DETERMINACION CUANTITATIVA DE PROTEINAS:

METODO DE BIURET Y METODO DE FOLIN LOWRY

El amoniaco y sus derivados, incluyendo los aminoácidos, forman iones complejos

con 𝐶𝑢+2 y otros iones metálicos. Además de estos complejos más complicados a base
de 𝐶𝑢+2 y péptidos o proteínas, en los cuales el 𝐶𝑢+2 se une a varios grupos al péptido.
Estos complejos aparecen de manera especial en las soluciones alcalinas y muestran
un color rosa o violeta muy distinto de los complejos azules simples del tipo de
amonio y cobre. El nombre de esta prueba se debe a que el nombre de la sustancia
conocida como Biuret produce un color rosado en las mismas circunstancias y tiene
una estructura semejante a un enlace peptídico.

Biuret

La intensidad del color obtenido es una medida del número de enlaces peptídicos
presentes en las proteínas. La reacción no es absolutamente específica, debido a que
cualquier compuesto que contenga dos grupos carbonilo unido a través de un átomo
de nitrógeno p de carbono, daría una reacción positiva típica.

La reacción de Folin Lowry introdujo la determinación de los grupos

hidroxifenolicos de las proteínas, junto con la formación del complejo Cu-proteína,
resulto ser un método más sensible (100 veces), que el Biuret.

MATERIAL:

 Espectrofotómetro.
 Tubos de ensaye de 18 x 150mm.
 Pipetas de 1, 5 y 10ml.
 Probeta.
 Papel filtro.
 Gradilla.
 Matraz volumétrico.
 Vasos de precipitados.
REACTIVOS:

 Albumina de suero de bovino (BSA) 5mg/ml en NaCl al 0.9% para el método de

Biuret.
 Albumina de suero de bovino (BSA) 0.2mg/ml en NaCl al 0.9% para el método
de Folin Lowry.
 Reactivo de Biuret. A 50 ml de agua destilada se agregan 150mg de CuSO45H2O
y 600mg de tartrato de sodio potasio 4H2O. Añadir 30ml de NaOH al 10% y
aforar a 100ml con agua.
 Método de Folin Lowry- Reactivo A- Carbonato de sodio al 2% en NaOH 0.1N.
Reactivo B- Tartrato de sodio de potasio al 1% mas CuSO4 al 0.5% El sulfato de
cobre debe estar al 0.5% en la solución de tartrato que se prepara previamente
an 1%. Disolver por separado las dos sales y luego mezclar. Reactivo C-Mezcle
antes de usarse 50ml de A+1ml de B.
 Reactivo de Folin-C en dilución 1:1 con agua destilada.

PROCEDIMIENTO:

Método de Biuret: Añadir 1.5ml del reactivo de Biuret a 1.5ml de la solución proteica
preparada a diferentes concentraciones según las indicaciones de la siguiente tabla,
mezcle y lea las densidades ópticas a 540nm después de 15 min de reposo. Trace en
una gráfica los resultados.

Tubo No ml de BSA ml de NaCl ml de Biuret

1 0.2 2.8 3.0
2 0.4 2.6 3.0
3 0.8 2.2 3.0
4 1.6 1.4 3.0
5 3 -- 3.0
Blanco -- 3 3.0

Tubo No. BSA (ml) g moles M D.O.

1 0.2 1 1.5x10-5 2.5x10⁻6 0.018
2 0.4 2 3.03x10-5 5.05x10⁻6 0.121
3 0.8 4 6.0x10-5 1x10⁻5 0.165
4 1.6 8 12.1x10-5 2.01x10⁻5 0.293
5 3 15 22.7x10-5 3.78x10⁻5 0.441
Blanco 0 0 0 0 0
 Curva de calibración para el método de Biuret
0.5 M D.O.
0.45 y = 0.1088x - 0.017
0.4 R² = 0.9532
2.5x10⁻6 0.018
0.35 5.05x10⁻6 0.121
0.3 Series1
1x10⁻5 0.165
D.O

0.25 Linear (Series1)

0.2 2.01x10⁻5 0.293
0.15
3.78x10⁻5 0.441
0.1
0.05
0
0 1 2 3 4 5
Tubos x=c [BSA] y="A" xy x2 y2
Blanco 0 0 0 0 0
1 2.50E-06 0.018 4.50E-08 6.25E-12 0.000324
2 5.05E-06 0.121 6.11E-07 2.55E-11 0.014641
3 1.00E-05 0.165 1.65E-06 1.00E-10 0.027225
4 2.01E-05 0.293 5.89E-06 4.04E-10 0.085849
5 3.78E-05 0.441 1.67E-05 1.43E-09 0.194481
∑=6 0.00007545 1.038 2.49E-05 1.96E-09 0.32252

M= n∑xy-∑x∑y

6(∑x2)-(∑x)2

M= 6(2.49E-5)-(7.5E-5)(1.038) = 11589.24

6(1.96E-9)-(7.5E-5)2

N=6 M= 11589.24 R=0.9763 R2=0.9532

Método de Folin Lowry.

En este método es muy importante mantener el control del tiempo durante la adición
de los reactivos y la lectura de la densidad óptica en el espectrofotómetro. Añada 3ml
del reactivo C que se preparará a partir de las soluciones de A y B, a 0.5 ml de la
solución problema preparada como una serie diferentes concentraciones de proteína.
Agite y deje en reposo por 10 minutos antes de añadir 0.2ml del reactivo de Folin C,
agitando inmediatamente. Después de 30 minutos de desarrollo de color, determinar
en un espectrofotómetro las densidades ópticas a 500nm. Haga su gráfica de
calibración con las lecturas obtenidas en la ordenada y las concentraciones de la
proteína en las abscisas. Calcule la concentración de una solución proteíca
desconocida.

Tubo ml BSA ml NaCl 0.9% Reactivo C Folín C

1 0.2 0.8 6 0.4
2 0.4 0.6 6 0.4
3 0.6 0.4 6 0.4
4 0.8 0.2 6 0.4
5 1.0 0 6 0.4
6 0 1.0 6 0.4
Tabla método Folin Lowry.

Tubo No. BSA (ml) µg µmoles M D.O.

1 0.2 40 5.997x10⁻4 8.104x10⁻8 0.067
2 0.4 80 1.199x10⁻3 16.2x10⁻8 0.148
3 0.6 120 1.799x10⁻3 24.31x10⁻8 0.134
4 0.8 160 2.398x10⁻3 32.4x10⁻8 0.206
5 1.0 200 2.998x10⁻3 40.52x10⁻8 0.285
Blanco 0 0 0 0 0

Curva de calibración metodo folin lowry

0.3
M D.O.
y = 0.0494x + 0.0198
0.25 8.104x10⁻8 0.067
R² = 0.9075 Series1
0.2 16.2x10⁻8 0.148
Linear (Series1)
D.O

0.15 24.31x10⁻8 0.134

0.1 32.4x10⁻8 0.206
40.52x10⁻8 0.285
0.05
0 0
0
0 2 4 6
[DSA]
 Tubos x=c y="A" xy x2 y2
Blanco 0 0 0 0 0
1 8.10E-08 6.70E-02 5.43E-09 6.56E-15 4.49E-03
2 1.62E-07 1.48E-01 2.40E-08 2.62E-14 2.19E-02
3 2.43E-07 1.34E-01 3.26E-08 5.90E-14 1.80E-02
4 3.24E-07 2.06E-01 6.67E-08 1.05E-13 4.24E-02
5 4.05E-07 2.85E-01 1.15E-07 1.64E-13 8.12E-02
∑= 1.22E-06 8.40E-01 2.44E-07 3.61E-13 1.68E-01

M= n∑xy-∑x∑y

6(∑x2)-(∑x)2

M= 6(2.44E-7)-(1.22E-6)(8.40E-1) = 648170.011

6(3.61E-
13)-(1.22E-6)2
Coeficiente de
No. Tubo Concentración (M) Densidad Óptica (A) extinción
molar (ε) N=6 M=
648,170.011
Blanco 0 0.000 ∞ R=0.9526
1 2.5x10⁻6 0.018 7200 R2=0.9075
2 5.05x10⁻6 0.121 23960
3 1x10⁻5 0.165 16500
4 2.01x10⁻5 0.293 14577.11
5 3.78x10⁻5 0.441 11666.666
=14780.62

Coeficiente de
No. Tubo Concentración (M) Densidad Óptica (A) extinción
molar (ε)
Blanco 0 .000 ∞
1 8.104x10⁻8 0.067 826752
2 16.2x10⁻8 0.148 913580
3 24.31x10⁻8 0.134 551213
4 32.4x10⁻8 0.206 635802
5 40.52x10⁻8 0.285 703356
=726140.6
Conclusión:

Consideraremos como conclusión al método de lowry con mayor sensibilidad que el

método de biuret ya que tiene el coeficiente de extinción molar mayor esto es
comparando los datos sacados mediante el ajuste de mínimos cuadrados y el
promedio del total de los tubos.

Cuestionario

 En la determinación de proteínas por el método de Lowry ¿Qué aminoácido o

aminoácidos son los responsables de la formación del complejo colorido?

Los aminoácidos aromáticos debido a su grupo hidroxifenolico.

 Métodos para la determinación de proteínas.

Método Kjeldahl

Es un método que sirve para determinar el contenido de proteína y nitrógeno de

substancias orgánicas e inorgánicas. Estas determinaciones se hacen en alimentos,
bebidas, carnes, granos, aguas residuales, suelo y en muchas otras muestras.

Entendemos per proteína bruta el nitrógeno total de la muestra expresado como

proteína El método no es apto para aquellas substancias que presentan enlaces N-N,
NO i NO2. Se somete la muestra a un ataque con ácido sulfúrico concentrado, durante
el cual el nitrógeno pasa a forma amoniacal (como sulfato amónico); el amonio del
sulfato amónico pasa a amoníaco libre por tratamiento con hidróxido de sodio:

(NH4)2SO4 + 2NaOH ————> Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O

y el amoníaco así formado se separa mediante destilación y se recoge sobre una

cantidad exactamente conocida de disolución ácida titulada. El amoníaco formado se
determina mediante valoración del exceso de ácido titulado.

El método de Kjeldahl presenta la gran ventaja de ser inmune a muchas interferencias,

ya que solo da en su resultado el nitrógeno de las proteínas, evitando fraudes
alimentarios como los que se pueden derivar de la adición de nitratos, a la que son
sensibles muchos de otros métodos más rápidos.

Es un método muy largo y laborioso, se puede decir que el método de Kjeldahl sigue
siendo el estándar de medida del contenido en proteínas más ampliamente aceptado
 Método de Bradford

Está basado en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant blue G-250 en
respuesta a diferentes concentraciones de proteínas. Este compuesto interacciona con
aminoácidos básicos (especialmente arginina) y aromáticos. Esta unión del colorante
con las proteínas provoca un cambio en el máximo de absorción del colorante desde
465 a 595 nm. Por lo tanto, este método se basa en la propiedad del Azul Brillante de
Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La
forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la proteína.
Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-
465nm).

Estructura química del colorante Coomassie brilliant blue G-250.

Algunas ventajas y/o desventajas del Método

 La intensidad de absorción depende del contenido de aminoácidos básicos y

aromáticos.
 El complejo colorante-proteína tiene un alto coeficiente de extinción lo cual es
imprescindible para aumentar la sensibilidad en la medición de proteínas.
 La unión colorante-proteína es un proceso muy rápido (2min) y el complejo
permanece estable durante un tiempo relativamente largo, una hora. Haciendo
de este un proceso muy rápido, y que no requiere un tiempo crítico para el
ensayo.
 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE VERACRUZ

Materia: Bioquímica

Practica N°:2

Nombre del trabajo: Determinación cuantitativa de proteínas

Catedrático: Ing. Zaida Orta Flores.

Nombre Del Alumno: Perez Salazar Yerarli I.

Número De Control: E08020561

Semestre: 7°sem.

Especialidad: Ing. Bioquímica

Observaciones
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