilhidrazina) en la cual se puede observar
claramente que todas las muestras son positivas ya que adquieren una coloración roja lo cual nos indica la presencia de
los grupos tioles en las muestras.

Figura 6. Prueba acetaldehído con glucosa 0.5%

Regulador fosfato de potasio Regulador fosfato de sodio

Figura 6. Prueba ACETALDEHIDO con glucosa 0.5% (Reacción 2,4 dinitrofelnilhidrazina) donde se puede observar
una coloración diferente en los tubos que contienen el regulador de sodio ya que estos se ven de un color un poco
rojizo muy claro, pero si se alcanza a distinguir por lo que en este caso se consideran positivos.
 Durante la practica hubo varios pasos en los que debimos tener mucho cuidado de no
agregar los reactivos y las cantidades equivocadas ya que por un momento teníamos
demasiados tubos los cuales pertenecían a la prueba de piruvato y de acetaldehído, no se
cometieron errores en la práctica, se piensa que tal ves los reactivos ya estaban en mal
estado o ya tienen mucho tiempo dado que su eficiencia ya no es la misma porque en
ningún equipo se pudo ver la coloración azul o verdosa en las pruebas de piruvato, solo en
un equipo se pudo ver un poco una tonalidad como ámbar o un poco verdosa pero muy
muy ligero lo cual fue lo que consideramos como positivo.

PRUEBA REGULADOR #TUBO 0.5% 1% 2% Como se puede observar claramente en la tabla.1 de

los resultados, la concentración de glucosa es la que
nos va a reaccionar con los diferentes reactivos y de
ella depende proporcionalmente la presencia de
PIRUVATO piruvato en las muestras, como sabemos los
reguladores nos crean un medio ligeramente en las
muestras por lo que la piruvato descarboxilasa de
inactiva y lo que hace es que no puede metabolizar al
piruvato, por lo que mientras más concentración de
glucosa tengamos, más piruvato será en que se
generara y se ira acumulando en la muestra al no ser
metabolizado. Como sabemos mediante la
fermentación igual se obtiene energía, pero no
necesariamente se necesita oxigeno por lo que se crea
en ambiente anaeróbico de esa manera la levadura
ACETALDEHIDO
que tiene un metabolismo mixto puede trabajar, por lo
que también podemos notar que al mismo tiempo el
piruvato se convierte en acetaldehído que es una re
oxidación porque estamos en condiciones
anaeróbicas.

Tabla.1 Resultados

Se comprobó cómo la concentración de glucosa afecta de manera directa a la

producción de piruvato y de acetaldehído a partir de glucosa como fuente de energía
y como mientras tenemos mas glucosa de igual manera será más fácil identificar la
presencia de piruvato y acetaldehído acumulados en la muestra bajo condiciones
ligeramente alcalinas y anaerobias con ayuda de la levadura Saccaromyces
cerevisiae.