Manual Virologia

Fac. Cs. Qs. Dpto.
De MICROBIOLOGÍA
LABORATORIO DE VIROLOGÍA
Q.F.B
BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS

QUÍMICAS LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO
ÁREA ESPECÍFICA DE: MICROBIOLOGÍA
NOMBRE DE LA ASIGNATURA: LABORATORIO DE VIROLOGÍA
CÓDIGO: FAR 315L
FECHA DE ELABORACIÓN: MARZO 2002
NIVEL EN EL MAPA CURRICULAR: FORMATIVO
TIPO DE ASIGNATURA: DISCIPLINARIA
PROFESORES QUE PARTICIPARON EN SU ELABORACIÓN:
M. C. Nidia Gary Pazos Salazar

M. C. Maria Susana Pérez Fernández
M. C. Oscar Pérez Toríz
M. C. Alejandro Ruíz Tagle
M. C. Carlos Téllez Osorio
M. C. Claudy Lorena Villagran Padilla
HORAS DE TEORÍA: 3 HORAS PRÁCTICA: 2 CRÉDITOS: 8
1
Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA
Q.F.B
INDICE
NÚMERO DE LA TÍTULO DE LA PRÁCTICA PÁGINA
PRÁCTICA
PRÁCTICA No. 1 NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO 3
DE VIROLOGÍA.
PRÁCTICA No. 2 PRUEBAS DE HEMAGLUTINACIÓN (HA) E INHIBICIÓN 7
DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA). PRINCIPIOS Y
APLICACIONES.
PRÁCTICA No. 3 PRUEBA DE HEMAGLUTINACIÓN (HA) PARA EL 12
DIAGNÓSTICO PRELIMINAR DEL VIRUS DE LA
ENFERMEDAD DE NEWCASTLE.
PRACTICA NO 4 PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN 16
(IHA) PARA EL DIAGNÓSTICO DEFINITIVO DEL VIRUS
DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE.
PRÁCTICA No. 5 HUEVO FÉRTIL DE AVE COMO MODELO BIOLÓGICO 20
PARA EL CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE VIRUS.
PRÁCTICA No. 6 ENSAYO DE LAS VÍAS DE INOCULACIÓN EN HUEVO 24
FÉRTIL DE POLLO.
PRÁCTICA No. 7 REPLICACIÓN DEL VIRUS DE LA BRONQUITIS 28
INFECCIOSA AVIAR EN HUEVO FÉRTIL DE POLLO.
PRÁCTICA No. 8 TITULACIÓN DEL VIRUS DE LA BRONQUITIS 28
INFECCIOSA AVIAR (DI50) EN HUEVO FÉRTIL DE
POLLO.
PRÁCTICA No. 9 CULTIVOS DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS PARA LA 32
REPLICACIÓN DE VIRUS ANIMALES: OBTENCIÓN,
PROLIFERACIÓN Y MANTENIMIENTO.
PRACTICA No 10 SEMINARIO: OBTENCIÓN DE UN CULTIVO PRIMARIO
DE FIBROBLASTOS DE EMBRIÓN DE POLLO.
PRÁCTICA No. 11 PROLIFERACIÓN DE CULTIVOS CELULARES 37
MEDIANTE SUBCULTIVO O PASE 1:2
PRÁCTICA No. 12 REPLICACIÓN VIRAL EN CULTIVOS CELULARES: 40
OBSERVACIÓN DE MONOESTRATOS CELULARES
NORMALES Y CON EFECTOS CITOPÁTICOS.
PRÁCTICA No. 13 REPLICACIÓN DE BACTERIÓFAGOS LÍTICOS EN 43
ESCHERICHIA COLI.
PRÁCTICA No. 14 ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO (ELISA) EN EL 47
DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE VIRUS:
FUNDAMENTO, APLICACIONES Y LIMITACIONES.
PRACTICA No 15 ENSAYOS INMUNOENZIMÁTICOS PARA EL 52
DIAGNÓSTICO DE CITOMEGALOVIRUS, RUBÉOLA,
HEPATITIS B Y HIV.
PRACTICA No 16 EVALUACIÓN FINAL
2
1. VIROLOGIA CLINICA
1.1. NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE VIROLOGÍA
El conocimiento de las propiedades fisicoquímicas y de la infecto-contagiosidad de

los viriones, permite definir las normas que, en materia de seguridad, son necesarias
para no correr ningún riesgo de adquirir aún en forma accidental, una infección por
este tipo de partículas.
Con base en lo anterior, se enlistan a continuación los reglamentos y normas que

habrán de seguirse en el Laboratorio de Virología, con la finalidad de asegurar la
integridad física de los alumnos, así como para mantener una organización adecuada
para el desarrollo de las prácticas correspondientes.
 La hora de entrada tiene 10 minutos de tolerancia, pasado este tiempo, no

se permitirá el acceso al laboratorio.
 Entrar al laboratorio con la bata puesta y abotonada.
 Colocar todos los artículos personales en la zona lateral o en los cajones
de las mesas de trabajo.
 Al iniciar y finalizar las prácticas, lavarse las manos con agua y jabón
desinfectante.
 Queda estrictamente prohibido comer, beber o fumar en el laboratorio, así
como introducir algún objeto en la boca.
 La puerta del laboratorio debe mantenerse cerrada.
 Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes y después de utilizarla.
 Permanecer en la zona de trabajo asignada para cada equipo.
 Comunicarse con sus compañeros solo en la medida indispensable.
 Antes de iniciar la práctica, leer y recordar la metodología a seguir de
acuerdo con las indicaciones del profesor. Si se tienen dudas, es el
momento para aclararlas.
 Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra (rotura de material,
derramamiento de suspensiones virales, etc.).
 Todo el material que se va a incubar o desechar, deberá colocarse en el
sitio indicado por el profesor.
 Sea cuidadoso con el material y equipo que se le proporciona; el material
de desecho no contaminado deberá depositarse en los contenedores
correspondientes.
 En forma previa a su lavado, siempre se deberá desinfectar el material que
se le proporcione en el laboratorio.
 Rotule todo el material que se va a incubar, con los siguientes datos:
grupo, sección, equipo, nombre del alumno, así como fecha de entrada y
salida.
En general, las disposiciones anteriores tienden al cumplimiento de la Norma, en la

cual se establecen los requisitos para la separación, envasado, almacenamiento,
recolección, transporte, tratamiento y disposición final de los Residuos Peligrosos
biológico-infecciosos que se generan en establecimientos e instituciones relacionadas
con el sector salud.
En la NOM referida, se establecen además definiciones de interés para los

laboratorios y áreas de microbiología, tales como:
Desinfección: Destrucción de microorganismos patógenos en todos los ambientes,

materias o partes que pueden ser nocivos, por los distintos medios mecánicos,
físicos o químicos contrarios a su vida o desarrollo, con el fin de reducir el riesgo de
transmisión de enfermedades.
Residuo peligroso biológico-infeccioso: El que contiene bacterias, virus u otros

microorganismos con capacidad de causar infección o que contiene o puede
contener toxinas producidas por microorganismos que causan efectos nocivos a seres
vivos y al ambiente, que se generan en hospitales y establecimientos de atención
médica.
En adición, se consideran residuos peligrosos biológico-infecciosos los siguientes:
4
 La sangre
 Los cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos
 Los cultivos generados en los procedimientos de diagnóstico e investigación, así
como los generados en la producción de biológicos
 Los instrumentos y aparatos para transferir, inocular y mezclar cultivos
 Las muestras biológicas para análisis químico, microbiológico, citológico e
histológico
 Los residuos anatómicos derivados de la atención a pacientes de los laboratorios
 Los equipos y dispositivos desechables utilizados para la exploración y toma de
muestras
 Los objetos punzo cortantes usados o sin usar
 Los que han estado en contacto con pacientes o sus muestras clínicas durante el
diagnóstico y tratamiento, incluyendo navajas, lancetas, jeringas, pipetas Pasteur,
agujas hipodérmicas, de acupuntura y para tatuaje, bisturíes, cajas de Petri,
cristalería entera o rota, porta y cubreobjetos, tubos de ensayo y similares.
Con base en lo anterior, los residuos peligrosos infecto-contagiosos, deberán ser

tratados por métodos físicos o químicos, los cuales:
o Deberán garantizar la eliminación de microorganismos patógenos

o Deberán volver irreconocibles a los residuos peligrosos biológico-infecciosos
o Deberán ser cremados, si se trata de residuos patológicos.
El cumplimiento de las consideraciones señaladas con anterioridad, garantiza la

seguridad que deberá observarse tanto para alcanzar los objetivos de las prácticas,
como para su desarrollo en condiciones asépticas.
Finalmente, y dada la especificidad de especie que presentan los virus, en esta

primera sesión de laboratorio se hará énfasis en que, a través de las diferentes
prácticas, se utilizarán únicamente suspensiones virales de tipo vacunal destinadas
para uso veterinario, con la finalidad de evitar el más mínimo riesgo de infección
hacia los estudiantes.
5
Q.F.B
CUESTIONARIO
1. Con ayuda de un esquema especifique, cuál sería el manejo que se la daría a
materiales como jeringas, portaobjetos, pipetas, tubos y material con residuos de
tejidos, desde que han sido utilizados para el análisis de virus hasta su destino final.
6
Q.F.B
1.2. PRUEBAS DE HEMAGLUTINACIÓN (HA) E INHIBICIÓN DE LA

HEMAGLUTINACIÓN (IHA). PRINCIPIOS Y APLICACIONES
Desde el descubrimiento de los virus, se identificó que, de acuerdo a sus

características moleculares, estos agentes requieren del empleo de modelos vivos
para su análisis; esta condición hace particularmente difícil implementar el uso de
sistemas adecuados como son el uso de animales de laboratorio o los modelos de
Células en Cultivo. De esta manera se hizo necesaria la búsqueda de alternativas para
el análisis de virus que omitieran la necesidad de modelos vivos.
 Prueba de hemaglutinación (ha).
Inicialmente, la HA se aplicó para el análisis del virus Influenza, sin embargo, como
explicaremos más adelante, se puede aplicar para realizar ensayos sobre cualquier
virus con proteínas estructurales con propiedades hemaglutinantes.
El nombre de Hemaglutinación se debe al hallazgo de que los virus Influenza podían

aglutinar eritrocitos, posteriormente se determinó que el origen de esta propiedad se
debía a la existencia de una glicoproteína presente en la envoltura viral a la cual se le
denominó como hemaglutinina.
Actualmente se sabe que una gran cantidad de virus poseen proteínas externas con
estas características por lo que el método tiene una amplia aplicabilidad en el análisis
de diferentes entidades virales.
También se descubrió que la hemaglutinina tiene el papel de funcionar precisamente

como el ligando viral encargado de reconocer al receptor en las células blanco.
De manera general, el receptor corresponde a las moléculas de ácido siálico presente

sobre la superficie de diversos tipos celulares, aun que dependiendo del virus esta
molécula puede estar enlazada en diferentes tipos de enlaces químicos.
A este respecto cabe resaltar que la función de la hemaglutinina no es entonces

aglutinar eritrocitos, más bien es participar en el primer paso de la replicación viral
que es la adsorción, pero sus propiedades sirven para desarrollar la prueba de HA que
se utiliza como un ensayo in vitro.
7
Para empezar a conocer la prueba de HA, se hace necesario describir las ventajas y
desventajas que ofrece.
Ventajas:
Prueba sencilla de desarrollar.
No requiere de una infraestructura complicada.
Es económica.
Ideal cuando se manejan muestras con alta carga viral.
Se aplica en los ensayos para la determinación de la naturaleza
química de los receptores celulares.
Desventajas:
Se emplea sólo como diagnóstico presuntivo.
Existen agentes no virales que pueden causar HA.
Es poco sensible.
Genera falsos negativos.
El fundamento de esta prueba consiste en poner de manifiesto la existencia de virus

con proteínas con capacidad hemaglutinante que reconocen receptores celulares. De
esta manera los virus se unirán a los eritrocitos de la especie que sea siempre que
contenga en su superficie moléculas de ácido siálico. La prueba se representa en el
siguiente esquema:
ERITROCITO
ERITROCITO
Virus con proteínas

Hemaglutinantes
HEMAGLUTINACIÓN
Para la realización de esta prueba se requiere tomar una muestra que contenga virus,
como ejemplo tenemos: stocks virales provenientes de lotes vacunales o de cosechas
obtenidas de células en cultivo; muestras de origen clínico tomadas de acuerdo a la
zona anatómica que afecta el virus, tal es el caso del virus influenza donde la muestra
a tomar corresponde a un lavado faríngeo.
8
Para procesar la muestra se preparan diluciones seriadas al doble empezando desde
la dilución 1:10 hasta la dilución 1:1280 empleando como diluyente una solución
amortiguadora de fosfatos. Posteriormente a cada dilución se le adiciona la misma
cantidad de una suspensión de eritrocitos preparada al 1%.
Todo esto se realiza en tubos de fondo en U o en microplacas de fondo en U. Los

eritrocitos aglutinados sedimentarán en el fondo del pozo formando una red, mientras
los no aglutinados sedimentan por gravedad.
De acuerdo a la forma del pozo se forma una dona o un anillo en el centro. Los
sedimentos se aprecian de la siguiente manera:
PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA
Una prueba de HA positiva implica la sospecha de un virus presente en la muestra, sin

embargo, la determinación exacta del virus involucrado en una patología es aún
incierta.
Por esta razón como siguiente paso se debe aplicar una prueba que permita la plena
identificación del tipo de virus, a este respecto se cuenta con una prueba serológica.
 Prueba de inhibición de la hemaglutinación (iha)
Para realizar un diagnóstico definitivo se debe realizar una prueba que demuestre una
respuesta específica del huésped hacia este virus, dicha respuesta está representada
por la presencia de anticuerpos y la prueba empleada para ello se conoce como
Inhibición de la Hemaglutinación (IHA).
Esta prueba se basa en la unión de un anticuerpo específico hacia la hemaglutinina

del virión que impida la formación de puentes entre el ligando viral y el receptor
celular.
Este hecho permite identificar plenamente al virus y se conoce como neutralización

vírica.
La prueba de IHA, puede representarse esquemáticamente de la siguiente manera:

Q.F.B
Primera fase: Reconocimiento Ag-Ac.
Virus con Anti-HA

proteínas
hemaglutinantes
Neutralización viral
Segunda fase: Interacción con eritrocitos: demostración de la IHA.
ERITROCITO
NO EXISTE
RECONOCI
MIENTO
La existencia de anticuerpos que puedan reconocer a cepas virales específicas

permite diagnosticar plenamente que un virus en particular es el responsable de
alguna patología.
Esto basándose en un principio fundamental de inmunología: La presencia de

anticuerpos en un hospedero es la consecuencia de la exposición previa al antígeno
que induce entonces su producción.
Para esta prueba la muestra es el suero del hospedero sobre el que se realizan
diluciones seriadas también con factor dos como en HA pero iniciando de la dilución
1:2 hasta alcanzar la de 1:256.
Cada dilución del suero se incuba con 4 Unidades Hemaglutinantes de un virus

conocido, durante 10min. para permitir el reconocimiento.
Q.F.B
Transcurrido este tiempo, se adiciona una suspensión de eritrocitos al 1 %. Al igual
que para HA la prueba se efectúa en microplacas o tubos con fondo en U. De esta
manera los patrones de sedimentación para los resultados positivos y negativos se
observan de la siguiente manera:
11
Q.F.B
1.3. PRUEBA DE HEMAGLUTINACION (HA) PARA EL DIAGNÓSTICO

PRELIMINAR DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DEL NEWCASTLE
INTRODUCCIÓN.
Muchos virones animales posen en su envoltura proteínas codificadas por el genoma

viral capaces de unirse con eritrocitos. Tales virus pueden por tanto formar puentes
entre los glóbulos para constituir una red.
Este fenómeno conocido como Hemaglutinación fue primeramente descrito para el

análisis del virus Influenza. En este caso la proteína hemaglutinante (hemaglutinina)
en la superficie del virión es una glicoproteína que en adición de la Neuraminidasa se
proyecta en la envoltura viral.
El virión se unirá a cualquier eritrocito de la especie que sea siempre que lleve los
receptores complementarios que en este caso son moléculas de Acido N-
AcetilNeuramínico.
El virus de la enfermedad del Newcastle es un miembro del grupo de los

Paramyxovirus; es un patógeno primario de aves en quienes produce infecciones
respiratorias y digestivas con trastornos ocasionales en el S.N.C. que conducen a
parálisis y muerte; en el humano puede ocasionalmente producir conjuntivitis
autolimitada.
Se requieren aproximadamente 107 viriones de Newcastle para causar aglutinación,

por lo que la Hemaglutinación no es un indicador sensible de la presencia de
pequeñas cantidades de viriones, pero por su simplicidad constituye un ensayo
conveniente si se dispone de grandes cantidades de viriones.
OBJETIVOS:
1. El alumno dominará el manejo de la técnica de la reacción de

Hemaglutinación (HA).
2. El alumno determinará la concentración de viriones presentes en una

suspensión, la cual expresará en Unidades Hemaglutinantes (UHA).
12
Q.F.B
MATERIAL
 Solución reguladora de fosfatos SRF.
 Microplacas de poliestrireno con fondo en U.
 Espejo.
 Micropipetas de volúmen variable de 20- 200 µl.
 Puntillas para micopipeta.
 Vacuna viral ( viriones atenuados, cepa La Sota, INTERVET)
 Suspensión de glóbulos rojos al 1%.
 Pipetas de vidrio de 1 ml y 5 ml.
 Solución de Hipoclorito de Sodio.
 Alcohol y algodón.
 Tina para recolectar desechos.
METODOLOGÍA
1. Realizar con SRF una serie de diluciones del virus a partir de una suspensión
concentrada (vacuna viral), con factor de dilución 2, desde 1:10 hasta 1:1280, de
acuerdo al esquema de la figura 1; incluir un tubo control que no contendrá virus. El
proceso se describe a continuación:
 Agregar al pozo No. 1 de la microplaca 180 µl de SRF y del 2 al 9 agregar 100 µl.
 Colocar en el pozo 1 20 µl de la suspensión viral (vacuna) y mezclar por aspersión y

dispersión de dos a tres veces obteniendo así la dilución 1:10.
 Transferir 100 µl de esta dilución al pozo 2 y mezclar homogéneamente de la misma

manera que para el paso b.
 Repetir sucesivamente este procedimiento hasta el pozo No. 8 que corresponderá a

la dilución 1:1280.
 Desechar del pozo 8 100 µl en el recipiente para recolección de desechos.

Q.F.B
PATRONES DE SEDIMENTACIÓN
1. Los glóbulos rojo normales se asientan en el fondo del pozo formando un botón,
mientras que los glóbulos rojos aglutinados forman una malla homogénea.
2. Determinar el título de la muestra, identificando la última dilución en que se

presenta una reacción de HA evidente, que corresponderá entonces a 1 UHA
por volumen.
3. Identificar la dilución que contiene 4 UHA.
VACUNA
CONTRA e) Desechar 100 µl
NEWCASTLE
c y d) Transferir seriadamente 100 µl de cada

b) 20 µl
dilución al siguiente pozo
Pozo 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Fig. No 1. Realización de las diluciones virales
Volumen de cada Reactivo para realizar las diluciones

Pozo 1 2 3 4 5 6 7 8 9
a)SRF (µl) 180 100 100 100 100 100 100 100 100
Dilución 1.10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 Control
2) Eritrocitos 100 100 100 100 100 100 100 100 100
al 1% (µl)
14
Q.F.B
CUESTIONARIO
1.- Mencione tres ejemplos de virus que puedan ser analizados mediante la prueba
de HA.
2.- Cite dos causas por las que se puedan obtener resultados falsos negativos en
la prueba de HA.
3.- Porqué es importante determinar la dilución que contiene 4 UHA.
15
Q.F.B
1.4. PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA) PARA EL

DIAGNÓSTICO DEFINITIVO DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DEL
NEWCASTLE
INTRODUCCIÓN
La prueba de Hemaglutinación es un diagnóstico presuntivo más no específico de

infección por virus del Newcastle, de manera que de resultar positiva no nos permite
asegurar que este virus sea el agente causal.
Para realizar un diagnóstico definitivo se debe realizar una prueba que demuestre una
respuesta específica del huésped hacia este virus, dicha respuesta está representada
por la presencia de anticuerpos y la prueba empleada para ello se conoce como
Inhibición de la Hemaglutinación (IHA).
Esta prueba se basa en la unión de un anticuerpo específico hacia la hemaglutinina del

virión que impida la formación de puentes entre el ligando viral y el receptor celular.
Este hecho permite identificar plenamente al virus y se conoce como neutralización
vírica.
OBJETIVOS
1. El alumno desarrollará la técnica de Inhibición de la Hemaglutinación para
determinar el título de un suero problema.
2. El alumno será capaz de interpretar los resultados obtenidos al realizar la
prueba de IHA.
MATERIAL
Solución reguladora de fosfatos SRF.
Microplaca de poliestireno con fondo en U.
Micropipetas de volúmen variable de 20- 200 µl.
Puntillas para micopipeta.
Vacuna viral ( viriones atenuados, cepa La Sota, INTERVET),
preparada en una suspensión con 4 UHA.
Suspensión de glóbulos rojos al 1%.
Suero problema.
Pipetas de vidrio de 1 ml y 5 ml.
Solución de Hipoclorito de Sodio.
Alcohol y algodón.
Tina para recolectar desechos.
METODOLOGÍA
Con base en los resultados de la práctica anterior, preparar en un tubo una dilución del
virus del Newcastle que contenga 4 UHA en un volumen suficiente para realizar la prueba
de IHA.
Ejemplo:
a Resultado de la práctica de HA: Dilución
1:20 de la vacuna viral = 4 UHA
b Volumen suficiente para realizar IHA=
2ml Entonces:
Vacuna viral concentrada 100 µl

+
SSI 1900 µl
_________
Volúmen final 2000 µl de dilución con 4 UHA
1. Hacer diluciones al doble del suero problema, desde 1:2 hasta 1:256 de acuerdo
al esquema de la figura 2; incluir un pozo control que no contendrá antisuero ni
virus. El proceso se describe a continuación:
a Agregar 75 µl de SSI a los pozos del 1 al 9 de la microplaca.

b Colocar en el pozo 1 75 µl del suero problema y mezclar por aspersión y
dispersión de dos a tres veces obteniendo así la dilución 1:2.
c Transferir 75 µl de esta dilución al pozo 2 y mezclar homogéneamente de la
misma manera que para el paso b.
d Repetir sucesivamente este procedimiento hasta el pozo No. 8 que
corresponderá a la dilución 1:256.
e Desechar del pozo 8 75 µl en el recipiente para recolección de desechos.
17
Q.F.B
2. Agregar a cada uno de los 8 pozos con suero problema, 4 UHA del antígeno
viral en un volumen de 75 µl.
3. Agitar la microplaca para que reaccionen los sutratos y dejar en reposo durante
10 min.
4. Agregar 75 µl de la suspensión de glóbulos rojos a todos y cada uno de los pozos,
agitar y colocar la microplaca a temperatura ambiente hasta que los glóbulos rojos del
pozo que no contiene antisuero y sirve como control haya sedimentado.
5. Determinar el título del antisuero identificando la última dilución que presenta IHA.
PATRONES DE SEDIMENTACIÓN:
Fig. No. 2 Diluciones seriadas del suero problema
SUERO
PROBLEMA e) Desechar 75 µl
b) 75 µl c y d) Transferir seriadamente 75 µl de cada dilución al

siguiente pozo
Pozo 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Volumen de cada Reactivo para realizar las diluciones
Pozo 1 2 3 4 5 6 7 8 9
a)SSI (µl) 75 75 75 75 75 75 75 75 75
Dilución 1.2 1:4 1:8 1.16 1:32 1:64 1:128 1.256 Control
2) 4 UHA 75 75 75 75 75 75 75 75 -----
3) INCUBAR A TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 10 MIN
4) Eritrocitos 75 75 75 75 75 75 75 75 75
al 1% (µl)
18
Q.F.B
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la interpretación diagnóstica de un resultado negativa en la prueba

de IHA?
2. ¿Cuál es la interpretación diagnóstica de un resultado positivo en la prueba

de IHA?
3. Conjuntando las pruebas de HA e IHA, ¿Cómo explica un resultado negativo

en la prueba de HA con uno positivo en la prueba de IHA? y ¿Cuál es el
diagnóstico final que daría después de analizar ambas pruebas?
19
Q.F.B
1.5. HUEVO FÉRTIL DE AVE COMO MODELO BIOLÓGICO PARA EL CULTIVO E
IDENTIFICACIÓN DE VIRUS. (1ª. Parte)
INTRODUCCIÓN
.
Los embriones se han utilizado como el huésped natural para el crecimiento de los
virus, propagación y caracterización de los virus aviares y para la producción de
vacunas virales.
El embrión y sus membranas ayudan a proveer la diversidad de células necesarias

para el cultivo de diferentes tipos de virus, depende sobre todo de varias condiciones:
1.- Vía de inoculación

2.- Edad del embrión
3.- Periodo de tiempo de incubación
4.- Volumen y dilución del inóculo utilizado
5.- Temperatura de incubación
6.- El estado inmune de la parvada por el cual los embriones son obtenidos
Manejos preliminares.
La utilización de huevo fértil en el laboratorio, no debe ser obtenida de parvadas infectadas

con agentes virales conocidos u otros agentes microbianos. Después de 4 a 5 días de
incubación cuando el embrión puede ser observado fácilmente, estos son ovoscopeados
para determinar cuales son fértiles. La incubación es alrededor de 37° C y una humedad
de 60 a 70% (un alto exceso de humedad permite un subdesarrollo de la cámara de aire,
por lo tanto una baja de humedad permitirá que halla un desarrollo menor). Los embriones
deben estar en movimiento varias veces al día, ya sea automáticamente o manualmente, el
periodo de incubación antes de la inoculación depende sobre todo de la vía de inoculación.
Ovoscopeo.
El ovoscopeo consiste en revisar los huevos embrionados contra una fuente de luz
intensa en un ovoscopio, de esta manera mostrara el embrión, las membranas
asociadas y las cavidades del embrión se observan fácilmente.
20
Q.F.B
1.- En un cuarto obscuro, colocar el huevo embrionado al ovoscopio y observar el
movimiento, las condiciones de las venas de sangre y el estado del embrión. Notar
las diferencias con los embriones de diferentes edades.
2.-Con un lápiz, marcar la posición del embrión y la cámara de aire (esta área es
mantenida arriba en el ovoscopio).
3.- Comparar los embriones fértiles y los embriones muertos de varias edades,
descartar los embriones infértiles y muertos.
Estructura del huevo embrionado.
Justo bajo el cascarón se encuentra una membrana fibrosa que se disemina a través
de la superficie interna del embrión y forma la cámara de aire en el extremo ancho del
huevo. Esta membrana en conjunto con el cascarón ayuda al intercambio de gases en
el huevo. Esta distribución de gases se facilita por la membrana corioalantoidea
altamente vascularizada que sirve como órgano respiratorio del embrión. Esta
membrana se forma de manera adyacente a la membrana del cascarón y forma una
cavidad conocida como saco alantoideo que contiene entre 5 a 10 ml de fluido
alantoideo. El embrión se encuentra envuelto por la membrana amniótica formando el
saco amniótico que contiene entre 1 y 2 ml de fluido amniótico. El embrión se
encuentra unido al saco vitelino que es su fuente de nutrientes y se encuentra
localizado aproximadamente al centro del huevo.
Técnicas y/o vías de inoculación.
 Las cuatro vías más comunes para la inoculación del huevo embrionado fértil son:
 La vía de saco alantoideo
 La vía de saco vitelino
 La vía de membrana corioalantoidea (MCA)
 La vía de saco amniótico.
En situaciones de diagnóstico donde hay un agente no especifico que es sospechoso,

es conveniente utilizar muchas vías como sean posibles. Si una elección ha sido
hecha, la vía MCA es preferida a causa de su sensibilidad a un gran numero de virus y
porque es menos probable para afectarse por contaminación bacteriana.
21
Q.F.B
Saco vitelino.
La inoculación en saco vitelino es utilizada para el aislamiento y propagación del virus
de encefalomielitis aviar. Los embriones inoculados por esta vía, son generalmente
incubados de 10 a 13 días postinoculación.
Las lesiones que normalmente se presentan en los embriones al término del periodo de
incubación es parálisis de patas. Si los embriones se dejan nacer, a partir del tercer día
de nacidos se pueden observar pollos que se sientan en las patas, no se mueven bien
y algunos caen hacia los lados. Aparece un ligero pero rápido temblor del cuello y de la
cabeza, que especialmente se nota cuando los pollitos afectados se mantienen en la
mano.
Cavidad alantoidea.
La inoculación de embriones en saco alantoideo es utilizada para el aislamiento y

propagación de los Paramyxovirus, Myxovirus y Coronavirus. Los embriones
inoculados por esta vía, son generalmente incubados de 4 a 7 días postinoculación.
Las lesiones que se presentan en los embriones por los Paramyxovirus y los Myxovirus
es que pueden llegar a causar la muerte de los embriones, siempre y cuando se trate
de cepas altamente patógenas, pero tanto los Paramyxovirus como los Myxovirus
normalmente se evalua a través de fluido alantoideo de los embriones y no tanto por
las lesiones.
En el fluido alantoideo lo que se tiene que hacer es una prueba de hemoaglutinación

con glóbulos rojos de ave al 5 % para determinar la presencia de hemoaglutininas en
dicho fluido, que no es otra cosa más que la formación de grumos de color rojo
rodeados por espacios transparentes fácilmente visible.
Las lesiones que normalmente se presentan en los embriones por los Coronavirus son
enanismo, encorvamiento, desarrollo anormal de la pluma y depósitos de uratos en
riñones.
Q.F.B
Saco amniótico.
La inoculación de embriones en saco amniótico es utilizada para el aislamiento inicial

de los Myxovirus. Los embriones inoculados por esta vía, son generalmente incubados
de 4 a 7 días postinoculación.
Las lesiones que se presentan en los embriones por los Myxovirus son hemorragias
generalizadas en todo el embrión y pueden llegar a causar la muerte, siempre y
cuando se trate de cepas altamente patógenas, pero también se evalúa por la
presencia de hemoaglutininas que se encuentran en el fluido alantoideo del embrión.
Intravenosa
La inoculación por esta vía no tiene aplicación amplia para el estudio de infecciones
experimentales en embriones de pollo. El procedimiento es generalmente empleado
para estudios hematológicos. Embriones de 10 a 15 días de edad son los mas
adecuados para esta vía. La cantidad de inóculo puede variar de 0.2 a 0.5 ml.
Intracerebral.
La inoculación puede ser realizada con embriones de 8 a 14 días de edad y el inóculo

es de 0.1.a 0.2 ml. Esta vía puede ser empleada en estudios de alteraciones
patológicas del cerebro. Los virus de herpes simple y rabia pueden ser cultivados por
esta vía.
23
Q.F.B
1.6. ENSAYOS DE LAS VÍAS DE INOCULACIÓN EN HUEVO FÉRTIL DE POLLO

INTRODUCCIÓN
El huevo fértil de ave es una fuente de tejido vivo empleado como un sistema sensible
para el cultivo, titulación e identificación de virus. En comparación con los animales de
laboratorio empleados en los ensayos virales, el modelo de huevo fértil ofrece diversas
ventajas tales como:
 Son estériles.
 No tienen funciones inmunológicas desarrolladas.
 No son costosos.
 Son accesibles y no requieren para su manejo de tanta destreza técnica en
comparación con otros sistemas biológicos, tales como el mantenimiento y
reproducción de Cultivos Celulares.
El huevo fértil empleado para el cultivo de virus, debe obtenerse de aves sanas
ALPES, aves libres de patógenos específicos o SPF por sus siglas en inglés, para de
esta manera eliminar la presencia de virus que comúnmente afectan a las aves como
Adenovirus o Bronquitis Infecciosa Aviar, etc.
Para la propagación, cultivo y titulación de virus, es indispensable determinar la

viabilidad del embrión, así como dominar las técnicas para las diferentes vías de
inoculación debido a la especificidad que presentan algunos viriones por determinadas
células o tejidos. En la figura 3 se presenta en esquema de las diferentes zonas que
conforman a un huevo fértil.
Una vez realizado el ensayo de la inoculación, deberá observarse el conjunto del

huevo fértil para reconocer las cavidades y fluidos que constituyen al sistema biológico
empleado.
24
Q.F.B
3 4 1 Cavidad
Alantoidea
5 2 Saco de Aire
3 Saco Amniótico
2
4 Saco Vitelino
5 Membrana
Corioalantoidea
Fig.3 Vías de inoculación en huevo fértil de ave.
OBJETIVOS:
1. El alumno determinara al ovoscopio la viabilidad del embrión.
2. El alumno dominará las técnicas comúnmente utilizadas para la inoculación de
huevos fértiles de ave.
3. El alumno diferenciara las estructuras embrionarias observando la organización
de los tejidos fuera de su cutícula.
MATERIAL:
Huevos fértiles de ave de 10 días de inoculación (+/- 1 día), calidad ALPES.
Ovoscopio y pinzas de disección
Recipiente para recibir desechos
Charola porta embriones
Perforadores, bulbos y lápiz.
Jeringas de insulina
Agujas de 20 x 38 mm.
Colorantes
Guantes
25
Q.F.B
DESARROLLO:
I.- CONFIRMACIÓN DE LA VIABILIDAD DEL EMBRIÓN
Trasluminar cada embrión colocando el extremo romo en la ventana del ovoscopio.
Un embrión no viable puede reconocerse a través de:

 Desprendimiento de la membrana corioalantoidea de la parte interna
de la cutícula.
 Falta de irrigación.
 Falta de movimiento.
 Cualquier coloración de verde a negra que indica por lo general contaminación
bacteriana.
II.- TÉCNICAS DE INOCULACIÓN

A Cavidad alantoidea
a Trasluminar el huevo fértil con ayuda del ovoscopio.
b Marcar un punto o cruz de 2 a 3 mm. por arriba del límite de la cámara de
aire del lado contrario al embrión y en una zona escasamente irrigada.
c Perforar la marca señalada.
d Con una jeringa que porte aguja de insulina o tuberculina, inocular en ángulo
de 45 grados con respecto al huevo fértil de ave.
B Saco vitelino
a Localizar la parte más alta del embrión sobre la cámara de aire y marcar con
un punto o cruz.
b Marcar otro punto o guía que indicara la localización del embrión.
c Perforar la marca señalada
d Introducir una aguja de 20 x 38mm recta con ligera inclinación opuesta a la
localización del embrión
C Membrana corioalantoidea
a Localizar la parte más alta de la cámara de aire y marcar un punto o cruz (*).
b Marcar otro punto en la parte media opuesta a la localización del embrión en
un área con la menor irrigación posible.
c Perforar ambas marcas.
d Succionar con un bulbo de goma a través del punto marcado en la primera
posición (*), creando así una cámara de aire falsa en la parte media del
embrión.
26
Q.F.B
e Inocular empleando jeringas con aguja de insulina o tuberculina en el lugar
que se desarrollo la cámara de aire falsa.
En estos ensayos, se emplearán colorantes para las diferentes inoculaciones con el

objetivo de facilitar la visualización del sitio donde se pretendió depositar un volumen
determinado de colorante. Una vez realizada la técnica, se abrirán los huevos fértiles
de ave para analizar si la vía elegida fue efectivamente inoculada, vertiendo el
contenido del embrión sobre cajas de Petri.
27
Q.F.B
1.7. REPLICACIÓN DEL VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR EN
HUEVO FÉRTIL DE POLLO (1ª Parte) TITULACIÓN DEL VIRUS DE LA
BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR (DI 50) EN HUEVO FÉRTIL DE POLLO (2ª
Parte).
INTRODUCCIÓN
Existen diversos agentes infecciosos que provocan en el humano y otros mamíferos

daños severos e incluso la muerte. En el mejor de los casos lo deseable es que esta
interacción induzca una protección inmunológica al individuo como consecuencia del
reconocimiento de antígenos específicos tanto en forma natural como artificial. En el
caso de medidas profilácticas, con el empleo de vacunas se procura inducir una
Inmunidad Adquirida Activa Artificial.
Para obtener resultados satisfactorios, es indispensable evaluar la calidad de la

vacuna. Para las vacunas elaboradas con virus atenuados, la valoración se puede
efectuar en sistemas biológicos tales como huevos fértiles de ave que pueden
responder a la infección viral dando lesiones características del virión inoculado que
afecte directamente al embrión y le produce signos tales como músculos distróficos,
enanismo o muerte, o bien, afectan estructuras y líquidos extraembrionarios donde se
pueden observar hemorragias, formación de placas o pústulas así como determinar la
presencia de hemaglutininas virales.
Los virus vacunales o de campo pueden titularse en conjunto de huevos fértiles de ave
cuando producen su muerte calculando entonces una Dosis Letal al 50% (DLEP 50) o en el
caso de virus hemaglutinantes calculando Dosis Infectivas al 50% (DIEP50) empleando la

reacción de Hemaglutinación de los fluidos cosechados.
31
Q.F.B
1.8. CULTIVOS DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS PARA LA REPLICACIÓN DE VIRUS

ANIMALES: OBTENCIÓN, PROLIFERACIÓN Y MANTENIMIENTO
En 1949 John Enders, Thomas Séller y Frederick Robbins descubrieron que el

poliovirus podía cultivarse en células de origen no neuronal, lo que les valió el premio
Nobel en Fisiología y Medicina en 1954. Desde entonces, Los cultivos celulares
reemplazaron a los animales de laboratorio convirtiéndose en el principal método para
la propagación de virus y son utilizados en prácticamente todos los campos de la bio-
medicina.
Un Cultivo Celular (CC), es entonces un modelo biológico conformado por un grupo de

células con características específicas que se mantienen adecuadamente bajo
condiciones in vitro. En este sentido deberemos entender que las células deben ser
obtenidas a partir de un tejido vivo y para su mantenimiento y propagación in vitro,
requieren de medios de cultivo especiales que provean de los nutrientes que cubran
sus necesidades de crecimiento, tal y como se encontraban en sus condiciones
originales.
Para la preparación de un CC se puede considerar el siguiente orden.
1) El tejido se obtiene del modelo original, que puede ser en un caso, cualquier
tejido sano de algún animal, por ejemplo, células epiteliales de intestino,
embriones de rata, etc. En otro caso los CC provienen de tejido anormal que
se puede obtener directamente de tumores cancerosos o bien de tejidos que
inicialmente son normales y que por exposición a algún mutágeno se
transforman en el laboratorio.
2) Las células que se obtienen inicialmente de los tejidos se disocian en una
suspensión celular mediante métodos mecánicos, como maceración. De
esta manera, se tienen trozos de tejido, más pequeños que el original, pero
sin células individuales. Para disgregar a las células, el procedimiento
continúa con una.
3) Digestión con enzimas proteolíticas.
4) Centrifugación
32
Q.F.B
5) Las células se suspenden en un medio de cultivo y se colocan en
recipientes o placas de plástico, conforme las células se dividen van
cubriendo la superficie. Las células de fibroblastos o epiteliales se adsorben
al plástico y van formando una monocapa, mientras que células como las
sanguíneas o los linfocitos, sedimentan pero no se adhieren.
6) El medio adecuado para las células consiste de una solución isotónica de
sales, glucosa, vitaminas, coenzimas y aminoácidos mantenidos en buffers a
un pH entre 7.2 y 7.4 Y se complementan con antibióticos para inhibir el
crecimiento microbiano. Frecuentemente se adicionan diferentes tipos de
suero para proveer a las células de una fuente rica de factores de
crecimiento Existen principalmente tres tipos de cultivos celulares:
Cultivos celulares primarios

Cepas celulares diploides
Líneas celulares continuas
Dado que el desarrollo de una línea celular es un proceso costoso, la gran mayoría de
líneas celulares de amplia utilización, son depositadas en y distribuidas desde centros
de reposición. Existen unos pocos de estos centros en el mundo, el principal en EEUU
es el American Type Culture Collection (ATCC).
Algunos ejemplos de líneas celulares que se distribuyen con origen y calidad

certificados ATCC son: Vero E-6, Vero C-76, BHK-21, MDCK, MDBK, HEp-2 entre
otras.
Además del análisis viral, los Cultivos Celulares pueden emplearse en diferentes áreas y
aplicaciones como: Actividad y flujo intracelular, movimientos del RNA, de proteínas etc.
Ecología celular, Interacciones celulares, Inmunología, Ingeniería de proteínas, Estudios
de diferenciación y desarrollo celular, Aplicaciones diagnósticas. Medicina,
Farmacología, etc.
33
Q.F.B
34
Q.F.B
RECONOCIMIENTO DE VIRUS EN CULTIVO DE CELULAS
INFECCION VIRAL
CAMBIO MORFOLÓGICO
EFECTO CITOPATICO
(ECP)
Sin cambio aparente:

Hemadsoción
Hemaglutinación.
Interferencia
Alargamiento
TIPOS DE EFECTO CITOPATICO
Vacuolización
Monocapa confluente de células

Redondeamiento
Cuerpos de inclusión
Lisis
Formación de sincitios
35
Q.F.B
HEMADSORCIÓN
Virus con HA
Eritrocitos con el
Monocapa confluente receptor adecuado de células
INTERFERENCIA
A
Muestra presuntiva de Rubéola
Sin efecto aparente Línea celular
B
Infección con Rinovirus
Redondeamiento Línea celular
C
Infección con Rinovirus
Interferencia
Línea celular, previamente
infectada con Rubéola
36
Q.F.B
1.9. PROLIFERACIÓN DE CULTIVOS CELULARES MEDIANTE SUBCULTIVO
INTRODUCCIÓN
El diagnóstico de laboratorio de las infecciones virales requiere frecuentemente del

aislamiento de virus en cultivos celulares. Para tal efecto, monocapas celulares son
inoculadas con un espécimen clínico adecuado y entonces son observadas para
detectar cambios citológicos inducidos por la reproducción de virus.
El término efecto citopático (ECP) es aplicado para indicar los cambios celulares que
inducidos por virus, son observables al microscopio óptico. Estos cambios incluyen el
redondeamiento o lisis de células, la formación de células gigantes multinucleadas
(sincitios) y la producción de inclusiones en el núcleo y citoplasma de células
infectadas.
La obtención de cultivos de células eucarióticas en el laboratorio de Virología, es una

de las mayores contribuciones históricas para toda el área de las ciencias naturales, en
especial para la Biología Celular y Molecular. La labor de los investigadores que
sentaron estas bases, ha sido reconocida con el otorgamiento de varios premios Nobel
en Fisiología y Medicina.
Con base en lo anterior, resulta conveniente conocer el procedimiento de reproducción

de cultivos celulares a través de un subcultivo o pase en relación, ya que, de esta
manera, se pueden obtener monocapas de células en cultivo para la reproducción de
virus en condiciones de laboratorio.
1.10. REPLICACIÓN VIRAL EN CULTIVOS CELULARES: OBSERVACIÓN DE
MONOESTRATOS CELULARES NORMALES Y CON EFECTOS
CITOPÁTICOS
INTRODUCCION.
Entre los modelos disponibles para el estudio de virus, encontramos a los animales de
laboratorio, el embrión de pollo y los cultivos celulares. Estos últimos ofrecen ventajas
como la reproducibilidad de los resultados, la diversidad de virus que pueden ser
analizados y sobre todo la posibilidad de conocer los diferentes eventos que ocurren
dentro de ese compartimiento esencial para la supervivencia del virus, la célula. Debido
a estas propiedades las células en cultivo representan el estándar de oro para la
validación de pruebas efectuadas tanto en investigación como a nivel industrial para la
producción y control de calidad de vacunas.
Su mayor limitante recae en el alto costo de la infraestructura requerida para su

implementación, situación que vuelve inaccesible su aplicación en el diagnóstico clínico
de rutina.
La técnica consiste en inocular una muestra de prueba sobre células en monocapa,

que posteriormente se incuban bajo condiciones adecuadas efectuando una
observación diaria de los cambios presentados. Los cambios que son perceptibles
como modificaciones morfológicas en la célula, inducidos y característicos de cada
virus analizado se conocen como Efecto Citopático ECP. Existen diferentes tipos de
ECP como: redondeamiento, alargamiento, formación de Sincicios, vacuolización,
cuerpos de inclusión, lisis, etc.
En algunos casos el ECP presentado es tan característico que se relaciona con un solo
tipo de virus, en otros, la diversidad de virus que inducen a un mismo ECP merece la
aplicación de otras técnicas. Sin embargo, el modelo de Cultivos Celulares se requiere
para el primo aislamiento de los virus a partir de un espécimen dado.
1.11. REPLICACIÓN DE BACTERIÓFAGOS LÍTICOS EN ESCHERICHIA COLI .
INTRODUCCIÓN
Las bacterias son huéspedes de un grupo particular de virus denominados

bacteriófagos o simplemente fagos.
Los fagos constituyen modelos ideales para estudios sobre la infección a nivel celular,
la relación huésped parásito, la multiplicación viral y estudios de ingeniería genética.
Por otro lado, también son muy útiles en la tipificación de cepas bacterianas.
En los bacteriófagos lisogénicos, también denominados temperados, el genoma del

fago se replica sincrónicamente con el genóforo bacteriano, pasando a la progenie
cada vez que la bacteria se divide por fisión binaria.
En este estado lisógenico, los fagos integrados al genóforo bacteriano adquieren genes
de la bacteria durante su separación. Estos genes permiten a la bacteria lisógenica
expresar nuevas actividades y producir diferentes proteínas.
El genoma del fago lisógenico puede modificar la estructura del polisacárido bacteriano
y su antigenicidad, así como codificar la producción de toxinas bacterianas que causan
enfermedades tales como la difteria, la escarlatina, el botulismo y el síndrome urémico
hemolítico.
Por otra parte, los bacteriófagos líticos o virulentos se replican dentro de la bacteria
huésped y causan su muerte por lisis, liberando nuevos fagos. Los fagos líticos más
extensamente estudiados son los de Escherichia coli, mismos que se designan con la
letra T y diferentes números (bacteriófagos de la serie T). Los fagos virulentos al
destruir a las bacterias producen placas de lisis o calvas que se tornan evidentes en
cultivos sobre placas de agar.
43
46
1.12. ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO (ELISA) EN EL DIAGNÓSTICO
SEROLÓGICO DE VIRUS: FUNDAMENTO, APLICACIONES Y LIMITACIONES
El diagnóstico de las entidades virales es uno de los mayores retos a los que se
enfrenta la medicina actual ya que para estos agentes, una cosa es lo que idealmente
deseamos tener y otra la realidad con la que contamos.
Durante las últimas décadas, el desarrollo progresivo de nuevas y mejores

herramientas para evidenciar las etiologías de tipo viral, hace posible que estas
entidades se puedan descubrir y estudiar no sólo a nivel de laboratorios
especializados, sino también en los de diagnóstico de rutina.
¿Qué es lo ideal?
Identificar plenamente el agente viral.
Resultados en corto tiempo.
Una sola prueba.
¿Cuál es la realidad?
No se hace diagnóstico directo del agente viral (descarte).
Se requiere la complementación entre la clínica y el laboratorio.
Recurrir al análisis por pruebas pares.
Diagnosticar si una infección es de etiología viral es muy importante porque

determina un cambio en la conducta clínica y en el manejo terapéutico del paciente,
además de que ayuda a realizar un seguimiento clínico de la entidad.
Llevada con ética, esta actitud impacta social y económicamente, puesto que la
administración oportuna del tratamiento correcto reduce aspectos como el tiempo de
hospitalización y directamente el gasto a familiares.

Manual Virologia

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Manual Virologia

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Fac. Cs. Qs. Dpto.

BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS

ÁREA ESPECÍFICA DE: MICROBIOLOGÍA

NOMBRE DE LA ASIGNATURA: LABORATORIO DE VIROLOGÍA

CÓDIGO: FAR 315L

FECHA DE ELABORACIÓN: MARZO 2002

NIVEL EN EL MAPA CURRICULAR: FORMATIVO

TIPO DE ASIGNATURA: DISCIPLINARIA

PROFESORES QUE PARTICIPARON EN SU ELABORACIÓN:

M. C. Nidia Gary Pazos Salazar

HORAS DE TEORÍA: 3 HORAS PRÁCTICA: 2 CRÉDITOS: 8

1.1. NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE VIROLOGÍA

El conocimiento de las propiedades fisicoquímicas y de la infecto-contagiosidad de

Con base en lo anterior, se enlistan a continuación los reglamentos y normas que

 La hora de entrada tiene 10 minutos de tolerancia, pasado este tiempo, no

En general, las disposiciones anteriores tienden al cumplimiento de la Norma, en la

En la NOM referida, se establecen además definiciones de interés para los

Desinfección: Destrucción de microorganismos patógenos en todos los ambientes,

Residuo peligroso biológico-infeccioso: El que contiene bacterias, virus u otros

Con base en lo anterior, los residuos peligrosos infecto-contagiosos, deberán ser

o Deberán garantizar la eliminación de microorganismos patógenos

El cumplimiento de las consideraciones señaladas con anterioridad, garantiza la

Finalmente, y dada la especificidad de especie que presentan los virus, en esta

1.2. PRUEBAS DE HEMAGLUTINACIÓN (HA) E INHIBICIÓN DE LA

Desde el descubrimiento de los virus, se identificó que, de acuerdo a sus

 Prueba de hemaglutinación (ha).

El nombre de Hemaglutinación se debe al hallazgo de que los virus Influenza podían

También se descubrió que la hemaglutinina tiene el papel de funcionar precisamente

De manera general, el receptor corresponde a las moléculas de ácido siálico presente

A este respecto cabe resaltar que la función de la hemaglutinina no es entonces

El fundamento de esta prueba consiste en poner de manifiesto la existencia de virus

Virus con proteínas

Todo esto se realiza en tubos de fondo en U o en microplacas de fondo en U. Los

PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA

Una prueba de HA positiva implica la sospecha de un virus presente en la muestra, sin

 Prueba de inhibición de la hemaglutinación (iha)

Esta prueba se basa en la unión de un anticuerpo específico hacia la hemaglutinina

Este hecho permite identificar plenamente al virus y se conoce como neutralización

La prueba de IHA, puede representarse esquemáticamente de la siguiente manera:

Virus con Anti-HA

Segunda fase: Interacción con eritrocitos: demostración de la IHA.

La existencia de anticuerpos que puedan reconocer a cepas virales específicas

Esto basándose en un principio fundamental de inmunología: La presencia de

Cada dilución del suero se incuba con 4 Unidades Hemaglutinantes de un virus

PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA

1.3. PRUEBA DE HEMAGLUTINACION (HA) PARA EL DIAGNÓSTICO

Muchos virones animales posen en su envoltura proteínas codificadas por el genoma

Este fenómeno conocido como Hemaglutinación fue primeramente descrito para el

El virus de la enfermedad del Newcastle es un miembro del grupo de los

Se requieren aproximadamente 107 viriones de Newcastle para causar aglutinación,

1. El alumno dominará el manejo de la técnica de la reacción de

2. El alumno determinará la concentración de viriones presentes en una

 Microplacas de poliestrireno con fondo en U.

 Puntillas para micopipeta.

 Vacuna viral ( viriones atenuados, cepa La Sota, INTERVET)

 Suspensión de glóbulos rojos al 1%.

 Pipetas de vidrio de 1 ml y 5 ml.

 Solución de Hipoclorito de Sodio.

 Tina para recolectar desechos.

 Colocar en el pozo 1 20 µl de la suspensión viral (vacuna) y mezclar por aspersión y

 Transferir 100 µl de esta dilución al pozo 2 y mezclar homogéneamente de la misma

 Repetir sucesivamente este procedimiento hasta el pozo No. 8 que corresponderá a

 Desechar del pozo 8 100 µl en el recipiente para recolección de desechos.