Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
LABORATORIO DE MÉTODOS DE
ANÁLISIS
En forma sólida, la riboflavina es de color amarillo anaranjado intenso. En solución acuosa, tienen una
fluorescencia amarillo-verdosa muy intensa. En solución alcalina, es soluble con facilidad, pero es
bastante inestable al calor, y a la luz forma lumifavina, un producto de degradación fluorescente que
carece de actividad biológica. Las soluciones de riboflavina tienen una fluorescencia amarillo verde
característica, con una absorción máxima en 565nm en el rango de pH ácido.
Resultados:
10 Chart Title
9
7
Intensidad de Emisión.
0
0 1 2 3 4 5 6
Concentración (ppm)
H2O HCl CH3COOH NaOH
Gráfica 1. Curva tipo de emisión de riboflavina donde se incluyen los 4 diferentes disolventes contra la
concentración de 0 a 5 ppm.
25
20
Intensidad de Emisión. (RFU)
15
10
0
0 10 20 30 40 50 60
Concentración (ppm)
Gráfica 2. Curva tipo de emisión de riboflavina donde se incluyen los 4 diferentes disolventes contra la
concentración de 0 a 50 ppm.
Preguntas adicionales:
1. ¿Por qué se deben conocer las longitudes de onda de máxima excitación y de máxima emisión?:
2. Diga cuáles son las formas enzimáticas de la riboflavina y cuál es su papel en el metabolismo
molecular:
Discusión:
La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas por la absorción de
radiación electromagnética. Las especies excitadas se relajan al estado fundamental, liberando su
exceso de energía en forma de fotones. Hay factores que afectan este proceso:
-Efecto del pH:
La riboflavina, en estado neutro de pH (6 y 7) va a tener estructuras resonantes, las cuales le van a
conferir fluorescencia, y cuando hay mayor resonancia va a haber mayor fluorescencia.
Al estar en medio ácido la resonancia va a disminuir, pues al protonarse los grupos amino de la
estructura, ya no se tendrá la deslocalización de electrones, y a pH de 3 se protona un poco, mientras
que a pH de 1 se protonará totalmente, causando que la resonancia disminuya y la fluorescencia sea
muy baja.
Al estar en medio alcalino a pH de 13 no se protona la estructura, sino que se va a desprotonar, esto
afectará la resonancia, provocando que no presente fluorescencia. La riboflavina es inestable a pH
alcalinos, por eso se disolvió tan rápido en medios alcalinos, como lo pudimos ver en la práctica con
el Hidróxido de sodio, es por eso no fluoreció.
Esto lo podemos ver reflejado en la gráfica 1, con los cambios de pH´s de las soluciones.
Algo que podemos hacer antes de realizar un experimento con fluorescencia, es revisar el pH
adecuado con el que vamos a trabajar, para que la estructura con mayor resonancia sea la que
obtengamos para que la fluorescencia sea mayor. Esto se realiza teniendo una proporcionalidad entre
la emisión y la concentración.
-Efecto de la concentración:
A diferentes concentraciones va a ir aumentando la fluorescencia, pero no proporcionalmente (como
podemos observar en la tabla 1), pues esperaríamos el doble con cada concentración. Al no
mantenerse la proporcionalidad, va a bajar la fluorescencia en altas concentraciones, esto en un
método fluorométrico (observar gráfica 2). Este efecto se puede dar por dos fenómenos: El fenómeno
de autoabsorción, pues la cantidad de tantas moléculas de la muestra, al emitir, otra molécula
absorberá esa energía emitida. O también pudo haberse dado por el fenómeno de interconversión, la
interna (choques entre moléculas, pasa energía de una a otra) y externa (hay choques en el medio en
el que está disuelto el analito, chocan las moléculas), pues se liberará energía en forma de calor, lo
que va a causar que la fluorescencia disminuya.
Si estuviera en un método espectrofotométrico no lo podríamos detectar, pues la concentración es
muy baja.
Conclusión:
Aprendimos a manejar el fluorómetro de filtros.
El pH alcalino y muy ácido, disminuye la intensidad de fluorescencia.
La proporcionalidad de la concentración de riboflavina y la intensidad de fluorescencia es
importante para que nuestro analito tenga alta intensidad de fluorescencia.
Referencia bibliográfica:
Espectroscopia de fluorescencia molecular. [En Línea] [Disponible en:
http://www.ugr.es/~decacien/Planes/Quimica/Plan%201997/temarios/671111d-
archivos/fundamentos/SEMINARIO%203.PDF]
Microscopía de fluorescencia y epifluorescencia. Universidad de Alicante. [En Línea] [Disponible en:
http://ssyf.ua.es/es/formacion/documentos/cursos-programados/2011/especifica/microscopia-
optica/microscopia-optica-y-laser-confocal-2a-ed/tema-5.pdf]
Douglas A. Skoog, F. James Holler, Timothy A. Nieman, Principios de análisis instrumental, McGraw-
Hill, 2000, 1028 pages, consultado el 15 de marzo de 2018.
Salvador Badui Dergal, Química de los alimentos, Alhambra Mexicana, Editorial, S.A. de C.V., 1993,
648 pages, consultado el 15 de marzo de 2018.