Explorați Cărți electronice
Categorii
Explorați Cărți audio
Categorii
Explorați Reviste
Categorii
Explorați Documente
Categorii
e d i t u r a
BMedica
Bucureşti
( f i
VI
Toate drepturile rezervate Editurii INFOMEDICA. 3. Date privind echipamentul şi aparatura utilizate în laboratorul de
Nici o parte din acest volum nu poate fi copiată; microbiologie................................................... 9
fără permisiunea scrisă a Editurii INFOMEDICAi Mircea h a n Popa
Drepturile de distribuţie în străinătate aparţin în exclusivitate editurii.
Copyright ©2004 by INFOMEDICA s.r.l. All rights reserved. 4. Metode de dezinfecţie şi sterilizare utilizate în laboratorul
de microbiologie............................................. i.................................................................. 12
APĂRUT 2004 Mircea loan Pupa
REFERENŢI ŞTIINŢIFICI:
ADRIAN STREINU-CERCEL M.D., Ph.D.
LUCIA DEBELEAC M.D.. Ph.D. 5. Schema generală a diagnosticului de laborator microbiologic........................................18
Conferenţiar universitar
Profesor universitar Mircea loan Popa, Gabriela Loredana Popa
UMF „Carol Davila" Bucureşti UMF „Carol Davila" Bucureşti
Director general al Institutului de Boli Infecţioase 6. Norme privind prelevarea şi transportul produselor patologice
„Praf. Dr. Matei Balş" în diagnosticul microbiologic direct.................................... ........................................... .22
GHEORGHE DIMACHE M.D., Ph.D. Mircea h a n Popa, Gabriela Loredana Popa
Cercetător ştiinţific principal gr. I 7. Preparate microscopice, frotiuri Şi principalele coloraţii utilizate
Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare în microbiologie.........................................................................................'.........................33
pentru Microbiologie şl Imunologie „Cantacuzlno"
Mircea loan Popa, Gabriela Loredana Popa
8 . Tehnica examenului microscopic în diagnosticul microbiologic....................................39
REDACTARE: Mircea loan Popa, Gabriela Loredana Popa
Mircea loan Popa
Gabriela Loredana Popa 9. Medii de cultură..............i........................................................................... .......................45
Gabriela Loredana Popa, Mircea loan Popa
10. Tehnici de cultivare.......................................................................................................... 52
Tehnoredactare computerizată: Editura Gabriela Loredana Popa, Mircea loan Popa
Tehnoredactare: Ing. Nicoleta Anghel 11. Examinarea caracterelor de cultură, metabolice precum şi a
Dr. Mircea loan Popa altor caractere fenotipice utile în identificarea microorganismelor.............................. 61
Bucureşti Gabriela Loredana Popa, Mircea loan Popa
Editura INFOMEDICA
Şos. Panduri 35, Bl. P1B, Sc. A, Ap. 33-34 12. Teste de identificare având la bază diferite caractere biochimice
Tel./Fax: 021/410.04.10; 410.53.08; Tel.: 410.61.63
ale bacteriilor şi fungilor..................................................................................................70
e-mail: redactla@infpmedica.ro
www.infomedica.ro Gabriela Loredana Popa, Mircea loan Popa
Tipar executat la Tipografia INFOMEDICA
Cuprins y
Autorii
( (
Diagnosticul de laborator în microbiologie
VI
ELEMENTE LEGATE DE CONTROLUL CALITĂŢII ÎN
• LABORATORUL DE BACTERI0L0GIE/MICR0BI0L0GIE
45. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme
din genul Treponema.....................................................................................................218
Miivea loan Popa
46. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme
din genul Leptospira................................................... .................................................. 224 Cu toate că aceste noţiuni nu par a fi de utilitate imediată, trebuie să avem în vederefap
Mircea loan Popa, Cabriela Loreclana Popa tul că ele sunt incluse într-unul dintre cele mai importante capitole ale activităţii, în orice
47. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme tip de laborator şi nu numai în laboratorul de microbiologie.
din genul Borrelici.................... ...................................................... ...............................227 De fapt, cu cât sunt înţelese mai de timpuriu, cu atât pot fi mai utile în dezvoltarea
Mircea loan Popa viitoare a oricărui medic, care mai devreme sau mai târziu va trebui să înţeleagă importanţa
48. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme laboratorului clinic în general şi respectiv a laboratorului de microbiologie în particular, în
din familia Rickettsiacaae...................................................... I......... i............................230 colaborare cu celelalte specialităţi medicale. Am decis să introducem aceste elemente în
Mircea loan Popa primul capitol al manualului de lucrări practice. Considerăm necesară parcurgerea acestor,
noţiuni de către toţi colegii implicaţi în diferitele activităţi desfăşurate în sistemul sanitar.
49. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme
Recomandăm citirea şi altor materiale redactate pe această temă, din literatura medicală
din genul C h la m y d ia ...................................................... ............................................... 233
românească sau internaţională.
Mircea loan Popa
.în orice laborator, inclusiv în laboratorul de microbiologie al UMF „Carol Davila", este
50. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme
necesară stabilirea unor responsabilităţi. Chiar şi în cazul în care activitatea practică se
din genul Mycoplasma ......................................................... 235
rezumă la o serie de demonstraţii şi prezentarea unor anumite aspecte pentru tinerii aflaţi în
Mircea loan Popa ,
stagiu, elementele legate de controlul calităţii nu trebuie să fie ignorate.
51. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme
Atunci când este vorba de un laborator clinic de microbiologie, iar de rezultatele obţinute
din genul C a n d id a ................................................................... 237
poate depinde evoluţia şi uneori chiar viaţa unui pacient, controlul intern de calitate intră
Mircea loan Popa în responsabilitatea şefului de laborator, care trebuie să supervizeze (direct sau prin delegare
52. Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile acute ale de responsabilitate) toate activităţile desfăşurate şi să contrasemneze buletinele de analiză.
căilor respiratorii inferioare............................................................................................ 241
1. într-un sistem medical bine pus la punct, buletinele de analiză nesemnate, semnate
Mircea loan Popa, Cabriela Loreclana Popa
indescifrabil, verificate numai de către personalul medical cu pregătire medie etc., trebuie
53. Elemente privind importanţa diagnosticului microbiologic în să dispară şi să fie înlocuite de buletine de analiză redactate după toate rigorile, incluzând
sistemul de supraveghere al bolilor transmisibile.........................................................255 supervizarea menţionată mai sus.
Mircea loan Popa 2 . în fiecare laborator trebuie să existe şi să fie accesibil oricărui membru al personalu
lui de laborator un document scris, fie sub forma unui manual tehnic, fie sub forma unui
dosar în care să fie incluse o nene de materiale, după cum urmează:
®Un tabel nominal al personalului, date tehnice despre fiecare membru precum şi date
care să permită contactarea unei anume persoane în caz de necesitate
• Un regulament de ordine interioară, inclusiv normele de protecţie a muncii şi normele
de securitate microbiologică, precum şi descrierea sarcinilor fiecărui membru al per
sonalului de laborator
• O listă cuprinzând toate formularele utilizate în laborator precum şi descrierea fiecărui
formular în parte, inclusiv recomandări privind modul de completare al formularelor
• Un plan al laboratorului
• O listă a analizelor care pot fi efectuate în laborator
• Tehnicile de identificare a microorganismelor izolate, pornind de la normele de
recoltare, conservare şi transport (pentru fiecare tip de produs în parte), testele uti-
( :(
lizate, lista mediilor de cultură şi a reactivilor utilizaţi, inclusiv modul de preparare al unui examen de laborator este făcută fără responsabilitate, fără colegialitate şi fără a avea
acestora. suficient în vedere interesul pacientului. Atât personalul medical din laborator cât şi cel din
în mod ideal (pentru că deocamdată aceste recomandări nu sunt aplicate în toate labora clinică trebuie să acţioneze în strânsă colaborare. Numai în acest caz rezultatele obţinute pot
toarele din ţara noastră) ar trebui ca manualul (dosarul tehnic) să fie revizuit şi completat fi corect interpretate, eventualele rezultate care par incorecte pot fi analizate şi corelate cu
periodic şi să includă normele metodologice redactate şi transmise de către instituţia care situaţia concretă, particulară a unui anume pacient, iar în cazul persistenţei Suspiciunii unei
se ocupă de coordonarea şi controlul activităţii desfăşurate în sistemul laboratoarelor de erori de laborator se poate solicita în cunoştinţă de cauză repetarea unei analize sau se poate
microbiologie din România precum şi actele normative (recomandări, ordine de ministru, realiza prelevarea unui nou produs patologic sau a unei probe de sânge pentru obţinerea
serului de cercetat.
ordonanţe de guvern, legi etc) apărute în legătură cu activitatea de laborator.
Cele menţionate mai sus sunt valabile pentru laboratoarele de microbiologie, dar în în vederea stabilirii unei bune colaborări trebuie să existe o comunicare permanentă între
colegii care îşi desfăşoară activitatea în clinică şi în laborator.
parte, se pot aplica oricărui tip de laborator clinic.
3. în mod necesar, periodic, în cadrul laboratorului trebuie organizate scurte întâlniri Trebuie să recunoaştem că din păcate buna colaborare şi comunicare între verigile sis
care să permită schimbul de opinii între membrii personalului de laborator, prezentarea unor temului de sănătate reprezintă încă un deziderat neatins în ţara noastră, cu relativ puţine
referate alcătuite după materiale de specialitate apărute în literatura naţională sau inter excepţii. Pornind de la buletinul de analiză şi documentele tehnice care trebuie să fie
disponibile atât pentru laborator cât şi pentru clinică, continuând cu scrisorile metodologice
naţională, discutarea unor aspecte legislative legate de activitatea de .laborator etc.
care au devenit din ce în ce mai rare în ultimii 10-15 ani trebuie găsite cele mai bune soluţii
4 .0 modalitate obiectivă a controlului intern de calitate este reprezentată de solicitarea (de de comunicare colegială şi ştiinţifică, Este datoria managerului instituţiei medicale ca,
către şeful de laborator, care va efectua şi verificarea rezultatelor) realizării unor teste având împreună cu şeful laboratorului şi şefii secţiilor clinice, să faciliteze organizarea unor întâl
la dispoziţie probe „oarbe", rezultatul corect fiind cunoscut numai de către cel care a pregătit niri periodice între colegi.
proba respectivă şi respectiv de către şeful de laborator.
Trebuie discutate şi agreate în mod colegial criteriile care pot conduce, spre exemplu, la
5. în protocolul de lucru, pentru fiecare test în parte, este notificată utilizarea unui control
respingerea unor probe. Trebuie desfiinţată modalitatea de lucru în care se acceptă pentru
pozitiv şi respectiv a unui control negativ (spre exemplu în cazul testului susceptibilităţii la lucru în laborator orice probă, indiferent de modul în care a fost recoltată, transportată şi
bacitracină, controlul pozitiv va fi reprezentat de o tulpină de Streptococcus pyogenes, iar con indiferent dacă este însoţită (sau nu) de un buletin care solicită o anumită examinare şi care
trolul nşgativ va fi reprezentat de o tulpină de Streptococcus agalactiae), astfel putându-se va ar trebui să menţioneze o serie de date strict necesare. în loc să fie prelucrate probe fără cali
lida rezultatele obţinute. tate, care nu au cum să conducă la realizarea unui diagnostic microbiologic corespunzător
în mod complementar, controlul de calitate extern ar trebui să condiţioneze autoriza şi util pacientului care prezintă o infecţie de etiologie probabil microbiană, este de preferat
ţia eliberată pentru funcţionarea oricărui laborator de microbiologie clinică, atât în sistemul ca aceste probe să fie respinse şi să se solicite o nouă recoltare, corespunzătoare calitativ şi
public cât şi în cel privat. Din punct de vedere operaţional, fiecare laborator ar trebui să cantitativ.
primească: înainte de a încheia această destul de sumară prezentare, dorim să subliniem încă o dată
• un număr de cod, care este cunoscut de laboratorul respectiv şi de către instituţia care că aceste noţiuni ar trebui cunoscute şi aplicate deopotrivă în sistemul public şi privat.
organizează controlul extern de calitate; Controlul intern şi extern de calitate trebuie să reprezinte o prioritate absolută pentru sis
• periodic, un număr de probe, al căror rezultat va fi verificat (pentru examene bacteri temul naţional de sănătate iar elementele legate de acesta ar trebui să fie cunoscute încă din
ologice, micologice şi serologice); perioada de pregătire de bază a oricărui medic, biolog sau asistent medical.
• formulare standardizate pentru re-transmiterea rezultatelor obţinute.
îndeplinirea recomandărilor menţionate mai sus va conduce implicit la protecţia pacien
ţilor, identificarea unor anumite erori, compararea rezultatelor la nivel naţional, posibilitatea
colaborării la nivel internaţional, realizarea ,unei standardizări în microbiologia clinică
românească, creşterea încrederii tuturor partenerilor din sistemul sanitar.
Identificarea unor modalităţi de lucru necorespunzătoare ar trebui să conducă la retra
gerea autorizaţiei de funcţionare cu reacordarea acesteia numai după îndeplinirea tuturor cri
teriilor necesare unei activităţi utile diagnosticului şi care să nu pună în pericol sănătatea sau
viaţa pacienţiloî.
Controlul calităţii la nivelul oricărui laborator va atinge eficienţa maximă cu condiţia
unei colaborări între clinică şi laborator. Sunt încă prea frecvente situaţiile în care solicitarea
(
Elemente legate de conduită în laboratorul de bacteriologie/microbiologie 5
■ P A R T E A G E N E R A L Ă
• identificării contaminării de laborator;
ELEMENTE LEGATE DE CONDUITA ÎN
2 • LABORATORUL DE BACTERIOLOGIE/MICROBIOLOGIE.
NORME DE PROTECŢIE A MUNCII
• depistării purtătorilor de germeni etc.
Chiar dacă cele menţionate mai sus par complicate, ele reprezintă o simplificare în raport
cu complexitatea activităţii din laboratorul de bacteriologie.
ÎN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE Pentru îndeplinirea obiectivelor, laboratorul de bacteriologie trebuie astfel conceput
încât condiţiile de lucru să fie optime. în plus, trebuie să avem în vedere că în momentul
efectuării oricărei tehnici de laborator, este necesar să fie asigurată protecţia personalului de
laborator precum şi prevenirea contaminării probelor de lucru. Toate elementele necesare
trebuie să apară scrise manualul tehnic menţionat în cadrul capitolului precedent.
Clădirea laboratorului de bacteriologie medicală trebuie să asigure, pe cât posibil, pre
venirea expunerii la praf, curenţi de aer, să fie luminoasă şi în măsura posibilităţilor spaţiile
Ţinta activităţii în laboratorul de bacteriologie/micologie ar putea fi definită foarte pe
de lucru să fie orientate astfel încât să prevină incidenţa directă a razelor solare (având în
scurt drept stabilirea tratamentului care trebuie urmat în cazul unui pacient care prezintă o
vedere efectul bactericid al radiaţiilor UV; acest element este de maximă importanţă în la
boală infecţioasâ de etiologie bacteriană/fungică. De fapt lucrurile sunt mult mai compli
boratorul de mycobacteriologie).
cate, datele de laborator nu pot fi interpretate în lipsa unei pregătiri serioase atât din punct
de vedere teoretic cât şi practic, în lipsa unei activităţi susţinute în perioada de pregătire care Fiecare încăpere a laboratorului de bacteriologie trebuie să aibă o destinaţie precisă iar pla
durează mai mulţi ani şi de fapt continuă toata viaţa. nul laboratorului în ansamblu trebuie să prevadă un anumit „flux“, pe cât posibil într-un sens
unic în vederea prevenirii contaminării preparatelor de laborator şi respectiv prevenirea „întâl
Ceea ce trebuie să fie însă foarte clar încă de la început este că, fără respectarea unor
nirii" dintre materialele contaminate şi materialele sterile.
principii, în condiţiile efectuării sau interpretării mecanice a unor teste etc., diagnosticul de
laborator microbiologic corect devine imposibil. Laboratorul de bacteriologie medicală include încăperi (spaţii) în vederea desfăşurării
corespunzătoare a următoarelor activităţi:
în vederea atingerii scopului, în laboratorul de bacteriologie se vor efectua tehnicile
necesare: • recepţionarea probelor recoltate în afara laboratorului;
« stabilirii prezenţei sau dovedirii absenţei unor anumite bacterii la nivelul unui anumit • recoltarea probelor în laborator;
substrat; • prelucrarea probelor în vederea cultivării, identificării bacteriilor implicate etiologic,
prin diferitele tehnici bacteriologice;
o studierii bacteriilor izolate pentru identificarea genului, grupului, speciei, tipului (de la
• realizarea diferitelor tehnici imunologice utile în diagnosticul bacteriologic sau imuno-
caz lâ caz) având la bază o serie de caractere ale bacteriilor, precum:
logic;
» caracterele morfotinctoriale; • pregătirea materialelor necesare în laborator;
» caracterele de cultură; sticlărie;
o caracterele biochimice (pigmentogeneza, sinteza altor factori care pot fi evidenţi * alte instrumente de laborator;
aţi macroscopic, sinteza unor enzime, sinteza de bacteriocine, capacitatea de a fer reactivi;
menta un anumit substrat, capacitatea de a folosi un anumit substrat drept unică ❖ medii de cultură etc;
sursă de carbon etc); • depozitarea materialelor necesare în laborator;
• caracterele antigeriice (utilizând tehnici din domeniul imunologiei); • spălarea materialelor înainte de sterilizare etc.
o caracterele de patogenitate; în afară de cele menţionate mai sus, în laboratorul de bacteriologie mai există spaţii des
• sensibilitatea faţă de bacteriofagi; tinate activităţilor administrative (birouri), vestiare, grupuri sanitare etc.
• caractere legate de sinteza anumitor metaboliţi sau structuri moleculare identifica în cazul unor laboratoare specializate (de ex. studiul acizilor graşi prin tehnici de cro
bile spre ex. prin tehnici de cromatografie; matografie, studiul caracteristicilor bacteriene prin tehnici de biologie moleculară etc.),
există anumite particularităţi în planificarea şi distribuirea spaţiilor funcţionale din labora
o caracterele genetice etc;
tor; elementele tehnice legate de aceste structuri sunt prezentate în diferite manuale tehnice
®stabilirii faptului că bacteria izolată este implicată în procesul infecţios respectiv; care pot fi consultate de către cei interesaţi.
®stabilirii sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice;- încăperile, spaţiile, mobilierul din laboratorul de bacteriologie vor fi construite în aşa fel
®monitorizării evoluţiei sub tratament (dovedirea eficienţei tratamentului antibacterian încât să permită realizarea unei curăţenii şi dezinfecţii la cel mai înalt nivel; în cazul aces-
ales);
( ( j
6 Diagnosticul de laborator în microbiologie Elemente legate de conduită în laboratorul de bacferiologie/microbiologie
tui tip de laboratoare se poate vorbi de necesitatea atingerii perfecţiunii. Va fi acordată toată 5. Mâncatul şi băutul sunt interzise în sala de lucrări practice de microbiologie. Fumatul
atenţia pentru ca laboratorul să fie organizat în vederea este interzis, conform legii, în orice instituţie medicală din România şi cu atât mai mult nu
• realizării scopului menţionat mai sus prin tehnicile enumerate; este acceptat într-un laborator de microbiologie.
• prevenirii contaminării probelor de laborator; - 6. Se interzice aplicarea de cosmetice, lăcuirea unghiilor, purtarea de unghii false,
manipularea lentilelor de contact etc,
• prevenirii răspândirii germenilor în mediul ambiant;
7. Este interzisă introducerea în gură a oricărui obiect.
• prevenirii infecţiilor de laborator, '
8. Pipet.area cu gura este strict interzisă. în vederea pipetării se vor utiliza dispozitive de
înainte de a încheia prezentarea principalelor încăperi (spaţii) din laboratorul de bacteri
pipetare adecvate.
ologie, dorim să. menţionăm că:
9. Nu este permisă depozitarea obiectelor de uz personal pe masa de lucru (haine, genţi,
• structura prezentată pentru laboratorul de bacţeriologie nu diferă în mod esenţial de
serviete, caiete etc). Se recomandă ca hainele să fie lăsate la garderobă sau într-un spaţiu
structura unui laborator de microbiologie în general;
special amenajat.
• în structura laboratorului este de dorit să fie incluse (în măsura posibilităţilor şi în
10. Manipularea materialului contaminat se va realiza cu maximă precauţie pentru
funcţie de nivelul laboratorului, de exemplu în cazul unui laborator de spital universi
evitarea răspândirii microorganismelor. Activităţile se vor desfăşura în vecinătatea becului
tar) spaţii în care să se poată desfăşura activităţi de învăţământ şi. pregătire teoretică şi
Bunsen aprins.
practică, spaţii în care ar putea avea loc şi diferite întâlniri tehnice între membrii per
sonalului de laborator; 11. însămânţările se efectuează „ia flacără11. Se vor flamba gurile tuturor recipientelor
(tub, eprubetă, flacon de sticlă etc) utilizate, atât la deschidere cât şi la închidere.
• laboratorul trebuie să fie legat funcţional de clinică.
12. Ansa bacteriologică se va steriliza „la roşu11, atât bucla cât şi firul ansei (iar portansa
Datele privind funcţionarea laboratoarelor care efectuează analize medicale sunt incluse
se va flamba) înainte şi după folosire. Atunci când s-a terminat lucrul cu ansa încărcată cu
în Ordinul ministrului sănătăţii nr. 119/2004, normativ aduce la zi Ordinul ministrului
produs patologic, în vederea sterilizării bucla ansei va fi introdusă iniţial „la baza flăcării11
sănătăţii şi familiei nr. 609/2002, precedat de Ordinul ministrului sănătăţii nr. 915/2000.
unde temperatura este mai scăzută, pentru a preveni împroşcarea cu particule infecţioase.
Aceste acte normative trebuie revizuite şi adaptate periodic.
Atunci când se lucrează într-un laborator de analize se vor lua preacauţii suplimentare.
13. Se vor utiliza anse bacteriologice corect şi complet închise şi cu o buclă cu diametrul
NORME DE PROTECŢIE A MUNCII ÎN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE
mai mic de 3 milimetri pentru a se evita descărcarea spontană. Nu se vor face mişcări bmşte
în laboratorul de microbiologie se lucrează cu microorganisme potenţial patogene sau atunci când ansa este încărcată cu produs patologic. Se vor evita gesturile ample şi se va
dovedite a fi patogene, care se pot identifica în diferite produse patologice (ex. sânge, menţine un permanent control asupra mişcărilor efectuate în laboratorul de microbiologie.
materii fecale, urină etc) sau au fost izolate în culturi la nivelul laboratorului. Există şi posi
14. Recomandăm ca toate activităţile care pot fi efectuate în laborator să fie înscrise şi
bilitatea ca un anumit laborator să primească spre identificare culturi: şi izolate de la un la
detaliate în manualul tehnic al laboratorului. înainte de începerea oricărui test sau a oricărei
borator cu un nivel de competenţă inferior.
manevre, trebuie să avem în minte toţi „paşii11pe care urmează să îi facem (conform proto
Chiar dacă activitatea se desfăşoară într-un laborator dedicat lucrărilor practice şi
colului de lucru) astfel încât să avem un control mental permanent al fiecărei manevre pe
demonstraţiilor făcute sub supravegherea unui cadru didactic pentru studenţi sau tineri
medici rezidenţi, există o serie de reguli care trebuie aplicate cu stricteţe în vederea elimi care urmează să o executăm.
nării riscurilor de contaminare: 15. Nu este permisă fuga şi nici mersul rapid prin laborator.
1. Este strict interzis accesul persoanelor străine în laborator. Tinerii medici sau viitori 16. Pipetele contaminate (pipete Pasteur, pipete gradate etc) nu se vor decontamina ia
medici vor accede în laborator şi vor participa la desfăşurarea lucrărilor practice numai după flacără, ci vor fi introduse (evitând producerea de stropi potenţial infectanţi) în flaconul cu
audierea şi însuşirea (dovedită prin semnătura pe un proces verbal pregătit în acest sens) re dezinfectant (lichidul dezinfectant trebuie să depăşească nivelul până Ia care a ajuns pro
gulilor de protecţie a muncii. 1 ■ dusul contaminant), unde vor fi menţinute pentru circa 24 ore (în funcţie de substanţa dez-
2. Toate produsele biologice vor fi considerate ca potenţial infectante.' f infectantă utilizată). Flaconul cu amestec dezinfectant este obligatoriu. Tot în amestecul
3. Este obligatorie purtatea echipamentului de protecţie; halatul de protecţie reprezintă nive dezinfectant vor fi introduse cu aceleaşi precauţii lamele de sticlă folosite.
lul minim acceptat. Halatul trebuie să fie curat şi corect încheiat. în anumite situaţii se va reco 17. Toate celelalte obiecte contaminate (exceptând ansele bacteriologice, pipetele şi
manda utilizarea mănuşilor, ochelarilor, măştii, bonetei, şorţului, încălţămintei de protecţie. Se
lamele) se vor introduce la finalul activităţii practice, cu precauţie, într-un recipient (ex. o
recomandă ca echipamentul de protecţie să fie păstrat separat de hainele utilizate în exterior.
găleată din metal, cu capac) care va fi autoclavată.
4. Nu se vor purta mănuşi de latex în momentul manipulării becului Bunsen.
Diagnosticul de laborator în microbiologie
8 DATE PRIVIND ECHIPAMENTUL SI APARATURA
UTILIZATE ÎN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE
18. Se va restrânge pe cât posibil utilizarea obiectelor ascuţite, tăietoare şi înţepătoare.
19. Pentru îndepărtarea obiectelor ascuţite de unică întrebuinţare recomandăm utilizarea
de „cutii sigure" în care acestea să fie colectate. Aceste cutii vor fi ulterior incinerate.
20. în cazul în care are loc accidental contaminarea unei suprafeţe cu produse patologice
sau culturi, în cazul în care acest eveniment se datorează unui tânăr inedic sau viitor medic
în diferitele încăperi (spaţii) ale laboratorului de microbiologie putem întâlni o serie de
aflat în pregătire, în primul rând trebuie anunţat fără întârziere asistentul responsabil cu
echipamente, elemente de birotică, diferite aparate.
pregătirea respectivei grupe de lucru. Se recomandă acoperirea cu o pânză a suprafeţei
Spre exemplu, în încăperea unde are loc recepţionarea produselor patologice trebuie să
contaminate după care se toarnă o soluţie dezinfectantă care se va menţine pe loc în funcţie
existe registre sau un sistem computerizat de înregistrare a datelor (înregistrarea corectă a
de recomandările producătorului, dar nu mai puţin de 30 minute. Ulterior se poate trece
datelor în sistemul sanitar trebuie să reprezinte o prioritate pentru oricare dintre unităţile
(după caz) la curăţirea locului. medicale indiferent de sistemul public sau privat), stative pentru tuburi, eprubete, flacoane
21. La sfârşitului lucrului în laborator se vor spăla mâinile cu apă şi săpun. etc, un incubator la 37°C, un frigiderele. în locul unde se desfăşoară diagnosticul microbi
22. în afară de aceste măsuri, se vor avea în vedere toate cele necesare evitării oricărui ologic trebuie să existe la îndemână anse bacteriologice, diferite pipete, pense, baghete de
risc care ar putea rezulta în urma utilizării unor substanţe caustice, manipulării diferitelor lemn, tampoane de diferite dimensiuni, becul Bunsen, microscopul, lupa, lame şi lamele,
truse de colorare, centrifuga, balanţa, baia de apă, un incubator, un frigider, plăci Petri, epru-
aparate electrice etc. bere, containere pentru materialul contaminat, cabinetul de siguranţă biologică etc.
în ceea ce priveşte utilizarea cabinetelor de siguranţă biologică (hote, boxe, nişe), vor fi
în cele ce urmează vor fi enumerate o parte dintre ustensilele şi aparatele care se pol găsi
prezentate unele noţiuni în capitolul al 3-lea. în laboratorul de microbiologie.
Respectarea acestor norme de protecţie este strict necesară.
1. Microscoape, lupe şi truse de coloranţi;
Trebuie să avem în vedere şi faptul că recomandările şi directivele Uniunii Europene în
- microscop optic (câmp luminos);
domeniul biosecurităţii trebuie să fie adoptate de către ţara noastră; după integrarea Româ
niei în EU respectarea acestora va deveni obligatorie. - alte tipuri de microscop, care pot fi utilizate în cameră obscură (microscop cu fond
întunecat, microscop cu contrast de fază, microscop cu fluorescenţă) în situaţii particulare
de diagnostic;
- truse pentru coloraţii uzuale (albastru de metilen, Gram, Ziehl-Neelsen etc) şi speciale;
- lupă de mână şi lupă stereoscopică (pentru studierea morfologiei coloniilor).
2. Cabinete de siguranţă biologică (incinte, boxe, nişe):
- cabinetul de clasă I, în care aerul curat antrenează aerosolii produşi dinspre persoana
care lucrează şi care se află în laborator către mediul exterior, printr-un filtru care reţine
majoritatea particulelor periculoase;
- cabinetul de clasă if, în care aerul curat pătrunde filtrat, este recircuiat prin filtre astfel
încât suprafaţa de lucru vine în contact cu aer steril; în boxă nu se vor introduce surse de căl
dură;
- cabinetul de clasă ill este complet închis; medicul îşi introduce mâinile în zona de lucru
prin mănuşi fixate etanş la aparat; aerul este atât admis cât şi evacuat prin filtre;
3..Termoslate şi băi de apă sau de nisip:
- termostate reglate la diferite temperaturi, în funcţie de profilul laboratorului şi a ger
menilor studiaţi (ex. 33-37°C pentru bacterii, 28°C pentru fungi etc);
>
- camere termostat;
- băi de apă de diferite mărimi (ex. pentru decomplementarea serurilor la 56°C);
- băi de nisip (ex. pentru coagularea unor medii de cuitură/Loeffler etc).
f (
10 Diagnosticul de laborator In microbiologie Date privind echipamentul şi aparatura utilizate în laboratorul de microbiologie 11
\
( f
WIETODE DE DEZINFECŢIE Şl STERILIZARE Metode de dezinfecfie şi sterilizare utilizate în laboratorul de microbiologie 13
UTILIZATE ÎN LABORATORUL DE IVIICROBIOLOGIE
Sterilizarea prin căldură uscată
Sterilizarea prin căldură uscată are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea structurilor
bacteriene.
j l e f in iţ ii de bază 1. SteriIizareamrin-mcăizkaJaJncandescentă (..la roşu“) reprezintă introducerea şi men
ţinerea în flacăra becului Bunsen până la înroşire, pe toată lungimea, a obiectului care urmează
Sterilizarea reprezintă distrugerea sau îndepărtarea tuturor microorganismelor patogene sau a fi sterilizat. Se poate aplica pentru ansa bacteriologică (cu buclă sau fir) sau pentru spatulă.
nepatogene, forme vegetative sau spori, de pe o suprafaţă sau dintr-un mediu (lichid sau solid). Flambarea reprezintă trecerea prin flacără (de câteva ori) a unui obiect, fără a se atinge
Septic înseamnă contaminat cu microbi patogeni sau infectat (de exemplu infecţia unei plăgi). temperatura de incandescenţă. Flambarea se aplică pentru portansă, gâtul unui recipient de
Aseptic înseamnă lipsit de microbi, indiferent dacă microbii sunt patogeni sau nepatogeni. sticlă (tub, eprubetă, flacon etc) sau pentru capilarul pipetelor Pasteur.
Asepsia reprezintă ansamblul de metode prin care evităm contaminarea mediului ij? 2 / Sterilizarea cu aer cald se realizează în etuvă (pupinel, cuptor Pasteur). Etuva este o
ambiant cu germeni microbieni sau prin care putem menţine “sterilitatea” ţesuturilor, medii cutie metalică cu pereţi dubli. Cu ajutorul unor rezistenţe electrice şi a unui termostat se
lor de cultură, medicamentelor injectabile etc. obţine şi menţine temperatura pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii în interiorul
aparatului este realizată cu ajutorul unui sistem de ventilaţie.
Dezinfectia reprezintă distrugerea formelor vegetative microbiene (uneori şi a sporilor)
din anumite medii (lichide, solide) sau de pe suprafeţe. Se realizează cu ajutorul unor agenţi Pentru majoritatea materialelor care urmează a fi sterilizate, temperatura din etuvă tre
fizici sau cu ajutorul substanţelor dezinfectante. buie să atingă J80°C,_ pentru o durată de 1 oră. în-unele situaţii timpul de sterilizare poate
depăşi 60 de minute (ex. pentru ambalaje de dimensiuni mari).
Antisepsia reprezintă înlăturarea sau distrugerea formelor vegetative microbiene de pe
tegumente, mucoase sau din plăgi. Se realizează cu ajutorul substanţelor antiseptice. Sterilizarea cu aer cald este indicată pentru obiecte de sticlă, obiecte de porţelan, pulberi
inerte şi termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (pentru instrumentarul meta
lic este de menţionat faptul câ repetarea sterilizării, în timp, conduce la decălirea oţelului) etc.
STERILIZAREA Nu se vor steriliza în etuvă soluţiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc, vată,
Toate materialele utilizate în laboratorul de microbiologie trebuie să fie sterile înainte de bumbac, fibră sintetică, alte materiale termolabile, materiale contaminate din laborator.
utilizare. Există o mare diversitate de materiale care trebuie sterilizate, astfel încât şi meto Incinerarea reprezintă arderea până la obţinerea de cenuşă. Există anumite reguli
dele de sterilizare sunt destul de variate, după cum urmează: stntfejîfivind incinerarea, pentru a preveni diferitele tipuri de poluare.
l t î. Metode de sterilizare prin căldură în cazul spitalelor, de multe ori sunt prevăzute incineratoare în structura unităţii sanitare
respective. De regulă, în vederea incinerării se încheie un contract de prestări servicii cu o
« căldura uscată;
firmă de profil. Din punctul de vedere al laboratorului de microbiologie ar putea fi supuse
• căldura umedă. incinerării materiale de unică folosinţă din plastic, reziduuri organice solide, gunoi, cada
£%}Metode de sterilizare prin filtrare vrele animalelor de experienţă etc.
^ M e to d e de sterilizare utilizând radiaţiile
Sterilizarea prin căldură umedă.
Metode chimice de sterilizare.
Metodele de sterilizare care utilizează radiaţiile (cu excepţia radiaţiilor ultraviolete) şi Sterilizarea prin căldură umedă este cea mai eficientă metodă de sterilizare şi are ca
metodele chimice de sterilizare (ex. cu oxid de etilenă) sunt utilizate rareori în laboratorul mecanism coagularea proteinelor si degradarea enzimelor. ___
de microbiologie. /(jy ’Autoclavarea este esenţială atât pentru laboratoarele de microbiologie, cât şi pentru
Sterilizarea va fi întotdeauna precedată de pregătirea materialului care urmează să fie unităţile sanitare în general, indiferent de sistemul public sau privat. Vaporii de apă rea
sterilizat: ' j lizează la 0,5 atmosfere o temperatură de 115°C, la 1 atmosferă o temperatură de 121°C şi
respectiv 134°G la 2 atmosfere.
e spălare, uscare, ambalare în cazul materialelor curate, necontaminate;
Autoclavul are ca piesă principală un cazan cu pereţi metalici, care se închide etanş cu un
• autoclavare, spălare, uscare, ambalare/în cazul materialelor contaminate refolosibile.
capac prevăzut cu un sistem special de închidere şi în interiorul căruia, vaporii de apă sunt
Există o serie de metode pentru a controla eficienţa sterilizării, prin indicatorii fizici (ex. ter comprimaţi la presiunea necesară în vederea sterilizării. Există mai multe tipuri de autoclave:
mometru), chimici (ex. floare de sulf, tiouree) sau biologici (ex. spori de Bacillus steamer- • autoclave cu perete simplu;
mopkilus). • verticale;
• orizontale;
1
14 Microbiologie Metode de dezinfecfie şi sterilizare utilizate în laboratorul de microbiologie 15
e autoclave cu manta de aburi; ^ jT in d a liz a rc a (sterilizarea l'racţionată) este o metodă de sterilizare prin căldură umedă
o verticale; care evită depăşi lea'll ne i temperaturi de 100°C. Substanţele de sterilizat se menţin la S£-
• orizontale. 100°C timp de 30-60 minutelfT jk n ă la 8 zile succesiv. Astfel, utilizând medii care permit
în continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu, verti germinarea, după prima încălzire timp de 30-60 minute sunt distruse, formele vegetative iar
cal, ia care vaporii provin din apa aflată în cazanul de presiune şi ajung în camera de sterilizare după răcire are loc germinarea sporilor. în ziua următoare sunt distruse prin încălzire formele
de jos în sus. Presiunea din interiorul cazanului este înregistrată de un manometru. Pentru pu vegetative rezultate din germinarea sporilor iar după răcire are loc germinarea sporilor care
nerea în funcţiune a autoclavului, în dotare există 2 robinete; unul superior (robinetul de aer şi nu au germinat în prima zi etc.
vapori, care permite legătura între cazan şi mediul exterior) şi unul inferior (robinetul care per Din punct de vedere tehnic pot fi utilizate autoclave la. care se va menţine permanent
mite evacuarea apei din cazan). Pentru a evita accidentele există o supapă de siguranţă care se deschis robinetul de vapori (şi astfei nu se va depăşi în interior temperatura, de 100°C), băi
deschide şi permite evacuarea vaporilor atunci când, accidental, presiunea vaporilor depăşeşte de apă sau băi de nisip.
limita de siguranţă. în momentul de faţă pentru evitarea riscului de a veni în contact cu vapori Prin tindaiizare se pot steriliza alimente, unele medii de cultură etc.
de apă fierbinţi aflaţi sub presiune, autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu permite
deschiderea capacului până când presiunea din interior nu o egalizează pe cea din. exterior. Pasteurizarea şi fierberea nu reprezintă metode de sterilizare, dar sunt utilizate în anu
Cazanul de presiune este inclus într-un perete exterior solid care la partea inferioară are un mite situaţii. Pasteurizarea foloseşte căldura umedă şi are aplicaţii in conservarea pentru
scurtă durată a unor alimente (lapte, bere ele). Există o pasteurizate joasă (30 minute la 56-
spaţiu în, care se află sursa de căldură.
65°C), o pasteurizare medie f 15 miinite la 65-75IIC) şi ojxisteurizare întiltă (2-5 minute ia
în partea inferioară a cazanului de presiune se află un suport pe care se aşează o placă 85-90°C).'~Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile în formă vegetativă dar nu şi sporii.
de metal perforată. Pe suport se aşează materialele care trebuie sterilizate iar faptul că placa Fierberea poate fi utilizată atunci când nu dispunem de alte metode eficiente de sterilizare.
este perforată permite trecerea vaporilor de apă produşi după încălzirea apei. în vederea ste Fierberea timp de 30 minute distruge bacteriile în formă vegetativă, fungii şi virusurile, dar
rilizării se procedează astfel; nu şi sporii bacteriei». Timpul se înregistrează după ce apa a început să fiarbă. Eficienţa
» verificăm nivelul apei din partea inferioară a cazanului, care trebuie să fie până ia o acestei metode poate Fi crescută prin adăugarea de carbonat de sodiu 1-2%,
distanţă de 2-3 centimetri de suport; dacă nivelul a scăzut, se completează (recoman
dabil se va utiliza apă distilată);
® aşezăm pe suport obiectele şi materialele de sterilizat, ambalate corespunzător Microorganismele pol fi reţinute mecanic şi electrostatic în porii unui filtru. Trecerea
* închidem etanş capacul, folosind sistemul special de etanşeizare cu care este dotat unui lichid pjrinlr-o substanţă prevăzută cu pori care va reţine microorganismele din lichidul
autoclavul pe care îl avem Ia dispoziţie; respectiv poartă numele de sterilizare prin filtrare.
e conectăm sursa de căldură; De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de filtre clasice (porţelan, sticlă poroasă.
* deschidem robinetul pentru evacuarea aerului şi vaporilor (dacă rămâne aer în cazanul .azbest impregnat cu caolin, pământ de infuzorO^ Actualmente se folosesc din ce în ce mai
cu presiune eficienţa sterilizării va scădea considerabil; vaporii de apă fiind mai uşori, frecvent, membrane filtrante din acerat de celuloză cu porozităţi între S şi 0,025 ret. în ve
vor încălzi în special partea superioară a cazanului în timp ce aerul, care va atinge tem derea filtrării suni necesare o serie de piese precum: un recipient în care se introduce lichidul
peraturi inferioare, fiind mai greu, va rămâne în partea inferioară a cazanului); care urmează a fi filtrat, un recipient în care se va colecta lichidul sterilizat, o pâlnie care se
* închidem robinetul .după evacuarea aerului şi apariţia unui jet continuu de vapori; montează etanş între cele 2 recipiente, o pompă de vid care va aspira lichidul din primiţi în
» presiunea din cazan începe să crească şi .este urmărită cu ajutorul manometrului; atunci al doilea recipient, prin membrana filtrantă. Toate aceste piese sunt sterilizate prin auto
când presiunea atinge, valoarea dorită (de ex. 1 atmosferă), reglăm sursa de căldura în aşa clavare înainte de începerea filtrării. *
iei încât această presiune să fie menţinută pentru toată durata sterilizării (de ex. 30 minute); Există şi. alte variante tehnice. Cu o importanţă practică particulară ar fi de menţionat fil
® după trecerea celor 30 minute întrerupem sursa de căldură şi lăsăm autoclavul să se trele pentru sterilizarea aerului din cabinetele de siguranţă biologică (clasa 11 şi clasa 111),
răcească până când presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii atmosferice; ir .Filters}.
* deschidem lent robinetul de vapori; Sterilizarea prin filtrare este utilizată pentru decontaminarea aerului, it unor medii de cul
» deschidem sistemul de etanşeizare şi capacul autoclavului; tură (care nu se pot steriliza prin autoclavare), â unor reactivi care sunt sensibili la tempe
» lăsăm obiectele şi materialele să se răcească în autoclavul deschis; / raturile atinse în cazul sterilizării prin căldură etc.
« atunci când.temperatura ajunge iu circa 80°C putem scoate materialele sterilizate.,
Prin autoclavare putem steriliza diferite substanţe în soluţie, sticlărie (cu excepţia
pipetelor şi lamelor), materiale contaminate din laborator, instrumentar chirurgical (metalic, Radiaţiile neionizante (IJV) sau ionizante (X ele) au efecte bactericide prin ruperea legă-
de cauciuc sau bumbac), medii da cultură, aparate de filtrat etc. iunie: do hidrogen, oxidanta legăturilor duble ele.
* i AAetode de dezinfecfie şi sterilizare utilizate în laboratorul de microbiologii
1<5 __________ ___________________________• Microbiologie
SCHEMA GENERALĂ A
DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR MICROBIOLOGIC la microscopul optic a i imersie, si se notează prezenţa diferitelor celule (eventual mo
dificate faţă de normal), prezenţa celulelor inflamatorii (dovada reacţiei organismului faţă
de infecţie, ex. ieucocite polimorfonucleare neutrofile), precum şi eventuala prezenţă a
microbilor, care va fi interpretată cu precauţie, în contextul dat.
Atunci când produsul recoltat este reprezentat de sânge, urină sau materii fecale, de
Diagnosticul de laborator în microbiologic poate fi un diagnostic bacteriologic sau mico- regulă nu se realizează frotiuri fixate şi colorate. Spre exemplu, în cazul materiilor fecale,
logic (direct), un diagnostic imunologic (indirect) sau o combinaţie a celor două variante se va face o coprocitogramă, un preparat proaspăt între lamă şi lamelă, căutându-se în spe
cial prezenţa leucoeitelor (dar şi a unor structuri care pot da anumite informaţii cu privire la
menţionate.
funcţionalitatea tractului digestiv). în cazul suspicionării unei infecţii urinare—se. va obţine
în continuare vor fi prezentate succint principalele etape ale diagnosticului microbio
un sediment tirmarid u p ă centrifugarea urinei), care se va examina între lamă şi lamelă în
logic, pe o schemă care va fi urmată pe parcursul următoarelor capitole. Fiecare dintre etape
vederea aprecierii prezenţei şi eventual a numărului de Ieucocite prezente pe câmp, precum
va fi tratată din punct de vedere practic, constituind un îndrumar al activităţii din cursul
şi a altor celule normale sau patologice, date care pot fi deosebit de utile în vederea unui
lucrărilor practice dar şi un suport pentru reţinerea acestor noţiuni din punct de vedere teo diagnostic corespunzător.
retic.
în cazul suspiciunii unei infecţii micotice sunt utile atât preparatele proaspete (de ex.
Astfel, începând cu normele privind prelevarea şi transportul probelor, continuând cu
preparatul umed montat în soluţie de KOH-glicerol 10-20%), frotiurile cu coloraţii negative
prepararea frotiurilor şi coloraţiilor, tehnica examenului microscopic, prezentarea princi (tuş de India, nigrozinâ) precum şi frotiurile colorate May-Griinwald-Gieinsa sau Qjam.
palelor medii dc cultură şi a tehnicilor de cultivare, după prezentarea metodelor de identifi
care, partea „generală" se va încheia cu testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice. ,5 ^Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se va face în funcţie de situaţie
(mediile şi condiţiile de incubare se vor alege în funcţie de presupusul microorganism pe
în partea de „imunologie", după o discuţie succintă a noţiunilor de antigen, anticorp şi a
care dorim să-l izolăm). Cultivarea se va realiza în aşa fel încât să se poată obţine colonii
reacţiilor antigen-anticorp, vor fi prezentate succesiv reacţiile de precipitare, aglutinare, de
izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica.
fixare a complementului, seroneutralizarea, reacţiile în care reaclanţii sunt marcaţi precum şi
utilizarea unor metode moderne în testarea imunităţii. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere:
Capitolul 22 va fi dedicat preparatelor biologice pentru uz uman.
/ tţTfcaractere morfologice (se va face un frotiu din colonia izolată, frotiu care se va colo
ra oram sau Ziehl-Neelsen, după caz, şi se va examina microscopic. în această situaţie se
A. Diagnosticul de laborator bacteriologic/micologic^
vor evidenţia numai microorganisme care au formă şi tinctorialitate similară);
Diagnosticul de laborator bacteriologic/micologic are mai multe etape, şi anume: |^b ) caractere de cultură (se-xpr examina coloniile izolate apărute pe mediilgjje cultură
/ f rŢ)Recoltarea şi transportul produsului patologic (se va face cât mat aproape de debutul bolii, solide-şTcare pot tTderiip S’jientru majoritatea bacteriilor studiate, defiip R .în cazul
înainte ca pacientului să i 7e fi administrat antibiotice sau chimioterapice, cât mai rapid şi corect Cormebpcterium dinhteriaţ~Mvcobaclerium tuberculosis şi Bacillus a n th n ich rf pespectiv
din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie, de: tip M în cazul bacteriilor capsulate, de exemplu Klebsiella pneumoniae sau alte caractere
prelevând un anumit produs patologic în funcţie de manifestarea clinică în cazul respectiv, de în cmuI fungilor);
exemplu urină în cazul unei infecţii urinare, materii fecale în cazul unei boli diareice, lichid fc)Caractere biochimice, care pot fi foarte variate de la o specie de microbi la alta şi care
cefato-rahidian în cazul suspiciunii unei meningite, scuame în cazul unei micoze cutanate pot fi foarte utile spre exemplu în cazul diferenţierii enterobacteriilor (mediile multitest),
supgrficiale ele). fungilor (auxanograma) etc;
• 2a) Examinarea macroscopică a produsului patologic poate fi uneori foarte utilă (ex. ' ( dfearactere antigenice «jre vor fi examinate bazându-ne pe structura microorganismelor
puroiul colorat albastru sau albastru verzui este sugestiv pentru o infecţie cu Pseudomonas şi pe specificitatea reacţiilor antigen-anticorp, utilizând anticorpi cunoscuţi pentru a iden
aeruginosa etc). tifica antigenele microbiene necunoscute; spre exemplu, prin reacţii de aglutinare pe lamă
2b. Examinarea microscopică a produsului patologic reprezintă de multe ori o etapă se vor identifica antigenele genului Shigella, Vibrio etc; există anticorpi specifici polivalenţi
esenţială şi poate orienta paşii următori. Se vor realiza minim două frotiuri din produsul sau monovalenţi care vor fi utilizaţi de la caz la caz;
patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de meailga- ,'''7e)'«aractere de patogenitate. atunci când se vor examina spre exemplu capacitatea unui
(AM) si respectiv Gram. Este de preferat să avem întotdeauna cel puţin încă un frotiu de re microorganism de a elabora anumite substanţe cu rol în patogenitate (exemplu coagulaza
zervă, mai ales în cazul în care produsul patologic este „preţios" (LCR, produs recoltat prin produsă de S. aureus) sau infecţia experimentală la animalul de laborator (de exemplu, izo
puncţie-biopsie etc). în cazul suspicionării unei jnfectii mvcohactetiene^este necesară larea pneumococilor de Ia un pacient cu pneumonie după inocularea sputei la şoarecele alb;
realizarea unui frotiu suplimentar, care se va colora Ziehl-Neelsen. Frotiurile se examinează
( i (
în cazul în care în sputâ există pneumococi, animalul va muri în 24-48 de ore, iar din sân
gele lui se va izola o „cultură pură'1de pneumococi); Iniţial vor fi studiate din punct de vedere practic noţiunile de bază (microbiologie gene
f) lizotipiş. (sensibilitatea la un anumit bacteriofag specific); rală şi imunologie) pentru ca în ultima parte să trecem la studierea diagnosticului ca atare, în
cursul microbiologici speciale, urmărind maladiile produse de principalele microorganisme.
g) caracterc-genetice care vor fi „examinate" prin tehnici de biologie moleculară;
Considerăm că pentru orice medic, indiferent de specialitatea aleasă, multe dintre prin
hî alte caractere utile în identificarea microorganismelor (bacterii, fungi).
cipiile de bază ale microbiologici sunt foarte utile, merită a fi înţelese şi aplicate corespun
,f S.^Antibiograma şi -respectiv antifungigrama (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi zător. Pentru cei care se dedică microbiologici, aceste noţiuni reprezintă o bază care poate
chimioterapice anti-bacteriene sau antî-fungice, îfr vederea stabilirii tratamentului) se va fi completată utilizând diferitele tratate medicale în domeniu dar şi experienţa personală
realiza de obicei prin metode difuzimetrice, dar în cazul unor infecţii grave trebuie să fie dezvoltată atât din punct de vedere teoretic cât şi practic.
însoţită de alte determinări. Spre exemplu pot fi necesare în cazul infecţiilor bacteriene
determinarea concentraţiilor minime inhibitorii (CMI).şi respectiv bactericide (CMB). în
anumite situaţii poate deveni necesară determinarea nivelului de eficienţă pentru antibioti
cul utilizat, respectiv nivelul de eficienţă inhibitorie (NEI) şi nivelul de eficienţă bactericidă
(NEB). Există şi metode moderne pentru determinarea sensibilităţii la antibiotice, (ex. E test,
metode care utilizează tehnici de biologie moleculară etc).
• recipientele pentru recoltare şi transport trebuie să fie marcate corespunzător în aşa fel
• în schimb, dacă în cazul în care este suspicionată tuberculoza pulmonară se vor încât să nu fie posibilă apariţia unor confuzii; ceea ce se notează pe recipient trebuie
trimite spre examinare salivă sau secreţii de la nivelul arborelului respirator supe să corespundă cu ceea ce a fost notat pe formularul de solicitare a respectivei analize;
rior în ioc de spută, diagnosticul microbiologic este imposibil etc.
• datele de identificare şi alte date semnificatice vor fi trecute în următoarele documente
• din p.p. se vor preleva şi utiliza în cursul diagnosticului microbiologic porţiunile cele
• registrul unităţii sanitare/secţiei/clinicii care solicită analiza respectivă (în cazul în
mai reprezentative, respectiv acele porţiuni în care sunt cele mai mari şanse de identi-
care recoltarea produsului patologic se face în afara laboratorului);
ficare/vizualizare prin microscopie/cultivare şi izolare a microorganismului infectant,
, * formularul prin care se solicită analiza microbiologică;
spre exemplu în cazul recoltării de materii fecale (suspiciune de boală diareică acută)
se vor selecta porţiunile muco-purulente (eventual muco-sanguinolente) • registrul de lucru al laboratorului;
• formularul prin care se anunţă rezultatul analizei (buletinul de analiză);
o este necesar să se recolteze o cantitate de p.p. suficientă pentru efectuarea diagnosti
• pentru simplificare, un singur formular poate include atât partea corespunzătoarea
cului microbiologic (preparate proaspete, frotiuri, cultivări pe medii de cultură, ino
solicitării analizei cât şi buletinul de analiză microbiologică;
culări la animale de experienţă, reluarea unor manevre în cazul că este necesar
• o altă modalitate de simplificare ar putea fi reprezentată de înregistrarea „electro
• recoltarea şi transportul p.p. trebuie să se realizeze în condiţii stricte de asepsie, pen nică" a datelor şi utilizarea metodelor moderne de transmitere a lor; există doar
tru prevenirea contaminării celui care recoltează, pentru prevenirea supra-infectării câteva unităţi sanitare în România unde sunt utilizate aceste metode;
pacientului şi pentru prevenirea contaminării p.p. o pentru reducerea cantităţii de date şi respectiv asigurarea confidenţialităţii, se recurge
• se vor respecta precauţiunile universale privind prevenirea contaminării în unităţile la „număml unic de identificare", un grup de cifre şi litere care permit codificarea şi
sanitare; asocierea a câte unui astfel de număr fiecărui pacient în parte;
• se va evita, pe cât posibil, contaminarea p.p. cu microorganisme care aparţin florei • cu toate că înregistrarea datelor pare pentru majoritatea celor implicaţi în actul
rnicrobiene normale (spre ex. prin tehnica de recoltare/vezi recoltarea urinei sau medical o „simplă" şi inutilă birocraţie, această modalitate de apreciere este com
prin manevre invazive care şuntează căile naturale prin care sunt eliminate plet eronată; înregistrarea datelor şi fluxul informaţiilor în sistemul sanitar sunt
microorganismele/vezi recoltarea sputei prin lavaj bronhoalveolar); extrem de importante şi este necesar să fie depuse toate eforturile în vederea efec
• se vor utiliza instrumente sterile şi recipiente (containere/recoitoare) sterile. tuării lor în mod corespunzător (din păcate orele de studiu dedicate acestor aspecte
sunt mult prea reduse atât pe parcursul studenţiei cât şi în cursul rezidenţiatului).
Regulile prezentate mai sus reprezintă elemente fundamentale în vederea obţinerii unui
• elemente importante care trebuie notificate atunci când se solicită o analiză de labora
diagnostic corect şi, după opinia noastră, trebuie cunoscute de orice persoană implicată în
actul medical, inclusiv de studenţii la medicină, chiar dacă nu vor alege pentru viitor pre tor microbiologică
gătirea în domeniul medicinei de laborator sau în domeniul bolilor infecţioase. • pentru identificarea produsului patologic care urmează a fi prelucrat se vor nota
numele, prenumele, vârsta pacientului (sau „numărul unic de identificare"), data şi
înainte de a încheia această parte a capitolului privind normele privind recoltarea şi
locul recoltării (unitate sanitară, clinica, secţia, salonul);
transportul p.p. în diagnosticul microbiologic direct dorim să subliniem câteva aspecte care
®pentru facilitarea alegerii celei mai potrivite modalităţi pentru prelucrarea p.p. se
nu trebuie să fie neglijate, după cum urmează:
vor nota diagnosticul prezumtiv, natura p.p., examenul solicitat, data debutului
e instrumentele pentru recoltare trebuie să fie nu numai sterile dar şi adecvate, de ex. bolii, ce medicaţie antimicrobiană a fost administrată respectivului pacient (anti
. foarte frecvent este utilizat tamponul de vată, însă recoltarea cu tampon ar trebui să fie biotic sau asociere de antibiotice, data începerii administrării, doze, durată);
recomandată doar recoltării şi transportului p.p. = secreţie de la suprafaţa mucoaselor ®în acelaşi sens se vor nota data şi ora recoltării, data şi ora recepţionării în labora
şi tegumentelor cu leziuni tor, cine şi cum a făcut recoltarea, cum a fost asigurat transportul p.p.;
® vata poate conţine substanţe inhibitoare pentru microorganisme; • subliniem faptul că, cel mai adesea venim în contact cu formulare incomplete/comple-
• cantitatea de p.p. recoltabil este mică; tate indescifrabil/completate cu erori şi chiar dacă ar putea părea incredibil, formulări
• microorganismele şi leucocitele „rămân" în proporţie mare pe vată şi nu pot fi uşor de genul „nume X, prenume Y, probă Z, rugăm toată bateria de analize" sunt încă mult
transferate pe frotiu, mediu de cultură; pred frecvente şi ar trebui ca de fiecare dată să conducă la o discuţie fermă cu „expe
® pentru anumite microorganisme (ex. Bordetella pertussis) utilizarea tamponului cu ditorul" până când asemenea comportamente vor fi eliminate, în beneficiul pacienţilor.
vată este total contraindicată;
Motive pentru care un p.p. ar putea ti respins de la analiza microbiologică
• recipientele pentru recoltare şi transport trebuie să fie întâi curăţate (dar prin clătire să
fie eliminate orice substanţe chimice cu posibil efect antimicrobian) şi apoi sterilizate, Respingerea p.p. ar trebui să reprezinte o excepţie în activitatea unui laborator de anali
preferabil prin autoclavare; închiderea recipientelor trebuie să fie perfectă, pentru a ze medicale, dar există anumite motive care pot conduce la această decizie. înainte de a
preveni orice contaminare pe parcursul transportului;
Diagnosticul de laborator în microbiologie Norme privind prelevarea şi transportul produselor patologice 27
26
prezenta câteva exemple în acest sens dorim să subliniem faptul că activitatea medicală se « este necesară menţinerea condiţiei iniţiale a produsului patologic (conţinut microbian,
desfăşoară într-un sistem în care există mai multe verigi care trebuie să funcţioneze perfect citologie etc) pentru a putea înregistra o „imagine" cât mai apropiată de ceea existen
(fiecare în parte) iar între verigile sistemului ar trebui să existe o perfectă colaborare. tă la nivelul procesului infecţios
în vederea stabilirii diagnosticului şi tratamentului corespunzător în cazul unui pacient • diferitele microorganisme au diferite temperaturi optime pentru supravieţuire;
care prezintă o anumită boală transmisibilă (infecţioasâ) nu există o subordonare ci o core • celelalte condiţii necesare supravieţuirii microorganismelor diferă în funcţie de
lare a activităţilor. Atât laboratorul cât şi clinica au de îndeplinit funcţii foarte importante, fiecare grup de microorganisme în parte (pH, deshidratare, radiaţii >UV sau radiaţii
uneori decisive pentru viaţa pacientului. solare în general, prezenţa oxigenului, prezenţa substanţelor antimicrobiene,
Pentru ca în situaţiile „limită1*funcţionarea să fie perfectă este necesar un continuu antre fenomene de autoliză etc);
nament atât din punct de vedere teoretic şi tehnic dar şi în ceea ce priveşte colaborarea din o microorganismele din flora asociată se pot miiltiplica în cursul transportului (de
tre parteneri. Respingerea unui p.p. şi solicitarea de către laborator a recoltării unui nou p.p. regulă mai lesne decât microorganisţhele patogene);
de calitate, care să permită stabilirea diagnosticului microbiologic, trebuie înţelese ca un • utilizarea mediilor de transport modifică aspectul citologie al p.p.;
gest normal atunci când anumite reguli de recoltare şi transport sunt neglijate.
®este necesară prevenirea contaminării p.p. precum şi prevenirea contaminării mediului
în anumite situaţii, chiar dacă sunt sesizate diferite disfuncţionalităţi în ceea ce priveşte
extern sau a personalului care asigura recoltarea, transportul şi ulterior prelucrarea p.p.;
modul în care p.p. a fost recoltat şi transportat către laborator, problemele pot fi rezolvate
prin telefon sau o discuţie directă, spre exemplu în vederea identificării unui p.p, care a fost ®în anumite situaţii (rezistenţa microorganismului în mediul exterior este deosebit de
recepţionat fără datele de identificare. însă, în cazul în care această discuţie nu poate con redusă) se va recomanda recoltarea şi prelucrarea p.p. „la patul bolnavului" sau, dacă este
duce la stabilirea identităţii p.p., respectiva probă nu trebuie prelucrată în laborator. posibil, pacientul va fi invitat în laborator pentru recoltare;
în cazul în care p.p. a fost identificat dar este necorespunzător din punct de vedere cali • pentru foarte multe dintre p.p. se poate accepta un timp de transport de 1-2 ore
tativ, prelucrarea acestuia ar trebui temporizată (p.p. menţinut la +4°C) până în momentul (repetăm propoziţia de mai sus: p.p. trebuie să ajungă în laborator în cel mai scurt timp
în care se ia legătura cu medicul care a solicitat analiza şi se analizează dacă recoltarea ar posibil);
putea fi repetată şi urmată de trimiterea unui p.p. corespunzător. în cazul în care o nouă ®în cazul în care timpul de transport al p.p. nu poate respecta ceea ce este indicat se
recoltare este posibilă primul p.p. se îndepărtează şi se va prelucra al doilea. în cazul în care poate recurge la „conservarea" acestuia după cum urmează
nu este/posibiiă o nouă recoltare şi se estimează că prelucrarea p.p. chiar necorespunzălor • menţinerea la temperatură scăzută (container izoterm cu gheaţă la 0°C sau frigider
poate aduce vreun beneficiu pacientului examinat, se încearcă obţinerea datelor care pot fi la +4°C); de menţionat că Neisseria meningitidis, Neisseria gonorhoeae,
obţinute (cu rezervele de rigoare care vor fi menţionate în buletinul de analiză). Haemophilus influenzae etc nu rezistă la aceste temperaturi;
Iată câteva motive de respingere a unui produs patologic: • utilizarea unui mediu de transport (Cary Blair, Stuart etc./vezi capitolul 9)
• spută recoltată pe parcursul a 24 de ore; • adăugarea de penicilină, streptomicină şi cloramfenicol atunci când se urmăreşte
o „spută11care de fapt conţine salivă şi secreţii din tractul respirator superior; izolarea unui fung (agenţii etiologici ai micozelor cutanate superficiale pol rezista
• urină recoltată cu mai mult de 60 de minute în urmă (care nu a fost menţinută la +4°C); împachetate în hârtie sterilă şi introduse într-o cutie Petri până la 48 de ore fără să
necesite adăugarea de antibiotice);
o exsudat faringian, exsudat nazal, spută, urină, materii fecale etc pentru care se solicită
izolarea şi identificarea germenilor anâerobi; • aspirarea p.p. lichid în seringă, cu eliminarea rapidă a bulelor de aer şi „închiderea"
• produse patologice pentru care este evidentă contaminarea (de ex. datorită unui reci seringii cu ajutorul unui dop de cauciuc steril în care introducem imediat acul
(atenţie la manevrarea acului de seringă în condiţiile recoltării unui produs pato
pient de colectare necorespuzător) etc.
logic uman/risc de înţepare şi transmiterea altor infecţii ex. HIV) atunci când
urmărim izolarea unei bacterii anaerobe care ar putea supravieţui în acest caz circa
Transportul produselor patologice
30 de minute etc;
în ceea ce priveşte transportul produselor patologice este semnificativă propoziţia urmă ® transportul către laborator se va realiza
toare: produsele patologice trebuie să ajungă în laborator în cel mai scurt tim p posibil, Faţă
• numai de către un curier instruit în acest scop;
de această recomandare cu caracter general, ar fi de discutat o serie de aspecte concrete.
• în recipiente etanşe pe care se va lipi pietograma pentru „risc microbiologic";
Transportul cât mai raptd/sau prelucrarea imediată a unui p.p. recoltat chiar Ia nivelul
laboratorului sunt recomandate ferm datorită următoarelor considerente; • iar în cazul în care p.p. trebuie expediat prin poştă se vor respecta normativele
legale în vigoare precum şi recomandările speciale recunoscute la nivel inter
naţional dintre care cele mai utilizate sunt elaborate de World Health Organization
j
I (
t, f
28 ___________ Diagnosticul de laborator în microbiologie
Norme privind prelevarea şi transportul produselor patologice 29
(WHO), Center for Diseases Control and Prevention (CDC) sau National
3. Sputa
Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) cu menţiunea că primele 2
pot fi obţinute în mod gratuit. • în diagnosticul microbiologic al infecţiilor acute ale căilor respiratorii inferioare
(1ACRI) se pot examina
Exemple de recoltare şi transport pentru câteva produse patologice ® prelevate care se pot contamina în cursul recoltării cu flora bacteriană normală:
spută, tampon nazal/faringian, aspirat nazal/faringian, aspirat hipofaririgian, produs
1. Exsudate otice sau nazale recoltat prin bronhoscopie simplă etc şi/sau
®pacientul stă pe scaun, cu faţa spre sursa de lumină (preferabil lumina naturală); ® prelevate care permit evitarea contaminării orofaringiane: aspirat transtraheal,
aspirat transtoracic, aspirat bronhoscopie prin cateter protejat cu canule telesco-
« utilizăm tampoane cu vată obişnuite uşor umezite cu soluţie salină fiziologică sterilă,
pate/lavaj bronhoalveolar, biopsie transbronşicâ, biopsie pulmonară pe torace
ceva mai mici decât în cazul recoltării exsudatului faringian
deschis, aspirat pleural, hemocukuri.
• un tampon va fi utilizat pentru examen microscopic direct;
• cu toate că este contaminată cu flora normală orofaringiană, sputa reprezintă produsul
• un tampon va fi utilizat pentru însămânţare pe medii de cultură; patologic recoltat cel mai frecvent, în majoritatea IACR1. Se pot obţine probe calitativ
®în cazul suspicionării difteriei se vor utiliza 3 tampoane. corespunzătoare în momentul în care pacientul se prezintă în unitatea sanitară (este
• tamponul trebuie încărcat cât mai bine cu p.p. (îl rotim relativ ferm pe suprafeţele unde recomandabil să se recolteze prima spută eliminată matinal şi în nici un caz sputa din
este prezent p.p.); , 24 de ore). Pacientul trebuie să înţeleagă diferenţa dintre „a expectora" şi „a tuşi şi
scuipa".
» este de preferat utilizarea imediat a p.p. iar în cazul în care acest lucru nu este posibil,
tamponul va fi trimis către laborator în mediu de transport. • înaintea prelevării se recomandă periajul simplu al dinţilor, clătirea energică a gurii şi
gargara cu apă (sau cu soluţie salină fiziologică);
2. Exsudatul faringian i® clacă proba apare constituită în principal din salivă, trebuie să solicităm imediat prele
« se recoltează preferabil dimineaţa înainte ca pacientul să mănânce şi fără să se fi spălat varea unei noi probe care să permită ulterior definitivarea diagnosticului. în IACRi o
pe dinţi, fără să fi utilizat gargarisme cu diferite soluţii (iar dacă aceste condiţii nu au probă mucopurulentă în volum de 2-3 ml ar putea fi suficientă;
fost respectate, recoltarea se va face după minim 4 ore) • stimularea expectoraţiei prin inhalarea de aerosoli calzi cu soluţie salină (3%) oferă,
®pacientul stă pe scaun, cu faţa spre sursa de lumină şi gâtul în uşoară extensie de regulă, probe citologie nesatisfăcătoare (sputa indusă ar putea fi utilă în izolarea
® ne aşezăm puţin lateral faţă de pacient pentru a evita contaminarea cu picături elimi Pneumocystis carinii). în cazul în care se presupune o infecţie mycobacteriană sau
fungică este recomandată recoltarea şi prelucrarea a 3 produse, în 3 zile consecutive;
nate în cursul unui eventual acces de tuse (de preferinţă vom purta mască şi ochelari);
• spălarea sputei intens mucopurulente (în 3 băi succesive de soluţie salină izotonă)
® deprimăm baza limbii cu ajutorul unui apăsător de limbă steril şi în condiţii de ilu
reduce contaminarea orofaringiană fără a influenţa semnificativ concentraţia bacteriei
minare adecvată examinăm faringele posterior, pilierii, amigdalele pentru a sesiza care
infectante prinsă în trama fibrinoasă a probei. Fluidifierea (de ex. cu N-acetil-L-cis-
sunt zonele inflamate (roşii, cu depozite, ulceraţii etc) şi eventualele depozite puru
teină) permite omogenizarea produselor patologice; se realizează în câteva minute;
lente;
• în cazul suspicionării unei infecţii fungice, probele fluide se concentrează prin cen
® utilizăm tampoane cu vată obişnuite
trifugare 20 de minute la 3000 rot/min., apoi se examinează sedimentul. Din probele
® un tampon va fi utilizat pentru examen microscopic direct; bioptice se disecă mici fragmente suspecte cu volume de circa 1 mm care sunt apoi
• 'un tampon va fi utilizat pentru însămânţare pe medii de cultură; examinate la stereomicroscop (mărire 30). Ţesutul cazeos, fibros şi grăsimea ascund
®în cazul suspicionării difteriei se vor utiliza 3 tampoane; în mod frecvent hifele iar tratarea cu KOH nu clarifică preparatul fiind necesară diso
• solicităm pacientului să pronunţe „A“ şi printr-o mişcare de ştergere, circulară, fermă, cierea şi omogenizarea probei;
recoltăm secreţia de la nivel faringian, amigdalian insistând în zonele unde există • produsele patologice recoltate pentru diagnosticul microbiologic trebuie transmise
ulceraţii, depozite (în căzui în care se remarcă prezenţa unei false membrane o detaşăm prompt către laborator (preferabil în maxim 1 oră, acceptabil în 1-2 ore);
cu grijă înspre periferie şi recoltăm secreţia care există sub această structură); • produsele recoltate într-un recoltor steril de 50-200 ml, cu capac care permite o
®trebuie să evităm atingerea bazei limbii sau a palatului moale; închidere etanşă, sunt etichetate şi expediate imediat la laborator pentru a fi examinate.
Nu există modalităţi optime de conservare a probelor. Menţinerea la o temperatură de
» este de preferat utilizarea imediat a p.p., sau în cel mult 1-3 ore; în cazul în care acest
4°C previne multiplicarea contaminanţilor, conservă unii patogeni, dar scade până la
lucru nu este posibil, tamponul va fi trimis către laborator în mediu de transport.
anulare şansa de izolarea a aitora (ex. H. influenzae, N. meningitidis).
i
( ,
Diagnosticul de laborator în microbiologie & Norme privind prelevarea şi transportul produselor patologice 31
• utilizarea unui mediu de transport perturbă raportul dintre bacterii şi reperele citolo- unei meningite este necesară efectuarea unor examinări biochimice adiacente celor
gice ale probei, esenţiale pentru apreciare calităţii probei şi interpretarea rezultatelor citologice şi microbiologice astfel încât este de dorit recoltarea (la adult) a unei can
sputoculturii, dar în cazul în care se apreciază că se va depăşi timpul de transport reco tităţi de 5-10 ml LCR; recoltarea p.p. este invazivă şi va trebui să fim în stare să exe
mandat se poate utiliza mediul Stuart sau Amies. în cazul în care se urmăreşte, spre cutăm toate testele necesare fără a solicita repetarea puncţiei lombare;
exemplu, izolarea M. pneumoniae, cultivarea trebuie făcută cât mai rapid; produsul • recomandăm recoltarea LCR în 2-3 tuburi sterile (2 tuburi vor fi centrifugate iar din al
patologic poate fi conservat maxim 4 ore în lipsa unui mediu special şi până la maxim treilea tub se vor realiza testele biochimice şi alte teste utile pentru a sugera etiologia);
24 de ore dacă se utilizează mediul de transport pentru molicute. în cazul în care ar fi dacă LCR este franc purulent, examenul microscopic direct se face fără centrifugare;
necesară o conservare prelungită, este necesară utilizarea unei temperaturi de -70°C • în mod ideal, LCR trebuie prelucrat imediat, cu alte cuvinte recoltarea şi procesarea
(în nici un caz temperatura congelatorului obişnuit). p.p. trebuie să înceapă „la patul bolnavului"; recomandăm ca pe lângă trusa necesară
manevrei de recoltare să avem la dispoziţie o spirtieră, stative pentru eprubete, medii
4. Puroiul de cultură diverse (agar-sânge, Lowenstein, Sabouraud etc);
• există numeroase condiţii clinice în care apar supuraţii (superficiale sau profunde) iar • dacă LCR urmează a fi transportai, transportul trebuie să se facă cât mai rapid şi la o
tehnica de recoltare variază în funcţie de „originea" puroiului (arsuri şi plăgi suprain- temperatură apropiată de temperatura corpului uman (în nici un caz la +4°C; atât
fectate, abcese, flegmoane etc); Haemophilus influenzae cât şi Neisseria meningitidis, agenţi etiologici recunoscuţi ai
• este recomandat ca pentru recoltare să folosim tampoane cu vată sterile numai în cazul meningitelor bacteriene sunt distruşi prin refrigerare);
în care nu avem o altă soluţie; • un al motiv în favoarea unui transport şi o prelucrare foarte rapidă a LCR este
• puroiul poate fi recoltat cu ansa bacteriologică, pipeta Pasteur, prin biopsiere, cliiu- reprezentat de studiul citologic al p.p. şi mai precis de numărarea leucocitelor polimor-
retare sau, atunci când este vorba de colecţii profunde, prin puncţie şi aspirare; fonucleare care încep să fie distruse în număr semnificativ încă din primele 30-60
• în special pentru situaţiile în care vom recolta p.p. dintr-o colecţie profundă, colabo minute după recoltare.
rarea între clinică şi laborator trebuie să fie foarte bună; 9. Secreţii recoltate de la nivelul aparatului genital
• atunci când suspicionăm o infecţie cu microorganisme anaerobe sunt necesare
» există mai multe tipuri de secreţii care tu- putea fi recoltate în funcţie de manifestarea
pregătiri speciale şi cel puţin utilizarea seringii care se „închide" cu dop (vezi mai sus);
clinică; în materialul de faţă vom discuta doar o parte dintre acestea;
există germeni anaeobi care pot fi distruşi în câteva secunde de contact cu oxigenul;
• în cazul secreţiei uretrale, la bărbat
o transportul către laborator se va realiza utilizând medii de transport sau containere spe
ciale (pentru asigurarea anaerobiozei); p.p. trebuie să fie prelucrat în 1-2 ore. * recoltarea p.p. trebuie să se facă dimineaţa, înainte de micţiune, sau la cei puţin 2
ore după aceasta; în cazul în care pacientul nu se prezintă dimineaţa şi nu este
5. M ateriile fecale (vezi capitolul 28) respectată condiţia de mai sus iar după 2 ore de la micţionare secreţia este în can
6 . U rina (vezi capitolul 29) titate prea mică, îi vom recomanda să consume cât mai puţine lichide în restul zilei
7. Sângele (vezi capitolul 31) şi să revină în dimineaţa următoare, înainte de micţiune;
8. Lichidul cefalo-rahidian * sunt necesare tampoane de vată sterile (un tampon pentru examenul microscopic şi
• se recoltează în cazul suspicionării prezenţei unui sindrom meningeal, după exami al doilea pentru cultivare) sau, alternativ o ansă bacteriologică sterilă; este reco
narea fundului de ochi (verificăm presiunea în artera centrală a retinei, semne de stază' mandabil ca ansa să aibă firul şi bucla de platină (sau ar putea fi o ansă bacterio
logică de unică întrebuinţare)
papilară);
* se observă penisul şi .meatul urinar precum şi dacă există secreţie uretrală
• suspiciunea este ridicată de medicul de specialitate (boli infecţioase, neurologie, medi
cină internă etc) iar recoltarea se va face la patul bolnavului de către medicul care are * dacă există secreţie uretrală, aceasta este recoltată cu tamponul (sau cu ansa);
competenţa de a executa această manevră (ex. prin puncţie lombară); * în cazul în care nu se evidenţiază secreţie uretrală în mod spontan, cu mâna prote
« tehnicile de asepsie trebuie să fie riguroase în toate situaţiile, dar în cazul recoltării jată de o mănuşă de latex, exprimăm uretra utilizând degetul mare şi indexul şi
LCR atenţia trebuie să fie şi mai sporită; recoltăm secreţia care apare;
• chiar dacă acest manual de lucrări practice se adresează numai infecţiilor bacteriene şi « dacă nici prin această manevră nu putem obţine p.p. vom recurge la recoltarea
fungice, trebuie să privim lucrurile în ansamblul lor şi drept exemplu, să nu uităm că intrauretrală cu tamponul (sau cu ansa);
există meningite infecţioase şi meningite neinfecţioase iar meningitele infecţioase pot * în acest scop sunt necesare tampoane de dimensiuni mai mici, preferabil din algi-
fi fungice, bacteriene, parazitare, virale, prionice; în plus, pentru elucidarea etiologiei nat de calciu (sau dacron în suspiciunea unei infecţii cu Chlamydia spp. sau
32 ______________________ Diagnosticul de laborator înmicrobiologie J PREPARATE MICROSCOPICE, FROTIURI
/ • SI PRINCIPALELE COLORAŢII
Mycoplasma spp.); după introducerea blândă, pe circa 2 centimetri lungime şi UTILIZATE ÎN MICR0BI0L0GIE
rotirea intrauretral a primului tampon, al doilea tampon va fi inserat cu aproxima
tiv 1 centimetru mai profund; •/■■■, ■■■ ... t -ş; L,. ţi; ■ ■c
• în suspiciunea de gonoree se recomandă cultivarea imediat dupărecoltâre pe medi
ul de cultură încălzit la 37°C; în cazul în care acest lucru nu se. poate realiza, tam Microorganismele studiate au dimensiuni foarte mici, de ordinul micronilor, astfel încât
ponul cu p.p. va fi transmis laboratorului în mediu de transport (ex.; mediul Amies pentru examinarea lor este necesară o mărire de circa 1.000, aşa cum vom discuta şi în capi
cu cărbune activat pentru Neisseria gonorhoeae sau alte variante-pentru (j/xIdfiyciiq^ tolul următor. Există diferite tehnici prin care se poate pune în evidenţă prezenţa unor
spp. sau Mycoplasmaspp. ) . , î ..fu-, r/'â-î microorganisme însă, de mare utilitate este examenul microscopic care se poate adresa unor
preparate microscopice proaspete (umede, între lamă şi lamelă) sau unor frotiuri fixate şi
• în cazul secreţiilor cervicale, la femei Ai •.•••nVm. . .:k i .âşnu., f ii.. ; , ., ...•
colorate în funcţie de suspiciunea diagnostică, p.p. examinat etc.
• recoltarea se va face preferabil în 1primele-10 zile după ciclul menstruali pe masa
în schema generală de diagnostic microbiologic (direct) vom examina microscopic pro
ginecologică, după introducerea valVelor ginecologice şi exăminarelf vizuală a
dusul patologic (etapa a 2-a) sau colonia apărută pe mediul de cultură (etapa a 4-a, punctul
vaginului şi colului uterin; • ’-.t-;;,»/. i r \ ' . r '* vr .,.: >
b, identificarea pe baza caracterelor morfotinctoriale).
o dacă se remarcă o‘ secreţie purulerttă, cti ajutorul unor comprese'sterile se înde
Uneori examenul microscopic este decisiv pentru diagnostic, alteori are un rol orienta
părtează secreţia de la nivelui colului extern; '■■■ ' , => .« -
tiv, însă, chiar din al doilea an de studiu ar fi bine ca viitorii medici să înţeleagă, reţină şi
• folosim 3 tampoane sterile introduse şi rotite uşor 1-2 centimetri în colul uterin (2 ulterior să aplice cele învăţate, indiferent de specialitatea pe care o vor urma.
dintre tampoane le vom Utiliza pentru frotiuri Gram şi Giemsa, iar al treilea pentru
cultivare procedând aşa Cum am menţionat mai sus). Preparate microscopice proaspete (umede, native, între lamă şi lamelă)
10. Diferite p.p. recoltate în suspiciunea unor infecţii fungice • este de preferat să folosim lame şi lamele noi supuse următoarelor proceduri succesive
• în infecţiile fungice, în funcţie de localizare se pot recolta p.p. foarte variate; (imersare în amestec sulfo-cromic câteva zile, spălare, clătire, păstrare în alcool 50%);
• spre exemplu, în micozele cutanate superficiale • lamele se usucă (folosim o cârpă curată) apoi se degresează suplimentar prin Hambare
(trecere de câteva ori prin flacăra becului Bunsen);
j «după antiseptizarea leziunii cu alcool medicinal (70°) raclăm tegumentul şi uti-
I lizăm pentru examinare scuamele produse; ' • depunem pe lamă o picătură din produsul care urmează a fi studiat;
« atât scuamele cât şi alte structuri (fire de pâr, fragmente de unghie etc) se împa • dacă produsul patologic are consistenţă lichidiană (ex. urină, sediment urinar, ma
chetează în hârtie sterilă care se introduce într-o cutie Petri şi se trimite pentru pre terii fecale, LCR, serozitate din şancru presupus sifilitic etc) va fi utilizat ca atare;
lucrare şi examinare în laborator (în maxitn 48 de ore). penU-u o mai bună vizualizare putem adăuga albastru de metilen, lugol, tuş de
• în micozele profunde, în funcţie de localizare India, nigrozină etc;
• dacă cultura este realizată în mediu lichid (ex. pentru Leptospira spp.) se va utiliza
• recoltăm p.p. şi îl transmitem către laborator având grijă să prevenim deshidratarea
ca atare;
produsului; ,
• dacă vrem să studiem spre exemplu mobilitatea microorganismelor care au format
• se recomandă prelucrarea şi examinarea imediată (unii fungi sunt fragili; este, de
colonii pe un mediu solid vom descărca o ansă din colonie într-o picătură de soluţie
dorit să putem evalua situaţia fungilor foarte aproape de momentul recoltării pen
salină fiziologică, apă distilată sau bulion;
tru a putea înţelege care a fost situaţia in vivo); ■
• dacă p.p. este recoltat într-o suspiciune, de micoză superficială, pe lama de micro
• iar în caz contrar adăugăm penicilină, streptomicină şi cloramfenicol pentru
scop se va depune o picătură dintr-o soluţie, 10-20% KOH-glicerol în care se va
inhibarea multiplicării bacteriene şi menţinem pip., la ,+4°C (supravieţuirea la
descărca şi dispersa p.p; , i
această temperatură depinde de fungul implicat şi poate varia de la ore la 2 /săp-
_ fămâni, aşa cum se întâmplă în cazul unor fungi dimorfij.' " " l'" ' 1/ • dacă vrem să studiem aspectul fungilor filamentoşi (mucegaiuri) dintr-o colonie,
pe lamă se va depune o picătură de soluţie lactofenol-albastru coton în care vom
Aşa cum am menţionat, datele prezentate nu cuprind toate posibilităţile şi variantele. Am
descărca un fragment din periferia coloniei respective;
încercat să dăm doar câteva exemple care sunt orientative. Pentru cei interesaţi există ma
nuale dedicate exclusiv recoltării şi transportului produselor patologice, în microbiologic. • acoperim picătura cu o lamelă;
Pentru trei dintre p.p. am ales o altă modalitate de prezentare. Recoltarea urinii, materii . • cel mai frecvent presăm uşor lamela pentru a elimina eventualele bule de aer;
lor fecale şi sângelui va fi discutată în partea specială. ‘
Diagnosticul de laborator în microbiologie Preparate microscopice, frotiuri şi principalele coloraţii utilizate în microbiologie 35
34
• în cazul p.p. recoltat într-o suspiciune de m icoză’superficială, încălzim uşor • Şupă ce am flambat lama, o aşezăm cu partea.flambată în sus; :
preparatul prin trecere cu grijă, de 2-3 ori, pe deasupra 'flăcării becului Bunsen; • cu ajutorul flaconului cu picurător sau.cu ansa bacteriologică sterilizată şi.răcită
®dacă vrem să studiem aspectul fungilor filamentoşi (mucegaiuri) dintr-o colonie, depunem în centrul iamei o picătură deşoluţie salină fiziologică sau. apă distilată;
nu trebuie să mişcăm sau să presăm lamela; • sterilizăm ansa bacteriologică şi aşteptăm să se răcească; , . '
• în microscopia optică pe câmp luminos aşezăm preparatul pe platina microscopului şi ;.-w , • pfelpvăm aşeptic.R.p./un fragmenţ din colonie şj depunem produsul în picăţura de
examinăm iniţial cu obiectivul 10, apoi cu obiectivul -20 sau4 0 (de regulă nu folosim v fluid de pe lamă; .... .
obiectivul de imersie);: se pot folosi.şi alte tehnici microscopice. "-ţ n,Ţi iu tu; , - * omogenizăm foarte Jbine p.p./fragmenţul de colonie îri picătura de fluid;
• procedăm ca mai sus pentru întinderea, uscarea şi fixarea frotiului;
Frotiuri (preparate microscopice fixate şi colorate) u' ■
• Executarea amprentelor de organ/alte p.p.
Structura peretelui microbian determină 9 .anumită, afinitate faţa de coloranţi, ceea ce • flambăm lama; ' '•> • t *■•••» •• s ,
permite examinarea şi diferenţierea bacteriilor sau fungilor în frotiuri,. . ' f ţ•
• cu partea flambată atingem suprafaţa de secţiune a organului respectiv;
• frotiurile se pot realiza pornind de la produse patologice (recoltate de ja om sau de la • lama se poate aplica şi pe suprafaţa de secţiune a unor prelevate bioptice sau
animale de experienţă) sau din cultura microbiană (în mediu lichid sau solid); . obţinute prin necropsie;
• frotiul trebuie întins în strat cât mai subţire (preferabil în unistrat) : u • procedăm ca mai sus pentru uscarea şi fixarea frotiului.
u este de preferat să folosim lame şi lamele noi supuse următoarelor proceduri succesive
(imersare în amestec sulfo-cromic câteva zile, spălare, clătire, păstrare în alcool 50%) Colorarea frotiurilor ‘ 1 <
• lamele se usucă (folosim o cârpă curată) apoi se degresează suplimentar prin flambate
Există foarte numeroase metode de colorare a frotiurilor. Dintre acestea vom prezenta
(trecere.de câteva ori prin flacăra becului Bunsen) ' . . . . . . ... ■
doâr câteva dintre coloraţiile folosite mai frebveht.
• Executarea frotiurilor din p.p. cu consistenţă fluidă sau din culturi microbiene
în vederea colorării avem nevoie de o trusă pentru colorare (stativ de colorare, coloranţi
realizate în mediu de cultură l i c h i d ------- -r—
conform „reţetei" de colorare, apă distilată sau apă curentă pentru spălare, stativ de uscare).
/• după ce am flambat lama, o aşezăm cu partea flambată în sus
Pentru colorarea frotiurilor din produs patologic folosim cel mai frecvent coloraţiile
I • sterilizăm ansa bacteriologică şi aşteptăm să se răcească .'i cu albaştrii de metilen (A.Mlj, Giemsa^ Gram şi după caz’, Ziehl-Neelsen, jn funcţie de'sus
« prelevăm aseptic p.p./cultură şi depunem produsul în centrul lamei piciunea diagnostică şi p.p. examinat se pot folosi şi alte coloraţii (de ex. coloraţia Gimenez
• întindem prin mişcări de „dute-vino" (de ,,haşurare“) pe axul lung al lamei pro pentru depistarea rickettsiilor pe amprente de organ de la animale infectate, experimental sau
dusul prelevat, în strat cât mai subţire, având grijă să nu ne apropiem de mar coloraţia.'^‘albastru de toluidină pentru evidenţierea Pneumocystis cătinii).
ginile lamei/întinderea se poate face şi prin mişcări circulare, excentrice; în cazul multora dintre coloraţiile uzuaie au fost realizate diferite modificări îp funcţie de
• lăsăm lama să se usuce lângă becul de gaz (nu grăbim uscarea prin eventuale experienţa autorilor şi scopul urmărit. De ex. coloraţia cti Ă.M poate avea următoarele variante:
treceri ale frotiului prin flacără) - în cazul în care avem în dotare un dispozitiv • albastru de metilen Loffier pentru cele mai multe coloraţii simple sau ca un al doilea
în care lama se poate aşeza şi usca la +70°C, vom utiliza această metodă; colorant în coloraţia Ziehl-Neelsen; C jP -
• fixăm frotiul; există metode chimice de fixare, însă cel mai frecvent folosim; • albastru de metilen policrom pentru evidenţierea Bacillus anthracis în p.p., pentru
fixarea prin căldură, distrugând în acelaşi timp şi microorganismele (care pre corynebacterii sau înlocuind coloraţia de mai sus;
zintă o afinitate tinctorială mai mare decât celulele vii); . • albastru de metilen (varianta Wayson) pentru p.p., cu o sensibilitate mai bună decât
• în acest scop, trecem frotiul prin flacără (aşa cum am procedat şi pentru flambareji . ., , .utilizarea A.fyl. Loffier etc. ~~ , .
lamei, înainte de executarea frotiului) însă de această dată partea pe care am întins în cursul lucrărilor practice precum şi în manualul de faţă se va. discutamumai, câte o
p.p. sau cultura este orientată în sus; ca o modalitate de control, atingem dosul variantă cu referire la principalele.coloraţii folosite în microbiologie. Cei interesaţi .au la.dis-
mâinii cu lama flambată, iar temperatura atinsă prin flambare nu trebuie să fie mai poziţie pentru studiu un bogat material teoretic iar după încheierea antrenamentului perso
mare decât pe care o putem suporta; j nal în ceea ce priveşte realizarea de frotiuri şi coloraţii, fiecare va putea alege o variantă,
• frotiijl fixat este gata pentru colorare; , ! % aplicabilă în funcţie.de situaţie. 1 ’
• Executarea frotiurilor din p.p. cu consistenţă solidă sau din culturi microbiene Pentru colorarea frotiurilor obţinute din cultură vom folosi în special coloraţiile Gram,
realizate în mediu de cultură solid Ziehl-Neelsen şi alte coloraţii specifice, după caz (coloraţii pentru cili, capsulă, spori etc).
36 ■ Diagnosticul de laborator în microbiologie
/ Preparate microscopice, frotiuri şi principalele colora)ii uim-cuic m micr 37
o diluăm într-un recipient fucsină (9 părţi apă distilată/!, parte, fucsină); • acoperim lama complet cu o hârtie de filtru decupată în acest scop;
• acoperim frotiul cu violet de, metilsau criştal yiolet (violet de genţiană din puncfcle, vedere • picurăm soluţie de fucsină fenicată Kinyoun până când hârtia de filtru se îmbibă com
istoric), pentru J_-3 minute (nu are rost să acpperirtîcu CQlorantlamaîn,întregime); plet şi aşteptăm 5 minute;
• îndepărtăm hârtia de filtru;
®îndepărtăm colorantul; şj,,r. îwf»»*>{* t,, .n.U*s i,;«:r ■ ou: ;
« acoperim frotiul cu lugol (mordant, fixator):pentru*£-3'minute; ma.o.H-.m vt$ • spălăm insistent cu apă distilată sau apă de la robinet;
• îndepărtăm lugoliil;:1 <• v. ...u.q M -w C tu w v 'A V i ; !<u:n<v<i u .-li.•••(, o ', u v -><:î»; acoperim lama cu amestecul decoloram acid-alcool pentru circa 30 secunde;, vărsăm
• acoperim frotiul cu un amestec de alcooj-acetonăjl parte âcetonă/3 părţi alcool de amestecul decoloram şi repetăm operaţia pentru încă 30 secunde
■if;96°) pentar un timp foarte scurtj^-8 secunde; j'/.v/J vŢTÎămĂ uunliraiî U*:-*«wrfî / r • spălăm insistent cu apă distilată sau apă de la robinet;
® spălăm insistent cu:ăpătdiStilată săti'apă'de lă'robineti ‘ vţri J jlfa.t/i.u • acoperim frotiul cu albastru de metilen, pentru 1 minut (nu are rost să acoperim cu co
• acoperimfrotiul cu fucsina diluată l/ld pentru' I m inut;'
.iP.i.u,;* 1- 7, - ,0, 1,x V^TTli.'. .'.j—-n: ■i-v.: i'!n'.;' MV CVj.i 7
......... . ,
<; luni
lorant lama în întregime);
• şpălătn cu apă distilată sau apă de la robinet; i,;,,,;,. -j> i' jr /i m , • spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet;
. ,-i, •; aşezăm frotiul în .stativ pentru uscare.(de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare • aşezăm frotiul în stativ pentru uscare (de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare
■: cu, sugativă sau hârtie de,.filtru; ■) . cu sugativă sau hârtie de filtru;
• examinăm la microscop, notăm observaţiile, interpretăm.
Iis
JJl
’ll
ill
'li
Ml. 38 Diagnosticul de laborator în microbiologie
'
Tehnica examenului microscopic în diagnosticul microbiologic 41
40 Diagnosticul de laborator în microbioiogie
celulelor fagocitare (levuri colorate în roşu), incluziuni de Chlamydia trachomatis Pentru a evita reflexia totală a razelor, înainte ca obiectul să fie luminat, acesta este imer-
(corpusculii reticulaţi apar albaştri, corpusculii elementari apar roşii) etc; sat într-o peliculă de lichid (lichid de imersie cu indice de refracţie mai ridicat, ex. gliceri
na). Lamele trebuie să aibă grosimea de 1 milimetru (distanţa focală a condensatorului fiind
• frotiu colorat Gram;
1,2 milimetri).
• în cazul în care frotiul a fost realizat din cultură purăputem vizualiza micro--
organisme cu aceeaşi formă, aceleaşi dimensiuni (excepţie Prbteus spp:), o anu Tehnica de examinare v .
___
mită dispoziţie, cu sau fără capsulă (halou necolorat), grarb pozitive (colorate în
violet)jjau gram negative (colorate în roşu), levurile se colorează în violet; După centrarea diafragmei de câmp folosind obiectivul cu mărire 10x şi condensatorul
• în cazul în care frotiul a fost realizat din produs patolojic putem vizualiza celule pentru câmp luminos, trebuie să înlocuim acest condensator cu condensatorul cardioid.
diferite (în funcţie de sediul recoltării) şi celule inflamatorii pentru care nucleul şi Condensatorul cardioid este cu diafragma închisă. Ridicăm condensatorul până la nivelul
citoplasmă apar în diverse nuanţe de roşu, bacterii gram pozitive şi/sau gram nega platinei microscopului şi punem pe lentila condensatorului o picătură de glicerină.
tive, fibrină şi levuri care se colorează în violet etc; 1 ! Pregătim preparatul proaspăt (între lamă şi lamelă) şi îl plasăm pe platina microscopului
• frotiu colorat'Ziehl-Neelsen sau Kinyoun/putem vizualiza: bacili de culoareîoşie, re astfel încât să vină în contact cu glicerina de pe lentila condensatorului. Fixăm preparatul cu
ajutorul „cavalerilor". . . .
lativ fini (în cazul prezenţei BA'AR), alte bacterii (ne-AÂR) ' celule djferite (în funcţie
de sediul recoltării) şi celule inflamatorii de culoare albastră (toate structurile ne-AAR Examinăm iniţial cu obiectivul 10x, apoi cu obiectivul 40x coborât până aproape de
apar colorate albastru) etc; în cazul colorării unui frotiu din cultură pură vom evidenţia suprafaţa lamelei; punem la punct imaginea cu ajutorul microvizei. Când obţinem imaginea
numai bacili de culoare roşie. ■-J curgerii curentului de lichid ştim că am „prins" câmpul microscopic. Utilizând mai departe
microviza punem la punct detaliile şi apoi înregistrăm ceea ce am examinat.
întreţinerea microscopului Examinarea la microscopul cu fond negru este indicată în mod special pentru exami
narea morfologiei şi mobilităţii pentru Treponema pallidum în serozitatea din şancrul sifili
După terminarea examenului microscopic trebuie efectuate următoarele proceduri:
tic sau pentru Leptospira spp. în produs patologic (ex. urină) sau din medii de cultură.
• închidem sursa de lumină; • lichidul clar recoltat şi şancrul sifilitic trebuie examinat în maxim 20 minute după
• ridicăm cu ajutorul macrovizei tubul microscopului; recoltare; putem vizualiza spirochete luminoase, fine, lungi, cu spire regulate, capete
• coborâm condensatorul; ,• efilate, cu mişcări de înşurubare, flexie, translaţie, pe fond negru;
• scOatem lama (sau lama şi lamela) de pe platina microscopului; • în preparatul proaspăt care conţine leptospire putem vizualiza filamente luminoase, spi
o preparatele proaspete le punem în borcanul cu amestec dezinfectant; ralate, foarte mobile, cu mişcări de înşumbare şi flexie, pe fond negru.
• preparatele fixate (pe care urmează să le păstrăm) se introduc într-un container cu
xilol (1-2 minute) apoi, după evaporarea xilolului se pun într-o cutie; Microscopul cu contrast de fază
• ştergem lentila obiectivului cu imersie cu pulpa degetului sau cu o hârtie moale, spe Pentru acest tip de examinare este necesar să avem în dotarea microscopului o serie de
cială, pentru a o curăţa de uleiul de cedru (periodic, vom şterge lentila acestui obiec piese strict necesare, respectiv: un condensator special care include o serie de diafragme
tiv cu un tifon foarte curat îmbibat în xilol); inelare, obiective de fază (de fapt obiective obişnuite la care în planul focal superior a fost
• curăţăm platina microscopului şi lentila condensatorului cu tifon curat îmbibat în xilol; montată o placă de fază; obiectivele de fază sunt gravate cu ,,Ph“), oculare de centrare,
• acoperim microscopul cu o husă de plastic sau pânză, pentru a-1 feri de praf; , lampă cu intensitate luminoasă mare, filtru verde.
• pentru a preveni efectul nedorit al multiplicării unor fungi asupra sistemului optic, (o Folosind microscopia cu contrast de fază este posibilă observarea obiectelor transparente
recomandare ar fi menţinerea microscopului într-un ambalaj de polietilenă împreună care prezintă variaţii de grosime sau variaţii ale indicelui de refracţie în structura lor. Sunt
cu o substanţă desicantă, spre exemplu silicagel. . c m: utilizate preparate microscopice proaspete. Faptul că aceste preparate nu sunt fixate şi co
lorate permite examinarea unor caracteristici care ar putea fi alterate în cursul acestor pro
Microscopul cu fond întunecat (negru). '. I cese. Se pot examina structuri citoplasmatice, morfologia celulară, dar şi structuri bacteriene
sau fungice.
Pentru acest tip de examinare este utilizatun microscop optic obişnuit la care se adap
tează o sursă de lumină cu intensitate mare şi un condensator cardioid (cu oglinzi sferice
Microscopul cu fluorescentă
concentrice), cu posibilităţi de diafragmare a luminii. Condensatorul pentru câmp întunecat
(fond negru) opreşte accesul spre obiectiv al razelor de lumină directe, iar obiectul este ilu Microscopul cu fluorescenţă trebuie să fie dotat cu următoarele piese speciale: sursa de
minat oblic. Astfel o pane dintre razele difractate şi reflectate de obiectul iluminat oblic radiaţii (de ex. o lampă din sticlă de cuarţ cu vapori de Hg care emite radiaţii ultraviolete),
pătrund în obiectiv careapare luminos pe fondul întunecat al câmpului. setul de filtre (caloric, de excitaţie, de baraj), condensatorul pentru fond întunecat.
44 Diagnosticul de laborator în microbiologie
Filtrele au următoarele roluri. Filtrul caloric absoarbe radiaţiile calorice emise de lampă MEDII DE CULTURA
(sursa de radiaţii emite atât radiaţii ultraviolete cât şi radiaţii luminoase şi calorice). Filtrele
de excitaţie permit numai radiaţiilor cu lungime de undă mică (ex. ultraviolete) su acceadă
către preparatul microscopic. Aceste radiaţii reprezintă radiaţii de excitaţie. Filtrele de baraj
sunt de fapt filtre de protecţie pentru că nu permit trecerea radiaţiilor de excitaţie nocive să
treacă spre ocular şi respectiv spre ochiul examinatorului, în
rocromi trece şi poate fi percepută. Filtrele de excitaţie şi de baraj sunt alese în funcţie de
Populaţia = o multitudine de indivizi ai unei specii care habitează într-un anumit
fluorocrcţinul,Utilizat. M. , r :;Fj Ţ .;; v.i.ifi x»t :ţî<’«v-y. tîfi' biotop. Clona reprezintă populaţia care rezultă dintr-o'singură celulă prin înmulţire
Condensatorul măreşte contrastul imaginii mai bine decât un condensator obişnuit. •••
vegetativă. Tulpina = populaţia microbiană alcătuită din descendenţii unei singure
Pentru examinarea În fluorescenţă mai suht.hecesare câteva elemente, respectiv obiec izolări în cultură pură.
tivele acromate (cu menţiunea că obiectivul cu imersie trebuie să aibă diafragmă iris), uti-
1izarea unui lichid‘de imersie care nu se usucă1uşor, şi•este lipsit; de proprietatea de fluo în funcţie de temperatura de dezvoltare, microorganismele pot fi mezofile, psi-
rescentă (ex. glicerina tamponată neutră) şi respectiv lame cu grosimea de ^milimetru. Este chrofile sau termofile. Bacteriile studiate de microbiologia medicală sunt în imensa
preferabilă utilizarea unui dispozitiv monocular, . lor majoritate mezofile (au temperatura optimă 'de dezvoltare cuprinsă între 30-
37°C). Pentru fungi, temperatura optimă de dezvoltare este în jur de 28°C.
Examinarea folosind microscopul cu fluorescentă Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecţii trebuie ca dintr-un produs
Preparatele microscopice (care pot include bacterii) sunt tratate cu flurocromi (coloranţi
recoltat de la pacient să obţinem mai întâi respectivul microorganism în cultură pură,
fluorescenţi). Fluorocrbmii sunt compuşi organici care, după „iradiere" cu radiaţii ultravio pentru ca ulterior să i se poată studia caracterele fenotipice sau genotipice. Cultivarea
lete absorb radiaţia excitantă, intră în stare de excitaţie, iar atunci când revin în „starea nor este esenţială şi pentru determinarea sensibilităţii la antibiotice şi,chimioterapice.
mală" pierd energia acumulată emiţând radiaţii luminoase. Dintre fluorocromi ani putea Metodele de cultivare a bacteriilor sau fungilor urmăresc trei obiective: obţine
aminti auramina O, rhodamina B, acridin-oratij R sau tripaflavina. Lumina vizibilă emisă rea unei populaţii microbiene suficiente cantitativ pentru investigaţiile propuse, pre
depinde de fluorocromul utilizat (spre exemplu culoarea este galbenă pentru auramina O, venirea contaminării produsului cercetat cu un microorganism, străin şi izolarea
gaiben-portocalie pentru combinaţia de auramina O - rhodamină B etc).
fiecărei tulpini microbiene urmărite în cazul unui produs plurimicrobian în culturi
Sun/de menţionat în mod special acele substanţe care se pot legă covalent de anticorpi, monomicrobiene denumite „culturi pure". Nu există un mediu unic, valabil pentru
marcând astfel complexele antigen-anticorp care devin fluorescente. Atunci când marcajul
cultivarea oricărui microorganism.
se realizează cu izotiocianat de fluoresceină lumina emisă va avea culoare verde, iar dacă
marcajul se realizează cu lisamin-rhodamină, lumina emisă va avea culoare portocalie. Termenul „însămânţare" defineşte operaţia de introducere a unei cantităţi de ger
Drept exemplu privind utilizarea microscopiei cu fluorescenţă vom menţiona exami
meni într-un mediu de cultură artificială, în timp ce pentru culturile celulare, ouă
narea fiotiurilor colorate fluorescent sau imunofluorescent în diagnosticul bacteriologic al embrionate şi mai ales animale de experienţă folosim termenul „inoculare".
tuberculozei sau al leprei.,Alte exemple vor fi prezentate în cadrul capitolului 20. Cultivarea se realizează prin însămânţarea microorganismelor pe medii de cul
tură. Mediile solide sau lichide care asigură nutrienţii şi condiţiile fizico-chimice
necesare creşterii şi multiplicării se numesc medii de cultură. Totalitatea microor
ganismelor acumulate prin multiplicarea într-un mediu de cultură poartă numele de
cultură (bacteriană, fungică etc).
••• . ' î • "••• , . ' ••• i • \ ) .'fii' :* *5?/
: î|î:Mî ,,
: ;■ ii- (:%,• A'*. '■\ V, '•*/ . f * *J: ; .. t;vşrf,' (/: -jj:
Există o foarte mare varietate de medii de cultură.
Mediile de cultură se pot clasifica după măi multe criterii. în primul rând, în
funcţie de conţinutul în celule vii avem la dispoziţie:
1. Medii necelulare (artificiale, medii de
f: i 2. Medii celulare (care includ celule vii) şi anume animale de laborator, ouă de
, j; găină embrionate sau culturi de celule.
Diagnosticul de laborator în microbiolcgie Medii de cultură
46 47
. Există anumite microorganisme (ex. virusuri, 'Rickettsii, Chlamydii) care nu pot Culturi de celule
fi cultivate decât pe substraturi care includ celule vii. Majoritatea bacteriilor, fungii
Există posibilitatea utilizării unor culturi de organ sau a culturilor de celule disper
şi unele protozoare se pot cultiva şi pe medii de cultură (necelulare, artificiale).
sate. Acestea din urmă se pot clasifica în culturi primare, tulpini celulare şi linii celulare.
Culturile primare derivă din dispersia enzimatică (de ex. cu tripsină-EDTA) a
Gazdele vii (medii celulare)
celulelor unui organ proaspăt recoltat şi pot fi menţinute in vitro pentru 3-5 pasaje.
Tulpinile celulare reprezintă culturi cu un singur tip de celule (culturi omogene) şi
Animalele de experienţă .. _ ...,, ,s
pot fi menţinute in vitro pentru 50-60 pasaje. Liniile celulare continue (stabile) sunt
Fie în situaţia microorganismelor care nu se dezvoltă pe medii artificiale, fie în populaţii celulare care derivă din ţesut normal sau malign şi pot fi subcultivate
cazul în care se studiază caracterele de patogenitate, se pot utiliza în funcţie de spe (respectând indicaţiile din protocol) în mod nelimitat. Au fost puse la punct foarte
cia microbiană şi scopul urmărit: şoarecele alb, cobaiul, şobolanul, hamsterul şi multe linii celulare spre exemplu:
iepurele. Pentru producerea de seruri imune sunt folosiţi, cai. Animalele de labora • linii celulare derivate din rinichi de maimuţă (Vero, BSC-1, BGMK etc),
tor necesită condiţii speciale de întreţinere iar biobaza trebuie, să respecte o serie de şoarece (McCoy), ovar de hamster (CHO);
norme care să garanteze calitatea acestor gazde vii. Astfel se explică costurile ridi • linii celulare derivate din carcinom de col uterin (HeLa), laringe (HEp-2);
cate în ceea ce priveşte acest,tip de „medii",,. . ,, . .. . . • lipii celulare limfoblastoide (MT-4, H9 etc) etc.
Având în vedere microorganismul inoculat, susceptibilitatea gazdei şi scopul Pentru Chlamydia trachomatis se pot utiliza liniile celulare BGMK, HeLa,
urmărit se pot inocula animale cu vârste diferite (embrioni, nou-născuţi, animale tinere, McCoy, pentru Chlamydia pneumoniae se pot utilizat liniile celulare HeLa, HEp-2,
adulţi) pe căi diferite de inoculare (per cutanat, prin scarificare, subcutanat, instilare la pentru Chlamydia psittaci se poate utiliza linia celulară McCoy etc. Liniile celulare
nivelul anumitor mucoase, per os, intramuscular, intravenos, intrateşticuiar etc). pot fi utile şi în vederea studierii efectului unor exotoxine, spre exemplu în cazul
Aşa cum, spre exemplu, virulenţa Mycobacterium tuberculosis scade pe măsură toxinelor produse de E. coli 0157:H7 şi respectiv de Shigella shiga se poate utiliza
ce microorganismul este cultivat pe anumite medii de cultură (aspect dovedit şi prin linia celulară Vero în timp ce pentru toxinele produse de Vibrio cholerae şi E. coli
obţinerea'tulpinii vaccinale BCG.deM. tuberculosis varianta bovis), în sens invers, '!# entero-toxigen se poate utiliza linia celulară CHO.
este necesară uneori exacerbarea virulenţei, prin pasaje repetate realizate pe gazde
susceptibile. Alte exemple pot fi discutate în raport cu Streptococcus pneumoniae, M edii artificiale (neceluiare)
Shigella spp., Klebsiella pneumoniae, Treponema pallidum, Rickettsia spp.,
Mediile de cultură artificiale sunt mai ieftine, se pot prepara mai uşor (folosind
Chlamydia spp şi Candida spp. , < . reţete foarte asemănătoare celor „de bucătărie" sau alte variante despre care vom
Oul de găină embrionat discuta pe scurt în continuare) şi, fără a fi „ideale", sunt cel mai frecvent utilizate în
practicat microbiologică.
Are avantajul unui preţ mai scăzut, este în mod normal steril (în condiţiile pro
Condiţii impuse mediilor de cultură artificiale:
ducerii acestor „gazde vii“ în unităţi specializate), nu prezintă factori antimicrobi-
eni în perioada în care se realizează în mod obişnuit inocularea (la 6-14 zile de - să*!# sterile,
incubaţie). 1!\ ■>' ' ■ r. - să fie nutritive (să conţină factorii de creştere necesari),
Oul de găină este întâi examinat la ovoscop pentru evaluarea embrionului şi j - să aibă un anumit pH (cel mai adesea între 7,2-7,6),
prezenţei unor eventuale modificări nedorite. în ‘condiţii de strictă asepsie puljde/ - să aibă o anumită presiune osmotică,
găină embrionat se poate inocula intraembrionar (intramuscular, intracerebral,etc)/ - să aibă umiditatea favorabilă multiplicării germenilor
la nivelul membranei chorioalantoidiană, în sacul alantoidian sau în sacul amniotic,! - alte condiţii.
Oul inoculat se introduce în incubator, la 37°C în condiţii, de bună ventilaţie a aeru
Clasificarea mediilor de cultură artificiale
lui şi umiditate corespunzătoare, pentru 1 sau mai multe zile! Se poate utiliza
această metodă pentru izolarea şi identificarea tulpinilor rickettsiene (utilizând , Mediile de cultură artificiale se pot clasifica după o serie de criterii.
metode imunologice, ex . reacţia de microaglutinare).
("
I Medii de cultura 49
1
48 Diagnosticul de laborator în microbiologie
această temperatură adaugăm în proporţie de 5% sângele .defibri nat (sânge de Cary-Blair este un mediu de transport în special pentru germeni gram negativi.
berbec, cal, bou sau de iepure; sângele de om ar putea fi utilizat numai dacă nu Lowenstein-Jensen
există o altă posibilitate, folosind de exemplu sânge care a depăşit limita de vala
bilitate într-o bancă de sânge). Distribuim mediul în condiţii aseptice, în plăci Petri. Reprezintă mediul clasic utilizat în mycobacteriologie. Include 3 componente
Poate fi menţinut la +4°C până la 4 şăptărrţâpi.Ss , principale: o soluţie de săruri şi amidon, soluţia de verde malachit şi omogenizatul
de ouă (proaspete şi bine antiseptizate). După filtrare produsul se repartizează în
Agar-chocolat ! tuburi (cu capac înşurubat, ţinând cont de timpul lung de incubare, 2-8 săptămâni).
Mediul este coagulat în pantă, la 85°C şi după răcire se poate menţine la tempe
Procedăm ca mai sus, până la obţinerea amestecului de agar-sânge. Introducem fla
ratura frigiderului câteva luni, până la utilizare.
conul cu mediu în baie de apă şi menţinem timp de 10 minute la 80°C; astfel eritrocitele
vor elibera factorii nutritivi necesari dezvoltării unor. bacterii mâi pretenţioase din M ac Conkey
punct de vedere nutritiv. Când temperatura revine la 50°C turnăm mediul în plăci Petri. Este un mediu slab selectivo-diferenţial care include hidrolizat de gelatină,
Se poate conserva la temperatura frigiderului pentru nu mai mult de 4 săptămâni. hidrolizat de cazeină, lactozâ, săruri biliare, clorură de sodiu, roşu neutru (indicator
. ' . . . I
de pH), cristal violet şi agar, dizolvate în apă distilată şi autoclavate timp de 15
Amies minute la 121 °C. Poate fi menţinut la +4°C până la 4 săptămâni.
Include agar, tioglicolat de sodiu, cărbune farmaceutic neutru (pentru a facilita Medii pentru anaerobi
supravieţuirea microorganismelor fragile, de ex. Neisseria gonorrhoeae) şi o soluţie
tamponată de săruri anorganice. Nu conţine indicator redox. Este sterilizat prin Există mai multe tehnici pentru a asigura condiţiile de anaerobioză. Relativ
autoclavare şi poate fi menţinut la -f4°C timp de 12 luni. frecvent se utilizează montarea plăcii Petri, care conţine deja mediul de cultură răcit
şi însămânţat, răsturnată pe capacul propriu, pe care se găseşte un pliculeţ care
Este un mediu de transport care limitează şi multiplicarea unor eventuali coli-
conţine amestec reducător (pirogalol, talc, carbonat de potasiu). Utilizăm parafină
fonni de contaminare (ceea ce nu se realizează prin folosirea mediului Stuart).
/■: ■ • • încălzită pentru a etanşeiza placa. După solidificarea parafinei, mediul de cultură
Apă peptonată alcalină este incubat în vederea obţinerii coloniilor.
Este un mediu utilizat pentru transportul probelor în care se suspectează prezenţa Medii pentru fungi
Vibrio cholerae. Include peptonă şi clorură de sodiu dizolvate prin încălzire în apă Vom discuta pe scurt doar un mediu mai frecvent utilizat, respectiv mediul
distilată, cu ajustarea pH-ului la o valoare de 8,6-9,0. Mediul este repartizat în Sabouraud. Acesta include glucoză, digestie pancreatică de cazeină şi agar care se
tuburi. Sterilizăm prin autoclavare (15 minute, 121°C). Valabilitatea este de circa 6 dizolvă prin uşoară agitare, la cald, în apă distilată. După ajustarea pH-ului la 5,6
luni (la temperatura de 4°Q- urmează fierberea şi filtrarea mediului, la cald. Apoi are loc repartizarea în plăci
Petri sau în tuburi şi acestea se autoclavează timp de 15 minute la 12i°C. înainte de
Bulion selenit /- utilizare, plăcile cu mediu Sabouraud pot fi stocate la temperatura frigiderului pen
Este un mediu de îmbogăţire, utilizat pentru izolarea Salmonella spp. Include i tru circa 2 luni. De multe ori acest mediu devine selectiv prin adăugare de antibio
printre alte componente selenit acid de sodiu. Datorită riscurilor acest ipediu nu va 1 tice (cloramfenicol, gentamincină etc).
fi pregătit de femei însărcinate, iar cei care îl produc vor avea grijă să nu.inhaleze Despre mediile multitest TSI (triple sugar iron) şi MIU (mobilitate indol uree)
sau înghită această substanţă. Sterilizarea mediului turnat în tuburi se face în baia vom discuta în cadrul capitolelor 12 şi 28.
de apă la temperatura de fierbere şi nu prin autoclavare. Se poate conserva la tem Stuart
peratura frigiderului timp de 6 luni. j
Include agar, tioglicolat de sodiu, glicerofosfat de sodiu, clorură de calciu şi
Cary-Blair albastru de metilen, dizolvate prin încălzire la temperatura de fierbere în apă disti
.. ■_ ...» - /
Include agar,. tioglicolat de sodiu şi o soluţie tamponată de săruri anorganice, lată. Este sterilizat prin autoclavare şi poate fi menţinut la +4°C timp de 2-3 luni.
dizolvate (prin încălzire şi agitare) în apă distilată. Este sterilizat prin autoclavare şi Este un mediu de transport universal; bacteriile pot supravieţui 1-3 zile.
poate fi conservat la temperatura frigiderului mai multe luni.
O Tehnici de cultivare 53
nută în termostat, cu mediul în sus, întredeschisă, pentru evaporarea con logic se vor trasa linii (striuri) aproximativ paralele între ele, ca un „zig-zag“
densului! (fără a se ridica ansa de pe mediul de cultură) reprezentând o primă latură a
'• se sterilizează ansa bacteriologică la flacăra becului de gaz prin aducerea la unui pentagon deschis; ' 1
incandescenţă a buclei şi firului ansei urmat ,de flambarea portansei (trecere • se închide placa Petri;
prin flacără de 2-3 ori); •, p -vT.v ■■■ • ansa se sterilizează la flacără, portansa se flambează;
• se notează pe placa cu. mediu de cultură data! inoculării,, numărul de identifi • se răceşte ansa (se poate încerca răcirea ei prin atingere pe suprafaţa mediului
care ,şi tipul produsului (tipuţ produsului ppaţe- fi. inclus,printij-un simbol în solid steril, neînsămânţat, lângă peretele exterior al plăcii Petri);
numărul unic de identificare); j; , : .v . , ; ... -i . ..vi ... • fără să se mai încarce ansa cu produs patologic se trasează a doua latură a pen
• se iareprubeta.eu produs patologic în, mâna, stângă ,,(în;,cazul,în careTiind tagonului intersectând-o pe prima, tot ca „linii paralele", după care ansa se va
dreptaci, ansa bacteriologică este ţinută în mâna drgaptă, ca un creion), sp scoate steriliza din nou;
dopul eprubetei utilizând în acest scop degetele 4-5 de la . mâna (jlreapţă;. ' • se va proceda la fel ca mai sus şi pentru următoarele laturi având grijă să nu se
• atenţie: să nu se scape dopuldin mână = pericol de contaminare'a mesei unească ultima latură cu prima latură
delucru! ■ ■ ■ '■ - v '■ "Jl! o în momentul intersectării cu ansa a laturii precedente a poligonului, ansa
• atenţie: dopul nu trebuie strâns îii podul pâlniei = pericol de cbntâniinare! este „reîncărcată" cu microorganisme, dar în „cantitate" din ce în ce mai
i. ■, . : V 'liio : - i * n i 'V. •.-•îlltlj' - : mică, până ce se va ajunge la câteva celule microbiepe izolate care, disemi
• se flambează gura eprubetei (trecere prin flacără de 2-3 ori, imprimând o
• „ . , ■■ . ■... :• “ li.‘ i.■'.(';!?'■!;; >1. ‘ ym: •" nate pe placă vor da naştere la colonii microbiene izolate
uşoara mişcare de rotire m ambple sensuri);
• se introduce placa Petri pe care a fost realizată cultivarea în termostat, răstur
• se introduce ansa în eprubetă fără să se atingă gura sau pereţii acesteia în
partea superioară, se răceşte bucla pe pereţii eprubetei în vecinătatea produsu nată (cu mediul în sus şi capacul în jos), la temperatura optimă multiplicării
lui patologic şi se încarcă bucla ansei din profunzimea produsului patologic, microorganismului suspectat (pentru cele mai multe bacterii termostatul va fi
( reglat pentru o temperatură de 35-37°C, pentru fungi la 28°C);
recoltând fragmente care ar putea include cu o mai mare probabilitate bacterii
implicate în procesul infecţios (ex. porţiuni cu aspect purulent); • după o perioadă de incubare de 18-24 ore (pentru cele mai multe dintre micro
organismele studiate), pe prima latură se va obţine cea mai importantă canti-
• se scoate ansa fără sa atingem pereţii sau gura eprubetei;
tate de cultură (cultură microbiană confluentă), pe următoarele laturi se va
• atenţie: contaminarea pereţilor eprubetei în porţiunea în care se va,,mon- remarca „scăderea cantitativă" a culturii iar cel puţin pe ultima latură a „pen
ta“ dopul, va duce la contaminarea dopului şi respectiv la o mare probabili tagonului deschis" se vor obţine colonii izolate.
tate de contaminarea a celui care va utiliza ulterior eprubeta/tubul cu pro
Dacă mediul de cultură pe care s-a realizat cultivarea „în pentagon deschis" este
dus patologic! . 'i •/, neselecti v, coloniile izolate obţinute pot fi utilizate în etapele ulterioare (identificare
• se flambează gura eprubetei; ...... , , prin diferite metode, testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapiqe). în cazul
• se montează dopul la eprubetă printr-o mişcare de răsucire ce are ca scop ' în care cultura primară este obţinută pe un mediu selectiv, este obligatorie repicarea
fixarea lui; coloniilor izolate deoarece coloniile izolate vizibile pot fi asociate cu microorga
• atenţie: gura eprubetei poate fi fierbinte după flambare! -vrji. i;.;ifc;'-/î jj nisme inhibate datorită selectivităţii mediului, cate nu se văd cu ochiul liber sau cu
lupa şi care se vor multiplica pe mediile de identificare făcând Imposibilă inter
• atenţie: în toată această perioadă se contraindică efectuarea unor mişcărf
pretarea rezultatelor.
bruşte cu ansa încărcată cu produs patologic; mişcările bruşte şi'hecoritro|
late pot determina contaminarea cu produs patologic a mesei de lucru, a Tehnica descrisă este o tehnică de bază şi cu anumite modificări se poate utiliza
şi în alte situaţii (spre exemplu atunci când produsul patologic este recoltat în alte
mediului de lucru sau a celui care manipulează produsul patologic! •' /
tipuri de recipiente).
o după ce eprubetă a fost aşezată în stativ, m âna stângă eliberată va lua o placă
Petri pe care o va aşeza pe m asă cu capacul în jo s şi m ediul în sus;
® tot cu mâna stângă se va deschide placa iar cu ansa încărcată cu produs pato-
l
(
t
Diagnosticul de laborator în microbiologie Tehnici de cultivare 57
56
« bacterii pretenţioase (care necesită medii com plexe, îm bogăţite sau/şi • mediul este tulburat om ogen (ex. Staphylococcus spp.);
adăugarea în m edii a unor factori de creştere ex. Haemophilus influenzae); ® mediul este clar, cu depozit grunjos pe pereţi şi la baza tubului (ex. S. pyogenes);
» bacterii strict aerobe (Bordetella pertussis), aerobe facultativ anaerobe (E. ® mediul este clar, cu văl la suprafaţă (V. cholerae în apă peptonată alcalină);
coli, S. aureus, S. pyogenes etc), carboxifile (S. pneumoniae etc), m icro- © dezvoltarea culturii se realizează ca un „inel“ aderent de'pereţii tubului, la su
aeroftle (Campylobacter spp., etc), strict anaerobe (Clostridium spp.); prafaţa m ediului (ex. E. coli);
0 tem peratura optim ă de cultivare (20-30°C pentru. Listeria monocytogenes, © m ediul este clar cu dezvoltarea unei m em brane uscate, ia suprafaţă (ex.
42°C pentru Campylobacter jejuni, 3 5 -3 T C pentru m ajoritatea bacteriilor, Bacillus subtilis); *
28-30°C pentru unele levuri etc); ,
» mediul este clar cu apariţia unui depozit floconos aderent la baza tubului (B.
• intervalul de tim p pentru apariţia coloniilor izolate,rin funcţie ;de tim pul de anthracis); . i
generaţie; ■ : ‘ • mediul este clar, iar la suprafaţă se dezvoltă o m em brană groasă, plisată (M.
« 18-24 ore pentru m ajoritatea bacteriilor; | tuberculosis).
* 24-48 ore pentru m ajoritatea fungilor;
Aspectul culturilor pe medii solide
» săptăm âni pentru Mycobacterium tuberculosis etc; ., ,. .
• aspectul, consistenţa şi aderenţa coloniilor/culturii; , C ondiţiile de cu ltiv are şi aspectul culturii sunt caractere cheie în identificarea
o m odificările apărute pe m ediu în vecinătatea coloniilor/culturii etc. bacteriilor. Aspectul co loniilor variază în funcţie de m icroorganism ul im plicat, fără
a perm ite diferenţieri de specie definitive (dar au utilitate în contextul studierii
Exam inarea culturilor/coloniilor izolate este un proces foarte im portant, necesită
tuturor caracterelor); în anum ite cazuri sugerează diagnosticul, dar întotdeauna ori
cunoaşterea teoriei, m ult exerciţiu, atenţie şi experienţă. Pentru a obţine cele mai
entează spre alte testări necesare.
bune rezultate este necesară o bună ilum inare (preferabil lum ina naturală), iar ilu
m inarea ţnediuiui care urm ează a fi „citit“ se va face cel puţin şi în incidenţă oblică. T re b u ie să e x a m in ă m u rm ă to a re le elem en te:
Exam inarea se poate face cu ocfiiul liber (cel puţin iniţial) dar ar trebui com pletată
• d im e n siu n e a (coloniile pot fi'm ari, de peste 2 mm aşa cum se form ează în
cu exam inarea făcută cu ajutorul unei lupe sau a unui stereom icroscop pentru a
cazul Staphylococcus spp., K. pneumoniae etc sau în cazul ievarilor; medii, de
putea înregistra toate aspectele im portante şi pentru a putea sesiza apariţia colonii
circa 1-2 mm pentru m ulte dintre bacteriile studiate; m ici, sub 1 m m , spre
lor de dim ensiuni mici sau foarte mici. exem plu în cazul Streptococcus viridanS, etc şi foarte mici, care se pot exam i
na cu ajutorul stereom icroscopului, aşa cum se întâm plă în cazul Mycoplasma
A apnctui c u ltu rilo r p e m e d ii lich id e spp. sau Ureaplasma Spp.);
B acteriile şi fungii facultativ anaerobi se dezvoltă în toată m asa de lichid, tul- • m a rg in ile (regulate, neregulate, întregi, circulare, erodate, zim ţate, ondulate,
burându-1. B acteriile strict aerobe se dezvoltă preponderent la suprafaţa.m ediului..., lobate, filamentoa.se, acoperite cu miceliu pufos, invadând mediul în valuri etc);
Se acceptă că de obicei tulpinile care pe m ediile solide form ează colonii d e tip © fo rm a (punctiform ă, circulară, neregulată, dendritică, filamentoasă, lenticulară);
/ •
,,S“ tulbură om ogen m ediul (m ajoritatea bacteriilor) în tim p ce tulpinile care • reliefu l (plat, acum inat, convex, bombat, om bilicat, papilat);
form ează colonii de tip „R “ realizează o tulburare mai puţin om ogenă. „V ariantele » s u p r a f a ţa (netedă, um edă, lucioasă, m ată, uscată, granulară, rugoasă, papilată,
R“ pot lăsa mediul lim pede, form ând flocoane care se depun sau un strat (văl) ţâ zbârcită, m ucoidă, pufoasă etc);
suprafaţa mediului (de exem plu bacilul difteric sau bacilul. tuberculos). ' /
© c u lo a re a (pigm entate, pigm entarea este la nivelul coloniei, sau al mediului,
în urm a dezvoltării m icroorganism elor în medii de cultură lichide se mai pot nepignientaţe; acest caracter depinde de pigm enţii produşi sau/şi d e indicatori
rem arca şi pigm entogeneza (ex. Pseudomonas aeruginosa) sau utilizând simţul de culoare din m ediu);
olfactiv se. poate constata apariţia unui miros caracteristic (ex. un m iros de corn ars
« o p a c ita te a (transparente, sem itransparente, opace);
in cazul closlridiilor).
o consistenţa, a d e re n ţa la mediu (examinate de ex. cu ajutorul ansei bacteriologice);
Vom prezenta câteva exem ple, m enţionând că există şi variaţii dc la regulă:
va
64 Diagnosticul de laborator în microbiologie I s Examinarea caracterelor de cultură, metabolice, a altor caractere fenotipice 65
® a lte c a ra c te re , care vor fi prezentate în continuare. • apariţia coloniilor pufoase; spre exemplu pe m ediul Sabouraud, la 28-30°C
după circa 7 zile, coloniile de Coccidioides immitis dezvoltă un m iceliu aerian,
T ip u ri de colonii
devin pufoase, cresc şi acoperă în câteva zile suprafaţa m ediului; iniţial albe,
C olonia S (sm ooth) are suprafaţă bom bată şi netedă, um edă, m argini circulare şi devin în tim p galben-m aronii; colonii pufoase p ot apărea şi în cursul dez
adesea aspect strălucitor. G erm enii păstrează structura antigenipă şi nu aglutinează voltării în anaerobioză a unei tulpini de Clostridium (etani etc. v ,
spontan cu soluţie salină fiziologică. G erm enii capsulaţi îşi'p ăstrează capsula. V i
rulenţa este conservată. M ajoritatea bacteriilor studiate precum şi levurile form ea Caractere metabolice
ză colonii de tip S (S. aureus, S. pyogenes, E. coli, Candida albicans etc).
Colonia R (rough) este plată, mată, uscată, suprafaţa ei prezintă rugozităţi, marginile E xistă num eroase teste care perm it investigarea acestor caractere ale m icroor
sunt crenelate (zimţate). Stăietură antigenică nu este caracteristică. N u păstrează capsula. ganism elor. în continuare vom prezenta doar câteva dintre aceste teste (vezi şi capi
V iralenţa nu este conservată (excepţii B. anthracis, M . tuberculosis, C. diphteriae). tolul 12 precum şi diferite capitole din partea specială). în capitolul 11 vom m ai dis
cuta şi despre câteva dintre testele care evidenţiază caractere d e patogenitate ale
C olonia M (m ucoid) este m are, strălucitoare, um edă, m ucoasă. E ste dată de
bacteriilor sau fungilor. E ste de rem arcat faptul că unele dintre testele care vor fi
exem plu de bacteriile care prezintă capsulă (exem plu Klebsiella pneumoniae).
discutate ar putea fi incluse atât în grupul caracterelor m etabolice cât şi în grupul
A sp ecte p a r tic u la re caracterelor de patogenitate (ex. hem oliza în cazul anum itor m icroorganism e, pro
ducerea unor enzim e cu caracter de toxine etc).
• fenom enul de „invazie", reprezintă un caracter de identificare prelim inară pen
tru Proteus spp., o bacterie foarte mobilă; dacă însăm ânţăm o tulpină care .lv; 1. P ig m en to g en eza
aparţine acestui gen la periferia unei plăci Petri cu mediu sim plu (agarizat V; Pigm entogeneza este caracteristică bacteriilor crom ogene şi este dependentă de
2% ), de la locul însăm ânţării cultura se „dezvoltă în valuri concentrice" (se
întinde din aproape în aproape) pe toată suprafaţa m ediului; pe anum ite medii ■'v1: condiţiile de cultivare. Poate reprezenta un elem ent util pentru identificare (de
selective, invazia este inhibată şi se pot obţine colonii izolate (adăugăm la % exem plu pentru Pseudomonas aeruginosa sau pentru Staphylococcus spp.).
m ediul de cultură acizi sau săruri biliare, tiosulfat de sodiu etc); ,, D upă localizarea pigm entului, bacteriile pot fi crom ofore (pigm entul este legat
a fenom enul „liniei de dem arcaţie", reprezintă un caracter util în studii epi- în citoplasm ă); paracrom ofore (pigmentul este prezent în perete sau în stratul
dem iologice, în cazul în care tulpinile im plicate aparţin genului Proteus; dacă m ucos, de exem plu pigm entul auriu la S. aureus, pigm entul galben-citrin la S.
pe o placă cu mediu solid cultivăm 2 tulpini diferite, în 2 puncte opuse, tulpi '’’■Jr saprophyticus); crom opare (pigm entul albastru, galben-verzui, sau de altă culoare
nile se vor dezvolta invadând până la un punct în apropierea liniei de întâlnire, ■W: este difuzibil în mediu, de exem plu la Pseudomonas aeruginosa).
’,'v1.
unde se va crea o „linie de dem arcaţie" între cele 2 tulpini (distanţă de 1-2 m i A Fungii pot produce o serie de pigmenţi, spre exemplu coloniile de Candida albicans
lim etri); dacă tulpinile nu sunt diferite va avea loc „creşterea în valuri" fără au culoare albă. M ucegaiurile produc o varietate mult mai mare de pigmenţi (ex.
„dem arcaţie" cu dezvoltarea unei „pânze continue" de cultură ( I Aspergillus deflectus - colonii cenuşii cu periferia roz sau cu pete galbene, Aspergillus
• fenom enul de. „căţărate", reprezintă o variantă de izolare în cultură pură a uneţ
tulpini de Proteus; cultivarea unui produs patologic în lichidul de condens a)
M
' :;
fla m s - colonii galben verzui până la verde închis, iar privite pe partea cealaltă a plăcii
sunt roşii-brune, Aspergillus fumigatus - colonii iniţial albe care devin albastre-verzui
unui tub cu geloză înclinată incubat în poziţie verticală va conduce (în cazul sau albastre, iar privite pe cealalaltă parte a plăcii sunt colorate brun sau în alte culori,
în .care în p. p. există o tulpină de Proteus spp.) la obţinerea în 24 ore a unei Aspergillus niger - colonii iniţial albe care devin brun negre păstrând o culoare albă pe
culturi pure de Proteus, care se va dezvolta „în valuri suprapuse" până (a circumferinţă, iar privite pe cealalaltă parte a plăcii sunt colorate în galben etc).
partea superioară a m ediului de cultură; 1 -/
2. P ro d u c e re a u n o r hem o lizin e
• apariţia coloniilor în „cap de m eduză"/„coam ă de leu", aspect care poate/fi
caracteristic în cazul izolării unei tulpini de Bacillus anthracis; coloniile spnt U nele m icroorganism e produc enzim e (hem olizine) care lizează hem atiile din
m ari, alb-cenuşii, de tip „R“, iar la periferia coloniei, cu ajutorul unei lupe,' se m ediile de cultură cu sânge. H em oliza are diferite aspecte în funcţie de m ecanism ul
pot observa prelungiri ondulate care au dus la denum irile m enţionate m ai sus; de acţiune şi specia de origine a hem atiilor (cal, berbec, iepure etc). C âteva exem
ple de hem olizine:
L
66 Diagnosticul de laborator în microbiologie 1 1 Examinarea caracterelor de cultură, metabolice, a altor caractere fenotipice 67
1. a-hem olizina produce o liză incom pletă a hem atiilor, zona având o culoare Patogenitatea este un atribut de specie şi este determ inată genetic, Virulenţa repre
verzuie (ex. Streptococcus viridans, Streptococcus pneumoniae); zintă gradul diferit de patogenitate exprim at în cadrul unei specii. E ste un atribut al
tulpinii m icrobiene im plicate.
2. a-hemolizina produce liza hematiilor în 7,2 zone“ în apropierea coloniei
există un halou de hemoliza incompletă înconjurat de o zonă de hemoliza completă ’- Caracterele de patogenitate p o t fi evidenţiate in vitro sau in vivo.
(ex. unele tulpini d e Streptococcus spp.);
V".• Teste
*s efectuate in vitro
f
3. p-hemolizina produce liza completă a hematiilor, zona de hempHză este clară
(ex. Streptococcus pyogenes, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Haemophilus • exam inarea aspectului coloniilor (m ajoritatea speciilor bacteriene sunt pato
ducreyi); .,_ ... ■. -y gene în form a „S “, cu excepţia bacililor antraxului, difteric şi tuberculos); are
aspect orientativ;
4. P-hem olizina care produce o hem oliza de tip ,,cald-rece“ (zone de hem oliză
incom pletă la 37°C care, după m enţinerea culturii .la +4°G tim p .de câtev a ore, • efectuarea anum itor teste biochim ice/m etabplice, cu aspect orientativ (exam i
devine com pletă; ex. anum ite tulpini .de Staphylococcus .aureus);-.'. , •> , narea pigm entogenezei, ferm entarea m anitâi, testul coagulazei, testul fibrino-
lizei, producerea de hem olizite etc); dintre testele m enţionate este de luat în
5. 7 -hemolizina produsă de Staphylococcus spp. lizează de iepure, om,1oaie, dar'
consideraţie în prim ul rând testul coagulazei ;
nu produce zone de hemoliză pe agar-sânge; în cazul streptococilor, „y-hemoliza“
• evidenţierea producerii unor toxine;
indică absenţa hemolizei. . -.j- .-.vi •
® endotoxine (testul Limulus; prezenţa endotoxinei produce gelificarea unui
3. P ro d u c e re a a lto r enzim e lizat de Limulus polyphemus);
• catalază (ex. Mycobacterium spp., Staphylococcus spp.); • exotoxine (testul E LEK /vezi capitolul 16, ELISA , efecte citopatice, testul
• carbohidraze (evidenţiate pe medii diferenţiale, vezi capitolele 12 şi 28-34); producerii d e lecitinază, testul plăcilor sem i-neutralizate etc).
®gelatinază (cultura microbiană lichefiază gelatina, ex. Clostridium peifringens); Teste efectuate in vivo
• lecitinază (ex. Bacillus anthracis, Clostridium spp.); In acest scop se utilizează anim ale de laborator sensibile faţă de infecţia experi
o nitrat-reductază (ex. Mycobacterium spp.); m entală cu diferite m icroorganism e sau faţă de anum ite toxine m icrobiene (ex.
® oxidază (ex. Neisseria meningitidis, N, gonorrhoeae, Pseudomonas aerugi şoareci albi, cobai, iepuri, pisici etc., în funcţie de specia m icrobiană pentru care se
nosa, Vibrio cholerae ) ; . ’ .......... .. efectuează testul/specia de animal cea mai sensibilă şi calea de inoculare cea mai
©termonuelează (ex. Staphylococcus aureus) etc. potrivită). A nim alele de laborator trebuie să fie sănătoase, verificarea se face prin
exam inarea acestora în ain te de efectuarea testării, pe parcursul a 10-14 zile. După
4. A lte c a ra c te re m etab o lice inoculare, anim alele sunt m arcate şi ţinute sub observaţie (ferite de orice contam i
» acţiunea reducăţoare (evidenţiată de ex. la C. diphteriae cultivat pe m ediu cu nare); observaţia este clinică urm ărindu-se evoluţia curbei febrile şi apariţia sem
nelor de boală. Pentru orice test se recom andă utilizarea unui Iot de anim ale pentru
teiurit de K); ,j
acelaşi tip de inoculare, ceea ce creşte suplim entaf costul acestui tip de testare. în
• sensibilitatea la diferite temperaturi; :■ î continuare vom prezenta câteva exemple:
® toleranţa la un anumit pH (ex. V. cholerae se multiplică la pH alcalin);; ‘ ‘ f
• identificarea Bacillus anthracis: pregătim o suspensie a tulpinii care urm ează a fi
® toleranţa la o anumită concentraţie ă ţ NaCl (ex. Staphylococcus aureus); f testată în soluţie salină fiziologică şi injectăm subcutanat, câte 0,2 ml pentru fie
®sensibilitatea la optochin (ex. S. pneumoniae) sau Ia bacitracină (ex. S. pyo care animal, la u n lot de şoareci albi; urmărim evoluţia timp de 2-3 zile şi efectuăm
genes) etc. I frotiuri din sângele recoltat prin puncţionarea cordului sau am prente de splină;
© testarea toxigenezei unei tulpini de Corvnchactcrimn diphtenn&t obţinem o
Caractere.de patogenitate ' cultură de 24 ore a tulpinii de identificat; inoculăm subcutanat, în regiunea
abdom inală câte 2-5 ml de cultură pentru fiecare anim al, la 2 loturi de cobai
Patogenitatea reprezintă capacitatea unui germen de a declanşa în organismul
(un lo t neprotejat, al doilea lot protejat cu câte 1000 UI de ser antidifteric pen-
gazdă fenomene morbide, patogene, modificări locale, generale şi „functio laesa“.
(
tulinică fiind term olabilă; se vor inocula 4 loturi de şoareci (0,5 ml/şoarece) erii- At >1. , Io; t
, .sau,,cobai (1 m l/cobai) după cum urmează; , ,:u ,,
© supernatant ca atare; . . . . ■ :
' .it.fi'..,
o supernatant inactivat; . .-i a, : .■ u:.* *
■M.li ,■
O 0,1 ml ser antitoxină A urm at la 30 m inute de supernatant;
o 0,1 ml ser antitoxină B urm at la 30 m inute de supernatant;
© spre exem plu, în cazul în care anim alele din ioturile 1 şi 4 mor, iar ani îtn . X cfVM . , , n.,1
malele din loturile 2 şi 3 supravieţuiesc, în p.p. există toxină botuli ni că de
tip A.
© identificarea infecţiei pulm onare cu Streptoccus pneumoniae sau cu Klebsiella
1{ . . *î
prieumoniae: realizăm un am estec de spută şi soluţie'salină fiziologică sterilă
şi inoculăm subcutanat sau intraperitoneal câte 5 ml de p.p. pentru uri anim al,
la un lot de şoareci albi; prezenţa m icroorganism ului va produce în 24-48 de
ore o septicem ie m ortală; facem frotiuri şi culturi din sângele1recoltat prin
puncţie cardiacă, lichid peritoneal şi am prentă de splină; pentru determ inarea
tipului capsular putem face reacţia de um flare a capsulei (vezi capitolul 12);
® identificarea etiologici stafilococice a unei toxi-infecţii alim entare (producerea
enterotoxinei): după ce se obţine în cultură tulpina de stafilococ (pornind de la
materii fecale, lichid de vărsătură, alim ente) se repică în .a g a r 0,5% şi. se
incubează 48 ore în atm osferă de CO 2; se filtrează m ed iu l iar lichidul obţinut
se menţine la tem peratura de fierbere timp de 50 m inute:.(enţerotoxina este tef- ■A'UC,i
mostabilă); testul D olm an se face la pisoi de 2-3' luni la care se inoculează
intraperitoneal 1-3 ml din filtratul r ă c iţi după 2 0 -1 2 0 ’m inute; în 'baiul pre
zenţei enterotoxinei apare o stare ele nelinişte, agitaţie urinate de diâfeefvărşă-
turi şi som nolenţă; după 1-2 zile anim alele inoculate îşi revin; /
• cercetarea patogenităţii unei' tulpini de. stafilococ se face la iepure, ca're’e'ste
anim alul -de la b o ra to r cel m ai sensibil la in fecţia ex p erim en tală cu
Staphylococcus aureus; ' , V J
(
A ceste teste de identificare au o importanţă diferită la diferitele genuri şi specii • obligatoriu vom p releva din soluţia de glucoză;
bacteriene şi respectiv fungice şi „fac parte" din etapa a patra a diagnosticului de la • dacă dorim să testăm pentru 9 carbohidraţi diferiţi avem nevoie de 2 plăci
borator bacteriologic sau m icologic. Schem a de prezentare este însă asemănătoare. Petri.
E xistă sisteme com erciale m anuale şi autom ate utile pentru identificarea speci Incubăm la 28-30°C pentru 24-48 ore, apoi urm ărim apariţia culturii în ju ru l ro n
ilor m icrabiene. Spre exem plu, sistem ul sem iautom at d e identificare şi testare a delelor.
sensibilităţii la antibiotice a bacteriilor izolate, m in iA P I, perm ite identificarea unei E xistă şi alte m odalităţi tehnice în realizarea auxanogram ei.
gam e foarte largi de specii m icrobiene; necesită utilizarea unui inocul standard
realizat pornind de la o cultură bacteriană pură. Interpretare
• trebuie să existe m ultiplicare levurică (cultură prezentă) în ju ru l rondelei pe
12.1. Utilizarea unui carbohidrat ca unică sursă de carbon - Auxanograma care am depus o ansă din soluţia 5% de glucoză; toate levurile pot folosi glu
coza drept unică su rsă d e C;
P rin c ip iu
• se notează dezvoltarea culturii în jurul rondelelor unde aceasta este evidenţiată
D iferitele levuri prezintă un anum it echipam ent enzim atic cu ajutorul căruia pot,
şi utilizând rezultatele obţinute, în contextul celorlalte date d e laborator, se sta
spre exem plu, să utilizeze un anum it carbohidrat ca unică sursă de carbon. D ez
bileşte specia levurică.
voltarea unei levuri pe un m ediu în care este inclus un singur carbohidrat dem on
strează utilizarea acestuia c a unică sursă de carbon (asim ilarea carbohidratului Control de calitate
respectiv). în mod asem ănător se poate testa capacitatea asim ilării unor substanţe
• tulpina de referinţă de Cryptococcus laureaţii;
azotate de către levuri.
• tulpina de referinţă d e Candida pseudotropicalis.
M a te ria le necesare
• cultura pură a levurii de identificat, pe pantă de agar Sabouraud; 1 2.2. Testul sensibilităţii la bacitracină
o mediu pentru asim ilarea carbonului de către levuri; Principiu:
• soluţie de vitamine; M ultiplicarea streptococilor de grup A este inhibată de bacitracină (antibiotic
• soluţii 5% ale carbohidraţilor (ex. glucoza, m altoză, zaharoză, lactoză, galac- produs de Bacillus licheniformis). Se apreciază că dintre tulpinile de Streptococcus
toză, trehaloză etc) în apă distilată, sterilizate prin filtrare; : ij pyogenes, mai puţin de 1% sunt rezistente la bacitracină.
• rondele din hârtie de filtru, sterile (diam etru 6 m ilim etri). I
M ateriale necesare
T eh n ica de lu c ru ! • colonii (3-hemolitice izolate pe geloză-sânge;
C ultura fungică este suspensioriată în 5 ml de apă distilată sterilă. M ediul de cul o m icrocom pîim âte d e bacitracină cu 0,04 U şi cu 0,1 U (şi nu cu 10 U /m icro-
tură pentru asim ilarea carbonului este încălzit până la topire şi apoi răcit la 50°C. com prim at).
72 Diagnosticul de laborator în microbiologie 12 Teste de identificare pe baza caracterelor biochimice ale fungilor ţi bacteriilor
T e h n ic a de lu c ru .ro: , ./ ? Interpretare n . ■; < '■ ■ >;>
Se prelevează 3-4 colonii p-hem olitice şi se însăm ânţează în striuri foarte apro • Testul este pozitiv (bacteriile au fost lizate în prezenţa dezoxicolatului de so
piate, suprapuse în 3 direcţii, pe o jum ătate de placă P etri cu geloză-sânge .(din diu şi sunt pneum ococi) dacă suspensia s-a clarificat în tubul în care am adău
m otive de econom ie se poate utiliza şi un sector de placă). ' ,‘l‘ ' ' ...... gat dezoxicolat şi nu s-a clarificat în tubul îri care am adăugat apă distilată;
Plasăm în centrul ariei însăm ânţate un m icrocom prim ăt cu bacitracină şi incu- • Testul este negativ d acă am bele tuburi au răm as opace. V v ‘‘1 r c ■
băm pentru 18-24 ore la 35-37°C . , Control de calitate i :b;. ' . ; , ' Sî
I n te r p r e ta r e ,;i';" ,nt • Martor pozitiv^Streptococcus pneumoniae; .,.. ,v,
• M artor negativ - Streptococcus vindem .
Testul este pozitiv (bacteria este sensibilă lă bacitraciriă) în câZul'în care:
® rezultă o inhibiţie a creşterii bacteriene, indiferent de diam etru, în jurul m icro- 1 2 .4 . Testul CÂMP
com prim atului cu 0,04 U bacitracină;
Principiu
* rezultă o inhibiţie a creşterii bacteriene cu diam etrul g 11 m m , în jurul micro-,
com prim atului cu 0,1 U bacitracină. Streptococii de gm p B produc o substanţă extracelulară de natură proteică denu
m ită factorul CA M P (după iniţialele cercetătorilor care au pus la punct testul/ Christie,
C o n tro l d e c a lita te • I',::..;"- Mi l Atkins, M unch-Petersen); care acţionează sinergie cufl-lizina produsă de unele tulpi
e M artor pozitiv - Streptococcus pyogenes; ni de Staphylococcus aureus. D acă aceste 2 microorganism e sunt cultivate în 2 striuri
perpendiculare (fără să se atingă), acolo unde cele 2 striuri se învecinează, liza hemati
• M artor.negativ - Streptococcus agalactiae. j ilo r (de berbec sau de bou) apare mărită, în „form ă de vârf de săgeată".
: P rin c ip iu u-.; ■>.■,. ,< • colonii de streptococi hem olitici sau nehem olitici (dacă un anum it context sau
anum ite teste sugerează prezenţa unui streptococ de grup B);
Pneum ococii (Streptococcus pneumoniae) capsulaţi sunt lizaţi în prezenţă bilei
• plăci Petri cu geloză sânge de berbec sau de, bou;
sau sărurilor biliare (unele tulpini necapsulate nu suferă acest proces) prin activarea
1 • tulpina de S. aureus producătoare de p-lizină (A TC C 25923)/alternativ am
unei enzim e autolitice.
'•putea utiliza fâşii din hârtie de filtru impregnate cu P-lizină stafilococică;
M a te ria le n e c e s a re • ATCC = American Type Culture Collection;
© colonii izolate, a-h em o litice; • tulpini de cercetat.
• soluţie de dezoxicolat de sodiu 10%; Tehnica de lucru ’
• soluţie salină izotonă; Inoculăm în striu o tulpină d e S. aureus producătoare de p-lizină, pe unul din
• apă distilată. ..... . . ., . , ... ;.j. =;, diametrele plăcii cu agar-sânge. Perpendicular pe acest striu vom inocula (fără să
T eh n ica de lu c ru • ! ' , ',-t
i: '■ ' " " ’• :'L " '/*■'i’,‘ atingem striul de stafilococ) o tulpină CA M P pozitivă, o tulpină CA M P negativă şi
1 . ' :.!ji ; . , v tulpini de cercetat.
S e prepară în soluţie salin ă fiziologică o suspensie pornind de la coloniile hem o- •t.fin. - ■ .
Incubăm la'35-37°C aerob până a doua zi sau tim p de 6 ore în atm osferă de 5-
litice izolate. T urbiditatea suspensiei trebuie să fie asem ănătoare cu turbidjtatea
10% C 0 2. •" - ■v
etalonului M cFarland 0,5 sau 1. :■ '. li- . *. I . . . . .. . | .. *
Repartizăm câte 0,5 m l din suspensie în 2 eprubete de sticlă. J , . . Interpretare , ;.. - , . •„ ; . ..... , l!lt
în primul tub adăugăm 0,5 ml dezoxicolat de sodiu, iar în al doilea tub adăugăm o apariţia unei zone de hem oliză lărgite, în „vârf de săgeată" (vârful spre ttilpina
0,5 ml apă distilată. Incubăm tim p de 2 ore la 35-37°C. de stafilococ) reprezintă un test pozitiv (confirmat de martorul pozitiv);
Diagnosticul de laborator in microbiologie 1 2 Teste de identificare pe baza caracterelor biochimice ale fungilor şi bacteriilor 75
74
• heraoliză nemodificată - test negativ (confirm at de m artorul negativ ) , j • M artor negativ - m£diu neinoculat peste care se adaugă soluţie d e peroxid de
hidrogen.
C ontrol de calitate
12.5.B. pentru alte microorganisme (spre exem plu diferenţierea stafilococilor
• M artor pozitiv - Streptococcus flgalacţiae;. . n.., de alte microorganisme)
• Martor negativ - Streptococcus pyogenes sau un streptocqc de grup D.
E xistă mai m ulte tehnici dintre care vom prezenta testul realizat pe 6 suspensie
bacteriană şi respectiv testul catalazei prin suspensionarea culturii pe lam ă. .
12.5. Testul producerii de catalază i ; <?>
P rin cip iu Materiale necesare
Catalaza descompune peroxidul de hidrogen în apă şi oxigen. • colonii izolate dezvoltate pe medii fără sânge/în cazul în care urm ează să testăm
o bacterie care s-a dezvoltat pe geloză-sânge, deoarece pot apărea reacţii fals
12.5. A. pentru mycobacterii pozitive datorită catalazei eritrocitare, urm ează să prelevăm cultura bacteriană
fără a atinge mediul de cultură; în acest sens vom utiliza o ansă „fîr“ şi să
M a teriale necesare prelevăm cultură din porţiunea cea mai bom bată a coloniei de identificat);
• cultura pură a m icroorganismului care urmează a fi testat, pe mediu Lowenstein; • soluţie de peroxid de hidrogen 3%;
• soluţie de peroxid de hidrogen în Tw een 80 şi apă distilată. • apă distilată.
• /în prezenţa,unui tub fără-,dezvoltarea, culturii, cu lo area m ediului;,fiind verde b. Testul coagulazei în tuburi
(putem notifica un rezultat negativ. rj.. V erifică prezenţa coagulazei libere. Pipetăm aseptic 0,5 ml de p lasm ă într-un tub
steril. Prelevăm o colonie şi o descărcăm în plasm a din tub (alternativ putem
C o n tro l de c a lita te ': însăm ânţa o colonie de testat în 0,5 ml bulion glucozat, incubăm 18-24 ore la 35-
•■ , . i . 11C;i|,.j^ *-,»• |i,J ...I.ţ...
» M artor pozitiv - Klebsiella pneumoniae/Ehterobacter cloacae;, , ,, ,;., 37°C şi vom am esteca plasm a cu suspensia m icrobiană rezultată după cultivare).
Incubăm tubul tim p de 4 ore la 35-37°C (pentru unele tulpini reacţia poate fi p o
• M artor negativ - Escherichia coli.
zitivă chiar şi mai repede de 4 ore). Rezultatul reacţiei este exam inat prin înclinarea
tubului. Dacă reacţia este negativă la 4 ore, reincubăm până la 24 ore.
12.7. Testul coagulazei '.i • ■i;j ii a l;.a ; lo b itjd Hif f l '.>■]:>
1 ,i'i i:. i ' oi: :.. . "iolii!i.n• i:i t . A tenţie, cheagul poate fi lizat destul de rapid d upă m om entul form ării (unele
Principiu tulpini de S. aureus produc fibrinolizină). D in acest m otiv, unii autori recom andă
Stafilococii coagulazo pozitivi produc o enzim ă care ac tiv ează coagularea-; plas exam inare tubului test din 30 în 30 minute, în prim ele 4 ore.
mei. Există 2 tipuri de coagulază: coagulaza liberă ^ c o a g u la z a leg ată.d e(peretele Interpretare o.;
celular („dum ping factor"). Coagulaza liberă acţionează pe protrom binK C oaguiaza • form area unui cheag, sem nifică un rezultat pozitiv;
legată acţionează direct pe fibrinogenul plasmatic. Stafilococii coagulazo pozitivi • absenţa cheagului sem nifică un rezultat negativ.
sunt consideraţi Staphylococcus fţureiu..t ■ ,.:ît : a . . ,. .ţ.ţjţu ti k f
Control de calitate
Materiale necesare • M artor pozitiv - S. aureus;
• colonii izolate p e’mediu neseldctiv ale tulpinii care u rm ează să fie testată ( • M artor negatiy - S. epidemidis.
.. ........ .. a ' 1'-- . . iu -i.;. ' . tb îi t b j i » o i . , i r ' itÎH'Uiu i . - n r " ; ; r ' i : ' r c o -. ■!
... . / iaio • > ^Diagnosticul de laborator în microbiologie 12 Teste de identificare pe baza caracterelor biochimice ale fungilor şi bacteriilor
78 79
Mediul conţine uree, ti'iptofan, roşu fenol (indicator d e pH ) şi este condiţionat în • M artor pozitiv - Proteus m im bilis M + U + 1+ ;
tuburi de dim ensiuni mici. G eloza este m oale perm iţând m obilitatea m icroorganis ® M artor negativ - Shigella spp. M - U- I- 1
mului însăm ânţat; hidroliza ureei va duce la alcalinizare m ediului (culoarea virează
de la galben la roşu); producerea de indol din triptofan v a fi indicată de înroşirea
reactivului Ehrlich.
Teste de luentificare pe baza caracterelor biochimice ale fungilor şi bacteriilor 81
'■'1
80 Diagnosticul de laborator în microbiologic
Control de calitate
12.9. B. M ediul multitest M IL F (mobilitate indol lizin-decarboxilază fen il-
o M artor pozitiv - Proteus mirabilis M + 1+ FD -ază+ LD-ază-;
alanin-dezaminază) ... „ l h ,
® M artor negadv - Klebsiella pneumoniae M -1 - FD -ază- LD -ază+.
Principiu ,.u ••ilru /p u m :«n<u>ihi.T p b .i K *
M ediul conţine o cantitate scăzută de glucoza, peptonă cu D t-tr'iptofănl L-lizină, 12.10. Mediul m ultitesi TSI (triple sugar iron)
DL-fenil-alanină, brom crezol p u rp u r soluţie12% ’(indicator de p H )'şi"eite condiţio / Principiu
nat în tuburi de dim ensiuni mici. G eloza esta?nioale perm iţând m obilitatea m icroor 4
ganism ului însăm ânţat. Producerea de indol din triptofan va fi indicată d eîn ro şire a M ediul este agarizat, condiţionat în două „zone“ (în coloană la b az ă şi în pantă)
reactivului Ehrlich. D ecarboxilarea lizinei va duce la alcalinizâfe m ediului (în şi conţine glucoza (în raport de 1/10 faţă de celelalte zaharuri), lactoză, zaharoză,
absenţa lizin-decarboxilazei rezultă o uşoară acidifiere a mediului: datorită .fermen citrat feric şi un indicator de pH (roşu neutru). P artea dreaptă (coloana) nu vine în
contact cu aerul şi oferă condiţii relative de anaerobioză. Partea în clin ată (panta)
tării glucozei). D ezam inarea fenil-alaninei duce la apariţia1de acid fenil-piruvic şi
oferă condiţii de m ultiplicare în aerobioză.
am oniac; adăugând clorură ferică rezultă o culoare verde.” ';.
>V i- j • f t l ’s i U ' . i r \fi ■ 7 V . - l Concentraţia glucozei este mai mică, pentru ca ferm entarea acestui zahar să
Materiale necesare a , ; , . J ■. ,.v t.v ii i-,-. n.-.-d . ;t m ;i,u m L v poată fi detectată chiar dacă este singurul zahar m etabolizat. Dacă o bacterie se dez
• tuburi de dimensiuni mici cu mediul M ILF; ••■ y J voltă în partea dreaptă vor fi eliberaţi am inoacizi, care în zona aerobă v o r fi decar-
boxilaţi oxidativ şi vor m odifica pH -ul spre alcalin. în cazul în care lactoza şi/sau
• hârtiuţe indicator cu reactiv Ehrlich (se poate folosi şi reactiv K ovacs) sati
zaharoza nu sunt ferm entate, cantitatea de acid produsă prin ferm entarea glucozei
reactiv Ehrlich/K ovacs condiţionat în sticluţe de culoare brună;
(toate enterobacteriile ferm entează glucoza) este suficient de m ică pentru ca pH-ul
• colonii de identificat (colonii izolate, cultură pură);
de la nivelul pantei să revină rapid la neutru. în acelaşi timp, pH -ul răm âne acid (şi
• ansă fir etc. culoarea mediului răm âne galbenă) la nivelul coloanei pentru că în condiţii de rela
tivă anaerobioză nu are loc decarboxilarea oxidativă. D acă zaharurile de la nivelul
Tehnica de lucru >,
pantei sunt ferm entate, cantitatea de acid produsă este suficient de m are pentru ca
T ehnica de lucru este asem ănătoare cu cea expusă la punctul 12.9. A. pH -ul de la acest nivel să răm ână acid şi respectiv culoarea pantei să răm ână galbenă.
Interpretare P rezenţa citratului feric, în cazul în care bacteria produce H 2S duce la apariţia
unei culori negre (se form ează sulfit feros).
• din punctul de vedere al m obilităţii ,, , , , .
L a nivelul coloanei se mai înregistrează şi producerea de gaz (de la apariţia unor
• opacifierea apare numai pe traiectul de însăm ânţare —bacteria este imobilă
bule fine pe traseul de însăm ânţare, până la fragm entarea sau „ruperea" coloanei).
• opacifierea este uniform ă în coloana de m ediu - bacteria este m obilă
o din punctul de vedere al transformării triptofanului în indol )( Materiale necesare
o schim barea culorii hârtiei la roşu-violet - bacteria este indol pozitivă j ® tuburi de dim ensiuni mici cu mediul TSI;
• culoarea hârtiei răm âne albă - pacteria este indol negativă • colonii de identificat (colonii izolate, cultură pură);
• din punctul de vedere al producerii lizin-decârboxiiazer ( , , ii ® ansă fir etc.
• alcalini zarea coloanei ttaduce prezenţa enzim ei - /
Tehnica de lucru
• acidifierea uşoară a coloanei trtţduce absenţa enzim ei -■» ' ' ■'
• din punctul de vedere al producerii fenil-alanin-dezam inazei | U tilizăm pentru însăm ânţare o ansă fir. Prelevăm din colonia izolată pe mediu
• apariţia unui „inel" de culoare verde la suprafaţa m ediului şi la niVelul neselectiv (dacă pentru cultivare au fost utilizate medii selective trebuie să prele
traiectului de însăm ânţare după adăugarea unei picături de clorură ferică văm cu grijă, fără să atingem mediul de cultură) şi însăm ânţăm co lo an a prin înţe
10% traduce prezenţa enzimei pare, apoi retragem ansa şi atingând suprafaţa coloanei descriem un striu în „zig
zag". incubăm la 35-37°C tim p de 24 ore.
82 Diagnosticul de laborator fn microbiologie 1 2 Teste de identificare pe baza caracterelor biochimice ale fungilor şi bacteriilor
83
• în ceea ce priveşte ferm entarea glucozei; Folosim o subcultură m ycobacteriană cu creştere confluentă. A dăugăm cu ajuto
• culoarea coloanei este galbenă - glucoza este ferm entată; rul unei pipete P asteur ap ă distilată sterilă sau soluţie salină fiziologică. Cu ajutorul
pipetei Pasteur (sau cu ajutorul unei anse) raclăm coloniile pentru a perm ite extrac
• culoarea coloanei răm âne roşie - glucoza nu este ferm entată (nu este
ţia niacinei din m ediu. T uburile rămân 1 oră la tem peratura cam erei. * ,
enterobacterie);
T ransferăm câte 0,5 m l în fiecare dintre tuburile de testare. A d ăugăm succesiv
• ferm entarea glucozei poate fi sau nu însoţită de producere:de gaz;
' 0,5 ml anilină 4% şi respectiv 0,5 ml brom ură de cianogen. E xam inăm după 5
• interpretarea se face sim ilar pentru ferm entarea lactozei/zaharozei, la nivelul
m inute pentru a o bserva apariţia culorii galbene în cazul reacţiei pozitive. înainte de
pantei; . elim inare, vom „neutraliza11 tuburile prin adăugarea unui volum egal (aproxim ativ
• în cazul în care.se produce H 2S, rem arcăm apariţia unei culori negre la nivelul 3 m l) de N aO H 10 % în fiecare tub.
coloanei;
Interpretare
o alte elem ente privind interpretarea acestor rezultate vor fi prezentate în capi
tolul 28. • apariţia unei culori galbene, reprezintă un test pozitiv;
• absenţa culorii galbene, reprezintă un test negativ.
Control de calitate
Control de calitate
• M artor pentru pH acid la nivelul coloanei şi pantei, fără producere de H 2S -
E. coli; • M artor poziti \ - Mycobacterium tuberculosis;
• M artor pentru pH acid la nivelul coloanei, pH neutru la nivelul pantei şi pro • M artor negativ - Mycobacterium avium.
ducere de H 2S - Salmonella typhimurium;
• este posibilă şi utilizarea altor tulpini martor.
12.12. Testul producerii de citocrom oxidază
Principiu
1 2 .jh . Testul producerii de niacină
U nele bacterii produc citocrom oxidază, enzim ă care lipseşte la bacteriile strict
Principiu anaerobe. A ceastă hem oproteină acţionează şi asupra unei substanţe, tetra-m etil p-
fenilendiam ină rezultând un com pus de culoare purpurie
M ycobacleriile produc în timpul m ultiplicării niacină (acid nicotinic) pe care o
utilizează în sinteza N A D şi N A DP. M ajoritatea m ycobacteriilor posedă o enzim ă D intre bacteriile oxidazo-pozitive am intim Vibrio spp., m ajoritatea speciilor de
care poate transform a niacina liberă în acid nicotinic m ono-nucleotid. Dacă Pseudomonas , Alcaligenes spp, Neisseria spp. (dintre germ enii gram negativi) şi
Micrococcus spp. (dintre germ enii gram pozitivi)
m icroorganism ele nu prezintă această enzim ă (ex. M. tuberculosis), în m ediul de
cultură se va acum ula niacină. N iacina este solubilă în apă şi poate fi extrasă din Materiale necesare
mediu (dc ex. în soluţie salină fiziologică) iar în reacţie cu brom uravde cianogen
• soluţie apoasă de tetra-metil p-feniiendiam ină 1% conservată în sticlă d e culoare
(atenţie la utilizare!) în prezenţa andinei rezultă un com pus de culoare galbenă.
brună la tem peratura frigiderului sau fâşii de hârtie indicator im pregnată în
Materiale necesare reactiv (preparate com ercial).
• hârtie de filtru;
• soluţie de anilină 4% (conservată în sticlă de culoare brună la 2-8°C); j
• ansă cu fir de platină sau pipetă Pasteur (cudată);
• soluţie de brom ură de cianogen 10% (ar fi de preferat datorită riscurilor să uti
• colonii izolate dezvoltate pe agar-sânge, agar-chocolat sau agar M ueller Hinton.
lizăm fâşii de hârtie indicator im pregnate în soluţie de brom ură d e cianogen,
produse com ercial); ' / Tehnica de lucru
• folosim culturi (realizate pe m ediul L ow enstein-Jensen), în vârstă de m inim 3 E xistă mai m ulte variante tehnice, dar vom discuta doar una dintre acestea.
săptăm âni. P unem într-o cutie Petri un fragm ent de hârtie de filtru p e care depunem 1-2 pică-
l
34 Diagnosticul de laborator Tn microbiologie
I* Teste de identificare pe baza caracterelor biochimice aie fungi lor şi bacteriilor 85
•
~~* ~~ ’
turi de soluţie apoasă de tetra-m etil p-fenilendiam ină 1%. După,, sterilizarea şi ră
cirea ansei, prelevăm dintr-o colonie izolată şi descărcăm cultura p e hârtia de filtru © absenţa inhibiţiei în ju ru l discului sem nifică un test negativ;
prin m işcări circulare de m ică am plitudine. . * interpretarea este diferită dacă se folosesc discuri de optochin cu alte dimensiuni
Urm ărim apariţia unei reacţii de culoare în interval de 10 secunde ' (ex. cu diam etrul de iO mm).
î _ •,
I n te r p r e ta r e ' ,1'v i;' '' C o n tro l d e ca lita te
• apariţia unei zone de c u lo a r e purpurie în 10 secunde;1reprezintă tin test pozitiv; >• M artor pozitiv - Streptococcus pneumoniae;
o absenţa culorii purpurie, sem nifică un teist n e g a t i v ; . : . ' \ ’ ‘ • M artor negativ - Streptococcus viridans.
• apariţia zonei colorate m ai tardiv nu perm ite interpretarea testului, în principiu Fără îndoială că aceste teste reprezintă doar câteva exemple din multitudinea
este vorba despre un rezultat negativ. - .. testelor utilizate în laboratorul de microbiologie. Numai în vederea identificării dife
ritelor specii mycobacteriene se pot utiliza, spre exemplu, peste 130 de teste fenotipice.
C o n tro l de ca lita te
înţelegerea lor din punct de vedere teoretic precum şi utilizarea lo r în m od prac
« M artor pozitiv - Pseudomonas aeruginosa; tic sunt utile atât pentru studenţi, medicii rezidenţi aflaţi la debutul pregătirii în spe
« M artor negativ - Escherichia coli. cialitatea de m edicină de laborator, pentru viitorii m edici din alte specialităţi cât şi
pentru medicii şi biologii im plicaţi în diagnosticul de laborator la nivel clinic sau în
12.13. Testul sensibilităţii la optochin interesul sănătăţii publice.
A vând la bază noţiunile teoretice învăţate, diferitele exem ple precum şi m anu
P rin c ip iu
alele care prezintă din punct de vedere practic diagnosticul m icrobiologic, fiecare
M ajoritatea tulpinilor de pneum ococi (Streptococcuspneumoniae) sunt sensibile dintre cei im plicaţi va putea să aplice aceste elem ente,.deprinzând arta acestui diag
la concentraţii scăzute (< 5 gg/m l) de optochin (hidroclorid de etU-hidrocupreină). nostic atât de util în practica m edicală la nivel individual sau populaţional.
Unele tulpini ale altor streptoci care produc hem oliză viridans pot fi sensibile, dar
U ltim ul test pe care îl vom prezenta în finalul acestui capitol nu se bazează pe
la concentraţii mai m art ale substanţei active, in tim p ce alte tulpini sunt rezistente.
proprietăţile biochim ice ci are la bază caracterele antigenice (structura antigenică)
M a te ria le n ec esare ale m icroorganism elor din specia Streptococcus pneumoniae.
D atorită faptului că nu există un capitol special al tehnicilor im unologice unde
• discuri cu optochin (5 pg/disc), cu diam etrul de 6 m ilim etri; - / r:
ar putea fi integrat, precum şi datorită faptului că în paginile precedente am prezen
® plăci, cu agar-sânge; ' ' v ' ■ •' :l ■■ tat testul bilolizei şi respectiv testul sensibilităţii la optochin (am bele teste fiind
« tam poane sterile; necesare în diferenţierea Streptococcus pneumoniae de Streptococcus viridans) am
® colonii a-h em o litice izolate, care urm ează a ii testate. decis să includem aici, acest test.
Control de calitate
sondele nucleotidice m arcate ne-radioactiv, reactivii necesari fiind produşi şi livraţi
comercial. Vom prezenta în continuare, drept un exemplu, modul de lucru în cazul în funcţie de specia m ycobacteriană suspectată (pe baza altor criterii clinice, pa-
unei truse com erciale. A cesta are la bază hibridizarea A D N-A RN 16s şi este utilizată raclinice, de laborator) vom utiliza:
în identificarea tulpinilor m ycobacteriene aparţinând speciilor din com plexul M. • M artor pozitiv - M. tuberculosis sau M. avium sau M. kansasii etc;
tuberculosis, din com plexul M. avium precum şi speciilor M. kansasii, M. avium, M. • M artor negativ - un tub în care nu se introduc celule b ac te rie n e."
intracellulare şi M. gordonqe; există şi alte variante tehnice,, în funcţie deţproducător.
Reactivii utilizaţi au în com ponenţă un ester de acridinium , ceea ce v a perm ite II. Tehnica de Amplificarea genetică * Polymerase Chain Reaction (PCR)
evidenţierea reacţiei pozitive cu ajutorul unui lum inom etru. >• Principiu
M ateriale necesare i ... ,. tSs ,,, T ehnica PCR pentru secvenţe specifice de A D N (direct în produsele clinice sau
• reactivul 1, reactivul 2, reactivul 3 şi reactivul „sondă"; noi- după izolarea m icrobiană în culturi) constituie o m etodă rapidă de detectare a diferi
ţilor agenţi infeeţioşi. A ceastă tehnică presupune utilizarea unor am orse oligonu-
• baie de apă cu u ltra su n ete ;' :- ' : 1 ‘
cleotidice specifice A D N -ului ţintă. în urm a denaturării term ice a catenelor de
• aparat term ostat 50- 100°C; ’ '
A D N , am orsele vor hibridiza cu secvenţe com plem entare de pe acestea. A num ite
o lum inom etru „L eader"; condiţii de tem peratură precum şi prezenţa, unei polim eraze term ostabile (Taq
® pipetă m ecanică 100-1000 pi; polim eraza) vor perm ite copierea A D N-ului ţintă într-o catenă com plem entară
® vortex (om ogenizator); situată în prelungirea am orselor hibridate.
® tuburi cu medii de cultură solide pe care au fost cultivate m ycobacteriile de R epetarea procedeului, în condiţii diferite d e tem peratură necesare denaturării,
identificat; , . . . . hibridizării şi polim erizării pe m atriţa A D N -ului ţintă (utilizând un sistem automat,
• tuburi cu substrat pentru liza celulelor m ycobacteriene. într-un aparat construit în acest scop care se num eşte term ociclor), conduce la acu
m ularea mai m ultor m ilioane de copii ale fragm entului de A D N definit de amorse.
Tehnica de lucru , • r ‘ ■ r *'
Prin m etoda PCR se poate reduce timpul necesar diagnosticului infecţiei cu M.
Putem începe identificarea tulpinilor mycobacteriene după apariţia coloniilor pe me tuberculosis de la 3-8 săptăm âni (cât durează cultivarea pe mediu solid) la 2-3 zile.
diile de cultură. După ce pipetăm primii 2 reactivi în tuburile de liză, transferăm în tuburi M etoda poate fi . utilă şi în identificarea tulpinilor de M. tuberculosis sau de
câte o ansă de cultură şi.agităm pentru omogenizare („vortexăm ").Punem tuburile în m ycobacterii ne-tuberculoase („atipice"),
baie de apă cu ultrasunete (15 minute), în scopul lizării bacteriene şi extragerii ADN- s*
ului cromozomi al. încălzim 1.0 minute la 95°C pentru inactivarea mycobapteriilor. M a te ria le n ec esare
Transferăm 10 0 p l de lizat în tubul în care am pus reactivul „sondă" şi incubăm • term ociclor
15 m inute la 6 0 °C , după care adăugăm reactivul 3 şi vortexăm .'.Incubăm la160,°C • m icrocentrifugă şi centrifugă dotată cu sistem de răcire;
pentru o durată care variază în funcţie de apartenenţa ipotetică a tulpinii de testat şi • vortex (om ogenizator);
anume: 10 m inute pentru com plexul M. tuberculosis, 8 m inute pentru M. kansjisii • aparat de electroforeză;
şi respectiv 5 m inute com plexul M. avium, M. gordonae, M : avium şi M. mtmpel-
• transilum inator UV;
lulare. Lăsăm tuburile să se răcească la tem peratura cam erei după care le intro
• sistem foto Polaroid;
ducem pe rnd pentiu citire într-un luminometru. ........... I
• pipete autom ate P2, P20, P200, P1000; vârfuri; tuburi Eppendorf;
Interpretare / • gheaţă şi Cutii pentru gheaţă;
® în cazul com plem entarităţii dintre A D N -ul extras din tulpina testată şi sonda • am estec dN TP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP);
nucleotidică, va avea loc hibridizarea şi respectiv va fi evidenţiată em isia • Taq A DN polim eraza şi tampon de am plificare;
luminoasă, reacţia este pozitivă; ' • primeri (am orse) pentru M. tuberculosis sau pentru M. avium;
® lipsa em isiei lum inoase sem nifică o reacţie negativă.
( ■
Interpretare .. I î : n :.i: *' 1. Diagnosticul rapid al infecţiilor, pornind de la produse patologice sau cultură
• o reacţie pozitivă pentru M. tuberculosis (1561.10) este reprezentată d e un Prin tehnici cromatografice se pot identifica anumiţi compuşi care sunt în m od carac
ăm plicon (produs de am plificare genetică) având o dim ensiune de 201 pb în teristic asociaţi cii 'agefitul etiologic al unei anum ite boli transmisibile, spre exemplu:
tim p ce pentru M. tuberculosis (Mt308), este reprezentată de un ăm plicon
• identificarea şi analiza unui am estec de acizi graşi cu lanţ s c u rt (volatili şi
avand o dim ensiune de 276 pb ,
!.:jţoii tJnxr iii !>.■->:-1 îxiuî nevolatili) în puroi, lichid pleural, lichid de ascită etc, sem nificând o infecţie
• o reacţie pozitivă pentru M.^avium e ste reprezentată ,de, un ăm plicon,având o . cu bacterii angerobe (GC-FID);
dimensiune de 205 pb; . , . iiiy ^ u m • determ inarea prezenţei m anozei şi D -arabinolului la pacienţi cu candidoză sis
• din cauza sensibilităţi foarte crescute a reacţiei de polim erizare în lanţ (am pli tem ică (G C -FID );
ficarea unei singure m olecule ADN) trebuie luate o serie.d e m ăsuri care să • determ inarea prezenţei acidului -hidroxim iristic, pentru a dem onstra existenţa
provină contam inarea cu acizi nucleici exogeni, spre exem plu unei infecţii cu bacterii gram negatice (GC, M S, M S-SIM );
• nn se prepară A D N , reactivi şi am estecurile pentru reacţie în spaţiile în care • identificarea acidului tuberculostearic în spută sau LCR şi/sau acizilor m icoce-
so m anipulează produşii PC R ; se recom andă c a diferitele etape să fie exe- rozici în cultură de 5 zile, pentru diagnosticarea infecţiilor produse de myco-
eiitate în cam ere separate; în plus, este recom andată folosirea h o te lo r cil bacterii; m etoda ar fi extrem de utilă în m eningita tuberculoasă, o adevărată
flux lam inar dotate cu surse de lumină UV pentru inactivareă A D N conta- problem ă de diagnostic (TLC, GC);
,*• .. ... ." - •. .... *»i’'?.ffii
.. >V i î .i>biv;?»)1’ V-'Ş
1‘.i* ■it
niim n t;
• determ inarea unor concentraţii crescute de acid lactic în LCR, lichid de ascită,
lichid pleural etc pentru a diferenţia inflam aţia bacteriană de cea ne-bacteriană
•
(GC) etc.
•; ,jrJ i-;'d
:/:0. .1 4' Alegerea corectă a antibioticelor în tratamentul bolilor infecţioase
. w ,\\ 1 •A l , .'iik'.rj : i î t d A i Modificări ale spectrului antimicrobian iniţial
U ; . "î. ? ■’ / VrV/ : U ' p î - P P
p
i " ■\ • ‘'.'fi. 1' i i ' f . T i i . : 'I. •• f, ’•.iţi,ii': K
Implicaţiile clinice, terapeutice, epideiniologice şi administrative ale fenomenului de
rezistenţă bacteriană la antibiotice şi chimioterapice sunt extrem de mari. Selectarea tul
, .'(U ■:> 'iii .■ . :i'ţi : '.fi : o pinilor rezistente (adeseori datorită unor abuzuri de prescriere, în spitale, alte unităţi sanitare
• ■. ».■ ‘ ... AV- ’ sau prin auto-medicaţie), duce la variate aspecte negative: infecţii cu germeni rezistenţi,
apariţia şi transmiterea „germenilor de spital11, devalorizarea şi pierderea unor medicamente
antimicrobiene etc. Este strict necesară supravegherea fenomenului de rezistenţă la antibio
tice şi chimioterapice, testarea sensibilităţii germenilor, notificarea şi evaluarea statistică,'
■ t.'.o: v., j' -‘ ■< .1 ■■ , publicarea periodică a datelor şi punerea lor la dispoziţia sistemului sanitar.
Controlul terapiei antimicrobiene se va realiza pe tot parcursul administrării şi va Testarea sensibilităţii la agenţi antimicrobieni
cuprinde metode clinice (ex. ameliorarea simptomatologiei) şi de laborator (examene para-
în general, o tulpină poate fi considerată sensibilă atunci când germenii sunt în mod efi
clinice, dozarea antibioticelor în ser etc).
cient afectaţi de către antibiotic, iar efectul terapeutic poate fi obţinut cu doze şi pe căi de
Erori frecvente în utilizarea antibioticelor administrare „obişnuite". Tulpina va fi considerată moderat sensibilă dacă germenii sunt
afectaţi într-o măsură mai mică, iar efectul terapeutic nu poate fi obţinut decât în condiţii
Antibiotico-terapia se află într-un impas constatat clinic prin numeroase eşecuri terapeutice speciale (ex. prescrierea unor doze mai mari decât cele „obişnuite", utilizarea unor căi de
şi confirmat prin studii de laborator. Principalele probleme sunt reprezentate de un număr imens administrare speciale/injectare intravenoasă, intrarahidiană etc). în mod absolut se consideră
de prescrieri abuzive şi de folosirea iraţională a unor antibiotice. Ck rezultat se dbnkta't'ăiapariţia că o tulpină este rezistentă dacă rezultatul testării sensibilităţii in vitro este negativ.
de specii sau de tulpini („mutante") bacteriene cu1rezistenţă la antibiotice şi înmulţirea reacţii
lor adverse fală deaceste medicamente.' \ ’[ ‘‘ ‘ M etode de testare a sensibilităţii bacteriilor la agenţi antimicrobieni
Soluţia cea mai bună pentru prevenirea acestor problemei este, folqşirea raţională a medi Deoarece între rezultatele testării in vitro şi efectul terapeutic in vivo pot exista anumite
camentelor antimicrobiene deja existente, în acest sens fiind necesar, să cunoaştem care sunt diferenţe, metodele de testare a sensibilităţii pot fi diferenţiate în:
cele mai frecvente erori în folosirea antibioticelor.;; , , , , , .ytk^ nril.-ir.dot -.n.S a. metode de testare a sensibilităţii in vitro
1. Este incorectă utilizarea'antibioticelor în -lipsa unui diagnostic clinic, folosirea acestor b. metode in vivo, care ţin cont de relaţia agent terapeutic-infecţie.
medicamente în orice „stare febrilă" (temperatura trebuie, monitorizată corespunzător), în
„bănuiala, unei infecţii", în cursul unui tratament „la întâmplare" sau „pe încercate",,nefunda- Metode de testare a sensibilităţii in vitro
mentat pe criterii raţionale (cel puţin criterii de probabilitate). Oferirea criteriilor de;probabili
Antibiograma face parte din prima categorie de metode menţionate. Reprezintă metoda
tate este o datorie a centrelor naţionale de referinţă care trebuie să realizeze şi să publice peri
de laborator prin care se apreciază sensibilitatea la antibiotice a germenilor recoltaţi de la
odic studii privind circulaţia tulpinilor microbiene, implicarea acestora în diferitele,entităţi clini bolnavii cu infecţii bacteriene, după cultivare pe medii speciale (de exemplu pe agar
ce, sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor izolate etc,m u : ' - m ■ nnmm . •i i . ni ucUm. Muelier-Hinton).
2. Este incorectă prescrierea unui medicament antimicrobian în afara contextului (şi Pentru antibiograme trebuie să folosim culturi pure (reprezentând o singură tulpină bac-
interpretarea corectă a datelor de laborator). Indiferent de specialitate este necesară cu teriană), chiar în cazul infecţiilor multibacteriene. Cele mai frecvent utilizate tehnici sunt:
noaşterea şi utilizarea în mod corespunzător a unor noţiuni, elementare de microbiologie. Nu
• Tehnicile calitative
se va (începe antibioticoterapia înainte de recoltarea produsului patologic şi de efectuarea
• antibiograma difuzimetrică comună (cu discuri)
unor examene paraclinice elementare (leucogramă, VSH, radiografie, sumar de urină etc).
Nu trebuie să uităm că în supiciunea unei infecţii avem la îndemână posibilitatea efectuării • antibiograma difuzimetrică comparativă
de preparate între lamă şi lamelă şi frotiuri colorate, a cărof examinare poate dura uneori • antibiograma difuzimetrică standardizată
doar 5 minute, permiţând în scurt timp obţinerea unui rezultat orientativ, uneori foarte • antibiogramele difuzimetrice rapide
important. încă din al doilea an de studiu se obţin primele date referitoare la testarea sensi • Tehnicile cantitative
bilităţii la antibiotice (antibiograma), metodă care nu trebuie interpretată mecanic, nu tre • metoda diluţiilor în mediu lichid
buie nici subestimată şi nici supraevaluată. , ,. , , , , ;: ;j . • metoda diluţiilor în agar
3. Este incorect să nu cunoaştem şi să nu utilizăm corespunzător noţiunile şi datele • metoda microdiluţiilorîn agar
privind spectrul antimicrobian,'folosirea antibioticului1de elecţie, difuzibilitatea în focar, • metoda „punctelor de ruptură"
mecanismul de acţiune,;reacţiile adverse posibile, , ,; ., (;i> ; ,j> ■: • testul „E“
4. Utilizarea antibioticelor în.scop profilactic trebuie, privită cu rezerve. Este incorect să • metode şi sisteme comerciale, automatizate de testare etc.
nu cunoaştem foarte bine situaţiile în care antlbioticoprofilaxia este utilă şi recomandabilă.
A ntibiogram a difuzim etrică comună
3. Este incorect să nu acumulăm cunoştinţele necesare de microbiologie, farmacologie,
fiziopatologie, semiologie medicală; medicină internă, care contribuie la evitarea erorilor în Din punct de vedere tehnic însămânţăm germenul de testat pe mediul solid (ex. agar
conducerea tratamentului sau/şi greşelile în tehnica de administrare. "• • ■■■’ ' Muelier-Hinton) turnat în plăci Petri. însămânţarea se poate realiza de exemplu prin „inun
darea" plăcii urinată de aspirarea, aseptic, a excesului de inoculsau cu ajutorul unui tampon
6. Este incorect ca atunci când avem un dubiu cu privire la decizia pe care urmează (există şi alte variante tehnice). După circa 20 minute (timp în care placa Petri se lasă cu
să o luăm să nu ne consultăm cu alţi colegi, pentru a alege întotdeauna cea mai bună capacul întredeschis în vecinătatea becului de gaz, aprins) se aplică microcomprimatele în
variantă posibilă.
98 Diagnosticul de laborator în microbioiogie
care sunt încorporate antibiotice în concentraţie standardizată. Aplicarea microcompri- • există elemente minerale care trebuie adăugate în cazul testării anumitor microor
matelor se poate face cu ajutorul unei pense, în condiţii aseptice, sau cu ajutorului un apli- ganisme (ex. Mg2+ şi Ca2+, pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa, atunci
cator „automat" (la minim 30 mm distanţă între ele şi minim 15 mm de ntarginea plăcii; vom când este testată sensibilitatea la aminoglicozide);
utiliza 5 antibiotice diferite pentru o placă Petri cu diametrul de 9 cm). Microcompriniatele • se va verifica pH-ul mediului (de obicei cuprins între 7,2 şi 7,4);
trebuie să vină în contact perfect cu mediul, motiv pentru care, cu •ajutorul unei pense le
• există suplimente nutritive care trebuie adăugate în cazul testării Unor microorga
presăm uşor (după cai). După încă115-20 minute, incubăm plăcile peste noapte în termostat,
nisme pretenţioase;
la 28 sau 35-37°C, în funcţie de temperatura optimă de multiplicare a microorganismului
testat. Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzează în'm ediu; realizând zone de • grosimea mediului trebuie să fie de 4 mm (25 ml de mediu/placă de 9 cm);
( . 1• li? z ; .. ,
inhibiţie în care coloniile microbiene nu se dezvoltă. Cu'cât zona de inhibiţie este mai largă, o inoculul, care se obţine de preferat din 5 colonii izolate (cultură pură)'trebuie să aibă o
cu atât germenul va fi considerat mai sensibil. Dacă în interiorul zonei de inhibiţie (phiar turbiditate corespunzătoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland (circa IO8 unităţi
dacă diametrul înregistrat este foarte mare) se dezvoltă colonii, „mutanţi rezistenţi", ger formatoare de colonii/ml) în majoritatea cazurilor;
menul va fi considerat rezistent. 11 ....... " / '’'i "/1" , • timpul de incubare (în majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37°C, nu mai mult de 2-3
Această metodă, cu toate că este folosită pe scară largă în laboratoare, permite de fapt plăci suprapuse), atmosfera de incubare, umiditatea atmosferei de incubare;
numai eliminarea antibioticelor complet inactive şi eventual selecţionarea antibioticelor • concentraţia substanţelor antimicrobiene din microcomprimate şi dimensiunea micro-
foarte active, pentru că tehnica nu este standardizată. ' ,> ■:• i .• comprimatelor (6 mm diametru);
Antibiogram a difuzim etrică com parativă (Stokes, Balş) • alegerea substanţelor antimicrobiene pentru care se face testarea;
• păstrarea plăcilor cu mediu până în momentul utilizării (maxim 7 zile, în pungi de poli
Se efectuează pentru microorganismul de testat în paralel cu un microorganism de refer
etilenă, la +4°C);
inţă, din aceeaşi specie (sau o specie asemănătoare). Spre exemplu, pentru cocii grain pozi
tivi putem alege pentru comparaţie o, tulpină de Staphylococcus spp.,Tulpina de referinţă are • utilizarea tulpinilor de referinţă pentru controlul de calitate; .
o sensibilitate cunoscută la diferitele antibiotice pe care le utilizăm. • interpretarea rezultatelor (se măsoară diametrul zonei de inhibiţie şi se compară rezul
Prin această metodă se înlătură o parte din factorii de eroare ai metodei precedente, spre tatele cu ceje.din tabelele puse la dispoziţie de producători şi/sau centrele de referinţă).
ex. calitatea mediului, calitatea discurilor de antibiotice, care vor fi identice pentru microor Metodele difuzimetrice au dezavantajul că nu permit aprecierea concentraţiilor eficace
ganismul de referinţă şi pentru microorganismul testat. Rezultatele se exprimă cu termenii: ale antibioticului la nivelul focarului infecţios.
„sensibil", „intermediar", „rezistent", în funcţie de diametrul zonelor de inhibiţie a multi
plicării celor doi germeni, faţă de acdaşhmtibiotic (jumătăţile de cerc se examinează com Metoda diluţiilor în mediu lichid
parativ). în cazul în care cunoaşteiiTCMI (concentra|j«'mTnimă inhibitorie) a microorganis Oferă informaţii cu privire la CMI ale antibioticelor studiate,, faţă de microorganismul
mului de referinţă, putem face apretseri-mi privire M CM Ipentru microorganismul testat. testat. CM1 = concentraţia minimă inhibitorie, reprezintă cea mai mică concentraţie de agent
Din punct de vedere tehnic, pe o placă de forma tmtri'pătrat („împărţită" în 3 zone egale antimicrobian, exprimată în micrograme/ml, care mai exercită o acţiune bacteriostatică
marcând pe partea externă a plăcii liniile de demarcaţie) se inoculează în treimea medie asupra germenului testat.
microorganismul de referinţă iar în treimile exterioare 2 microorganisme diferite, pentru Din punct de vedere tehnic, pentru fiecare antibiotic avem nevoie de mai multe tuburi cu
care dorim să realizăm testarea. Inoculul trebuie să fie astfel realizat încât să conducă.la bulion Mueller-Hinton în concentraţii descrescânde (diluţii binare) pornind spre ex. de la 32 pig/ml
apariţia după incubate a unor colonii foarte apropiate, dar care să nu fie confluente. Plasăm şi până la 0,125 pg/ml, în total 8 tuburi, plus 2 tuburi martor, fără antibiotic (cantitatea finală
microcompriniatele cu antibiotice pe liniile de demarcaţie dintre culturi. Incubăm peste va fi de 1 ml în fiecare tub). Preparăm un inocul standardizat turbidimetric şi în condiţii
noapte la 35-37°C urmând ca în ziua următoare să citim şi interpretăm rezultatele. . aseptice inoculăm'toatei cele 10 tuburi, cu câte 1 ml de inocuj. Agităm pentru a omogeniza.
Incubăm cele 8 tuburi cu antibiotice şi 1 tub martor timp de 16-20 ore la 35-37°C, iar al doilea
Antibiograma difuzim etrică standardizată (Kirby-Bauer)
tub martor îl menţinem pentru aceeaşi perioadă la temperatura frigiderului. Pentru controlul
Din punct de vedere tehnic se realizează asemănător cu prima metodă prezentată,/dar de calitate utilizăm şi un şir de tuburi pe care le inoculăm cu o tulpină de referinţă cores
este standardizată, fiind singura metodă difuzimetrică recunoscută pe plan internaţional, punzătoare. în ziua următoare citim şi interpretăm rezultatele. Deoarece am utilizat o canti
care permite obţinerea unor rezultate reproductibile şi corelabile între laboratoare difeţite. tate de inocul egală cu cantitatea de mediu, concentraţia finală de antibiotic se va înjumătăţi
Elementele necesare standardizării surit:__ ^ , (de ex. în tubul în care diluţia iniţială a fost de 32 pg/ml, diluţia finală va fi 16 pg/ml). în
© mediul (în majoritatea căzuţilor agar Mueller-Hinton, pentru că are o valoare nutritivă tubul martor menţinut la +4°C ar trebui să nu fie prezentă creşterea, în tubul martor menţi
corespunzătoare şi nu conţine substanţe cu acţiune înmbitoare); nut la 35-37°C creşterea trebuie să fie prezentă. în tuburile inoculate cu tulpina de referinţă
trebuie să avem rezultatul corespunzător datelor pe care le cunoaştem privitor la respectiva
i
1 - 4 Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice 10.1
100 Diagnosticul de laborator în microbiologie
• benzi Etest (a. cu agenţi antimicrobieni cu nucleu (3 lactam, b. cu alţi agenţi antimi-
tulpină. în tuburile cu microorganismul testat, ultima diluţie care a inhibat dezvoltarea crobieni); se păstrează în congelator la -20°C; au o durată de utilizare de 1-2 ani (pentru
microorganismului corespunde CM1. Se consideră (în general, pentru că CMI diferă în prima grupă) şi respectiv de 2-3 ani.
funcţie de specia microbiană) că microorganismele în cazul cărora CMI este <3 pg/ml vor • tampoane sterile;
fi eficient inhibate de către antibioticul respectiv şi in vivo.; ;t, . t-fu-vA /: >-V.
• standard de turbidîtate McFarland de 0,5 şi 1,0;
D eterm inarea CMB (concentraţia minimă bactericidă) • pipete Pasteur sterile;
Pornind ,de la rezultatul obţinut prin metoda dîluţiilpr în mediu,lichid, se vor utiliza ca •. .»foarfece; .
sursă de inocul tuburile în care dezvoltarea microbiană a fost inhibată^ Este necesară o placă • plăci Petri sterile cu diametrul de 90 mm şi respectiv de 150 mm;
Petri cu agar MiieUer-Hiftton care va fi împărţită în sectoare, numărul de sectoare fiind co • incubator cu atmosferă obişnuită reglat la 34-35°C; incubarea în atmosferă îmbogăţită
respunzător numărului de tuburi fără creştere microbiană. însămânţăm în condiţii aseptice cu CO 2 este necesară în cazul testării anumitor microorganisme;
din fiecare tub fără creştere microbiană, fiecare în secforitl deplăcă cbrespunzator. Incubăm ■ • sursă de lumină;
pentru 16-18 ore la 35-37°C. CMB va corespunde ultimei-concentraţii de antibiotic care a
• aplicator Etest şi bandă adezivă (opţional).
distrus microorganismele însămânţate (sectoare de placă fără apariţia culturii). Se consideră Tehnica de lucru:
că antibioticul va fi eficient in viyo dacă în serul pacientului se pot atinge concentraţii de
A. Benzile Etest
antibiotic care să depăşească de 4-8 ori CMB. . u. , =<- i u- i ' - ; - , -
Determinarea CMI şi CMB este extrem de ,importantă pentru, .aprecierea, eficacităţii • scoatem plăcile cu mediul de cultură şi benzile Etest din congelator, le lăsăm la tem
antimicrobiene a unui antibiotic asupra unei tulpini bacteriene. Pentru tratamentulinfecţiilor peratura camerei pentru echilibrare termică timp de 20 minute sau până când nu mai
observăm nici o urmă de umezeală;
severe (de exemplu endocardite, meningite, septicemii etc), precum şi la imunodeprimaţi,
efectuarea acestei metode este indispensabilă. .., • înainte de a deschide folia care include benzile, inspectăm pentru a observa dacă există
perforări; dacă folia respectivă nu este intactă, atunci benzile din interiorul ei nu se mai
Determ inarea CM I p rin testul E (E test) . .•«, pot folosi; dacă nu sunt probleme, pentru a deschide o folie mai intâi tăiem cu o foar
E test reprezintă o metodă de testare in vitro a sensibilităţii la antibiotice pentru diferite mi- fecă de-a lungul liniei întrerupte apoi între compartimentele ce conţin benzile;
croorgahisme, inclusiv pentru bacteriile pretenţioase şi germenii anaerobi. E test se aseamănă • scoatem benzile din folie cu ajutorul unei pensete şi le punem în plăci Petri sterile; apoi
metodei diluţiei în agar combinând principiile metodei dîfuzimetrice cu cele de diluţie. E: test le putem aplica pe mediul de cultură care conţine inoculul microbiah de testat;
este uşor de utilizat şi spre deosebire de metoda difuzimetrică permite determinarea valorii CMI. • păstrăm restul benzilor în tuburi în care introducem o substanţă desicantă pentru, a le
Principiu: proteja faţă de umezeală; este necesară protecţia şi faţă de căldură şi expunerea direc
Asemănător metodei dîfuzimetrice, E test necesită un inocul bacterian ajustat ca turbidi- tă la lumină (punem tuburile în congelator, la -20°C).
B. Inoculul bacterian:
tate (standardizat), ce urmează a fi depus pe mediul de cultură potrivit microorganismului stu
diat (ex. mediul Mueller-Hinton, geloză sânge etc), în plăci, Petri. Benzile Etest conţin un gra • cu ajutorul ansei sau a unei pipete, transferăm mai multe colonii dintr-o cultură bacte
dient de agent antimicrobian se aplică după însămânţate. în funcţie de antibiotic, gradientul riană de 18-24 de ore într-un tub cu soluţie salină sterilă sau bulion; omogenizăm
acoperă un şir continuu-'de concentraţii între 0,002-32 jig/ml; 0,016-256 pg/ml sau 0,064- (există şi varianta să transferăm mai multe colonii în bulion, să incubăm timp de 2-8
1024 pg/ml. După incubare (timp de 16-18 ore la 35-37°C) se formează o zonă eliptică de ore până când obţinem densitatea dorită);
inhibiţie. Valoarea CMI se citeşte acolo unde creşterea bacteriană intersectează banda Etejist. • ajustăm (vizual) densitatea folosind soluţie salină sterilă 0,85% sau bulion, la un stan
M ateriale şi reactivi necesari: dard de turbiditate echivalent cu 0.5 McFarland; alternativ, suspensia se poate ajusta
la standardul dorit cu ajutorul unui nefelometru (aprecierea vizuală a turbidităţii inocu-
• plăci Petri cu agar Mueller Hinton (păstrate la 2-8°C până în momentul utilizării)^ .
lului nu garantează numărul corect al unităţilor formatoare de colonii).
. * bulion Mueller Hinton (cu 20-25 mg caţioni de calciu şi,Î0-12,5 mg cationi de mag-
neziu/litru; se repartizează câte 5 ml în tuburi sterile cu capac; se păstrează C. Inocularea plăcilor:
®medii de cultură pentru menţinerea în stare viabilă, a tulpinilor bacteriene necesare • introducem tamponului steril în tubul care conţine suspensia bacteriană de testat, rotim
efectuării controlului de calitate; , f de câteva ori, apoi eliminăm excesul de lichid prin presarea tamponului de pereţii inte
riori ai tubului;
• tulpini martor; ' • •/
a inocul bacterian; • depunem inoculul pe suprafaţa plăcii cu mediul de cultură având grijă să acoperim com
o soluţie salină sterilă (0,85% NaCl) sau bulion Mufeller Hinton, pentru ajustarea inocu- plet suprafaţa mediului (ex. inoculăm pe 3 direcţii diferite, rotind placa cu câte o treime);
luiui bacterian;
.(
• lăsăm placa timp de circa 10 minute, ca să se usuce, înainteide a aplica benzile Etest. • în cazul în care nu apare nici o zonă de inhibiţie, raportăm valoarea CMI caifîind mai
D. Aplicarea benzilor Etest: mare decât cea mai mare concentraţie a agentului antimicrobian de pe banda Etest;
• luăm cu grijă o bandă fără să atingem sau zgâriem partea pe care. este depus agentul dacă zona de inhibiţie nu intersectează banda (zona de inhibiţie se află sub banda
antimicrobian;-dacă folosim pensa sterilă, apucăm cu grijă de căpătui benzii notat cu Etest), valoarea CMI se raportează ca fiind mai mică decât concentraţia cea mai
E (benzile trebuie să fie complet separate una'de cealaltă’înainte’de a' le aplica pe scăzută a agentului antimicrobian de pe banda Etest;
suprafaţa mediului de cultură inoculat cu tulpina de testat); dacă se.foloseştejaplicato- • în caztil unei valori CMI situată între două marcaje ale gradientului benzii, rezultatul
rul Etest, banda adezivă trebuie să fie în poziţia corectă (la fiecare capăt al aplicatoru- pe care îl notăm va fi valoarea cea mai mare; .i
Iui>; o - , V ; '■ o - ;,,, . • raportăm rezultatul obţinut pentru tulpină studiată după ce verificăm rezultatul obţinut
• aplicăm banda Etest pe suprafaţa mediului de cultură, cu capătul ce conţine concen pentru tulpina de referinţă (control de calitate);
traţia cea mai mare aproape de marginea plăcii; • rezultatele C M ! se interpretează conform'criteriilor stabilite de NCCLS (National
• dacă lucrăm cu plăci cu diametrul de 90 mm, aplicăm una sau două benzi; dacă lucrăm Committee for Clinical Laboratory Standards).
cu plăci cu diametrul de 150 mm, putem aplica şase benzi Etest (benzile se pun la dis
tanţe egale, radial, pornind din centrul plăcii; marginea capătului' benzii noţâtâ cu E Alte metode de testare
trebuie să atingă marginea plăcii); • Testarea sensibilităţii la antibiotice a bacteriilor anaerobe:
• banda trebuie să fie în contact cu suprafaţa agarului; eliminăm eventualele bule de aer o metodele sunt utile în special din punct de vedere al supravegherii epidemiologice,
de sub bandă cu ajutorul undi pense începând de la mărginea bulei' şi tnutând-o în sus dar sunt rezervate pentru laboratoarele de referinţă;
pe gradient până la capătul notat cu E (prezenţa bulelor mici nu va afecta rezultatul
• se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid, tehnici de microdiluţii în
testării); mediu lichid, testul E, teste pentru producerea de p-Iactamază etc.
• banda aplicată' pe suprafaţa agarului nu se mută în altă poziţie (luând contact cu me • Testarea sensibilităţii mycobacteriilor:
diul de cultură, agentul antimicrobian de pe pârtea posterioară se eliberează imediat);
» se efectuează respectând prevederile Programului naţional de control al tubercu
dacă banda a fost aplicată cu partea posterioară în sus atunci se apucă cu grijă, se
lozei (care indică situaţiile în care vor fi efectuate aceste testări);
întoarce şi se pune corect pe suprafaţa mediului; dacă banda â atins suprafaţa mesei de
lucru sau un alt obiect, se poate folosi în continuare atâta timp cât nu!a luat contact cu • se pot utiliza metoda concentraţiilor absolute, metoda proporţiilor, metoda
o substanţă lichidă; f ■ ■ m n i i v-, f rapoartelor de rezistenţă, metode radiometrice etc.
• Testarea sensibilităţii altor bacterii:
E. Incubarea: ••
• timpul şi temperatura de incubare depind de combinaţia microorganism-agent antimi » există şi alte bacterii pentru care trebuie respectate condiţii particulare;
crobian ce urmează a fi testate; • spre exemplu pentru testarea sensibilităţii stafilococilor la oxacilină/meticilină se
recomandă ca mediul să conţină 4% NaCl, pentru testarea sensibilităţii la antibio
• incubarea în atmosferă de CO 2 modifică pH-ului mediului de cultură şi poate afecta
activitatea agenţilor ăntimicrobieni; se foloseşte numai în cazul în care microorga tice a streptococilor se recomandă ca mediul să conţină 5% sânge defibrinat de
berbec etc.
nismele supuse testării necesită pentru multiplicare CO2 (Haemophilus spp., Neisseria
gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae etc). • Testarea sensibilităţii fungilor (antifungigrama):
Interpretarea rezultatelor: 1 ® ţine cont de temperatura şi durata de incubare, care diferă faţă de cele pentru bac-
• terii, mediul utilizat fiind mediu! Sabouraud;
• putem citi rezultatul în cazul în care creşterea bacteriană este confluentă sau aproape
confluentă; . . ... . ... •, .... :r. ; » se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid.
• Testarea producerii de P-lactamaze:
• ţinem placa lângă o sursă de lumină (atunci,când mediul este Mueller-Hinton);,citim
valoarea CMI în punctul în care creşterea bacteriană intersectează banda Etest; dacă ®este utilă atunci când se verifică sensibilitatea la antibiotice a microorganismelor
am utilizat agar Mueller Hinton suplimentat cu 5% sânge de oaie, sau gfeloză şocolăt care pot produce p-lactamază (ex. Haemophilus spp., Staphylococcus aureus etc);
Mueller Hinton sau alt mediu opac, vom utiliza pentru citirea rezultatului o sursă de • se pot utiliza teste iodometrice, teste acidimetrice, teste cu cefalosporine cromo-
lumină reflectantă şi o lupă; j gene etc; există şi metode puse la punct pentru testarea sintezei de P-lactamaze cu
o pe geloză-şânge citim zona de inhibiţie a creşterii bacteriene nu zona de inhibiţie a spectru extins (BLSE).
hemolizei;
1
104 Diagnosticul de laborator Tn microbiologie
Exista şi sisteme automate (ex. ATB şi rapid ATB) sau sisteme semiautomate (ex. ATB REACŢII ANTIGEN-ANTICORP UTILIZATE
Expression sau miniAPi), pentru testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice, uti ÎN MICROBIOLOGIE
lizând criteriile de interpretare NCCLS.
antigenele multivalente sunt stabile, disocierea lor fiind dificilă, deoarece esţe necesară • pot avea loc în mediu lichid (reaeţia Ramon, precipitarea în inel Ascoli etc)
ruperea tuturor legăturilor existente. • reacţii de. aglutinare............
• se pot folosi în diagnosticul bacteriologic (ex. reacţia Huddleson) sau
Reacţii încrucişate
• se pot folosi în diagnosticul serologic (ex, reacţia Wright)
în anumite cazuri pot avea loc reacţii încrucişate; un Ag reacţionează cu un Ac care a • reacţia de fixare a complementului (RFC)
fost sintetizat faţă de un alt Ag (aceste reacţii pot apărea de ex. datorită faptului că anumite ■dai • în diagnosticul.serologic al sifilisului,îepţospirozei etc , . , •r
Ag posedă anumite grupări determinante comune).* :Spre exemplu; serul imun ariti-poliza-
’i » îri diagnosticul serologic al infecţiildrivirale etc *v • . ’ ■:
harid capsular de Streptococcus pneumoniae aglutinează eritrocitele umane de grup A (cu
specificitate' antigenică 'conferita de :N-acetil-găîactozamină); târ serul imun' mti-Escheri- • reacţii cie seroneutralizare ' '' ,Vl l:!u •
/' I' ", : vţi- ■;i f ţ i n ■.•
chia coli aglutinează eritrocitele umane de grup1B'(cu spedificitate'ănfigenică conferită'de ... . • reacţia, A S t0 , (în diagnoşticul serologic al infecţiilor ştreptococice)
galactoză). Nu vom detalia aceste,aspecteîn‘materialul'deifăţă.a!i‘ • : •-n»: m w w » diferite intradermoreacţii cu mecanism imun umoral etc
.«’• .{-Wh'ViC:? .. Y*- . i " • reacţii în care componenţele sunt marcatei,
iStadiile reacţiilor a n t i g e n - a n t i c o r p >s y >r: « , a.:;, trims.
• izotopic (radio immuno assay, RIA) - ,
.1(1'' ui
• Interacţiunea primară se datorează legării efective a Ac de Ag şi depinde în mod direct • enzimatic (enyzme linked immuno assay, ELISA)
de cantitatea şi'afinitatea Ac. Din punct de vedere diagnostic, reacţiile Ag-Ac în care • fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA) '
reactanţii se află în interacţiune primară pot, fi puse în evidenţă 'prin nefeiometrievln
• chemiluminiscent (chemiluminişcent assay, CLA), . . •
cazul tipurilor de reacţii care vor fi discutate în capitolele următoare, interacţiunea pri
mară nu devine vizibilă (complexele Ag-Ac sunt de dimensiuni mici, solubile şi se pot
desprinde uşor). In vivo aceste interacţiuni sunt spre exemplu necesare şi suficiente în
vederea neutralizării unor exotoxine circulante i(difterică, botulinică etc), pentru
inhibarea activităţii unor bacterii sau virusuri, sau în declanşarea unor reacţii de
hipersensibilitate (ex. în reacţia de hipersensibilitate de tip I).
• Interacţiunile secundare apar la circa 30 de minute: după interacţiunile primare. Datorită
faptului că Ag poate avea mai mulţi epitopi iar Ac are. minim 2 paratopi complexele pri
mare mici, solubile, interacţionează între ele formând complexe secundare, produsul
final fiind un complex Ag-Ac ca o reţea tridimensională, insolubil, mult mai stâlpii depât
complexele primare. Din punct de vedere diagnostic, reacţiile Ag-Ac în care reactănţii
se află în interacţiune secundară pot fi puse în evidenţă prin tehnici care vor fi enume
rate în finalul acestui capitol şi discutate în capitolele următoare. In vivo, manifestările
interacţiunilor seciindare sunt dependente de natura reactanţilor şi de condiţiile de
reacţie.' .
• • Interacţiunile terţiare definesc manifestările in vivo ale reacţiilor Ag-Ac,şi depind în
special de anumite variabile care sunt caracteristice gazdei. Interacţiunile terţiare pot
conduce la un rezultat pozitiv (protecţia gazdei) sau negativ (degradare tisulară). 1
Reacţii de precipitare în care difuzia în gel este combinată cu migrarea în câmp electric
REACŢIA
» DE PRECIPITARE • Imunoelectroforeza;
• Contraimunoelectroforeza;
f.J' j ! ‘ !iJ (i'l'.'.l! •.'l'b j'i.-iîK lifii J . •« c • Eiectroforeza urmată de imunofixare;
‘.a (i'i Dny.ih-m ih-Aiit w * • Electroimunodifuzia. v '
' l .M U) ii l ?i■ i-'-î/Vtiîţ'î'i of.) iJ e■
Reacţia Ag-Ac de precipitare poate avea loc în mediu lichid sau solid şi constă în unirea , Reacţii de precipitare în mediu lichid
Ag solubile cu Ac specifici, rezultând, complex? antigen-anticorp, care nu devin insolubile
Au la bază unirea Ag cu Ac în mediul lichid, formându-se complexe Ag-Ac, care vor
şi stabile decât în cazul formării unei reţele tridimensionale, conform teoriei reţelei care pre precipita atunci când Ag şi Ac se găsesc în anumite proporţii.
supune: un Ag cel puţin trivalent pentru amplasarea Ac, un Ac bivalent şi condiţii Fizice
favorabile precipitării (ex. Ac puţin giicozilâţi, de tip IgG cu 3% glucide, superiori Ac de tip Reacţii de precipitare în amestec
IgM cu 10% glucide). ■: i». nutr.î •fi'-.'irth ou •<.> .*b«-*.ii vuriiib •••
Reacţia de precipitare între Ag şi Ac se poate cuantifica şi este foarte utilă pentru a demon
Reacţia de precipitare este sensibilă şi specifică în evidenţierea1prezenţei' Ag (pentru stra prezenţa şi respectiv absenţa precipitatului în funcţie de concentraţiile relative de Ag şi Ac.
realizarea reţelei Ag-Ac este necesar ca în reacţie să intre o.anumiţă „cantitate" de Ag şi Ac, Spre exemplu pentru titrarea toxinei difterice (Ramon) se pun în contact, în amestec în tuburi,
care să se găsească într-un anumit raport/prpporţie.jar Ag,care.participă la formarea agre cantităţi egale din componenta care trebuie titrată (toxina difterică, Ag) cu cantităţi variabile de
gatelor sunt într-o cantitate proporţional niai mică, în raport cu Ac). în cadrul cursului se dis Ac la care titrai este cunoscut. Cantitatea maximă de precipitat se găseşte în tubul unde există
cută diferitele situaţii legate de prezonă (exces‘de Â6)i1exces'relâtiv,de;Ac^| ,z6hâ de echi raportul de echivalenţă. Pentru sistemul toxină difterică - anticorpi anti-toxină difterică (ca şi în
valenţă (Ag şi Ac se găsesc „în totalitate" în precipitat), eXces relativ de Agşurespectiv post-, cazul sistemului toxină tetanică - anticorpi anti-toxină tetanică), raportul de echivalenţă se
zonă (exces de Ag). Pentru anumite sisteme Ag-Ac va fi definită şi noţiunea de proporţie „suprapune" peste proporţia optimă, astfel încât se poate observa relativ uşor tubul în care apare
optim ă., cantitatea cea mai importantă de precipitat. Cunoscând titrai anticorpilor, se află imediat titrai
toxinei (1 Lf = / limes floculans = cantitatea de toxină care se combină cu o unitate de antito-
Clasificarea reacţiilor de precipitare xină = 1 UA = 1 unitate antitoxică). Dacă spre exemplu precipitarea maximă apare în tubul în
care titrai anticorpilor este de 10 UA, titrul toxinei este de 10 Lf.
Reacţiile de precipitare se pot clasifica după cum urmează.
în mod asemănător, prin metoda Dean şi Web se poate determ ina titru l anticorpilor
Reacţii de precipitare în mediu lichid anti-toxici, cunoscând titrul toxinei.
• Reacţii de precipitare în amestec, reacţii de floculare; Reacţii de precipitare în inel
• titrarea toxinei difterice (metoda Ramon), determinarea titrului Ac antitoxici etc;
Reacţia de precipitare în inel, constă în punerea în contact a Ag şi Ac astfel încât să nu
• VDRL (Venerai Disease Research Laboratory), USR (Unheated Serum Reagin), se amestece; reacţia care apare la interfaţa dintre Ag şi Ac se concretizează printr-un inel de
RPR (Rapid Plasma Reagin) etc, în diagnosticul serologic al sifilisului. precipitare albicios. Se utilizează pentru identificarea originii petelor de sânge (reacţia
• Reacţii de precipitare în inel Uhlenhut, în medicina legală) şi pentru identificarea provenienţei unor preparate pe bază de
• reacţia Ascoli, determinarea grupului streptococic etc. carne (în industria alimentară).
• Reacţii de precipitare în tub capilar j. ■ Demonstrativ, în cursul lucrărilor practice, reacţia de precipitare în inel (reacţia Ascoli) se
poate utiliza pentru identificarea prezenţei antigenului cărbunos (Ag obţinut de la Bacillus
• determinarea prezenţei proteinei C reactive; ,i J
ahthracis). Istoric, soluţia de antigen se prepara pornind de la organe (de ex. splină) recoltate
• determinarea prezenţei tipului M streptococic (streptococi de grup A) etc. de la un animal care a decedat şi pentru care se suspecta că decesul a fost produs de o infecţie
« Dozajul nefelometric etc j generalizată cu Bacillus anthracis. Fragmentul de organ se mojara în soluţie de clorură de sodiu
sterilă, adăugându-se ulterior câteva picături de acid acetic, apoi se menţinea la temperatura de
Reacţii de precipitare în mediu gelifiat i fierbere timp de 5-10 minute. După decantarea şi alcalinizarea cu NaOH, urma filtrarea şi rezul
I'
®Imunodifuzia radială simplă (ex. metoda Mancini) ta soluţia antigenică. Din punct de vedere tehnic vom utiliza 3 tuburi, 1 pentru reacţie şi 2 tuburi
o Difuzia dublă . martor. în primul tub martor vom pipeta 0,5 ml ser anticărbunos şi 0,5 ml soluţie salină fizio
logică iar în al doilea tub martor vom pipeta 0,5 ml ser normal de cal şi 0,5 ml soluţie de anti-
• metoda Elek
• difuzia dublă radială (Ouchterlony)
no Diagnosticul de laborator în microbiologie 16 Reacfii antigen-anticorp: reacţia de precipitare 111
gen. în ceea ce priveşte tubul de reacţie trebuie să pipetăm întâi 0,5 ml din seruî anticărbunos, Imunodifuzia dublă radială (Ouchterlony)
urmând ca soluţia de antigen (în cantitate de 0,5 ml) să fie pipetată foarte lent, eventual prin Imunodifuzia dublă se bazează pe difuzia Ag şi Ac (unul spre celălalt) într-un gel. Deoarece
„scurgere picătură cu picătură", pe peretele interior al tubului, în aşa fel încât cele 2 soluţii să nu mărimea moleculelor de Ag şi Ac este mai mică decât diametrul porilor gelului, iar distanţa par
se amestece. în cazul reacţiei pozitive (prezenţa Ag cărbunos în soluţia antigenică), după circa cursă de reactant într-un anumit timp este direct proporţională cu gradientul concentraţiei sale
5 minute, la interfaţa dintre cei 2 reactivi apare un „inel" de precipitare. şi invers proporţională cu greutatea sa moleculară, migrarea reactanţilor unul spre celălalt deter
mină formarea unor linii de precipitare la locul de întâlnire Ag-Ac. în gelul transparent vor
Reacţii de precipitare în mediu geiifiat ; ^ :: ;Vi .; apărea linii opace, numărul lor corespunzând numărului sistemelor Ag-Ac studiate.
Metoda certifică prezenţa sau absenţa proteinei cercetate. Se pot evidenţia alfa-fetopro-
Utilizarea gelozei, în care pot să migreze cei doi reactivi (se va utiliza o anumită con
teina, proteina C reactivă, beta-2 microglobulina, proteine Bence-Jones tip kappa şi lambda,
centraţie de agar în soluţie de’tampon veronaî, în aşa 'fel încât porii getului şâ permită
produşi de degragare ai fibrinogenului etc. în micologie, prin imunodifuzie se poate identi
migrarea), va duce la vizualizarea reacţiei Ag-Âc printr-un arc/linie de precipitare.
fica prezenţa exoantigenelor fungice (Histoplasma capsulatum, Blastomyces dennatidis,
Imunodifuzia radială simplă (IDRS Mancini) j,
Coccidioides immitis etc) sau prezenţa Ac faţă de Ag fungice, spre exemplu în diagnosticul
serologic al unei aspergiloze invazive. Această metodă este încă frecvent utilizată pentru
Imunodifuzia radială simplă (Mancini) şe pazează pe ciifuzia spontană şiiradială a Ag din determinarea specificităţii anticorpilor antinucleari sau a altor anticorpi în patologia umană.
proba de cercetat, într-un gel care conţine,o cantitate conştantă de. anticorpi, determinând Sunt necesare lame de microscop pe care se toarnă un gel de agar 1%, lama putând fi folosită
apariţia unui cerc de precipitare al cărui diametru este direct proporţional cu concentraţia de pe parcursul unei zile (dacă acest lucru nu se poate îndeplini, lama trebuie păstrată în camera
antigen din probă. Pentru a obţine un cerc de precipitare de mărime convenabilŞ.: concen umedă, la temperatura frigiderului, pentru maxim o săptămână). în gelul de pe lamă se perforează
traţia Ac înglobaţi în gel trebuie să fie aleasă în funcţie de titrul acestora şi de coî^enţraţia 3 grupe de godeuri, câte 7 godeuri în fiecare grup (1. godeu central şi 6 godeuri periferice, fiecare
Ag care urmează a fi testat. Metoda permite determinarea cantitativă a imuppgl^ulinelpr cu diametrul de 3 mm). Dacă spre exemplu dorim să determinăm prezenţa proteinei C reactivă
(IgG, IgM, IgA), fracţiunii C3 a complementului, alfal-anţitripsinei, siderofilinei etc., . (CRJP) în seruri de cercetat, avem nevoie de un ser cu Ac anti-CRP, seruri de cercetat şi un ser de
Sunt necesare plăcuţe (de ex. cu diametrul de 5 cm) în care se toarnă un gel cară include referinţă care conţine CRP. Numerotând godeurile periferice, pipetăm Ac anti-CRP în godeul
Ac faţă de structura a cărei concentraţie dorim să o determinăm. Există un cod al culorilor central şi ser de referinţă cu CRP în godeurile 1 şi 4. în celelalte godeuri pipetăm serurile de cer
şi spre exemplu, plăcuţele care vor fi utilizate pentru determinarea concentraţiei âe IgG au cetat. Incubăm Ia 37°C, timp de 24 de ore, în cameră umedă (într-o cutie Petri putem pune o
culoare roşie, pentru IgA culoarea este albastră, pentru siderofilină culoarea este portocalie bucată de vată îmbibată în soluţie salină fiziologică, alături de lama respectivă). Liniile de preci
etc. în gel sunt perforate mici godeuri (3 mm diametru). Sunt necesare seruri de cercetat şi un pitare pot deveni vizibile după 2-4 ore dar sunt mult mai clare după 24 de ore.
ser de referinţă în care se cunoaşte concentraţia diferitelor componente (spre ex.;câte 100 Pentru citire poate fi necesară o lupă şi o sursă de lumină. între godeul central şi
Ul/ml pentru fiecare dintre cele 3 imunoglobuline). înainte de pipetarea serurilor în godeuri se godeurile 1 şi 4 (martori pozitivi) vor apărea linii (arcuri) de precipitare. în cazul în care de
realizează diluarea acestora, diluţia fiind 1/4 pentru IgG, IgA şi siderofilină şi respectiv 1/2 ex. în godeul 2 există CRP, va apărea un arc de precipitare şi între godeul central şi godeul
pentru IgM, complement C3 şi alfal-antitripsină. Diluţia serului de referinţă se face în funcţie nr. 2. Este certificată prezenţa CRP în cazul în care cele 2 linii de precipitare (dintre godeul
de proteina care urmează a fi determinată. Cantitatea de ser introdusă în fiecare godeu este de central şi godeurile 1 şi 2) sunt una în continuarea celeilalte (imagine de „genunchi îndoit").
5 pi (un godeu pentru serul de referinţă şi restul pentru serurile de cercetat). Dubla difuzie Elek
După 10 minute de nienţinere a plăcuţei pe masa de lucru aceasta se incubează la 37°C,1 Această metodă permite depistarea capacităţii toxigene a unei tulpini de Corynebac-
cu stratul de gel poziţionat în sus, timp de 48 ore pentru IgA şi IgM şi respectiv-24 de ore terium diphteriae. în cazul în care tulpina este toxigenă, toxina va difuza în mediu, iar după
pentru celelalte componente. Citirea se realizează cu ajutorul unei rigle gradate, din. plastici, unirea cu Ac anti-toxină, complexele Ag-Ac vor'da naştere unor linii de precipitare.
o riglă specială pentru această analiză (demonstrat în cursul lucrărilor practice). Se va
într-o cutie Petri turnăm mediul Elek şi după ce mediul s-a întărit, decupăm un şanţ pe unul din
măsura iniţial diametrul cercului de precipitare din jurul godeului în care se .află sşrulpe
diametre, în şanţul respectiv pipetăm 0,5 ini,ser antidifteric, ser care conţine Ac anti-toxină difter
referinţă iar rezultatul obţinut trebuie,să corespundă.aşteptărilor (de ex.,6 mm pentru IgCÎ ică în concentraţie de 1,000 Ul/ml. Ac anti-toxină difterică vor difuza în mediu. După circa 2 ore
care a fost diluat 1/4 şi astfel are concentraţia'de 25 Ul/ml). în cazul că rezultatul este cel însămânţăm perpendicular pe şanţul cu Ac anti-toxină, de fiecare parte a şanţului, o tulpină de
aşteptat, se poate face direct citirea diametrelor cercurilor de precipitare pentru serurilejde Corynebacteriwn diphteriae toxigenă (martor pozitiv), o tulpină de Corynebacterium diphteriae
cercetat; în caz contrar este necesară o „corecţie" (dacă spre exemplu diametrul este 6,5 mm ne-toxigenă (martor negativ) şi tulpini de cercetat, câte un striu (de fiecare parte a şanţului) pentru
în loc de 6 mm, din valoarea obţinută pentru serurile.de cercetat se scad.0,5 mm). După, fiecare tulpină. Incubăm la 37°C pentru 48 ore, dar urmărim zilnic apariţia culturii şi precipitatului
citirea diametrelor, se compară rezultatele cu cele puse la dispoziţie în tabele,.iar cifra obţi (liniilor de precipitare). De-a lungul liniilor de însâmânţare apare cultură bacteriană. Din cultura de
nută se înmulţeşte cu diluţia probei (spre ex. dacă obţinem o valoare de 50 Ul/ml pentru IgG, Corynebacterium diphteriae toxigen, toxina (Ag) difuzează în mediu. Unirea dintre Ag şi Ac duce
vom înmulţi cu 4 pentru a obţine rezultatul real).
112 Diagnosticul de laborator în microbiologie
ia formarea unor complexe Ag-Ac care precipită, iar îrr mediu; ^or apărea linii de .precipitare în
unghiurile dintre cultură şi şanţul cu Ac anti-toxină. în cazul în care apar linii de precipitare în REACŢIA
i DE AGLUTINARE
unghiul dintre una dintre tulpinile de cercetat şi şanţul cu Ac anti-toxină, respectiva tulpină este toxi-
genă. Reacţia va fi negativă pentru martorul negativ şi pentru tulpinile de cercetk rie-toxigene.
Aglutinarea mediată de Ac anti-imunoglobuline si lama de câteva ori, uşor, în toate direcţiile, pentru a favoriza contactul dintre cei 2 reactanţi
şi unirea complexelor Ag-Ac mici, solubile, pentru, a forma reţele de complexe Ag-Ac, în
Anticorpii anti-Ig se vor cupla cu particule „încărcate" cu Ac şi vor duce la apariţia unor cazul reacţiei pozitive (corespondenţă între Ac cunoscuţi şi Ag pe care dorim să îl identi
aglutinate (prin apariţia complexului imun). Se utilizează spre exemplu în decelarea fac ficăm) picătura „se limpezeşte" şi apar grunji de aglutinare. Este indicat să citim reacţia pe
torului reumatoid (tehnica Waaler-Rose). fond negru. De cele mai multe ori citirea se face cu ochiul liber însă în cazul unor aglutinate
de dimensiuni foarte mici poate fi necesar să folosim o lupă, un microscop sau un âglu-
Utilizarea reacţiei de aglutinare în microbiologie 1 tinoscop. Pentru identificarea diferitelor microorganisme există scheme care orientează,
etapele de urmat (tabelele şi schemele respective se livrează de către producători împreună
Vom prezenta atât exemple de utilizare a reacţiei de aglutinare în diagnosticul direct cât
cit serurile cu Ac specifici); Lamele pe care se fac reacţiile de aglutinare, după terminarea
şi în diagnosticul indirect (serologic). Reamintim faptul că în cadrul diagnosticului de,labo
reacţiilor se introduc în amestecul dezinfectant.
rator serologic se. va determina prezenţa (sau se va dovedi absenţa) Ac necunoscuţi în serul
pacientului respectiv, utilizând Ag cunoscutei în diagnosticul serologic, de;regulă, trebuie în cadrai lucrărilor practice vor fi discutate aglutinările pentru identificarea E. coli,
să putem răspunde la minim trei întrebări esenţiale: există anticorpi în serul. pacientului Salmonella spp. până la nivel de specie (conform clasificării Kauffmann-White) şi respec
investigat? care este titrai anticorpilor? cum evoluează în dinamică (în timp) acest titru? în tiv a grupurilor de Shigella spp. T ot‘prin aglutinare directă se mai pot identifica tulpini de
acest scop vom realiza minim două determinări diferite la un ,internal de ,7-1.0 zile .(pentru Vibrio choleras, Haemophilus influenzae tip b, tulpini de Brucella spp., tulpini de E. coli
majoritatea infecţiilor care pot fi diagnosticate astfel). în acest capitol vom discuta atât entero-patogen, iar îri cazul leptdspirelor şi unor rickettsii apariţia aglutinării trebuie verifi
reacţii serologice calitative cât-şi reacţii serotogice cantitative. cată cu ajutorul microscopului.
Reacţii de aglutinare indirectă se pot utiliza pentru detectarea în p.p. a streptococilor de grup
Reacţii de aglutinare utilizate în diagnosticul de laborator microbiologic direct A sau B, pneumococilor, meningococilor, E: coli tip capsular K l, H. influenzae tip capsular b,
Tehnica de aglutinare se execută în a patra etapă a diagnosticului de laborator, respectiv în pentru detectarea unor enterotoxine (stafilococice, ciostridiene etc), pentru detectarea unor
etapa de identificare, pe baza caracerelor antigenice. în momentul aplicării acestei reacţii avem fungi (Cryptococcus neofonnans, Candida albicans, Aspergillus spp.) sau a unor virusuri. Tot
o serie de date pornind de la informaţiile clinice, paraclinice, epidemiologice, s-a prelevat un prin tehnica de aglutinare indirectă se pot identifica exotoxineîn filtratul de cultură, streptococii
anumit p.p. care s-a examinat din punct de vedere microscopic şi a fost cultivat. Aşa cum am de grup A-D, E, coli 0:157, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes etc.
menţionat anterior, în vederea identificării este necesar să avem colonii izolate, cultură pură.
2. A glutinarea în tuburi
/ . , .... ... .
1. Aglutinarea pe lam ă Tehnica de aglutinare în tuburi se poate folosi pentru confirmarea unui rezultat pozitiv
Spre exemplu, în cursul identificării unei tulpini enterobacteriene (Shigella spp., la aglutinarea pe lamă sau atunci când rezultatul unei aglutinări pe lamă nu este suficient de
Salmonella spp., E. coli etc), după cultivarea p.p. pe medii selectivo-diferenţiale se obţin clar. Vom avea ia dispoziţie cultura pură de identificat care se va prepara diferenţiat în
colonii izolate şi din porţiunea superioară (bombată) a coloniilor izolate facem treceri pe funcţie de tipul de Ag pe care dorim să-l identificăm. Spre exemplu, ducă încercăm să iden
medii multitest (ex. TSI, MIU). în ziua următoare, avem deja mai multe elemente pentru tificăm Ag de tip O, iar bacteria ar putea să prezinte şi Ag H sau Ag K (care ar putea inhi
încadrarea tulpinii izolate într-o specie, dar, folosind spre exemplu cultura bacteriană dez ba aglutinarea cu Ag O) cultura se va menţine 1-2 ore la 1.00°C pentru inactivarea Ag de
voltată pe mediul TSI, putem face reacţia de aglutinare. în nici un caz nu se vor utiliza pen înveliş, după care se va trece la realizarea aglutinării în tuburi (o procedură asemănătoare
tru identi ficarea pe bază de caractere antigenice tulpini mai „vechi" de 18-24 ore. poate fi necesară şi în cazul tehnicii de aglutinare pe lamă). Vom utiliza un şir de eprubete în
Pentru realizarea reacţiei de aglutinare sunt necesare următoarele: cultura de identificat care vom introduce Ac cunoscuţi, care se vor dilua succesiv, binar, cu soluţie salină fiziolog
(colonii de tip S, de 18-24 ore), soluţie salină fiziologică, Ac cunoscuţi faţă de Ag pe care ică. în tuburile respective vom adăuga o cantitate echivalentă de suspensie Ag (spre ex., la 0,5
dorim să le identificăm (Ac polivalenţi, Ac monovalenţi de grup, Ac monovalenţi de tip, ml Ac vom adăuga 0,5 ml suspensie Ag). lncubarea se va face diferenţiat, în funcţie de tipul
după caz), lame de microscop curate, pahar Berzelius cu amestec dezinfectant etc. 1 j de Ag pe care dorim să-l identificăm (ex. 20 ore la 52°C pentru identificarea Ag O).
Iniţial, pe o lamă de microscop curată şi degresată punem la una dintre extremităţile Reacţia este pozitivă în cazul apariţiei aglutinatelor (grunjoase - în cazul prezenţei Ag O,
lamei o picătură de soluţie salină fiziologică, în care suspendăm un fragment din colotjia de floconoase - îlT cazul prezenţei Ag H etc). Reacţia de aglutinare în tuburi permite şi verifi
identificat în aşa fel încât să obţinem o suspensie omogenă, opalescentă. în cazul în cai;b sus care litrului la care are loc formarea complexelor Ag-Ac.
pensia rămâne omogenă, putem trece la etapele următoare; în cazul în care picătura „se Reacţii de aglutinare utilizate în diagnosticul serologic
limpezeşte" şi apar grunji, tulpina este ne-tipabilă prin această metodă (apare „aglutinarea
nespecifică"),-ar putea fi vorba de o tulpină care provine dintr-o colonie de tip R. în urmă în diagnosticul serologic, în mod obişnuit, reacţiile utilizate permit detectareaprezenţei
toarea etapă, la cealaltă extremitate a lamei, punem o picătură de ser cu Ac cunoscuţi, de ex.: Ac în serul de cercetat dar şi stabilirea litrului. Totuşi există şi câteva exemple de reacţii de
polivalenţi şi realizăm o suspensie omogenă, opalescentă, a coloniei de identificat. înclinăm aglutinare calitative.
Diagnosticul de laboratorân microbiologie
116
REACŢIA
» DE FIXARE A COMPLEIVIENTULUI
1. A glutinarea pe lamă
Reacţiile de aglutinare pe lamă Huddleson (în diagnosticul brucelozei) şi respectiv
Kudicks-Steuer (în diagnosticul tifosului exanţematic) au intrat în istoria'medickţei. Prima
dintre reacţii o utilizăm demonstrativ în cadrul lucrărilor practice, apariţia aglutinatelor fiind
clară iar tehnica de lucru foarte simplă. Sunt necesare următoarele materiale: lame de micro
scop.curate, Âgbrucel’os inactivat (colorat în violeţii ser de cercetat., pe p lam^ de.microscop , Sistemul complement
depunem o picătură dirhsoluţia de Ag brucelos şi în imediata, vecinătate, a acesteia, o picătură
de,ser de cercetat.,Cu colţul unei,alte lame amestecăm şi.omogenizăm cei. doi reactanţi. Prin Complementul reprezintă un constituent foarte important al apărării naturale şi respectiv
mişcări de înclinare a lamei în toate direcţiile facilităm formarea complexelor Ag-Âc, în cazul o componentă normală a serului. Sistemul complement (C’> cuprinde circa 30 de compo
în care în serul de pacient sunt prezenţi Ac anti-Brucella spp. Reacţia.este pozitivă în cazul nente celulare saii plasmatiee. Sistemul C’ se poate activa pe trei căi, repectiv calea clasică,
în care se remarcă prezenţa aglutinatelor. Chiar şi în perioada în care această'se utiliza în calea lectinică şi calea alternă. Activarea pe calea clasică este declanşată în primul rând de
diagnostic, o reacţie pozitivă pe lamă trebuia sâ fie confirmată prin aglutinare în tuburi. formarea complexelor imune (Ag-Ac) dar şi de apariţia celulelor apoptotice, anumite
, Tehnica de aglutinare indirectă poate fi utilizată în diagnosticul serologic al infecţiilor.pro virusuri sau de proteina C reactivă cuplată cu anumiţi liganzi. Calea lectinică poate fi acti
vată de microorganisme care prezintă în structură grupuri manoză-terminale. Calea alternă
duse de Helicobacter pylori, Treponema pallidum (hemaglutinare pâsivăTetc.
poate fi activată de bacterii, fungi, virusuri sau de celule tumorale etc.
2. A glutinarea în tuburi Sistemul C prezintă numeroase activităţi biologice fiind implicat în inflamaţie (componen
tele C3a, C4a, C2b, C5a, complexul C5b7, C3e), în apărarea anti-infecţioasă (opsonizare, faci
Tehnica de aglutinare în tuburi se poate, folosi în diagnosticul serologic al bfuceiozei
litarea fagocitozei, liza microorganismului implicat), în metabolismul complexelor imune,
(reacţia Wright), diagnosticul serologic ai infecţiilor produse de Cryptococcus neoformans,
clearance-ul celulelor apoptotice sau în reglarea răspunsului imun. Cu toate că în mod
diagnosticul serologic al. febrei tifoide etc. Denumirea.de reacţie Widal pentru diagnosticul
obişnuit are un rol benefic, sistemul C’ poate avea şi efecte dăunătoare.
serologic al febrei tifoide a Intrat în istoria, medicine!.
Luând în discuţie diagnosticul serologic al febrelor enterice, inclusiv febra tifoidă, sunt Reacţia de fixare a complementului (RFC)
necesare'următoarele: seruri recoltate (în dinamică) de la pacienţii la care se suspicionează
acest diagnostic, tampon fosfat salin, baie de apă cu temperatură reglabilă, Ag cunoscute (Ag Face parte dintre reacţiile al căror rezultat nu poate fi vizualizat fără un artificiu tehnic,
O şi Ab H). Se va lucra cu minim, două rânduri de eprubete, un rând pentru detectarea în acest caz utilizarea unui sistem hemolitic indicator. Motivul pentru care este necesar acest
prezenţei, şi litrului Ac anti-O, al doilea pentru detectarea prezenţei şi titrului Ac anti-H (pen sistem indicator se datorează faptului că Ag este fie sub formă macromoleculară fie este
tru persoanele în convalescenţă sau în cazul suspicionării stării de purtător vom încerca Să reprezentat de corpi microbieni de dimensiuni foarte mici, iar complexul Ag-Ac format nu
identificăm în serul de cercetat Ac şi titrul Ac ânti-Vi, de ex. prin hemaglutinare pasivă). '' ’ devine vizibil cu ochiul liber. RFC a fost imaginată încă din anul 1901 de către Jules Bordet
şi s-a perfecţionat destul de mult de-a lungul timpului. Această reacţie este utilizată în peste
Serul de cercetat, pentru fiecare rând de tuburi, va fi diluat cu tampon fosfat salin, în
100 de sisteme Ag-Ac, prin tehnici clasice sau tehnici care au suferit modificări, inclusiv
diluţii binare. Dacă amestecul.de ser de cercetat şi diluant va fi în cantitate de 0,5 ml, vom
introducerea micrometodeior RFC.
adăuga o cantitate simiîârifde Ag, câte 0,5 ml Âg O în primul rând de tuburi şi respectiv câte
0,5 nil Ag H în al doilea rând de tuburi. Vom proceda în aşa fel încât să obţinem în primul Reacţia de fixare a complementului se poate folosi atât pentru identificarea Ag cât şi în
diagnosticul serologic. Pentru că nu urmează să discutăm pe larg prima variantă, vom enu
tub. o diluţie de 1/20, în a) doilea,tub 1/40 etc.,Un tub va.cqnţiiie doar un amestec de. tanf
mera doar câteva dintre exemple, RFC permiţând identificarea unor Ag rickettsiene,
pon fosfat sai,in şi soluţie.Âg (tub martor). D upă,ce omogenizăm conţinutul tuburilor, vorh
chlamydiene, virale etc. în diagnosticul serologic, cea mai cunoscută metodă rămâne încă
incuba tuburile cu Ag O timp de 20 ore, la 52°C,,iar tuburile cu Ag H. v.or fi incubate timp
RFC Bordet-Wasserman, utilizată în diagnosticul serologic ai sifilisului.
de 2 ore la 52°C urmat de 10 minute la temperatura camerei. ’' , 1 J
i:*v , . ; .* i . 1 t y <v ;T i ;y , >Ş1 Subliniem faptul că RFC este o metodă laborioasă, în care nu se admit erori tehnice, dar
Citirea se,va realiza după incubare, comparând rezultatul din fiecare tub cu martorul pen
fiind executată corect este foarte exactă, are o mare sensibilitate şi specificitate. Este de aseme
tru Ag. Pentru evidenţierea reacţiei voiţi,agita uşor tuburile. Aglutinarea H,diferă,/de
nea una dintre metodele cu un mare grad de reproductibilitate.
aglutinarea O. Aglutinatul O este mai dens, mai grunjos, în timp ce aglutinatul H este ihai
floconos şi uşor de disociat prin agitare. Ultimul tub care mai prezintă aglutinare vizibilă Principiu
permite.stabilirea, litrului reacţiei. în, capitolul 31, vom relua acest tip de diagnostic şi ,vom
RFC se bazează pe proprietatea sistemului C’ de a se fixa pe complexul imun Ag-Ac. în
discuta modalităţile de, interpretape. , , ; ,, . .„it , .
prima fază a reacţiei se introduce serul de cercetat iar dacă acest ser conţine Ac specifici faţă
Diagnosticul de laborator în microbiologie I 8 Reacfii antigen-aniicorp: reacfia de fixare a complementului 119
118
de Ag cunoscut se va forma W boniplex Ag-Ac,:urmat de fixarea C ’, care se va activa pe * în RFC finală se va proceda astfel
calea clasică şi nu va mai fi „disponibil" pentru a se fixa pe sistemul hemolitic indicator » se diluează conform indicaţiilor din protocolul de lucru reactivii utilizaţi (serul
(hematii + Ac-antihematie). în cazul în care serul de cercetat nu conţine Ac specifici faţă de hemolitic, serurile de cercetat, Ag, serurile de referinţă, C’)
Ag cunoscut, nu va avea loc formarea unui complex Ag-Ac în prima etapă a RFC. După ®se repartizează în godeuri le corespunzătoare serurile de cercetat, Ag şi C’
introducerea în reacţie a sistemului hemolitic indicator, hematiile şi Ac-antihematie se vor e pe o placă separată se prepară martorii (martor pentru sistemul hemolitic, martor pen
cupla, vor forma un complex imun, iar C ’ „liber" se va fixa pe acesta. După fixare va urma tru C ’, martor pentru Ag, 2 martori pentru serul de referinţă, martor sigur negativ)
activarea C ’ şi respectiv liza hematiilor, hemoliza putând fi examinaţii cu .ophiulljbeiv « plăcile se introduc până a doua zi la 4°C
• a două zi, plăcile se menţin la 37°C timp de 30 minute
i M aterial^ şi reactivi necesari ,, : ■ , . w ) 'Aen j,-.
• se adaugă în toate godeuri le sistem hemdlitic
• serul de cercetai recoltat de la pacientul suspect sau o pereche:de seruri, obţinute „în
• plăcile se menţin la 37°C timp de 30 minute
dinamică"; '■ ' ‘ ■' v i, . r r ! 1 -
■si /; ; . . - i • •' : ni ” •d < « i ‘ • se pun plăcile la 4°C, până la sedimentarea hematiilor
• seruri de referinţă (martor pozitiv şi negativ); _ ( ...... ®există anumite diferenţe între tehnicile cantitative şi cele calitative, dar principiile
« Ag,cunoscut (suspensie. coipusculară şavi.şpluţie coloidală, după.caz); sunt aceleaşi ' ■,
e sistemul C’ obţinut din ser proaspăt sau conservat recoltat d e ja cobai; . ,i u a • • în RFC Bordet-Wasserman, metodă calitativă, reacţia se realizează în eprubete, 2
• sistemul hemolitic indicator format din -1 " ........' ‘ ' !/- pentru reacţia propriuzisă (una cu ser diluat 1/8, eelaltă cu ser diluat 1/16, 2 pentru
martori sigur pozitiv şi sigur negativ şi câte una pentru fiecare din ceilalţi martori,
» hematii de berbec, soluţie 4%, valabil timp de o săptămână la4°C
respectiv martor pentru serul de cercetat, martor pentru Ag, martor pentru C ’, mar
• ser hemolitic anti-hematii de berbec (obţinut prin injectări repetate de hematii'de tor pentru serul hemolitic)
oaie la iepurele de laborator, spălate cu soluţie salină fiziologică) titrat şi conservat
îa 4°c ' r .. : In terp retare
» baie de apă cu temperatură reglabilă Iniţial se verifică rezultatele apărute pentru martori (fie că este vorba de o metodă cantita
• plăci cu godeuri, tuburi de hemoliză, pipete1diferitb etc. tivă sau calitativă); spre ex. în cazul metodei calitative, în tubul martor pentru serul de cercetat
/ trebuie să fie hemoliză, la fel ca şi în tuburile martor pentru Ag, C şi ser sigur negativ. în
Tehnica de lucru1 tuburile martor sigur pozitiv şi martor pentru sistemul hemolitic, nu trebuie să fie hemoliză.
Aşa cum am menţionat, tehnica de lucru este laborioasă şi nu va fi prezentată în totali în tuburile cu serul de cercetat, dacă apare hemoliza, înseamnă că nu există Ac, iar tes
tate, în cele ce urmează. , tul este negativ (lichidul din tub va avea un aspect roşu, limpede).
• serul de cercetat se va menţine 30 minute la 56°C, în baia de apă, pentru inactivarea Testul este pozitiv atunci când în tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliză, hemati
ile se depun formând un „buton" în partea inferioară a tubului (în serul de cercetat există
C’ propriu;
Ac). Pentru a stabili diagnosticul final, este necesar ca RFC-BW să fie confirmată prin
o principial, RFC are loc în 2 etape; reacţii specifice (vezi capitolul 45).
• în prima etapă se pun în reacţie C \ serul de cercetat şi Ag cunoscut; sunt 2 posi
bilităţi: a. în serul de cercetat există Ac specifici, rezultând un complex Ag-Acjpe Control de calitate
care se va fixa C ’ b. în serul de cercetat nu există Ac specifici, nu se fonneîiză ■ţ
. Cu privire la controlul de calitate am menţionat utilizarea martorilor, pentru fiecare
complex Ag-Ac, C ’ rămâne liber » reacţie.
• în a doua etapă se introduce în reacţie sistemul hemolitic indicator Chemată t Ac jmţi- ifn RFC utilizată în diagnosticul serologic, Ag cunoscut va fi ales în funcţie de suspiciu-
hernatie); există 2 posibilităţi: a. C ’ nu este liber) nu are loc hemoliza, b. C’ se fixează nea;sde diagnostic. RFC cantitativă se poate utiliza pentru diagnosticul serologic al infecţii
pe sistemul hemolitic, lizează hematiile şi observăm apariţia hemolizei"’ . lor produse de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia spp., Rickettsia spp., Treponema pal
• toţi reactivii utilizaţi trebuie standardizaţi, respectiv se vor realiza , j lidum, Leptospira spp., Borrelia spp., Brucella spp,, diferite virusuri etc.
o omogenizarea suspensiei de hematii cu eventuală etalonarc prin spectrofotorhetiie în-scopul creşterii sensibilităţii şi specificităţii se aleg proprietăţile Ag cunoscut, o anu
o titrarea serului hemolitic • ! mită temperatură „de incubare" (de ex. 4°C în loc de 37°C în RFC Kolmer) etc. Ac fixatori
de C ’ apar precoce în cursul bolii astfel încât identificarea prezenţei lor poate semnifica o
®titrarea C ’ în prezenţa Ag
infecţie acută sau recentă
• titrarea bidimensională a Ag şi a serului de referinţă
/
( (
■
Titrarea Ac anti-SLO se bazează pe faptul că SLO are efect hemolitic asupra hematiilor Utilizarea RSN în profilaxia şi tratamentul unor boli infecţioase
de iepure sau de berbec. în cazul în care în serul de cercetat există Ac anti-SLO, acţiunea Vaccinarea în scopul obţinerii unei protecţii prin seroneutralizare
hemolitică a S L O este neutralizată. Combinând diluţii din serul de cercetat cu o cantitate Vaccinul DTP,include o suspensie de germeni (Bordetella pertussis) în faza.I, combinată
constantă de S L O vom putea determina titrul ASLO. 1 . cu anatoxina difterică şi tetanică. Primovaccinarea se începe vârsta de 2 luni a nou-născutului,
122 Diagnosticul de laborator în microbiologie
.V»
ponenta pertussis) se recomandă eliminarea acesteia la nou-născuţii cu probleme ale sis
temului nervos, la cei predispuşi la boală şi la cei care au avut o reacţie adversă semnifica
tivă la o administrare anterioară a DTP-ului. Se studiază posibilitatea utilizării pe scară largă
a unui vaccin acelular în care să fie inclusă toxina pertussis inactivată. ''
Reamintim că, în funcţie de natura antigenului, metodele aplicate pentru vizualizare,
ÎVS
Evaluarea eficacităţii vaccinurilor scopul urmărit există mai multe tipuri de reacţii Ag-Ac, şi anume:
• Se recomandă testarea stării de imunitate indusă prin vaccinare, conform normativelor 1. reacţii de precipitare;
elaborate de autorităţile de sănătate publică; metodele au la bază titrarea Ac anti-toxi- 2. reacţii de aglutinare;
nă (difterică, tetanică etc) în seruri prelevate de la copii vaccinaţi, prin diferite tehnici. 3. reacţia de fixare a complementului (RFC);
Spre exemplu se consideră că un copiî este protejat (prezintă rezistenţă/specifică în
4. reacţii de seroneutralizare.
cazul unei infecţii difterice) dacă titrul Ac-anti toxină difterică1este mai mare de 0,03
Dacă în cazul primelor 2 tipuri de reacţii vizualizarea se poate face direct (cu ochiul
UAI/ml v '
liber, cu ajutorul unei lupe etc) în cazul RFC şi RSN este necesară utilizarea unor „sisteme
• Se pot face teste de susceptibilitate, in vivo, pentru a verifica dacă persoana investi indicator*1. în continuare vom discuta despre reacţiile Ag-Ac în care pentru interpretare este
gată este sau nu protejată faţă de o eventuală infecţie. în acest scbp.se practică IDR. în necesară marcarea reactanţilor, ceea ce se poate face:
istoria medicinei au intrat IDR Dick, care permite testarea susceptibilităţii faţă de scar
• izotopic (radio immuno assay, RIA);
latina (toxina este elaborată de către streptococul de grup A lizogenizat) şi respectiv
IDR Schick, care permite testarea susceptibilităţii faţă de difterie (toxina este elaborată • enzimatic (enyzme linked immuno assay, ELISA);
de către bacilul difterie lizogenizat). • fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA);
gam bele IDR se realizează similar din punct de vedere tehnic • chemiluminiscent (chemiluminiscent assay, CLA) etc.
• spre ex. în cazul IDR Schick se injectează în treimea medie a antebraţului, strict
( intradermic o cantitate de 0,1 ml toxină difterică diluată corespunzător. în cazul în Radioimunoanaliza (RIA)
care în sângele persoanei testate se găseşte o cantitate de Ac anti-toxină mai mare Posibilitatea utilizării izotopilor radioactivi în medicină a condus la multe descoperiri
de 0,03 UAI / ml, toxina inoculată va fi neutralizată şi nu va apărea nici o modifi importante în domeniu. Introducerea RIA, pentru determinarea cantitativă a prezenţei unui
care la locul inoculării (lipsa eritemului semnifică faptul că persoana testată nu este mare număr de substanţe prezente în cantităţi foarte mici în lichidele biologice, a constituit
susceptibilă să facă difterie, în cazul în care se infectează cu un bacii difterie toxi- un real succes. RIA a fost şi încă mai este utilizată în multe dintre specialităţile medicale.
gen). în cazul în care persoana respectivă nu prezintă Ac anti-toxină difterică, Ag
Pentru marcarea Ag se pot utiliza 3H,, l25I, 14C etc. Se introduc în reacţie o cantitate
inoculat va conduce la apariţia unui eritem ia locul de inoculare
cunoscută de Ag marcat radioactiv, Ag nemarcat pe care dorim să îl dozăm şi Ac cunoscuţi
• UAI = unitate anti-toxică internaţională ■ ■ , cu specificitate faţă de Ag. Se va realiza o competiţie pentru cuplarea cu Ac între Ag mar
cat şi Ag nemarcat radioactiv. După respectarea timpilor din protocolul de lucru se măsoară
Terapia sau profilaxia specifică (imunoterapie pasivă) radioactivitatea complexului Ag-Ac şi aplicând formule de calcul corespunzătoare se poate
• Administrarea de imunoglobuline specifice omologe, obţinute de la persoane imii- afla cantitatea de Ag nemarcat.
nizate (natural sau artificial) faţă de o anumită maladie infecţioasă, de ex. în imunote- RIA este o tehnică obiectivă, cu foarte mare sensibilitate, permite cuantificarea unor can
rapia infecţiei cu Clostridium tetani (tetanos) se pot administra intramuscular 3-6.QOO tităţi foarte mici de Ag sau de haptene dar, datorită problemelor legislative, costului apara
UAI ' f turii şi reactivilor, riscurilor implicate, este înlocuită din ce în ce mai mult cu tehnici de tip
• Administrarea de seruri imune heterologe, obţinute prin hiperimunizarea căilor, în trata ELISA.
mentul tetanosului, difteriei, botulismului etc. /
Terapia bolilor în care mecanismul patogenic implică exotoxine trebuie instituită cât mai
Analiza imunoenzimatică (ELISA, EIA)
rapid, deoarece exotoxinele pot fi neutralizate numai atunci când se găsesc în circulaţie. Marcarea enzimatică a fost introdusă pentru prima oară în histochimie, în 1966, după 5
ani devenind un marker şi în cazul reacţiilor Ag-Ac. Prezenţa complexelor Ag-Ac va putea
( ('
Reacţii antigen-anticorp: reacţii în care componentele sunt marcate ] 25
12 4 Diagnosticul de laborator în microbiologie
în anumite situaţii, rezultatele obţinute prin ELISA trebuie confirmate prin metode mai
fi vizualizată şi cuantificată deoarece unul dintre reactivi este conjugat cu o enzimă, iar după specifice.
adăugarea în mediul de reacţie a unui substrat cromogen specific enzimei marker, densitatea
în continuare vom prezenta succint etapele ELISA în cazul determinării prezenţei de Ac
optică a mediului de reacţie se va modifica iar valoarea densităţii optice se poate înregistra.
anti-mycobacterieni în ser., ,Nu există încă o, standardizare a diagnosticului serologic în
Reacţiile imunoenzimatice pot avea lor în sistem omogen sau heterogeii (activitatea tuberculoză (vezi cap. 42) dar aşa cum urmează să discutăm, pentru a pune diagnosticul unei
markerului enzimatic nu este influenţată de către reacţia Ag-Ac). în continuare nu vom dis infecţii cu M. tuberculosis, toate datele care pot fi obţinute sunt importante şi tlfebuie anali
cuta decât despre al doilea „tip“ de reacţii, care sunt mai frecvent utilizate în microbiologie. zate în context. £,u' 5 l,H‘ 1 ", ,
Tehnicile ELISA pot fi dtilfcate, atât pentru identificarea Ag cât şi pentru identificarea
şi/sau titrarea Ac. în general, reacţiile imunoenzimatice se realizează în următoarea succe •|
i, Principiu ■ ..... i, ....
siune: Anticorpii prezenţi în serul de analizat se leagă specific de Aţj imobilizate pe microplă-
• primul reactiv (Ag sau Ac, în funcţie de ceea dorim să determinăm) este „fixat" pe uh ci Koh-I-Nor Hardmuth. Complexul imun forhiat, reacţionează prin fragmentul Fc al imu-
suport solid (foarte frecvent reprezentat de godeurile unor plăci de plastic,1dar pot fi şi noglobulinelor (în special IgG) cu conjugatul Proteină A stafilococică - peroxidaza din
bile, tuburi etc); de regulă această fixare se fealizeazăde Către companiile1producătoare; hrean (SpA-HRPO) care este pus în evidenţa cu orto-fenilen-diamină HC1 (OPD). Reacţia
este cuantificată fotometric. ’ u
• adăugăm al doilea reactiv, cel necunoscut (Ac sau Ag);' ’ >■■■■■ ’*•", j'1-1’,'T-'
Uli-i: I îi:: :■! •
• în cazul în care există complemeritaritate structurală şi electrochirhică între 'cei doi M ateriale şi reactivi necesari ( V, '
reactivi, are loc cuplarea şi formarea complexului Ag-Ac; pentru eliminarea reactivilor .• Plăci sensibilizate (IC) 1 ■ « > ■ - > ft;
care nu au intrat îh complex are loc o primă Spălare; ' ' ' - : M!
• Tampon 1 (TFSTCH) este format din tampon fosfat salin pH 7,2, 0,15M, Tween 20
• reactivul adăugat în următoarea etapă variază în funcţie de tipul de tehnică ELISA (în 0,05% caseinâ;Hammersten 0,5% şi mertiolat de sodiu 0,l% . Se păstrează la + 4°C.
finalul acestui subcapitol vom prezenta pentru exemplificare una dintre Variantele . Este utilizat pentru rehidratare şi diluări. "■ ;
tehnice); de ex. se poate adăuga un reactiv care se poate cupla cu Ac, iar acest reactiv este • Tampon 2 (TFST) de 10 ori concentrat are aceeaşi compoziţie ca Tamponul 1 cu
la rândul lui cuplat cu enzima (conjugat enzimatic); în continuare are loc o nouă spălare; excepţia caseinei Hammersten. este utilizat pentru spălări.
• pentru vizualizarea reacţiei, adăugăm un substrat cromogen pe care ,enzima poate • Tampon citrat (3) pH 5,0, pentru dizolvarea OPD
acţiona şi conduce la apariţiţt unei culori care se poate vedea şi cu ochiul liber, dar se • Ortofenilen diamină (pastile de 9mg, cântărite de producător)
citeşte cu ajutorului unui spectrofotometru; ■ > ;<U • Ser de cercetat 1
• valorile înregistrate pentru „probă" se compară cu valorile înregistrate pentru martorul , • Ser martor pozitiv (M+)
pozitiv şi martorul negativ, se aplică formula .indicată, de către producător, iar inter • Ser martor negativ (M-);
pretarea se face aşa cum este indicat în protocolul tehnic care însoţeşte trusa ELISA. • Soluţie concentrată de conjugat SpA-HRPO;
Enzimele utilizate mai frecvent sunt fosfataza alcalină şi peroxidaza. în cazul primei enzime, • Perhidrol (30% H20 2).
substratul cromogen va fi p-nitro-fenil-fosfatul, iar în cazul peroxidazei, substratul cromogen va
fi o-fenilen-diamina în soluţie de apă oxigenată. Tehnica de lucru
Prin tehnicile de tip’ELISA se obţine o specificitate bună sau foarte bună, iar sensibili? • în godeurile plăcii sensibilizate (Institutul Cantacuzino) se introduc 100 pi Tampon 1
tatea este comparabilă cu cea obţinută în cazul RIA. Tehnica este obiectivă, a devenit auto? şi se incubează 60 minute la 37°C.
matizată, iar prin extinderea ofertei şi creşterea numărului celor care o utilizează preţurile • Placa se goleşte de conţinut (automat sau prin răsturnare şi scuturare pe un strat de hâr
sunt competitive. ' -0 . ',.0 . «fii: tie de filtru).
Există mai multe modalităţi de clasificare pentru aceste tehnici* spre exemplu: ,-j î« j • Probele de ser de analizat şi serurile martor (M+ şi M-) se diluează 1/25 în Tampon 1
• în funcţie de scopul urtn&rit,'se poate determina prezenţa Ag îh diferite'produse pato (25 pi ser + 0.6 m l Tampon 1). Serurile se repartizează câte 100 pl în 3 godeuri para
logice sau prezenţa Ac în ser, LCR, alte umori; j- lele, notându-se în caietul de lucru poziţia serurilor.
• în funcţie de tipul şi ordinea reactivilor introduşi în reacţie tehnicile pot fi necomţieti- • Incubăm placa la 37°C timp de 60 min, în atmosfera umedă.
tive sau de competiţie (directesau indirecte);,,., , ,, ... .. . • Placa se spală de 3 ori cu Tampon 2 şi de 2 ori cu apă distilată, pentru înlăturarea
• în funcţie ele complexitatea tehnicii, putem discuta despre variantele clasice (aşa cum spumei. Pentru această operaţie, întâi se diluează Tamponul 2 concentrat prin ameste
•a fost descris mai sus şi respectiv aşa cum urmează să fie prezentat în exemplul con carea unui volum Tampon 2 cu 9 volume apă distilată.
cret) şi respectiv despre variantele simple/rapide. ■ ■ •••’«
Diagnosticul de laborator în microbiologie 20 Reacfi i antigen-anticorp: reacţii în care componentele sunt marcate 12 7
126
• Conjugatul SpA - HRPO se diluează 1/500 în Tampon 1 (30 pi conjugat + 15 ml Tampon intrat în complexul Ag-Ac), aşteptăm să se: usuce şi examinăm cu microscopul cu fluo-
1) şi se repartizează câte 100 pl/godeu rescenţă. Putem, identifica astfel Ag aparţinând speciilor Legionella pneumophila,
• Se incubează 60 min la 37°C în cameră umedă. ' Boreletella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia trachomatis, Treponema pal
• Se înlătură din godeuri conjugatul şi se spală ca mai sus de 3 ori cu Tampon 2 şi de 2
lidum, Cryptococcus neoformans, Hiştoplasma capsulatum, Pneumocystis jiroveci etc.
Metoda este rapidă şi aplicabilă pentru frotiuri din p.p. sau din cultură dar şi în anatomia
ori cu apă distilată. ! ^ ‘ i " ■ V ■- ! l,: ■
patologică sau în histochimie:' Pentru fiecare Âg de cercetat trebuie preparat serul care
• Se prepară soluţia de OPD prin adăugarea a 15 ml Tampon 3 şi 8 pi perhidrol, repar- conţine Ac specifici, marcaţi fluorescent. ' /
tizându-se câte 100 pl/godeu.
, ,IF indirectă presupune realizarea unui, frotiuj pornind de la Âg cunoscut. Froţiul se aco
• Se incubează la temperatura camerei, ferit de lumină directă, până în'momentul peră, cu .ser de cercetat şi. dujiă o ihctibaţieide ŞO minute la 37°C spălăm cu tampon fosfat
apariţiei în godeul corespunzător serului M+ a unei. culori galbene intense iar core salin şi cu apă distilată p fti^ ,ta^ p $ rtârea, re^ Y % ţ,ca re . nu au. intrat în reacţia Ag-Âc. Pe
spunzător serului M- lipsa apariţiei culorii. Aceasta se realizează în circa 10-30 min. frotiu se pune un ser cu Ac anti-Ig (le om, marcaţi'fluorescent şi se incubează timp de 30
• Analiza se face cu ajutorul unui fotometru ( X = 450 nm) fără blocare cu acid,,' minute la 37°C, se spală, se aşteaptă uscarea frotiului; urmând examinarea, la microscopul
cu fluorescenţii în situaţia în care în serul'de cercetat există Ac specifici Ag cunoscut,'are
Interpretare .... i loc formarea complexului Ag-Âc, iar în etapa următoare, Ac ănti-Ig de om se cuplează pe
• Rezultatele se exprimă în Unităţi Imuno Enzimatice (UIE) după relaţia: (OD X - OD complex şi în mod indirect, prin fluorescenţă, identificăm5(şi în unele variante tehnice putem
M-/OD M+ - OD M -) x 100 titra) Ac. Metoda poate fi utilizată îh diagnosticul serologic: al infecţiilor produse de
• în cure OD X reprezintă densitatea optică a probei de analizat, OD M- este densitatea optică a serului mar Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, Leptospira spp., Borrelia burgdorferi,
tor negativ, iar OD M+ densitatea optică a serului martor pozitiv. Treponema pallidum, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, Pneumocystis jiroveci etc.
• Valorile de pînă la 10 UIE sunt considerate nesemnificative, deşi pot indica un început
de sinteză de anticorpi, repetarea determinării după 1-2 luni, putând indica o creştere
a titrului.
• Indiferent de valoarea obţinută rezultatele se vor-interpreta în contextul clinic, epi
demiologie şi paraclinic, ţinând cont de rezultatele examenului microbiologic direct.
TESTAREA IMUNITĂŢII DE TIP CELULAR „ cere de iimfocite T Citotoxice in vitro prin culturi stimulate cu antigene tumorale şi IL-2
etc);
• studii privind reactivitatea celulelor implicate în răspunsul imun de tip celular
apreciată prin incorporarea de timidină tritiată de către iimfocifoie stirfiulăte cu
■ţ • ■ l’.i'l iii : ‘iil i - f P l! lili ■ ! S .■' Jfi V Ai; •■:V ".! ' . ■M; ■•y'-.'l' diverşi mitogeni, lectine care se leagă de membrana celulară (fitohemaglutiriihă,
Există q serie de. metode, utile pentru, evalparea răspunsului imun, de tip celular. (RIC).
concavaiină A etc), substanţe care acţionează direct fără a necesita existenţa unor
Evaluarea RIC este necesară atât în situaţia unor pacienţi ia, care se suspicioneazi prezenţă
componente membranare, diferite antigene (PPD, candidină etc), citokine (IL-2),
unei stări de imuno-deficienţg, cât şi în anumite boli transmisibile care se pot însoţi de modi
' celule allogenice etc;
ficări fizidpatologice a RIC. Datorită faptului că dn momentul de faţă au: fost ţ«ise la punct
vâriante tefâţ5ei.ttice isâie pot influenţă în mod’'Wvbmblî’ rieceâăr să • studiul secreţiei de citokine, modalitate indirectă de apreciere a funcţiei celulelor
avem la'dispoziţie mb'dâlităţi’de1identificare a deficienţelor, imtirfe,1 v' implicate în răspunsul imun de tip celular etc.
" iii V' . ■ :■ ii: ' • .J'i*-' • ■i'iii '/■/ '}■:'■• p ;’!:U 'iiifilfs 'Will
In vederea stabilirii unui astfel de diagnostic,,cel mai frecvent pomtm.de la o suspiciunş care i • Teste imunobidiogice, prin tehnica intradermoreacţiei (IDR), folosind antigene care
poate fi clinică, iar asocierea unei infecţii cu agenţi.etioiogici consideraţi „oportunişti"' poate să ,. stimulează răspunsul imun ele tip celular („întârziat”); în literatura internaţională este
reprezinte semnalul pentru declanşarea, diferitelor investigaţii. Spre exemplu, infecţiile cu recomandată o „baterie”,de antigene, patru-cinci dintre antigenele menţionate în con
Pneumocystis jiroveci sau Cryptococcus neofprmans pot „ţrăda“ o, afectare a limfociţelor T, tinuare;
infecţiile,repetate, purulente, cu Staphylococcus, aureus, Pseudomonas cepacia, Serratia • Candidină (antigen extras din Candida albicans, un extract apos realizat în diluţie
marcescens, Aspergillus spp. ăf,putea ft datorate unor suferinţe ale celulelor fagocitare etc. I/iO; antigenul este numit şi „Dermatophyton 0 “);
Având în vedere cele de. mai,sus, investigarea pacientului la care se suspicionează o • Coccidioidinâ (antigen extras din Coccidioides immitis) care însă poate interfera cu
imuno-deficienţă ar trebui să fie realizată prin următoarele activităţi: testele seroiogice realizate pentru histopiasmoză;
• Aplicarea anamnezei pe parcursul căreia,ar trebui să aflăm date privind medicaaţia primi . • Histoplasmină (antigen extras din Histoplasma capsulation) care produce şi o
tă de respectivul pacient, momentul debutului suferinţei respective, antecedentele heredo- ; creştere a titrului anticorpilor fixatori de complement;, ..."
colaterale, date privind vaccinările efectuate (vezi şi capitolul 22), date privind agenţii o Antigenul,extras din virusul urlinn;
etiologici izolaţi şi identificaţi ulterior etc. Adeseori anamneza are o importanţă crucială,
® Fitohemaglutinină (mai rar folosită in vivo);
• Examenul clinic, pornind de ia cunoaşterea înălţimii şi greutăţii pacientului investigat
• Lizat din cultură de Staphylococcus aureus;
comparând-cu valorile considerate normale pentru vârsta respectivă, prezenţa unor
Lemne clinice sugestive (la nivelul feţei, dentiţiei şi evoluţiei acesteia, ia nivelul tegu • O combinaţie între streptokinază şi streptodornază;
mentului şi anexelor acestuia, la nivelul scheletului, organelor interne care pot fi exa • Toxoid tetanic, cu concentraţia de 10 limes floculans/m! (diluat);
minate clinic etc); • Toxoid difteric, cu concentraţia de 30 limes floculans/ml (nediiuat); pentru uitime-
• Examene de laborator (numărul elementelor figurate: hematii, granulocite, trombocite; ijil;.' le 2 antigene pot apărea reacţii de hipersensibilitate de tip umoral ceea ce poate
formula teucocitară, aspectul pe frotiul realizat din sângele periferic, VSH etc): l *' , crea probleme importante în ceea ce priveşte evaluarea răspunsului imun de tip
• studiul mai aprofundat limfociţelor şi subpopulaţiiior limfocitare CD3+, CD4+, celular;
CD8+ etc (număr, procent) prin metode clasice şi moderne (ex. flow-citometrie); i • Trîcofitină (extras din Trichophyton spp.);
• studiul funcţiei subpopulaţiiior limfocitare (prin metode clasice şi modeme); ! » Tuberculină (derivai proteic purificat, PPD, extras din cultura de Mycobacterium
• determinarea numărului de celule formatoare de anticorpi faţă de antigeifo tirao- tuberculosis);
dependente (plaje hemoiitice); r în cele ce urmează vom discuta despre IDR cu PPD.
• studiul funcţiei celulelor fagocitare (aderare, inhibiţia aderării, inhibiţia migrării ma- Principiul metodei
crofageior sau leucocitelbr, deficienţe.la nivelul granuiaţiilor, deficienţe îri mieloper- Tuberculiha- reprezintă un amestec relativ bine standardizat de antigene proteice myco-
oxidază, deficienţe în NADPH oxidază, eliberarea radicalilor de oxigen activi de către bacteriene, utilizat în mod curent pentru decelarea infecţiei tuberculoase (TB), individual
celulelor fagocitare nestimulate şi/sau stimulate cu. zimosan, lectine etc); sau popuţaţioiiai. Acest extract se poate utiliza în cadrul unei „baterii” de teste IDR pentru
• evaluarea activităţii citotoxice a celulelor NK şi K (citotoxicitatea naturală imedi evaluarea reactivităţii din punct de vedere al RIC. După ce o persoană data se infectează cu
ată celular, citotoxicitatea mediată celular anticorp-dependentă/ADCC, citotoxi mycobacterii, urinează sensibilizarea şi proliferarea anumitor populaţii de iimfocite T (LT).
citatea' specifică faţă de celule tumorale sau normaie/prin eliberare de 5!Cr, indu- Injectarea intradermică a luberculinei stimulează LT şi declanşează o serie de evenimente
ce conduc la un apariţia unui RiC şi a unor manifestări de hipersensibilitate de tip IV.
13 0 Diagnosticul de laborator în microbiologie 21 Testarea imunitâfii de tip celular 13 1
Reacţiile implică vasodilataţie, edem şi infiltrat cu Iimfocite, bazofile, macrofage,neutro- ® eliberăm tegumentul şi fixăm seringa presând-o pe antebraţul subiectului, având-grijă
file. LT antigen-specifice proliferează şi eliberează limfokine care mediază acumularea să nu se acopere diviziunile seringii pentru a putea urmării cantitatea injectată;
locală a diferitelor alte celule. Răspunsul maxim se constituie ia circa,48 ore după injectare. • injectăm strict 0,10 mi; dacă injectarea s-a făcut strict intradermic apare o bulă uşor
Aria induraţiei,(infiltratului ,celular),reflectă hipersensibilitatea d e; tip întârziat. Eritemul denivelată, cu margini relativ abrupte, cu aspect de coajă de portocală şi diametru ,de
reprezintă o reacţie inflamatori? acută, cauzată de vasodilaţaţia capilară,iar apariţia eritemu- 5-8 mm; în lipsa apariţiei acestei bule (în cazul injectării hipodermice sau când,se
lui nu va fi interpretată drept o reacţie pozitivă, Limfocitele sensibilizate, ating un nivel adec pierde soluţie între seringă şi acul incorect montat), este recomandat să se reia manevra
vat pentru a conduce la apariţia unui răspuns interpretabil .dţjpâ'j2-4 săptămâni, de la infecţia cu mai multă atenţie, repetând injectarea la o distanţă de 3-5 cm sau la antebraţul opus.
iniţială cu M. tuberculosis. Sensibilitatea poate persista mai mulţi ani, dar reactivitatea scade ' La persoanele infectate anterior (sensibilizate), la locul injectării apare o reacţie con
de regulă o dată cu vârsta. ,, , , ,, , ' ... .;,, ,r Vţ’.,,.,,.,-. ţ,', stând din eritem-edem-indiiraţie începând după circa 6 ore şi atingând un nivel maxim după
M ateriale şi reactivi necesari ,,r ,, i;. ( , y - circa 36-60 ore, care se retrage în următoare câteva zile.'Pe locul reacţiei poate persista o
Pornind de la tuberculina preparată de Koch (Old-tuberculin, 1891), în 1901 a fost rea perioadă îndelungată o zonă de hiperpigmentaţie.
lizat produsul New tuberculin, iar ulterior, derivatul proteic purificat (PPD-S,, preparat de Citirea rezultatului
Seibert în anull941), adoptat ca Standard Internaţional pentru PPD. Metoda de obţinere a Citirea rezultatului se face de regulă după 72 ore, asigurând o bună iluminare a zonei
fost reprezentată de precipitarea proteinelor din filtratul mediului de cultură concentrat la examinate (este de preferat lumina naturală). Recomandăm o primă citire la 24 ore (pentru
cald, cu soluţie 50% sulfat de amoniu. Unitatea internaţională pentru PPD este definită drept a surprinde o eventuală hipersensibilitate de tip umoral faţă de antigenul inoculat care are
activitatea biologică conţinută în 0,000028 mg de PPD-S (0,00002 mg PPD + 0,000008 mg
structură proteică), o a doua citire la 48 ore şi citirea finală la 72 de ore..,
săruri). PPD-RT 23 reprezintă lotul de tuberculin# purificată în anul 1958 în Danemarca şi
: Identificăm existenţa unei eventuale arii intens eritemato-violacee care circumscrie zona
asigură omogenitatea produsului antigenic folosit in studii epidem iologie în lumea întrea
gă. Din produsul realizat iniţial se prepară diluţiile necesare (etalbnate) la care se adaugă în care am făcut inocularea. în cazul existenţei unei astfel de reacţii, apreciem tactil (prin
mişcări repetate, atingând zona respectivă) cu pulpa policelui sau inelarului limitele zonei
Tween 80 în scopul reducerii absorbţie! pe peretele de sticlă al fiolei; îh mod uzual se utili
de infiltraţie dermică (percepută ca fiind reliefată) corespunzând din punct de. vedere
zează 2 Ul/doză, echivalentul a 5 UI PPD-S. în raport cu PPD-RT23, în România se utili
histopatologic inflamaţiei (edem, Iimfocite, macrofage, PMN) şi care reprezintă reacţia ne-
zează PPD IC-65 produsă de către 1NCDMI „Cantacuzino”,
specifică şi specifică.faţă de antigenul injectat.
Tehnica de lucru
Măsurăm „diametrul maxim" al zonei de infiltraţie. Notăm şi semicantitativ intensitatea
în ţara noastră se utilizează tehnica injectării intradermice (Mantoux). infiltraţiei dermice („tip Palmer"), semnificaţia fiind următoarea;
• controlăm produsul biologic pe care urmează să îi utilizăm din punct de vedere al • tip I, induraţie fermă sau prezenţa unei flictene;
perioadei de eficacitate şi conservării în condiţiile prevăzute de către producător;
• tip II, induraţie elastică;
• utilizăm numai seringi cu volumul,de maxim 1 ml şi.cu diviziuni clar marcate, cel
• tip 111, infiltraţie depresibilă;
puţin pentru fiecare 1/10 ml precum şi ace pentru injecţie intradermică, de unică între
buinţare; • tip IV. fără infiltraţie aparentă.
• agităm energic fiola pentru u omogeniza concentraţia produsului biologic, ştiut fiind Citirea reacţiei tuberculinice reprezintă o evaluare subiectivă, existând posibilitatea unor
că în timpul unei conservări mai îndelungate tuberculina tinde să se absoarbă pe pereţii importante variaţii inter- şi intraindividuale din partea persoanelor care efectuează lectura.
de sticlă ai fiolei; ' , Dubla citire „în orb" fără cunoaşterea rezultatului celeilalte lecturi, poate reduce variaţiile
“grosiere”, cu condiţia ca ambele persoane care „citesc” rezultatul să aibă experienţă cu
• aspirăm în seringă o cantitate suficientă de soluţie pentru a putea elimina integral orice această tehnică. ..
bulă de aer apărută între piston şi orificiul acului;
Interpretarea rezultatului testului tuberculinic (IDR cu PPD)
O poziţionăm acul astfel încât bizoul să fie aliniat diviziunilor seringii; .... , &
în funcţie de analizele statistice efectuate, există câteva recomandări cu privire la inter
• antiseptizăm cu alcool (minim 3 minute) o arie situată pe faţa anterioară a antebraţu
pretarea IDR cu PPD.
lui stâng, la unirea treimii medii cu cea superioară; , ;f
Centrul de control şi prevenire a bolilor Atlanta-Georgia (CDC) a modificat relativ
• cuprindem zona respectivă a antebraţului în palmă, întinzând pielea cât mai uniform
recent clasificarea reactivităţii la testul cutanat efectuat cu 5 UI PPD după cum urmează:
între extremitatea inferioară a eminentei tenare şi hipotenare pe de p parte şi cele patru
degete strâns lipite, pe de altă parte; : 1. Reacţia este considerată a fi pozitivă dacă diametrul induraţiei este >5 mm în urmă
toarele cazuri;
• pătrundem cu acul aproape tangent la supmL i antebraţului, cu bizoul în sus, până
acesta este situat în derm; • persoane care au avut un contact recent cu un caz de TB;
132 Diagnosticul de laborator în micrdbiologie
• de regulii folosite în scop profilactic , ; /j administra la 12 luni, simultan cu DTP în timp ce ultima doză de DTP se va administra la
• pot fi utilizate în tratamentul asociat al unor infecţii severe (ex. sepsis) copilul cu vârsta cuprinsă între 30 şi 35 de luni.
• imunoglobuline specifice (hiperimune) Sugarul în vârstă de 9-12 luni va primi vaccinul pentru prevenirea rujeolei, iar copilul în
vârstă de 7 ani (la intrarea în clasa 1) va primi simultan o nouă doză de vaccin rujeolos şi
• obţinute de la persoane imunizate (natural sau artificial) cu un anumit Ag bivaccinui DT. : , - > . . .
• pot fi utilizate în tratamentul tetanqsului, rabiej, varicelei,:formelor;severe de
Pentru reducerea incidenţei hepatitei cu virusul B (şi în consecinţă şi a hepatitei cu viru-
herpes zoster, infecţiilor cu virusul citomegalic, infecţiei cu virusul: sinciţial
• sul delta), în clasa a 111-a copiii nevaccinaţi primesc trei doze de HepB, prima dintre ele
. ■ respirator etc /. ■. ,v > v ' / :!>! . ■' ■ A n -'', • uv. 'U-u' v-rnV . simultan cu o nouă doză de VPO, iar elevii şcolilor Sanitare postliceale şi respectiv studenţii
• seruri-imune hetfcfbloge-i*' • . facultăţilor cu profil medical, primesc 3 doze de HepB în primul an de studiu. Am introdus
• obţinute de la animale imunizate (hiperiniunizate) artificial această politică de vaccinare îrt România prin ordin al ministrului sănătăţii în anul 1999,
• sunt utilizate în tratamentul unor boli în care rolul esenţial aparţine unei exo- strategia fiind ulterior inclusă în acte normative de nivel superior. '
‘ toxine (difterie, tetanos, botulism, gangrenă gazoasă etcj. Prevenirea difteriei şi tetanosului se realizează prin vaccinarea copiilor în clasa a VIII-a
(Ia vârsta de 14 ani) cu rapeluri ulterioare la fiecare 10 ani sau de câte ori este necesar în
Spre exemplu, principala resursă terapeutică în difterie este reprezentată de adminis
funcţie de recomandările tehnice naţionale şi internaţionale. Cu privire la revaccinarea cu
trarea de ser imun anti-difteric, în dozele corespunzătoare calculate fie pe kilogram-corp fie
vaccinul BCG, aceasta se va realiza în colaborare cu programul naţional de prevenire şi con
în funcţie de anumite aspecte clinice. Este necesar un diagnostic foarte rapid (dar tratamen
trol al tuberculozei.
tul începe chiar şi în lipsa diagnosticului de certitudine, în cazul suspiciunii clinice) şi
administrarea de antitoxină difterică. Doza în terapia difteriei depinde de sediul infecţiei (ex. Im unom oduiatorii
20-40.000 UAI pe cale i.vV în cazul localizării faringiene, în primele 24 de ore de la debut în privinţa obţinerii substanţelor cu efect imunomodulator s-a pornit de la observaţia că
şi respectiv 40-80.000 UAI pe cale i,v. în cazul localizării laringiene; în cazul difteriei unele infecţii (bacteriene) stimulează în mod nespecific organismul gazdă şi conducând lâ
maligne şi respectiv atunci când de la debut au trecut 48 de ore). apariţia unei „rezistenţe” faţă de alţi agenţi infecţioşi sau chiar şi faţă de apariţia unor metas
taze neoplazice. Ulterior s-a demonstrat că structuri aparţinând şi altor organisme (fungi,
Vaccinurile
alge) sau diferiţi compuşi chimici prezintă proprietăţi asemănătoare.
Vaccinurile sunt produse biologice administrate în special în scbp preventiv.
Pe baza datelor acumulate au fost puse la punct conceptele de bază privind imunomo-
Prin Ordonanţa Guvernului nr. 53 din 30 ianuarie 2000 (redactată şi propusă pentru apro dularea şi substanţele imunomodulatoare. Astfel, se consideră că: a. terapia nespecifică este
bare de către autorul acestui manual) a fost instituită obligativitatea raportării bolilor şi a utilă menţinerii homeostaziei; b. agenţii utilizaţi, imunomoduiatorii, menţin funcţiile imune
efectuării vaccinărilor. Acest act normativ a devenit Legea nr. 649 din 20 noiembrie 2001, în limite normale (activându-le atunci când scad sub pragul inferior al valorilor normale sau
după aprobarea Parlamentului României. Am considerat necesară sublinierea poziţiei inhibându-le atunci când depăşesc pragul superior); c. un imunomodulator trebuie să aibă o
medicilor de familie (indiferent dacă lucrează în sistemul public sau privat) în raport cu sis serie de calităţi (să nu fie antigenic, să nu conducă la apariţia fenomenului de hipersensibi
temul de raportare şi programul naţional de imunizări precum şi instituirea unui registru unic litate, să nu genereze reacţii adverse, să poată fi administrat.concomitent cu alt antigen
de vaccinări şi respectiv a carnetului de vaccinări (au existat iniţiative în realizarea utilizarea folosit în scop terapeutic, să fie cât mai uşor de produs iar preţul de cost să fie rezonabil).
carnetului de vaccinări şf înainte de anul 2000 în câteva judeţe ale ţării şi, respectiv în
Prim ii im unom oduiatori de origine bacteriană au inclus suspensii ale tulpinii vaccinale
municipiul Bucureşti). Ordonanţa Guvernului nr. 53/2000 şi respectiv aprobarea acesteia obţinute din Mycobacterium tuberculosis, respectiv tulpina BCG. Au mai fost utilizate şi
prin Legea nr. 649/2001 reprezintă o referinţă din punct de vedere legislativ pentni sisleiftul suspensii obţinute din Coryiiebcicterium parvum. Imunomoduiatorii au fost puşi la dispoziţia
de sănătate publică din România. , , ;j- , sistemului medical atât sub formă de preparate monomicrobiene cât şi sub formă de
In ceea ce priveşte schemele de vaccinare recomandate pentru.copii, adolescenţi şi ţineri, preparate polimicrobiene. Dintre preparatele polimicrobiene amintim cele cunoscute sub
vom prezenta câteva .exemple. ' V.,.,. m tiv» mu,- numele de: Omnadin, Bronhodin, Aerodin, Polidinul, Broncho-vaxom, ICB-10 etc.
în maternitate, la nou născuţii în vârstă de 0-7 zile se vor administra vaccinul BCG.şii Spre exemplu, Broncho-vaxomul este o suspensie alcătuită din specii bacteriene distruse
prima doză de vaccin pentru prevenirea hepatitei cu virusul B (HepB), dozele ulterioare de prin diferite tehnici (Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneu
HepB fiind administrate la 2 şi respectiv 6 luni. , j moniae, Staphylococcus aureus, Neisseria catarhalis etc). Acest produs este recomandat în
Simultan cu HepB, conform recomandărilor naţionale şi internaţionale, la vârsta de 2 şi 6 prevenirea şi terapia unor infecţii ale căilor respiratorii inferioare şi superioare. Aerodinul
luni se vor administra doze vaccinale pentru prevenirea infecţiei cu virusul polio (VPO) şi conţine un amestec de 10 specii bacteriene (Streptococcuspyogenes, Streptococcus faecalis,
respectiv prevenirea difteriei —tetanosului—tusei convulsive (DTP) în timp ce la vârsta de Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas
4 luni se vor administra simultan DTP şi VPO. Următoarea doză de vaccin VPO se va aeruginosa, Neisseria catarrhalis, Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Proteus
Biopreparate 13 7
136 Diagnosticul de laborator în microbiologie
0X19), distruse prin căldură, parţial lizate, concentraţia fiind ^de circa 11 miliarde ger- - antigene pentru intradermoreacţie (PPT iC 65 de 2UT şi 10UT);
meni/ml. Aerodinul este condiţionat sub formă de suspensie nazală pentru aerosoli şi disti 2. Reactivi biologici pentru diagnostic in vitro
laţii, Este recomandat pentru prevenirea infecţiilor nespecifice .ale căilor respiratorii dar şi - antigene pentru diagnostic (Ag brucelos pentru diagnostic serologic, Ag cardiolipiitic
pentru pregătirea preoperatorie în intervenţiile chirurgicale,ORL. Fplidinul are în .compo pentru VDRL, Ag Coxiella burnetii pentru RFC, Ag Chlamydia pşitacii pentru RFC, Ag
nenţa sa 13 tulpini bacteriene distruse prin căldură (o fiolă conţine circa 48 de milioane ger- gripal, Ag Leptospira patoc, Ag Mycoplasma pneumoniae pentru RFC, Ag Pertussis, Ag
meni/ml). Polidinul este încă utilizat în prevenirea sau terapia infecţiile acute ale căilor res Salmonella grupele A, B, D, Ag. Salmonella H. Ag Salmonella Vi, SLO activată şi liofilizată
piratorii superioare sau a infecţiilor genitale. , : ^ . etc);
. Ulterior, s-a arătatşcă .şi;diferite extracte,‘bacteriene (în, special localizate la nivel,pari - seruri pentru diagnostic in vitro (hemoîizină anti-oaie, seruri aglutinante anti EPEC
etal) pot fi utilizate ca imunoniodulatorLAstfel, a fost obţinut Canţasţjrnul produs de către, mono şi polivalente, ser aglutinam anti-Shigella shtga, ser anti-Proteus 0X19, 0X 2 şi
INCDMI „Cantac.uzino", pornind.de la o tulpină foarte, virulentă de pseudomonas aerugi OXK, ser anti-Yersinia pseudotuberculossis, ser mti-Yersitiia enterocolitica, ser ântidifteric
nosa. Acest produs normalizează,funcţiile fagocîtare ,şi. secretarii,ale ipacrofagelor.funcţiij pentru testul ELEK, ser aglutinam imti-Haemophilus influenzae polivalent sau anticapsular
le citotoxiee ale celulelor NK şi T citotoxice (CD8+), cooperările interceiulare, activitatea de tip a-f, ser fluorescent antirabic, ser aglutinam anti-holeric grup 01, seruri anti -Salmo
limfocitelor T helper (CD4+) şi limfocitelor’B (CD19+). , .V nella diferite grupuri şi tipuri, ser anti-EHEC etc).
în categoria imunomodulatorilor intră,şi diferite produse,pentru car.e îp momentul, defaţă - reactivi pentru diagnostic imunochimic (ser uman de referinţă 1C, ser de referinţă
sunt cunoscute, structurile .moleculare, precum: tuftsina, timopoietinele, tiniozinelejeuco- pentru proteina C reactivă, ser de referinţă pentru aî-fetoproteină umană, ser
trofina, interferonul, interleukinele, factorii de necroză ai tumorilor, factorii decreŞtefe,a monospecific anti-IgA umană etc);
macrofagelor şi/sau granulocitelor (MG-CSF).
- enzime (enzimă distrugătoare de receptori, penicilinază liofilizată în două concen
Pornind de la diferitele molecule naturale identificate ca fiind utile, studii aprofundate traţii);
au permis obţinerea unor produse sintetice sau identificarea! efectelor imunbmodiilafbare
- medii pentru culturi celulare (soluţii Hancks, soluţie EDTA, mediu IC 65 cu tam
pentru unele substanţe care fuseseră produse iniţial cu un alt scop. Spre ekemplu, îevămi-
pon Hancks etc):
solul (Decarisj este un medicament antiparazitâr, Substanţa activă din acest medicament are
efecte imiinoniodulatoare deoarece influenţează mecanismele de apărare a gazdelor aflate în - medii de cultură pentru diagnostic bacteriologic (peste IOC) de produse diferite);
hipofuncţie imună (ex. din cauza vârstei înaintate sau a unor boii) modulând în special RIC. - suplimente pentru medii de cultură (supliment Tinsdale, supliment tip HYL, supli
Efectul iliuinomodulator se realizează consecutiv restaurării funcţiilor macrofagelor, limfo ment tip Fildeş, amestec reducător pentru itnaerobioză etc).
citelor t ! granulocitelor PMN etc, exprimat printr-o mai bună secreţie de limfoktne sau sin 3. Animale de laborator (şoareci non-consangvini, şoareci consangvini, şobolani, ham-
teza diferitelor substanţe cu structură proteică prin activarea fagocitozei, activarea mobi steri, cobai, iepuri etc);
lităţii celulelor fagbcitare etc. 4. Produse din sânge de animate (sânge defibrinat de berbec, sânge defibrinat de iepure,
Este important cu imunomodulatorii să fie utilizaţi în mod corespunzător şi să se ţină sânge Jaeat de cal, ser normai de bou, ser normal de cal, ser normai de iepure etc).
seama atât de beneficiile care pot fi obţinute cât şi de limitele existente. Modul de adminis
trare este destul de variat, în funcţie de substanţa activă şi efectul dorit. Imunomodulatorii
pot fi inoculaţi intratumoral, peritumorai, la distanţă de o tumoră'solidă aşa cum poî fi
administraţi şi sistemic prin injecţii intramusculafe, subcutanate, intfadermice,'iar îi* unele j
cazuri chiar pe cale digestivă: ’ ' , : j
Produse realizate de INCDM I „Caiitacuzino"
în anul 2004,, INCDMI „Cantacuzi.no",• conform,tradiţiei de aproape un veac,a realizat,
numeroase.produse strict necesare,sistemului-.ste sănţitate din România. Dintre,acestea voiţi,I
aminti o mai mică parte, după cum urmează: , . j.
1. Produse medicamentoase imtinologice de uz uman . , i
- vaccinuri (BCG liofilizat, DTP, DT, dT, gripal, dizenterie viu oral, rabic, rujeolos etc);
- seruri terapeutice (anticărbunos, ântidifteric, antirabic.’antitetahicîn două variante eţc);
- imunomodulatori (Aerodin în două variante, Bronhodin, Cantastim, Imunbstimulâtor
cu Căndidină, Orostim etc); . ' ' 1 ’
23 Introducere în diagnosticul.de laborator microbiologic 139
PARTEA SPECIALĂ urmat în „ateliere de lucru", întâlnirile cu factori de decizie ai Organizaţiei Mondiale a Să
nătăţii, Conferinţa internaţională „Health Issues of Joint Interest to Romania and the
INTRODUCERE ÎN DIAGNOSTICUL DE European Union" organizată în octombrie 2000, iniţiativa organizării unei reţele de supra
veghere a bolilor transmisibile în ţările din Europa Centrală şi de Est (întâlnire plenară pe
LABORATOR MICROBIOLOGIC care am organizat-o în decembrie 2000, în Bucureşti) au condus la elaborarea unui program
de reformă în domeniul .supravegherii bolilor transmisibile eu sprijin european (PHARE)
care a fost aprobat de asemenea în anul 2000. .r
•v Chiar dacă reprezintă o măsură pentru prevenirea.unor maladii virale (şi nu bacteriene ,sau
fungice) vom mai aminti dintre iţiăsuri luate în ultimii ani îmbunătăţirea programului de vac
îti prima parte1a manualului am prezentat date privind bazele diagnosticului în1microbio cinare împotriva infecţiilor cu virusul hepatitei B, în anul 1999. Vaccinarea npu-născuţilpr
logic, studiul microbiologic dirbct şi respectiv evaluarea răspunsului gazdei faţă de infecţie.
avea deja o „vechime" de 4 ani. dar în 1999 prin politica dusă în domeniul sănătăţii publice
Având la bază aceste cunoştinţe, în capitolele următoare vom discuta pe rând diagnosticul a fost inclusă şi vaccinarea copiilor din clasa a lll-a, vaccinarea tuturor elevilor din anul I de
de laborator al infecţiilor produse de principalele microorganisme studiate. la şcolile sanitare postliceaie şi respectiv a studenţilor din anul I din facultăţile de medicină
Pentru fiecare dintre capitolele 24-52 vom utiliza schema ele diagnostic prezentată în şi stomatologie. Această politică va duce ca în numai câţiva ani, un mare număr de generaţii
capitolul 5, schemă pe structura căreia am discutat de altfel şi diferitele aspecte din partea de copii să fie vaccinate faţă de o infecţie care devenise endemică la nivelul anilor ‘90.
generală. Utilizarea în mod repetat a unei scheme clare permite o mai bună fixare a cu
Fiecare din aspectele menţionate are o strânsă legătură atât cu microbiologia cât şi cu
noştinţelor. Microbiologic este, după părerea noastră, o ştiinţă cu foarte mare aplicabilitate
sănătatea publică şi merită a fi cunoscute de către medicii şi viitorii medici din sistemul sani
practică. Elementele de bază ale microbiologici sunt necesare şi utile pentru.toţi cei impli tar românesc.
caţi în sistemul sanitar; cunoaşterea acestor elemente de bază ar putea preveni o serie de
anomalii şi erori care uneori sunt dezastruoase (aşa cutn s-a întâmplat de ex. înţr-o materni In bolile inlecţioase (transmisibile), diagnosticul are o importanţă considerabilă,
deoarece de stabilirea corectă şi precoce a diagnosticului depind atât vindecarea bolnavului,
tate în care o serie de nou-născuţi au decedat datorită unor infecţii de spital).
cât şi succesul măsurilor preventive care trebuie iniţiate cât mai rapid posibil. Spre exem
Dacă,în urmă cu circa 30 de ani a început să se considere la nivel internaţional (în mod plu, ignorarea primului caz al unei boit .inlecţioase grave (ex. holeră) poate avea consecinţe
eronat) <^ă problemele legate de bolile inlecţioase sunt din ce în ce mai puţin importante,
epidemiologice foarte importante. Cu toate că în primii de studiu este abordată în mod spe
eroare care a creat şi crează încă mari probleme în sănătatea publică, în ultimii 5-6 ani (în
cial partea microbiologică (bacteriologică, virusologică, parazitologică, mieolpgică) a diag
special jîncepând cit anul 1998) s-a înţeles că bolilor transmisibile trebuie să li se reacorde
nosticului, este strici necesar să menţionăm că examenul clinic îşi păstrează şi astăzi o
importanţa cuvenită. Astfel, inclusiv la nivel european, au fost elaborate numeroase acte
deosebită valoare. în scopul diagnosticării bolilor inlecţioase au fost puse ia punct nu
normative în acest domeniu iar fondurile alocate au sporit substanţial, încercând să se ame
meroase tehnici de laborator, metode paraclinice, precise .şi obiective, dar utilitatea lor este
lioreze situaţia creată datorită erorilor anterioare. maximă atunci când rezultatele sunt interpretate în contextul clinic şi epidemiologie.
Şi în ţara noastră, preocuparea faţă de sănătatea publică în general şi faţă de microbio-
în diagnosticul bolilor transmisibile trebuie respectate o serie de reguli, după cum urmează.
logia în sănătatea publică în mod particular a crescut după anul 1997. Activitatea desfăşurată
în domeniul reformei pentru sănătatea publică în România este, din acest punct de vedere, I. Obţinerea datelor (clinice, paraclinice şi de laborator) este urgentă. Anamneză trebuie
destul de aproape de reforma care are loc restul Europei. Diferitele proiecte .şi programe realizată cu rigurozitate.- Aprecierea stal tisului imunologic poate fi esenţială. Nici un element
iniţiate în special în perioada 1997-2000 îşi găsesc şi astăzi concretizarea în aplicarea unor obţinut prin examenul obiectiv nu trebuie neglijat. 2. Datele obţinute trebuie privite ea un tot
măsuri cu mare importanţă ia nivel naţional: reabilitarea centrelor de referinţă pentru micro unitar; nu pot fi absolutizate nici posibilităţile clinice şi nici cele ale laboratorului. 3. Este
biologic, reforma sistemului de supraveghere a tuberculozei, adaptarea la standarde inter indispensabil să se stabilească un diagnostic etiologic în toate maladiile inlecţioase, având în
naţionale a sistemului de diagnostic, prevenire şi control pentru bolile cu transmitere sexu vedere importanţa tratamentului antimicrobiun; 4. Folosirea corectă a laboratorului consti
ală, menţinerea la un nivel corespunzător a imunizărilor pentru a preveni bolile prevenibiie tuie o uită regulă importantă. Este necesar ca fiecare medic clinician să ştie ce analiză să
prin vaccinare, includerea României în sistemul de pregătire în scopul supravegherii bolilor ceară, ce produse tie recoltează de la bolnav, când şi cum să le recolteze, cum să le expe
dieze către laborator. Pentru obţinerea unor date corecte prin examenele de laborator, clini
transmisibile la nivel european ele.
cianul va respecta câteva reguli: produsele se recoltează înainte de administrarea tratamen
Din anul 1999 România face parte (ca membru fondator) din Reţeaua de supraveghere a tului antimicrobiun; se trimite laboratorului o cantitate suficientă de produs pentru exami
bolilor transmisibile în Balcani. în anul 2000, a fost organizată una dintre cele mai impor nat; produsul patologic trimis trebuie să lie reprezentativ pentru boala respectivă (de exem
tante întâlniri cu.scopul armonizării supravegherii bolilor inlecţioase în Europa (Consensus
plu, spută şi nu salivă în infecţiile respiratorii inferioare); produsul examinat nu trebuie con
Meeting on Surveillance of Infectious Diseases, Grottaferrata, Italia, 7 aprile 2000).
taminat cu alţi germeni în cursul recoltării sau al transportului (recoltare aseptică);- expe-
Prezentarea pe care autorul prezentului volum a făcut-o cu acest prilej, discuţiile care au
Introducere în diagnosticul de laborator microbiologic 141
140 Diagnosticul de laborator în microbiologie
dierea către laborator se face în condiţiile de conservare cerute pentru fiecare tip de produs Un prim grup important este Cel care include cocii cu importanţă medicală, gram pozi
patologic în parte; se solicită examinarea imediată a produselor transmise către laborator. 5. tivi (stafilococi, streptococi, pneumococi etc) şi respectiv gram negativi (meningococi şi
gonococi etc).
Trebuie să existe o colaborare strânsă şi continuă între elinician şi specialistul de laborator.
Este necesară o informare clinică a omului de laborator de către clinician pentru orientarea Dintre bacteriile gram negative care au dimensiuni pe baza cărora nu pot fi încadrate
studiilor în 'laborator şi peîrtrti alegerea Celor -mar bune!metode'de identificare-a' agentului drept coci sau bacili se află parvobacteriile, cocob’acilii gram negativi (Haemophilus influen
etiologic. în acelaşi timp; laboratorul trebuie să informeze clinicianul-pe parcurs în legătură zae, Bordetella pertussis, Brucella spp. etc).
cu datele obţinute. ,4 1,1 / r ‘ -n' 1J,; ' ■ ■ --T' ■ JBacilii gram pozitivi care vor fi discutaţi se pot grupa în bacili nesporulaţi (Corymbac-
în cadrul-examenelor de laborator, iun ide prioritar este ocupat de diagnosticul micro- * lerium diphteriae, Listeria spp. etc) şi respectiv bacili gram pozitivi sporulaţi (Bacillus
biologic (bacteriologic, mitologic şi/saU imunologic), care va fi prezentat în continuare anthfacis, Clostridium spp. etc). '
(vezi 'şi capitolul 5). Fpârte pe/scurt'volţi, discuta câtevâ1date.' referitoare la alte examene >pa- ' Baci!ii gram negativi studiaţi aparţin fie familiei emerobacteriilor (E. coli, Salmonella
raclinice, utile în diagnosticul bolilor infecţioase." . spp., Shigella spp., Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Yersinia spp. &tc) fie sunt incluşi
Diagnosticul citologie constă în punerea .în evidenţă a unor aspecte celulare cahicteris-J în genuri separate precum' Vibrio cholerae din genul Vibrio sau Pseudomonas aeruginosa
din genul Pseudomonas.
tice, utilizând iln produs1prelevat de Iii Bolnav. Spre exemplu, citodiagnosticui revărsatelor
pleurale şi al LCR poate aduce date preţioase'pentru elucidarea etiologici unei pleurezii şi Microorganismele din genul Mycobacterium se-pot colora (cu dificultate) prin metoda
respectiv a unei meningite. Diagnosticul histologic implică biopsii (recoltate prin tehnicii' Gram, dar în mod caracteristic se colorează prin metoda Ziehl-Neelsen. Specia principală
chirurgicală) sau puncţii-biopsii ale diferitelor organe (ficat, rinichi, plămân, ganglioni lim studiată este reprezentată de M. tuberculosis.
fatici, fragmente vasculare,'mucoasă digestivă sau respiratorie) care permit punerea în evi O serie de bacterii spiralate (ex. Treponema pallidum, Leptospira spp.. Borrelia spp.) nu
denţă a unor modificări structurale caracteristice, determinate de acţiunea agentului rnicro- se colorează.prin metoda Gram datorită structurii particulare a peretelui, Pot fi studiate
bian. Dintre metodele de laborator nespecifice sunt utile în diagnosticul bolilor infecţioase microscopic fie în preparate proaspete (utilizând tehnici microscopice speciale) fie utilizând
hemograma, leueograma (cu modificări caracteristice în unele boli),-viteza'de sedimentare coloraţii particulare (ex. impregnarea urgentică).
a hematiilor, testele de disproteinemie, diferite teste enzimatice, determinarea prezenţei pro Până în urină cu o, perioadă de limp microorganismele aparţinând genurilor Rickettsia.
teinei G reactivă (beta-globulină care apare în ser în afecţiuni inflamatorii, neoplazii şi în Chlamydia şi Mycoplasma erau incluse în categoria virusurilor. Totuşi proprietăţile lor fun
procese necrotice). alte teste de inflamăţie (reactanţi de faza acută) etc. damentale fac să le studiem astăzi între bacterii.
Referitor la alte metode paraclinice vom aminti examenul radiologie care poate furniza' în obiectul de studiu sunt încadraţi şi fungii (ciupercile) care au o serie de caracteristici
date de valoare pentru bolile infecţioase cu participare pulmonară (pneumonii virale, febră Q, aparte. Noţiunile legate'de diagnosticul mitologic sunt prezentate mai pe larg în tratatele de
tuse convulsivă, pneumonie pneumococică etc). în diagnosticul bolilor infecţioase se mai pot specialitate, . 1
folosi rectosigmoidoscopia, elcctrocncefalografia, electrocardiograful, diferite determinări
biochimice, examene oftalmologice, scintigrafia, ecografia, tomografia computerizată, tehni
ca de rezonanţă magnetică nucleară.
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
mente ale peretelui celular (proteina A, coagulaza legată), a enzimelor elaborate în ali
ÎN INFECŢIILE PRODUSE DE MICROORGANISIVIE
ment sau lichidul tie hemdcultură xftestui pentru termonuclează) şi a toxinelor (entero-
toxine, TSST1, exfoliatine). Există metode care utilizează marker! moleculari pentru DIN GENUL STREPTOCOCCUS
evidenţierea prezenţei MRSA (stafilococ rezistent la meticilină) şi pentru diferenţierea
intraspecifică la 5'. u u t e u s şi SCN. :i V a -■■■
5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chîriliotefâpibeîriAedefeă sta-
bilirii tratamentului) este obligatorie şi se realizează de 'obicei'prin metode difuziitietricfe;
în cazul unor infecţii grave trebuie să fie însoţită de alte determinări (vezi capitolul 14).
Streptococii sunt rnni ş-feriri pi-mn-poziiud. care formează perechi sau lanţuri în cursul
■ •' l '* ' ■• r "«•;’î'rî 'iii Ar U.y '■-;: diviziunii celulare. Sunt larg răspândiţi în natură. Unii fac parte din flora umană normală;
, j *• r.:- •. ;r. •" alţii sunt asociaţi cu afecţiuni umane importante datorate partial infecţiei streotococice şi
parţial răspunsului iimtn al gazdei. Nu s-a elaborat un sistem perfect pentru clasificarea
tuturor streptococilor. Dintre speciile cu importanţă medicală ar fi de amintit S. pyogenes
(grup A), S. agalactiae (grup B), S. viridans (care aparţine florei normale), j>. pneumoniae
T p netimbcocul) etc. Enterococii aparţineau grupului D, însă în momentul actual fac parte
dintr-un gen separat, genul Enterococcus. Streptococii sunt imobili, nesporulaţi şi pot avea
sau nu capsulă. în acest capitol,vom discuta diagnosticul de laborator ai infecţiilor produse
de Streptococcus pyogenes,
Cei mai mulţi dintre streproeeefi care conţin antigenul de grup A sunt streptococi piogeni.
Streptococii piogeni sunt hefa-hemolitici fnroduc în mod caracteristic zone largi de hemo-
liză clară în jurul unor colonii de dimensiuni mici). De regulă streptococii piogeni sunt sen
sibili la bacitracină. *
Streptococii sunt potenţial implicaţi într-o mare varietate de boli. în principal strepto
cocii piogeni pot deveni patogeni datorită multiplicării şi capacităţii de invazivitate.
Proprietăţile hiningico ale microorganismelor infectante, natura răspunsului gazdei şi poar
ta de intrare a infecţiei au o mare influenţă asupra tabloului clinic. Infecţiile streptococice ar
putea fi grupate astfel:
• Boli invazive, în care putem include faringita, angina streptocoeică, erizipelul, diferite
“infecţii în sfeFa ORL, pneumonia, impetigo streptococic, celulita, fasceita necrozantă,
febra puerperală, endocardita infecţioasă, sepsisul streptococic etc.
• Boli produse de streptococi lizogenizaţi, în care putem include scarlatina şi sindromul
de şoc toxic streptococic.
• Bolile poststreptococice care includ reumatismul articular acut (RAA) şi glomerulo-
. nefrita acută poststreptococica (ONA). Diferiţi autori iau în considerare şi alte entîtăţT
clinice.
Pentru a discuta diagnosticul de laborator în infecţiile produse de streptococii piogeni
vom alege faringita streptocoeică. în vederea confirmării unei boli poststreptococice vom
discuta reacţia ASLQ (vezi si capitolul 19).
Diagnosticul de lab o rato r bacteriologic, direct, în faringita streptocoeică.
/ u R ecoltarea si transpnn.nl pi-nHnsnlui patologic, secreţia purulentă de la nivelul
farttigelui, trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât mai aproape de debutul
bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere
(
146 Diagnosticul de laborator în microbiologie .JlS Diagnosticul de laborator în infecjiile produse de Steptococcus 14 7
i" \ i y ' *i *' i.ii v's-'. ,/b? . i-■./Vii-1: ri'Qirî'Cifj'* ' L . :'V. '
•r.t - ............
al tehnicilor utilizate, respectând, toate normele de asepsie şi antisepsie, recoltarea se face • Streptococii piogeni sunt rezistenţi la trimetopriin-sulfametoxazol.
preferabil dimineaţa înainte ca pacientul să mănânce şi % ă să se fi spălşt pe dinţi, fără să fi • Caractere antigenice:
utilizat gargarisme cu diferite soluţii, iar dacă aceste condiţii nu au fost respectate, recoltarea
• Se pol utiliza teste comerciale pentru detectarea rapidă a polizahariduiui specific
se va face după minim 4 ore etc vezi şi capitolul 6). Produsul recoltat trebuie prelucrat cât
de grup A al streptococilor piogeni în p.p., după extracţie chimică sau enzimaticâ
mai repede posibil, însă în nici un caz nu trebuie să treacă mai mult d & 3 o v e \te la recoltare
(ex. cu p ro n az ăh je taicije utilizate pot fi aglutinarea indirectă (latexaglutinare),
până la cultivare (preferabil 1-2 ore). în cazul în care se estimeazădgpăşireadîcestui interval coaaluiinarea sd a E LiSA.,^ ^ =*—____
de timp trebuie folosit un m ^ i" h»Transport^.», mediul Stmniiwy/i şi capitolul 9). Chiar şi
•" “ Prin reacţii ele aglutinare (latexaglutinare,.coaglutinare) pe lamă, sau precipitare se
în această situaţie, nu ar trebui să treacă mai mult de 24 de ore până la prelucrarea p.p.
!v pot determina antigenele streptococice de; gi-up (Lancefieid) sau de lip.
/ î . Examinarea microscopică a produsului patologic iricliKle realizarea a două frotiiirj din
proaus&r^tttbtegidTTOdTîîrşrtranspdrtat' cores^ se vor colora cti albastru de
•J - pyogenes este împărţit în serotipuri pe baza antigenelor proteice M.(peste 80)
prin reacţia de precipitare în tuburi capilare şi T (28 serotipuri) prin reactiTcTe
metilen (AM) şi respeeliv'Gram. Frotiurile se examinează lâ microscopul optic cu imersie şi
■'■( ' aglutinare pe lamă. Aceste testări se fac în centre de referinţă.
se notează prezenţa celulelor de la nivel farmgian, prezenţa celulelpr inflamatorii (ex.ieu-
cocite, piocite) şi prevenţii cnrijor gram-pozitiyi aşezaţi separat, în perechî sâu în lanţuri, dar • Alte teste utilizate în identificare: Se pot utiliza sondele nucleotidice pentru detectarea
şTâ^l'tof. tipuri de microorganisme. Examenul microscopic al p.p. are doar uiţ rol orientativ. directă a streptococilor (le grup A în exsudatul faringian. • :
f 3.jCultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşg fel încât să Slreptococii piogeni îşi menţin sensibilitatea cunoscută la penicilină fan fost identifi-
sejîlSată obţFnecoloniilzolatc şi respectiv o cultură pură, care,se va identifica (vezi şi capi caheTn ultima perioadă tulpini “tolerante”, care sunt inhibate dar nu distruse de către peni-
tolele 9 şi 10). Streptococii piogeni sunt germeni pretenţioşi caceuţu se dezvoltă pe medii cilină)..Egiiixii pacienţii alergici ia .beta-lactamine se poate alege pentru tratament eritromi-
cină, dar au fost identificate tulpini rezistent&ja acest medicament antimicrobian şThracesT
de cultură obişnuite. Mediul cel mai frecvent folosit este stear-sângo? pe care cultura apare
caz anţibiograma devine necesară. în general antibiograma se realizează în scop epidemio
în 18-48 ore, la 35-37°C. în cazul în care nu remarcăm apariţia de'colorm ^^ictedstice după
logie.
24 de ore, reincubăm placa Petri pentru încă o zi. Coloniile au asp ecp d etip S cuiliametrul
de 0,5-1 mm, înconjurate de o zonă de B-liemoliză (zonă clarW e Jie m d iză , cu un
diametru mult mai mare decât diametrul coloniei), în cursul însămânţării, pe cel puţin una
Diagnosticul de laborator serologic
dintre laţurile „poligonului" descris trebuie să realizăm şi o înţepare a mediului în aşa fel Diagnosticul imunologic al infecţiilor produse de streptococii p-heinolitici din grupul A
încât inoculul să ajungă mai în profunzime, Această.-rrianevră (există şi alte variante ţehniţe) ar putea consta din investigarea fie a răspunsului imun umoral (prezenţa şi litrul anticorpi
este necesară pentru a permite activitatea hemolizinei O (această streptoiizină este inactivată lor, în cadrul diagnosticului seroiogic), fie a răspunsului imun de tip celular. în continuare
în prezenţa oxigenului). Speciile care produc material capsular, din acid hialuronic, adese nu vom discuta decât diagnosticul serologic, care are importanţă practică.
ori dau naştere unor colonii mucoide (de tip M). Se pot folosi pentru cultivare şi medii selec- Diagnosticul serologic este util pentru certificarea etiologiei bolilor poststreptococice
tiv^Xde ex. agar-sânge plus irimetoprim-sulfanietoxazol). (RAA, GNA), identificarea unei eventuale stări de hipersensibilitate, diagnosticul retro
6 1U Identificarea
1 microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor spectiv al unei infecţii streptococice, evaluarea evoluţiei clinice şi eficacităţii tratamentului.
caractere: Diagnosticul serologic se realizează de obicei prin reacţia ASLO, care identifică titruri ale
• Caractere morfotinctoriale:.Sunt coci gram-pozilivi. sferici sau ovoidali. cu diametrul anticorpilor anti-streptolizină O (vezi şi capitolul 19). Testarea se face în dinamică, pe seruri
cleTcirca )pm. Se divid într-un pian perpendicular pe axa lor lungă şi se pot dispune îţi recoltate la interval de 7-10 zile. Pentru zona noastră geografică se acceptă ca normal un
lanţuri. Lungimea lanţurilor variază şi este condiţionată de factorii de mediu. litiu de 200 (maxim 250) unităţi ASLO. Este strict necesară realizarea controlului intern şi ‘7
extern de calitate. .
• Caractere de cultură: Produc colonii d*rtlp*S>cu diametrul de 0,5-1 mm, înconjurate
de o zonă de P-hemoliză sau colonii oeT ijfM ., , ‘ Există teste seroiogice pentru determinarea prezenţei şi litrului anticorpilor faţă de altd^
structuri antigenice (streptodomază. hialuronidază, streptokinază). Titrai anticorpilor anti-
• Caractere biochimice: , " , • ' /
strcptociornază este Crescut la pacienţii cu infecţii tegumentare şi trebuie investigat dacă se
<TSti-p.pinr.ncii piogeni produc hemoliză de tip behu_ suspicionează prezenţa unei glomerulonefrite acute. Se pot determina şi anticorpii anticar-
• Prin testul PYR este identificată sinteza pirolidonil-amidazei (actualmente există şi bohidrat (hemaglutinare pasivă) sau anti-MAP (prin latex aglutinare).
•teste comerciale, rapide, pentru testul PYR).
• Multiplicarea streptococilor de grup A este inhibată de bacitracină (antibiotic oro-
dus de Bacillus liclwnijbrniis). Se apreciază că dintre tulpinile de Streptococcus
pyogenes, mai puţin dc \% sunt rezistente la bacitracină (vezi capitolul 12),
J
26 Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Steptococcus pneumoniae 149
11
vii
ţ ţ | t ]' i"| Ş , >
i V l i - i t l i , ■! ' i
Neisseriameningitidis
IJt T1 V ; - s j.î -vf ' t:. Neisseria meningitidis poate face parte din flora microbiană de la nivel oral, nazal sau
faringian. Colonizarea poate persista săptămâni sau luni de zile. Meningococul este un
microorganism condiţionat patogen care poate fi implicat în infecţii respiratorii, dar este
'■ / semnificativ de reţinut faptul'că prin invazivitate poate conduce la apariţia unei bacteriemii
în cursul căreia complicaţia principală este meningita meningococică. Meningococul repre
zintă una din primele trei cauze de meningită infecţioasă la adulţi (alături de Haemophilus
influenzae şi Streptococcus pneumoniae).
Diagnosticul de laborator
11 în m eningita meningococică diagnosticul este urgent (risc de evoluţie cu sechele şi/şau
deces), de importanţă-maximă fiind recoltarea şi transportul rapid al LCR către laborator.
Este de preferat realizarea unei cultivări „la patul bolnavului", chiar dacă pentru concen
trarea germenilor ar putea fi necesară centrifugarea LCR. Analiza citologică şi biochimică
a LCR este utila în stabilirea etioiogiei.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând re
gulile cunoscute (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibi
otice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate
(
152 Diagnosticul de laborator în microbiologie 27 Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Neisseria 153
normele de asepsie ţi antisepsie etc). Aşa cum am menţionat, recoltarea LCR prin puncţie 0,05 pg de Ag/ml). De notat posibilitatea unei reactivităţi încrucişate faţă de Ag
(după verificarea presiunii din artera centrală a retinei prin examinarea fundului de ochi) tre grupului B, respectiv Ag Ki de la E. coli.
buie tăcută pe cât posibil la patul bolnavului, având la dispoziţie tot ce este necesar pentru
• Tehnici similare se pot utiliza pentru identificarea tulpinilor de meningococ izolate
pregătirea frotiurilor, cultivarea pe diferite medii de cultură, repartizarea unei cantităţi de
în cultură.
LCR pentru examenul citologic şi biochimic (vezi şi capitolul 6). LCR poate fi purulent. în
cazul în care p.p. urmează a fi transportat către laborator, transportul trebuie realizat fără • Caractere utilizate în tiparea tulpinilor izolate: Există diferite tehnici .(imunologice,
întârziere (la o temperatură apropiată ’de, 37°C). Meningococul ar, putea fi izolat şi prin electroforetice, de biologie moleculară) care sunt practicate numai în centre de refe-
hemocultură, cultivarea secreţiilor nazale sau faringiene.etc., ...... m , / rinţâ. Utilizarea PCR are o sensibilitate şi specificitate de circa 91%; foarte utilă la
pacienţii pentru care s-a iniţiat dejaantibioticoterapia.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a,minim două
frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora.cu 5. Antibiograrna (testarea sensibilităţii tulpinilor izolate în vederea stabilirii tratamen
albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram..Dacă LCR. este, franc purulent,frotiurile se pot tului) este recom andată şi se realizează de obicei prin metode difufcimetrice. în cazul unor
executa direct din p.p;, în caz,contrar realizării.iniţial.,centrifugarea LCR. Froţiurije se exa; infecţii grave antibiograma trebuie să fie însoţită de alte determinări (vezi capitolul 14).
minează la microscopul optic cu imersie ş i se notează .prezenţa celulelor inflamatorii (ex.
Îeucocite) şi prezenţa cocilor gram-negativi, dispuşi în diplo, reniformi, (mobili, înconju Neisseria gonorrhoeae
raţi de o structură capsulară comună, situaţi intra sau extraleucocitar. , Infecţiile gonococice continuă să reprezinte o problemă importantă de sănătate publică.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se După pătrunderea în organismul receptiv, Î 11funcţie de calea de transmitere, gonococu!
poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură; care se va identifica (vezi şi capitolele 9 se ataşează de mucoase (genito-urinarâ, oculară, rectală, faringiană etc) şi produce local o
şi 10). Meningococii sunt germeni pretenţioşi, care nu se dezvoltă pe medii simple, sunt aerobi, supuraţie acută. La bărbaţi apare uretrita gonococică. La femei, gonoreea se localizează
facultativ anaerobi. Se pot utiliza medii selective (ex. medii în care se include vancomicină, endocervical, dar se poate extinde, la nivelul uretrei, vaginului, glandelor Bartholin,
colistin, trimetoprim şi nistatin) sau neselective (ex. Mueller-Hinton, geloză-sânge sau geloză- trompelor uterine, Dacă mama are gonoree şi nou-născutul se naşte pe cale naturală, poate
chocolat) pe care formează colonii de tip S sau de tip M. Este necesară o atmosferă de 3-5% apărea oftalmia gonococică. Rareori gonococu! poate disemina pe cale sanguină (bac-
CO2, la o temperatură de 37°C. teriemie), cu apariţia unor leziuni dermice, artrite, tenosinovite gonococice etc.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere': Diagnosticul de laborator în gonoree
1 ■■. , ...... ,
• Caractere morfotinctoriale: Sunt coci gram-negativi, dispuşi în diplo, reniformi, imobili, Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic (direct).
înconjuraţi de o structură capsulară comună, nesporulaţi. 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regu
• Caractere de cultură: Coloniile de meningococ sunt de tip S, cu dimensiuni de circa 1- lile cunoscute (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibio
2 mm. Tulpinile încapsulate (ex. grupele A, C) pot conduce la apariţia unor colonii de tice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate
tip M. normele de asepsie şi antisepsie etc). La bărbat se prelevează secreţia u retrală (eventual
o Caractere biochimice: „picătura matinală"), iar la femeie recoltarea trebuie efectuată pe masă ginecologică de la
nivelul colului uterin şi glandelor Bartholin (vezi şi capitolul 6). Secreţiile au de obicei un
'• Metabolizează diferiţi carbohidraţi, activitate care poate fi utilă în identificare. Spre
aspect purulent. Este de preferat cultivarea imediat, pe medii de cultură potrivite şi în
exemplu meningococul metabolizează atât glucoza cât şi maltoza.
atm osferă de CO 2. în cazul în care p.p. urmează a fi transportat către laborator, transportul
• Produc citocrom-oxidază, un test cheie în identificare (vezi şi capitolul 12) trebuie realizat fără întârziere (la o temperatură apropiată de 37°C). Chiar şi în cazul uti
• Există , o serie de sisteme comerciale pentru identificare .exoenzimatică a lizării mediilor de transport (ex. mediul Amies plus cărbune activat), acesta nu ar trebui să
Neisseriilor (ex. API, Quad Ferm+, RIM, Miniteketc). , , ..... ... dureze mai mult de 6 ore. Gonococul ar putea fi izolat şi prin hemocultură, cultivarea
• Caractere antigenice: în funcţie de structura lipooiigozaharidului există 12 serotipuri. secreţiilor conjunetivale, faringiene, cultivarea urinei etc. în cazul în care nu există nici o
Cel mai important determinant antigenic este capsula polizaharidică. Structura capsu secreţie, se poate utiliza Urina care trebuie centrifugată şi însămânţată im ediat pe medii de
lară permite subdivizarea speciei în 13 serogrupuri. Dintre acestea mai importante siint cultură.
grupele: A, B, C, Y şi W -135. 1/ . 2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a ,minim două
• Prezenţa meningococului poate fi detectată direct în produsul patologic prin latex frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu
aglutinare, coagiutinare sau contraimunoelectroforeză utilizând seruri polivalente albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic
anti-A, C, Y , W-135 şi respectiv seruri monovalente anti-B (se pot detecta 0,02- cu imersie şi se notează prezenţa celulelor, a celulelor inflamatorii (ex. îeucocite) şi
154 Diagnosticul de laborator în microbiologie Li Diagnosticul de laborator în infeefiile produse de Neisseria
155
prezenţa cocilor p kam-negsitivi, dispuşi în di'plo, rertiformi, imobili, înconjuraţi cîe o struc • Metodele biologiei moleculare au atât o specificitate cât şi o sensibilitate foarte bună;
tură capsulară comună, situaţi intra sau extraleucoeitar. se pot utiliza fie pornind de la culturi fie de la p.p.
3. Cultivarea pe mediii de cultură a produsului patologic se realizează în-aşa fel încât să * Sondele nucieotidice
se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi capi
• PCR
tolele, 9: şi 1,0). Goiipcpcii- sţint germeni .foarte pretenţioşi,,care nu se, dezvoltă pe,rneclii .sim
ple, sunt aerobi, facultativ anaerobi,.;Se, pQtsutiliza mediii selective (ex,v) medii, în, care se • IţCR (Ligase Chain Reaction); această metodă se poate utiliza pornind de la urină
includ®: y.ancomicina,,;coliştin,,,trim,etQprim §i ţiistatin) sau neselective (eţi imeţăul GC, , sau,,de la,secreţii yaginaieşŞHU'e un.singur.dezavantaj.'COSţui ridicat», , ;
geloz#sânge sau geloză-chocolaţcu, diferite suplimente iputritjve; se, tec,ontandă; utilizarea (>''> 5. Antibiogrnma (testarea .sensibilităţii tulpinilor izolate în vederea stabilirii tratamen
pulberii de, hemoglobina şi nu a sângelui proaspăt), Eşţe preferată cultivarea „în dublu", pe tului) este recomandată:şij’se:reâlizează de obicei prin metode difuzimetrice (mediul utilizat
medii selective şi nesejectivefln câzuj 'în care p.p. esţe reprezentat ele secreţie de ia nivelul este GC suplimentat nutritiv clar fără pulbere de hemoglobină). Au fost identificate tulpini
rectului sau .de secreţie, iaringiană se vor, folosi .nunţiii medii selectiveiEste necesară o rezistente la penicilină (fie datorită unui plâsmid care codifică o fS-iactamază de tipul TEM,
atmosferă de 3-10% COa, la o temperatură de 35-37°C. Coloniile apar în 24-48 de ore. fie datorită unor imitaţii cromozomiale). Este'necesară testarea producerii de (3-lactămază
Gonococul produce colonii de tip S, cu dimensiuni de 0,5-1 mm s.au.cplqnij de .tip,Mi(,nepig (de ex»< folosind discuri cu nitrocefin). Determinarea;CMI se poate realiza prin metode cla
mentate, transparente sau opace. Este de remarcat faptul că în aceeaşi placă pot apărea până sice .sau Pu ajutorul’testului E'(vezicapiloluN4).'-; >•'' ■
la cinci tipuri de .colonii (TI-Ţ5). Pitica eşte eliminată în cazul în care nu se dezvoltă colonii,
după 72 de ore, i ,, ; ,, .
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe bazamai,multor
caractere: ■ ■■ . .■ • : p ;.:
• Caractere morfotinctoriale: Surit coci gram-negativi, dispuşi în dipio, reniformi, i'mo-
. bili, eventual înconjuraţi de o structură capsulară comună, nesporuîaţi. Se poate utiliza
şi „coloraţia"fluorescentă; <• ^ ■1 , ; f . - ; -ri <
• Caractere de cultură: Coloniile de gonococ sunt de tip S sau M (vezi punctul 3).
/ .
• Caractere biochimice: ...... ...; ,v.j •
4 Metabolizează diferiţi carbohidraţi, activitate care poate fi utilă în identificare.
Gonococul metaboiizează glucoza dar nu şi maitoza,
• Produc citocrom-oxidază, un test cheie în identificare (vezi şi capitolul 12).
• Testul catalanei (superoxol) este intens pozitiv.
• Există o serie de sisteme comerciale pentru identificare exoenziinatică a Neisse-
riilor (ex. API, Quad Ferm+, RIM. Minitek, Gonochek II etc).
• • Utilizând galeria, API NH (manuală) putem identifica,specii ,de,jyeişşţiaa, Haemq-
philux şi Branheiimllq caiurrhali$,\n numai 4 ore.
• Caractereantigenice: ■/ ■ .*
• în funcţie de structura lipooligozahariduiui există 6 serotipuri.'Gonococii po't
exprima simultan mai multe structuri antigenic diferite, ceea ce trează probleme
tehnice. Aceste testări se realizează în centre de referinţă. 1: ■‘ "■■if
• Prezenţa gonococutui poate fi detectată direct în produsul patologie prin
coaglutinare (suspensie de S. aureus tip Cowan i stabilizată şi sensibilizată cu Ac
monoclonali antiproteină I din membrana externă a gonocodlor) sau printr-o
tehnică imunoenzimatică (cu Ac policlonali). j
• Se pot .utiliza Ac monoclonal! cunoscuţi, pentru identificare gonococttlui prin
tehnica inuinoiluorescenţei directe. 'I
Diagnosticul de laborator în infecfiiie produse de enferobacterii 157
0 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
2 O # ÎN INFECŢIILE PRODUSE DE ENTEROBACTERII Infecţiile enterobacteriene sunt destul de variate. Pot fi localizate la nivel digestiv (dizen
terie şi sindroame asemănătoare dizenteriei, sindroame asemănătoare holerei, toxi-infecţii ali
mentare etc), la nivelul tractului urinar, la nivelul aparatului respirator sau la nivelul sis
temului nervos. Infecţiile enterobacteriene pot avea şi alte localizări sau poţ fi generalizate
, > ' ■' '•V-! V ••• i Vl (de ex. în febra tifoidă, febrele paratifoide, pestă).
•• .V .1 ;>'!»î'J*v ' MfjfO 0£>*l£: ' ?l J-r > i? în majoritatea infecţiilor produse de enterobacterii diagnosticul este bacteriologic, direct,
Familia Enterobactiriacecte Cuprinde tin impbftant nuM tide geriiiri'de microorganisme în febra tifoidă diagnosticul poate fi atât bacteriologic cât şi imunologie (serologic). Datorită
semnificative din punct de vedere medical(28) şiţriumeroase speqii (peste >IQQ,, îrfcazul în faptdlui că în multe dintre aceste infecţii produsul patologic este reprezentat de către mate
care-nu luăm în considerare clasificarea genului Salmonellatn pesţe 200Q d e specîi). Dintre riile fecale, în continuare vom discuta examenul bacteriologic al materiilor fecale.
genurile incluse în această vastă familie, ,vom-aminti următoareie:. Escherichia, Shigella,
.Salmonella, Yersinia, Klebsiellai,Proteus, 0robacter,>Edwarsiellti,*Enterobacter, Morgane- C0PR0CULTURA
Hai Providencia şi Serratia. în capitolele, următoare, vom discuta numai, despre diagnosticul
în multe dintre infecţiile produse de enterobacterii, care se manifestă prin sindrom diareic,
în , infecţiile produse de microorganismele -i aparţinând , primelor ,6,; genuri; enumerate.
utilizăm coproculturu. în cele ce urmează vom discuta coproculturaîn general, nu numai din
Enterobacteriile sunt bacii! gram negativi care, nu,se. pot diferenţia-prin;microscopie,optică,
punctul de vedere al unei infecţii enterobacteriene.
mobili cu cili peritrichi (ex. Salmonella spp., Proteus spp.),."sau imobili (ex. Shigella,
Yersinia, Klebsiella), nesporulaţi; unele specii prezintă capsulă (ex. Klebsiella pneumoniae). Boala diareică acută
Sunt germeni nepretenţioşi care se pot multiplica pe medii simple, aerobi facultativ anae-
Boala diareică acută (BDA) a fost şi rămâne o entitate patologică foarte răspândită la nivel
robi, utilizează fermentaţiv glucoza cu sau fără producere de gaz, sunt oxidazo-negativi, mondial. Spre exemplu, în ţara noastră în ultimii ani, numărul de cazuri de boli diareice acute
catalazo-pozitivi, reduc nitraţii. Formează colonii de tip S, R (în cazul culturilor ,,vechi“) a fost de 85.055 în anul 2000, 81.268 în anul 2001 şi respectiv 97.317 în anul 2002, cu o
sau M (pentru speciile capsulate), pot fermenta lactoza (ex. Escherichia coli, Klebsiella) sau incidenţă de 446,5 °/nooo în 2002. în aceeaşi perioadă de timp, în fiecare an au decedat
sunt lactozo negativi (ex. Salmonella, Shigella, Yersinia). Pentru izolarea speciilor de ente-
datorită BDA circa 100 de pacienţi.
robacterii putem folosi medii selective, diferenţiale şi selectivo-diferenţiale. Există medii cu
selectivitate mai redusă care inhibă majoritatea bacteriilor gram pozitive şi permite dez- Sindromul diareic include eliminarea a peste 3 scaune în 24 de ore iar scaunele au con
voltareâ tuturor enterobacteriilor (ex. mediul Mac Conkey cu săruri biliare în concentraţie sistenţa diminuată (până ia emiterea unor scaune apoase, cu pierderea a până la 20-30 litri/zi
mică; se poate adăuga şi cristal violet), medii cu selectivitate medie care inhibă multipli în holeră). Materiile fecale pot avea aspect patologic (apos, mucos, purulent, sanguinolent
carea Enterobacteriilor lactozo-pozitive (ex. mediul ADCL cu dezoxicolat, cltrat şi lactoză, etc), culoare modificată, miros, particular etc. De regulă sindromul diareic asociază şi alte
mediul Shigella-Salmonella cil săruri biliare şi verde briliant sau mediul XLD cu xifSză, Uzi semne şi simptome digestive (dureri abdominale, teesine, greaţă, vărsături etc) sau generale
nă şi dezoxicolat, preferat în multe dintre ţările Uniunii Europene) şi medii cu selectivitate (febră, stare generală alterată etc). Foarte important şi obligatoriu de reţinut este că BDA
înaltă (ex. mediul Wilson-Bîair cu verde briliant în concentraţie crescută). duce la pierderi de apă şi electroliţi iar intervenţia cea mai importantă care trebuie avută în
vedere este reechilibrarea hidroelectroliţicâ.
Caracterele biochimice sunt esenţiale pentru identificarea enterobacteriilor. După exami
narea caracterelor de cultură, (pe mediile selectivo-diferenţiale se poate identifica şi comporta Agenţi etiologici
mentul în ceea ce priveşte fermentarea iactozei), prin repicarea coloniilor suspecte pe medii
potrivite (TS1, M1U/M1LF, Simmons etc), în zilia următoare se pot examina diferite carac Boala diareică acută poate fi de etiologie infecţioasâ şi neinfecţioasă. în continuare vom
tere biochimice (fermentarea zaharurilor, evidenţierea unui anumit metabolit, metabolizarea discuta pe scurt etiologia infecţioasă în general, nu numai cea bacteriană sau fungică. Este
unui anumit substrat, utilizarea căratului ca unică sursă de carbon, identificarea unor enzi- de menţionat că marea majoritate a BDA infecţioase au etiologie virală.
me etc) sau alte caractere fenotipice (ex. niotilitatea). în momentul de faţă există baterii de
Etiologia bacteriană include
teste şi sisteme comerciale care permit examinarea unei, game extinse de caractere biochi
mice (ex. galeriile API). Dorim să menţionăm.că pentru fiecare test fenotipic există o serie • Salmonella spp.
de variaţii care sunt prezentate procentual în tabele special dedicate. .. j , • Shigella spp.
Un alt aspect foarte util pentru identificare este reprezentat de studierea caracterelor anti- • Escherichia coli (EPEC/enteropatogen, ETEC/enterotoxigen, EHEC/enterohemoragic,
genice folosind seruri cunoscute (preparatg pe animale de laborator), cu ajutorul diferitelor EIEC/enteroinvaziv, EAEC/enteroagregant, DAEC/aderent difuz)
reacţii Ag-Ac (vezi şi capitolele 15-20). Toate enterobacteriile deţin Ag O. Enterobacteriile • Klebsiella spp.
mobile deţin Ag H. Enterobacteriile capsulate deţin Ag K. Salmonella typhi prezintă şi Ag • aite enterobacterii (Yersinia enterocolilica, Citrobacter spp., Proteus spp. etc)
Vi, Yeninia pestis prezintă Ag FI etc; • Vibrio cholerde şi alţi vibrioni
Diagnosticul de laborator în microbiologie Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de enterobacterii
158
! • alţi bacili gram negativi -(Aerâinohad:spp4 Alâdligenes sppj Pseudoiiiolias spp. &tc) include acţiunea unei toxine este contraindicată administrarea de antibiotice sau chimiote-
• Bacillus cereus rapice antibaqteriene.
• Campylobacter jejuni ■ Indicaţiile coproculturii în bacteriologie
• Clostridiumpeifringenx, Clostridium difficile '' " ’ -ii ■-ii • "•
• Clostridium bvtuliniirn • atunci când este suspicionută o infecţie cu Shigella spp., Vibrio cholerae, E. coli (tipu
: • Staphylococcus aureus etc.i-; ■!.. tir rile patogene), Campylobacter spp., Yersinia enterocolitica sau Salmoiîella spp. în
specia! la pacienţi cu vârste extreme sau imunodepresie'
Etiologia fungică include ‘
" • după circa .1 săptămână de la debutul febrei tifoide etc
• Candida albicans, (la pacienţi, cu S I p A ) , e t C t i i . - . » • •< v'lmm-;- ,o Si. :
• atunci când BDA prezintă riscul extinderii la nivelul unei colectivităţi (creşe, grădiniţe,
Etiologia parazitară include tabere, unităţi 'de alimentaţie publică, staţii de distribuţie a apei potabile etc)
■.!?> ' ■■■,.'ii lb ! .
/ » .atunci când BDA apare la pacienţi care ati fost trataţi cu antibiotice iar sindromul
• Giardia lamblia
'• Entamoeba'hystoUtica Entamoeba call' 1 ’ 1 1 ■ 1” '.’- diareic persistă şi după întreruperea anţibipticoterapiei. ,
• Tricliinella spiralis ’ • **' ' - v ;••• ' :: ■ i' • atunci când sindromul diareic persistă mai mult de o săptămână sau are loc o recădere
• Cryptosporidium parvum • în scopul verificării stării de sănătate a persoanelor care lucrează în unităţi de alimentaţie
• Strongvloides stercoralis etc. publică (conform normativelor stabilite de către ministerul sănătăţii)
‘ < .-i.
• în scop de cercetare etc.
Etiologia virală include
• rotavirusurije !i Recoltarea şi transportul materiilor fecale
• virusurile Norwalk şi asemănătoare virusurilor Norwalk ;'
Se. vor respecta recomandările menţionate în capitolul 6, în special faptul că recoltarea
:• calicivirusurile i . -i ■< ■■ . .. <■!' t p.p. trebuie să se realizeze înainte de administrarea de medicamente antimicrobiene. Se pot
• astrovirusurile . 1 ■; recolta şi examina:
• coronavirusurile . .
• scaunul emis spontan care reprezintă p.p. utilizat cel mai frecvent. Defecaţia are loc
• enterovirusurile ,, ........
într-un recipient de carton sau îiur-un container din material plastic de unică între
• adenovirusurile etc.
[ ................................... ' buinţare (care poate fi apoi decontaminat şi eliminat fără probleme). în acelaşi timp
Gruparea agenţilor etiologici în funcţie de mecanismul patogenic efectuăm şi examinarea macro,scopică a p.p. din punctul de vedere al mirosului, culorii
sau aspectului. Utilizăm pentru prelevare linguriţa recoîtorului alegând porţiuni care
Atât din punct de vedere diagnostic cât şi, pentru tratament poate fi importantă elucidarea
permit cu o mai mare şansă izolarea agentului patogen'(fragmente mucopurulente,
tipului de mecanism im plicat Astfel, BDA ar putea fi produse prin: : , ;. ,
porţiuni cu sânge, flocoane riziforme etc) sau porţiuni diferite dintr-un scaun în care nu
• mecanism neinflamator, atunci când din punct de vedere microscopic în preparatul se remarcă aspectele menţionate anterior. Prelevăm o cantitate de aproximativ 1 gram
între lamă şi lamelă nu se evidenţiază leucocite (ex. BDA produse de Vibrio cholerae, pe care o suspensionăm în mediul de transport (minim 2 ml în cazul scaunelor apoase).
ETEC, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Giardia îdmbliâ, 'fotaViru-
• tamponul rectal este recomandat în cazul unei infecţii cronice cu Shigella spp., atunci
suri, virusuri Norwalk, Ciyptpsporidium parvum etc), .. ; '
când suspicionâni portajul de Shigella spp. sau Salmonella spp. Tamponul steril se
• mecanism inflamatori atunci când din punct de vederemicroscopic în preparatul între introduce cu blândeţe şi se prelevează secreţiile de la nivelul mucoasei rectale, prin
lamă şi lamelă' se- evidenţiază leucocite' polirriorlbnucleare (ex. BDA produşe db : rotire, pentru a recolta material din criptele rectale. Apoi introducem, tamponul în;
Shigella spp., EIEC, Salmonella enteritidis, Vibrio parahaemolyticum, Entqţnoeba ,. mediul de transport. Pentru a putea închide recoltorul, tăiem în mod corespunzător tija s
hystoliticci etc) ■v ,! tamponului.
• mecanism de „penetrare", atunci când dur punct de vedere microscopic-în'preparatul • sonda Nelaton-.se poate utiliza atunci când, urmărim recoltarea p.p. d e,la nivelul
între lamă şi lamelă se evidenţiază leucocite mononucleare (ex. BDA sau Vsindrom colonului sigmoid. Introducem cu blândeţe sonda până la nivelul dorii (circa 10-12 cm
'diareic produs de Salmonella typlti-, YirsiniirenterocoUt'lca etc). . 1d ■la copil şi respecti v circa 15-20 cm la adult), adaptăm la celălalt capăt al sondei o serin
După cum se poate remarcă, simplă recoltare a produsului patologic urinată de realizarea gă şi aspirăm p.p. de la nivel sigmoidian. Introducem p.p. în mediul de transport.
uiiui preparat nativ (vezi capitolul 7) şi examinarea microscopică a acestuia pot da informaţii în cazul în care p.p. nu poate II prelucrat imediat sau în maxim 1 oră, utilizăm un mediu
importante cu privire la etiologia probabilă precum şi atitudinea terapeutică de urmat. Este de transport, transportul la rece (+4°C) sau transportul în mediu de transport menţinut la.
evident că într-o BDA pentru care agenţii etiologici suiit virali sau mecanismul patogenic
■I
4°C. Cel mai frecvent utilizăm, mediul Cary-Blair (vezi capitolul 9). Acest mediu asigură ■-jp' 3-5 colonii în cazul îti care pacientul este adult. în căzui în care nu există colonii Iactozo-
supravieţuirea enterobacteriilor patogene timp de 24-48 de ore, inhibând în acelaşi timp negative, pentru identificare vom repica (fără să atingem mediul de cultură) 10 colonii la
multiplicarea florei de asociaţie. Atunci când este suspicionată infecţia cu V. cholerae, apa copil şi respectiv 10 colonii la adult (dacă se consideră că identificarea este necesară, de ex.
peptonată alcalină serveşte în acelaşi timp drept mediii de transport şi m ediu'de 1îmbogăţire. în izbucniri epidemice de BDA).
Aşadar, după apariţia coloniilor izolate pe mediile selectivo-diferenţiale trecem ia iden
Exam inarea m ateriilor fecale tificarea speciilor implicate patogenic pe baza caracterelor morfo-tinctoriaJe, de cultură
Materiile fecale sunt examinate macroscopic şi microscopic. Din punct de vedere micro (vezi capitolul 11), biochimice (vezi capitolele 11 şi 12), antigenice (vezi capitolele 11-20,
scopic, de fiecare dată se vor realizapreparaţe native,(între lamă şi. lamelă). Materiile fecale în special capitolul 17), de patogenitate, pe baza sensibilităţii la bacteriofagi şi eventual pe
sunt suspensionate într-o picătură de lugo! sau de albastru de m e t i l e n i a r preparatul se baza unor caractere moleculare. Pentru interpretare vom utiliza diferitele tabele disponibile
va examina iniţial cu obiectivul I0x, apoi cu obiectivul 40x. Spre exemplu.'evidenţierea a în tratatele de specialitate sau recomandările producătorilor în cazul utilizării unor sisteme
peste 40 PMN/câinp, însoţite de măcrolage şi hematii, conduce la suspicionaVea unei dizen comerciale de diagnostic. Pentru tulpinile considerate a fi implicate patogenic vom realiza
terii bacteriene. Frotiurile colorate pot fi utile în suspicionarea diagnosticului de enteroco- •î studiul sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice, de regulă prin metode difuzimetrice
lităcu Campylobacter spp. sau hi coliiCi pseudbmembranoaiîe; post antibioticoterapiC. (antibiograma difuzimetrică ,standardizată, comparativă, E test).
. ............. *■• : ■) ■' f Alte aspecte particulare urmează a fi prezentate în capitolele următoare.
Cultivarea m ateriilor fecale . ■.... i . jv Iu--- •ui--»:’
■■
‘Hi-.-' . .?•i> . • 7." .. • • •{( .. • ; .•«
în mod obişnuit, pentru cultivare vom-utiliza13-medii diferite,Respectiv o epriibetă cu
bulion selenit acid de sodiu şi 2 plăci Petri, una cu mediu cu selectivitate scăzută (exr Mac
Conkey) şi alta cu mediu cu selectivitate medie (ex. ADCL sau XLD). Aceste medii selec
tive sunt în acelaşi timp şi medii diferenţiale. m '
Alegem fragmente caracteristice clin p.p. (mucus, puroi etc) şi însămânţăm,2-3 anse în
mediul cu bulion selenit (mediu de îmbogăţire în special pentru Salmonella spp.). Realizăm:
o suspensie omogenă în mediul lichid. Prelevăm o ansă (sau o picătură) din suspensie şi o
depunem pe mediul MacConkey. Modul de însămnnţare diferă de cel prezentat în capitolul
10. întindem p.p. în striuri paralele pe o jumătate de placă, până aproape de marginile plăcii
fără să/le atingem. Fără să sterilizăm ansa, atingem ultimile 3-4 striuri şi dispersăm p.p. în
alte striuri paralele, perpendiculare pe primele, pe jumătate din mediul.disponibil, până
aproape de marginile plăcii, fără să le atingem. Atingând din nou ultimele 3-4 striuri, dis
persăm p.p. în mod similar pe mediul încă neînsămânţat. Incubăm timp de 18-24 de ore la
35-37°C.
în ziua următoare examinăm plăcile însămânţate precedent în vederea selectării colonii
lor suspecte. Apoi, pornind de la tubul cu bulion selenit însămânţăm aşa cum am menţionat
mai sus o placă cu MacConkey ,şi o placă cu ADCL (sau XLD);.incubăm aceste plăci timp
de 18-24 de ore la 35-37°C. , ,
Pe mediul MacConkey coloniile lactozo-pozitive au dimensiuni de 1-3 mm, sunt roşii,
pot prezenta un halou opalescent, de regulă sunt de tip S dar pot fi şi de tip M. Coloniile lâc-
tozo-negative au dimensiuni de 1-2 mm, nu sunt colorate, sunt transparente, de regulă sunt i
de tip S. '• fain,: !j ■
Pe mediul ADCL majoritatea bacteriilorîactozo-pozitîve sunt inhibate; pot apărea tai/div
colonii de dimensiuni mai mici, roşii, de tip S. Coloniile iactozo-negative au dimensiuni de 1-
2 mm, nu sunt colorate, sunt seini transparente, de tip S; dacă produc H2S centrul coloniei
. -l
este de culoare neagră. .y* . .. ■■: ■ ">■ ' • ' ■
De regulă urmărim apariţia coloniilor Iactozo-negative, iar pentru etapele de identificare
vom repica (fără a atinge mediul de cultură) 3 colonii în cazul în care pacientul este cppil şi
Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Escherichia coli \(,3
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
9 • ÎN INFECŢIILE PRODUSE DE ESCHERICHIACOLI recolta şi lichid de vărsătură sau un anumit aliment incriminat. Materiile fecale se examinează
macroscopic şi se trimit către laborator aşa cum am menţionat în capitolul precedent. în con
tinuare vom discuta diagnosticul unei infecţii produsă de EHEC (ex. 0157.H7) dar, subliniem
'■ i ■■ .. it •! faptul că în practica medicală, pornind de la p.p. reprezentat de materiile fecale, putem izola
orice microorganism implicat etiologic în BDA, după caz; Materiile fecale pot avea aspect
: ;:-rn '.ij'liJ hemoragie iar la examinarea microscopică a p.p. putem observa prezenţa unor lambouri de
mucoasă epitelială. Transportul se va realiza aşa cum am menţionat în capitolul nr. 28.
După ce o serie de date sugerau asemănarea din punct de vedere molecular între speci
, 2. Examinarea microscopică â produsului patologic include realizarea preparatului nativ,
ile genurilor Escherichia şi Salmonella, cunoştinţele actuale pledează pentru o grupare a
între lamă şi lamelă; remarcăm prezenţa hematiilor şi leucocitelor PMN.
speciilor din genurile Escherichia şi Shigella. Cu toate acestea, Vom prezenta în continuare
separat diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganismele aparţinând 3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să
genurilor „clasice". Genul Escherichia cuprinde germeni comensali care se găsesc ubicvitar se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi capi
(în apă, pe sol, etcf iar la nivelul intestinului'uman au rol în sinteza unor vitamine'‘(sim tolul nr. 28). în vederea izolării EHEC, pe lângă mediile menţionate în capitolul precedent
bioză). Sunt bacili gram negativi'mobili sau imobili, aerobi facultativ ânaerobi, lâctbzo poizt- se recomandă utilizarea mediului MacConkey cu D-sorbitol, deoarece spre deosebire de
tivi. Specia tip este reprezentată de Escherichia coli. 4 , [ : ’ l : ; ; :: majoritatea tulpinilor de E. coli EHEC nu fermentează' sorbitolul (sau îl fermentează tardiv),
în acest sens, coloniile suspecte, repicate (fără a atinge mediul) în vederea identificării vor
Cu toate că majoritatea tulpinilor de E. coli sunt saprofite sau condiţionat patogene (fiind
fi necolorate, cu dimensiuni de 1-3 mhi; de regulă de tip S (coloniile sorbitol-pozitive vor
implicate în infecţii oportuniste cu localizări în afara tractului digestiv, spre ex. peritonite,
avea o culoare roz). '
colecistite, infecţii ale plăgilor, endomelrite, pneumonii etc) există şi anumite tulpini dotate
cu caractere patogenice particulare. Dintre aceste tipuri de E. coli (patotipuri) se disting trei 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
grupări mai importante: caractere:
• tipuri patogene implicate în boli diareice acute (BDA) • Caractere morfolinctoriale: Sunt bacili gram-negativi.
• E. coli enteroagregativ (EAggEC) implicat în apariţia unei BDA apoase, persisten • Caractere de cultură:
tă, cu mucus, în special la sugari • Produc colonii de tip S cu caracterele menţionate mai sus.
• jE, coli enterohemoragic (EHEC), spre exemplu serotipul 0157:H7, care elabore- • Caractere biochimice şi de mobilitate (pentru EHEC se vor examina la nivelul centrur,
/ ază două citotoxine şi este implicat în apariţia unei BDA apoasă, care poate deveni lui de referinţă, neceşitând măsuri suplimentare de siguranţă):
! severă şi se poate însoţi de o complicaţie gravă, sindromul hemolitic uremie • Fermentează glucoza (cu producere de gaz), sunt lactozo-pozitivi, nu fermentează
• E. coli enteroinvaziv (E1EC) care elaborează una sau mai multe enteroxine pro (sau. fermentează tardiv) sorbitolul, nu produc H2S
ducând un sindrom dizenteriform • Pot produce îndoi, sunt urează-pozitivi, mobili (dar există şi tulpini imobile) etc.
• E. coli enteropatogen (EPEC) care determină diaree la copilul mic, uneori de gra • Se pot folosi mediile multi-test convenţionale (TSI, MlU/MiLF) sau galeriile
vitate maximă (ex. diaree malignă la nou născut) multi-test API 10 S, API 20-E, API Rapid 20 E sau alte variante
• E. coli enterotoxigen (ETEC) cure elaborează două enterotoxine (termolabilă şi ter- • Alte teste ce pot fi studiate în scopul identificării germenilor:
mostabilă) şi produce un sindrom holeriform
• Testarea caracterelor antigenice: Ag somatice pot fi identificate prin reacţii de
• E. coli aderent difuz (DAEC) care produce diaree apoasă, persistentă, la copii în aglutinare sau latex aglutinare (se pot utiliza şi seruri monovalente anti 0157 şi
vârstă de 1-5 ani respectiv anti H7); toxinele pot fi identificate prin tehnici de tip ELISA, latex
• tipuri (grupuri) patogene implicate în infecţii ale tractului urinar (ITU) aglutinare, latex aglutinare pasivă inversată (VET-RPLA), sau prin seroneu-
• tipul patogen implicat în infecţia meningeală la nou născut. tralizarea efectului citotoxic pe celule Vero
Indiferent de localizarea infecţiei, diagnosticul de laborator microbiologic este bacterio ' • Testarea caracterelor de patogenitate: EHEC produce enterocolită hemoragică
logic, direct. j letală la purcel; se poate studia efectul citopatic pe celule Vero'
• Teste de biologie moleculară (PCR, detectarea genelor de patogenitate pornind de
Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu localizare digestivă la p.p. sau de la coloniile izolate pe MacConkey cu D-sorbitol).
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regu 5. Antibiograma este recomandată de regulă numai pentru supravegherea apariţiei fenome
lile cunoscute. Produsul patologic este reprezentat de obicei de scaunul diareic dar am putea nului de rezistenţă la antibiotice şi chimioterapice; se realizează prin metode difuzimetrice.
,164 Diagnosticul de laborator în microbiologie
Diagnosticul de laborator în infecfiile produse de Escherichia coli 165
UROCULTURA : (ţlln-
uretrale sau ale colului vezical, compresiune uretraiă în timpul sarcinii, corpi străini, calculi
Tractul urinar este în mod normal necontaminat, în schimb uretra distală poate prezenta urinari, cateterizare urinară etc), refluxul vezico-ureteral, alţi factori funcţionali.
o floră microbiană foarte variată, fiind contam inată cu.microorganisme provenind din,zona Microorganismele mai frecvent implicate în producerea unei infecţii a tractului urinar sunt în
genitală sau de la nivelul colonului. Dintre aceste microorganisme,putem, jzola,de, la nivelul ordine descrescătoare E. coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae,
uretrei distale stafilococi coagulnzo-negativi, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Proteus ' vulgaris,
difteromorfi, enterococi, streptococi, neis,serii saprofite, Mycoplasma spp^Ureplqsma spp. Citrobacter freundii, Citrobacter diversus, Enterococcus Jaecalis, stafilococii coagulază-nega-
sau Fusobacterium spp. La acelaşi nivel ai; pufea fi identificate şi tu|pini(.dţCcindida spp., tiyi. Adenovirusurile pot determina cistite hemoragice' la copii. Mai rar, în ordine descrescătoare
i-ll i - A o n o ! n o n iss a ra m nAtrsifriV/i îi n u A r /S K î,-1 Iri n iu p n - etiolbj|ia ITU poate fi reprezentată de Staphylococcus aureus, Acin’etobacter calcoaceticus',
streptococi (3-hemolitici din grupele A, B, C sau G, Morganella morgani, Provklencia rettgeri,
explică mdtivdî pentr P. stuartil, Serratia liquefaciens; Serratia marcettcens, Candida albicans, Salmonella spp.,
. [. ■ vt-iîlo.'-.i. i . ' i s u t - o .r;;iti> 15;.,, Corynebucterium urealyticum. Cu privire ia E. coli, cel mai frecvent microorganism implicat în
tativă.
.;i ITU, există anumite grupuri uropatogene, spre ex. O l, 02; 07 etc. în mod cert, există diferenţe
Cu toate ,că indiferent' de grija cu cţire vom ,recolta p.p.iţurinaj. acesta^a fi contaminat,
p'rin aprecierea.cantitativă ă.numărului,de,unităţi formatoare,de ,colpnii„ţn,urina'proaspijţ în ceea ce priveşte etiologia ITU. pe grupe de vârstă, în funcţie de sex sau ia pacienţii spitalizaţi
recoltată, „din mijlocul jetului",: pptenpăprecizăm dacăpacientLil.are.sau,nu infecţie urjnarăi în comparaţie cu pacienţii pentru care se solicită urocultura în ambulatoriu.
Mai multe studii.au,arătat,că aţunci când se, demppstrează prezenţa,a,105,bacterii/mj, aceas Recoltarea şi transportul produsului patologic
ta indică o infecţie a tractului urinar (ITU) în aproximativ 80% dintre cazuri întinrp ,ce,p
valoare de 104 bacterii/ml indică ITU în mai puţin de 30% dintre c a z i i t i . j : £ în ITU se pot recolta urină, sânge (ex. în pielonefrita acută) sau chiar şi LCR. în contin
uare vom discuta despre recoltarea şi transportul urinei,
Datorită acestor rezultate, în practica medicală se consideră că ne aflăm în situaţia unei
ITU atunci când numărul de bacterii/ml• urină /•este > 105/ml. •; ; în afară de recomandările generale menţionate anterior, trebuie să subliniem unele
».ll'», t-<•J■ • • •
aspecte-particulare ' H
Cu toate acestea, dorim să subliniem că interpretarea rezultatului ,nu trebuie realizată
mecanic şi decizia finală în ceea ce priveşte identificarea bacteriei, efectuarea testării sensi • în cazul în care nu se poate recolta prima urină de dimineaţă, trebuie aşteptat pentru
recoltare 3-4 ore după micţiune
bilităţii la antibiotice şi respectiv redăctdrea buletinului de analiză ar trebui să fie luată având
în vedere aspectul macroscopic 'al urinii (ex. purulent); rezultatul exameriului microscopic • Recoltarea se realizează după spălarea cu apă şi săpun a organelor genitale şi a peri-
al sedimentului urinar (ex. prfeenţa de‘PlvîNjimumăful de unităţi'forinâtbare de colonii/ml neului; există recomandări specifice pentru sexul feminin şi masculin şi respectiv pen
urină şi elemente clinice (ex. disurie. micţiuni mai frecvente, febră), cualte cuvinte Colabo tru copilul mic
rarea între clinică şi laborator este esenţială. Spre exemplu, în cazul unor elemente suges • Este preferabil ca recoltarea să aibă ioc într-un spaţiu corespunzător în apropiere.de
tive, chiar dacă numărul de bacterii este de 104/ml, putem lua decizia-să.repetăm urocultura, laborator, iar personalul medical trebuie să explice şi eventual să asiste recoltarea
iar izolarea aceleiaşi bacterii poate indica prezenţa ITU.,Pe.de altă parte, izolarea a.peste IO4 • Este contraindicată recoltarea urinei la domiciliu (pot exista erori de recoltare iar pre
unităţi formatoare/ml în cazul stafilococilor sau (evurilor .este luată în considerare, iar lungirea timpului de transport va conduce la multiplicarea bacteriilor, aşa cum am
prezenţa în urină a Listeria monocytogenes la femeile însărcinate sau prezenţa în urina a menţionat mai sus); după recoltare, în cazul în care urina nu este prelucrată imediat
Salmonella typhi sunt semnificative indiferent’<ie număr ui UFd/ml. , (sau în cel mult 30 de minute după recoltare), p.p. trebuie menţinut la temperatura
Pentru a sublinia încă!o dată importanţa etapei ;de recoltare şi transport â urinei..amintim fapj- frigiderului iar transportul trebuie realizat ia +4°C
tul că urina reprezintă un foarte'bun mediu de cultură penti;u majoritatea bacteriilor care pot con • De regulă se recoltează urina „din mijlocul jetului"; după spălarea organelor genitale şi a
tamina p.p., iar o probă de urină care are iniţial (în momentul recoltării) f O3 bacterii/ml, după 2 perineului, prin micţiune se elimină circă 100 ml urină (îndepărtând astfel o parte a ger
ore la temperatura camerei va conţine K)5 bacterii/ml. ' -..ru, . . i .• .••!:•[} 1 | menilor de Ia nivelul,uretrei distale) şi abia apoi se recoltează 20-50 ml (preferabil 50 ml)
Clasificarea ITU se poate, face după, mai multe criterii., ITU joase includ cistita;dar după urină în recipientul steril, după care micţiunea continuă
unui autori şi uretrita, prostatita şi epidjdiniita. ITU înalţe includ pielonefrita aquţă, necrpfea • Există şi alte tehnici de recoltare, neinvazive sau invazive (puncţie şi aspiraţie supra-
papilară (complicaţie a pielonefritei acute sau care poate apărea în absenţa infecţiei), abcesul pubianâ, cateterizare uretraiă, cu riscurile respective),
renal sau pielonefrita.cronică'ţdiîpă unii autori)'. Invazia tractului urinar poate avea Ioc pe cale
E xam inarea macroscopică şi microscopică a urinei
ascendentă, limfatică său heinatogenă.1 * 1' ‘ .
•. • , • i; ‘ ■•.i Cjî‘*■}..(^1{*t • Ţjtî ‘ /"
Există o serie de factori care favorizează apariţia 1ŢU, dintre care amintim: obstrucţiile Realizăm iniţial examenul macroscopic; p.p. poate fi tulbure, opalescent, poate prezenta un
care duc la stază urinară (adenom sau carciiiom de prostată, tumori.'de vecinătate,‘stricturi anumit miros etc. în vederea examenului microscopic al urinei omogenizăm urina prin „răs-
(
166 Diagnosticul de laborator în microbiologie Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Escherichia coli 167
turnare", de 2-3 ori. Punem o picătură de urină pe lamă, acoperim cu o lamelă şiexaminămcu • Izolarea a trei bacterii diferite, chiar şi în cazul în care concentraţiile pentru fiecare în
microscopul cu imersie (sau microscopul cu contrast de fază)., în:cazul în care identificăm parte depăşesc 10-Vml de urină, impune repetarea analizei; extrem de probabil este
prezenţa a cel puţin unei bacterii. pe fţecafe cârnp,,în fiecarp, dintre,5 ^âmpuri, succesive, putem vorba de o contaminare sau de un p.p. recoltat cu mai mult timp în urmă şi menţinut
cu o bună aproximaţie să, considerăm că aveni o bacteriurie.de, 10? bacterii/ml. Alternativ se ■la temperatura camerei şi nu la frigider
poateuţiliza preparatul'colorat.Gram.i Este, necesşrsăapreciem.concomitenţ,§i. prezenţa piuriei • Izolarea unei bacterii cu o concentraţie de !04/ml de urină conduce !a recomandarea
i
(peste 10 leucocjte/mtţi3' de prină^Â u fost .imaginate ,q serie de alte teste pentru aprecierea repetării analizei (există şi unele excepţii, în care rezultatul este considerat pozitiv,
pi^«uşi,',bt«te4un^L spre exetp^ju.ftMtul spre ex. pentru levuri în concentraţie de peste 104/ml de urină, stafiiococii coaguiazo-
razei leucocitarej teste,bioIuminiseenteptc' .Piuria,şi bacteriuria trebuie inţerpţetaţe'încontex negativi în concentraţie de peste 5 x l0 4/ml de urină etc)
tul clinic., i i ; . ■.. ,..\k u .şr. ;■v« :Ş> rrj+i: ni!; '0'i!ilornrr!..,ţ i , ■ i::ăt •. • Lipsa multiplicării bacteriene sau dezvoltarea de UFC în concentraţie de 103/ml de
;.,i Examenul sedimentului urinar .permite vizualizarea de celule epiteliale (malpighiene, urină reprezintă o urocuîtură negativă
vezicule, uretrale etc), celule sanguine (leucoeite, hematii),.cilindrii urinari (hialini, leucoci- • Dorim să subliniem din nou că rezultatul microbiologic trebuie să fie analizat în con
tari,;eritrocitari,'-.epi tel i aii,' granulaţi etc:), cristale urinare, levuriufeventuaLînrnuguriteVcu textul clinic şi corelat cu rezultatul microscopiei iar în cazul anumitor bacterii (ex.
blastoconidii),.Trichomonas•vaginalis etc; examenul sedimentului urinar este fqarte util şi Salmonella typhij rezultatul este pozitiv indiferent de concentraţia UFC/ml de urină.
trebuie realizat de fiecare dată., •i mmr, '• 'l ,:e în jisw » ' . >>•
în cazul unei uroculturi pozitive, bacteria izolată se identifică (pe baza caracterelor morfo-
Cultivarea urinei tinctoriale, de cultură, biochimice, alte caractere) şi se testează sensibilitatea la antibiotice şi
chimioţerapice, de regulă prin metoda difuzimetrică (vezi capitolul 14).
în mod obişnuit, .pentru cultivare putem utiliza 3-4 medii diferite,.Din motive:deEco
nomie am putea însămânţa o jumătate de piacă cu mediu MacConkey,(fără cristal violet),,o Există o serie de încercări pentru optimizarea diagnosticului ITU, inclusiv abordarea
jumătate de placă cu geloză-sânge şi câte un sector de placă cu mediu agar telurit şi respec unor tehnici miniaturizate. Dintre acestea vom aminti metoda imaginată în Institutul de boli
tiv agarcu eozină şi albastru de metilen (EMB) în cazul în care examenul ,microscopic al infecţioase „Matei Ba!ş“ (prof. Florin Cărunţii), metoda „Uriline“ etc. Spre exemplu ultima
urinei este pozitiv. Dacă examenul microscopic este negativ, însămânţăm doar o jumătate dintre metode utilizează o lamă de plastic acoperită pe ambele părţi cu mediu de cultură,
protejată într-un tub de plastic.
de placă Petri cu mediii MacConkey. ‘ ..
O variantă de însămânţam pentru mediile MacConkey şi geloză-sânge este utilizarea unei Principiu
anse calibrate d e : 1' ţii cu ajutorul, căreia prelevăm urină prin atingerea suprafeţei p.p, după Mediul CLED de pe prima parte a lamei (Cysteine - Lactose - Electrolyte Deficient agar)
omogenizare. însămânţăm iniţial un striu pe centrul jumătăţii‘de placă după care întindem are culoare verde şi permite numărarea coloniilor bacteriene (indirect a numărului de
p.p. în striuri paralele, perpendiculare pe primul striu. în final fără sterilizăm ansa întindem UFC/mi urină) şi identificarea prezumtivă. Concentraţia scăzută de electroliţi inhibă invazia
p.p în striuri paralele în unghi de. 45 faţă de striurile precedente: După o incubarc de 18-24 Proteus spp. Mediul MacConkey fură cristal violet de pe a doua parte a lamei are culoare
ore la 35-37°C,'înmulţind cu 1000 numărul de UFC dezvoltate, putem' aprecia care este roz; inhibă majoritatea bacteriilor gram pozitive.
numărul de bacterii/ml de urină. !•••
Tehnica de lucru
Frecvent este utilizată înşămânţarea urinei după diluare (ex. 1/100) cu ajutorai pipetei gra- (
date. însămânţăm de ex. pe o placă cu mediu MacConkey 0,1 ml de urină diluată 1/100, Deştirubăm capacul şi extragem iama iară să atingem, suprafaţa agarului. Imersăm lama în
incubăm în' condiţiile cunoscute şi după apariţia coloniilor calculăm numărul de bacterii/ml prin proba (je urină recoltată (dacă urina nu este suficientă cahţitativ, repartizăm p.p. pe cele 2 părţi
înmulţirea numărului de UFC x inversul diluţie x inversul volumului însămânţat. '1 j ale Jaijjgi cu ajutorai unei pipete Pasteur). îndepărtăm excesul de urină pe o hârtie de filtru
curatăl$rptmem la ioc în dispozitiv lama însămânţată. Injjubăni în poziţie dreaptă, timp de 18-
Interpretarea rezultatelor uţoculturii.cantitative .,.. 24 o rela 35-37°C. A doua zi citim rezultatele, comparând numărul de colonii apărute pe me
diul CLED cu modelul producătorului.
• Izolarea unei bacterii cu o concentraţie de peste lO-Vnil de^urină confirmă ITU la băr
bat sau la femeie (cu simptome caracteristice); în cazul că pacienta este asimtomaticâ, In terp retare
certificarea. ITU este dată de izolarea aceleaşi bacterii în a doua probă de urină,, ,f în cazul în care numărul de UFC/mi este mai mare de IO5 realizăm teste suplimentare
• Izolarea a două bacterii diferite,'fiecare cu o concentraţie de peste 105/tnl de1urină, pentru identificare şi respectiv antibiograma. Alte elemente privind interpretarea au fost
impune repetarea recoltării şi însămânţării; în cazul în care rezultatul este similar şi prezentate anterior.
pentru a doua probă de urină este posibilă ITU mixtă (îri caz1contrar este o foarte
Control de calitate
probabilă contaminare) • ! : -■
• Pregătim o suspensie baeteriană în soluţie salină fiziologică sterilă cu 105-I06 bacterii
pe mi din fiecare dintre tulpinile de referinţă
(
168 Diagnosticul de laborator în microbiologie
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
• Staphylococcus aureus ATCC 25923 » ÎN INFECŢIILE PRODUSE MICROORGANISME
• Escherichia coli ATCC 25922 DIN GENUL SH IGELLA
• Proteus mirabilis ATCC 12453 ...
o Inoculăm suspensiile astfel pregătite pe suprafaţa mediilor de cultură; ţJriline, iar după
18-24 ore incubare,citim şi interpretăm rezultatele ..., ,-a *
• Staphylococcus aureus: apar colonii, doar.pe mediul CLED.Fermenţarea;lactozei este
indicată de.prezenţa culorii ■galbene în jurul coloniilor dezvoltate. . .
• Escherichia coli: apar colonii galbene pe CLED şi colonii roz pe MacConkey. ■Genul Shigella ar trebui să facă parte conform studiilor de biologie moleculară dintr-un
• Proteus mirabilis: apar colonii translucide iar culoarea CLED este albastră; pe Mac gen care include şi Escherichia spp., genul Escherichict-Shigella. Actualmente este accep
tată tratarea separată a celor două genuri înrudite. Ffe bâza structurii antigenice au fost dife
Conkey apar colonii incolore. , . .. .
renţiate patru subgrupe (A-D) respectiv Shigella clysenteriae (13 setotipuri), S.'flexneri (6
... '[ ■. .■y' . -v i: *S* 1,. h ■i > :i ?tK'' .-H ' ' serotipuri care se pot subdiviza în sub-serotipuri), S. boydii (18 serotipuri) şi S. sorinei (1
serotip cu 2 faze sau variante, respectiv R şi S). ■ • .
, Genul Shigella include bacili gram negativi, imobili, cu dimensiuni de 0,5-0,8pm/2-3 pm,
nesporulaţi, necapsulaţi, aerobi facultativ anaerobi, glucozo pozitivi fără producere de gaz
oxidazo negativi, lactozo negativi. Subgrupele se pot diferenţia de ex. pe baza fermentării
manitei (subgrupui A este mani to negativ). Cresc pe medii simple şi produc colonii de tip S
în 24 de ore.
Microorganismele din genul Shigella sunt patogene prin multiplicare şi invazivitate. în
cazul serotipului 1 din subgrupui A (Sh. sluga) este implicată şi toxigeneza. Exotoxina shiga
afectează atât intestinul cât şi sistemul nervos central (putând; conduce, la apariţia unor
fenomene de meningism sau chiar pierderea stării de conştienţă, până la comă). Faţă de ani
*iS malele de experienţă are efect letal.
Infecţiile cu Shigella spp. sunt de regulă limitate la nivelul tractului intestinal. Dizenteria
poate apărea după ingestia a numai 10-100 de bacterii, care se localizează, se multiplică şi
invadează epiteliul intestinal (pot apărea abcese la nivelul peretelui intestinului gros, la
nivelul ileonului terminal, abcese care evoluează spre ulceraţie, necroză, hemoragie). După
o perioadă de incubaţie de circa 2-5 zile, în cazul unei dizenterii tipice apar brusc febră, dia
ree apoasă, dureri abdominale intense. Ulterior se elimină scaune foarte numeroase (20-
40/zi), nefecaloide, cu mucus, puroi şi sânge, însoţite de colici intestinale şi tenesme rectale.
Starea generală se înrăutăţeşte (mai grav în cazul unei infecţii produse de Sh. shiga). în lipsa
tratamentului corespunzător (în special în lipsa reechilibrării hidro-electrolitîce) evoluţia
poate fi fatală. în afară de dizenterie, Shigella spp. poate produce şi toxiinfecţii alimentare
de tip infecţios.
Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic (direct) şi trebuie făcut
de urgenţă datorită implicaţiilor posibile ale unei dizenterii.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând re
gulile cunoscute (vezi capitolul 6), în s'pecial recoltarea cât mai rapid după'debutufbolii şi
înainte de iniţierea antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat de m aterii fecale; dar
s-ar putea recolta, şi lichid de vărsătură. La începutul bolii este mai uşor să. izolăm bacteria
patogenă, deoarece iniţia! .se elimină circa 103- IO9 bacterii/gram de materii fecale. Din
punct de vedere macroscopic materiile fecale pot fi în cantitate mică, conţinând mucus,
puroi şi sânge (uneori sângele nu este vizibil macroscopic). Recomandăm recoltarea şi cui-
170 Diagnosticul de laboratoei ... microbiologie Diagnosticul de laborator în infecfiile produse de Shigella 171
tivarea în special a fragmentelor care conţin iiiucus, puroi şi sânge:. Transportul trebuie să din respectiva tulpină, pe care o menţinem-timp de 30-60 minute la o temperatură
fie realizat rapid,'-dar eăle'-'pttsferabilli•‘ftisamânjtti«ârla' patul bolnavului. iDacă această reco de 100°C şi ulterior repetăm reacţia de aglutinare
mandare nu poate fi urmată, recomandăm folosirea unui mediu de transport, mediul bacte • Testarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza în studii epidemiolo-
riostatic Cary-Biair. O altă variantă de recoltare posibilă (de ex. în cazuri atipice, sau.pentru gice sau în scop de cercetare, fiind rezervată laboratoarelor de referinţă; schemele de
controlul stării de „purtător") este reprezentată de utilizarea sondei Nelaton introdusă în lizotipie au fost utilizate în special pentru S.flexneri 2a şi S. sonnei
colonul sigmoid (10-12 cm la copil sau 1.5-20 cm la adult) aspirând p.p. cu ajutorul unei
* Alte caractere/teste utilizate în identificare ia nivelul centrelor de referinţă:
seringi. Materiile fecale se vor suspensiona în,soluţie cloruro-sodică sau în mediul Cary-
Blair. Există şi posibilitatea de a recolta p.p. prin rectosigmoidoscopie. • teste biochimice suplimentare (biotipie)
2. ExaminareaMicroscopică a produsului patologicincludeyrealizafea‘!unui preparat '■ ■ • bacteriocinotipie (ex. pentru S, sonnei)
pjrbaspftt' în,tre. l&rnSV*""iameia ‘.^’n u; fi^duH’''dm'_'âcesţ tip' cîe proidusiii' patologic, în • rezistotipie (tipare prin patern-ul rezistenţei Ia antibiotice), utilă în scop epidemio
cazul în care suspectăm o infecţie ca'SHigellajpp.). Preparatul se examinează'la|micro logie
scopul optic cu obiectivul 4Qx. Evidenţierea a numeroase PMN vine în sprijinul stabilirii ; ’ • testul Sereny (producerea cheratocoiijunctivitei la cobai); repicăm colonia suspec
mecanismului bolii diareice, iar un procent de peşţe 75'°/o PMN însoţit de prezenţă hematii tă pe gelozu înclinată iar.după 8 ore, introducem o ansă de cultură sub pleoapa ţinui
lor este sugestiv pentru dizenteria bacteriană. Anumiţi autori recomandă utilizarea imuho- cobai; după 12-24 ore în cazul unei reacţii pozitive apare congestie conjunctivaiă,
fluorescenţei directe; examenul este costisitor în special datorită1existenţei numeroaselor secreţie purulentă şi opacifiere a corneei cu accentuarea acestor fenomene şi evo
serotipuri. ; ' ” 1 luţie spre cheratoconjunctivită (testul poate fi pozitiv şi în cazul unor tulpini de
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa;fel încât să Escherichia coli) ' ■
se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifică (vezi şi capi f tehnici ale biologiei moleculare (stabilirea profilului plasmidic, ribotipia, sondele
tolele 9 şi 10). Se vor utiliza mediile de cultură recomandate, prezentate în capitolul 281 ADN etc).
Shigella se dezvoltă pe mediile slab şi moderat selective şi nu se multiplică pe mediile înalt 5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii ia antibiotice şi chimioterapice) se realizează
selective. în cazul apariţiei unor colonii lactozo negative, repicăm 3-5 colonii izolate pe prin metoda difuzimetrică standardizată, în special în scopul supravegherii apariţiei unor
mediile multitest (TS1, M ili' M1LF) sau procedăm conform protocolului d e’lucrii pentru tulpini rezistente la» medicamentele antimicrobiene dar şi pentru stabilirea tratamentului
galeriile tip API. 1 !" " ’ ’• 'A 'Ji' ’ antimicrobial! corespunzător.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere: ' .' ’
• Caractere morfotinetoriale: Sunt bacili gram-negativi cu cu dimensiuni de 0,5-0,8 pm/
2-3 pm;
• Caractere de cultură: . .... ,,
• produc colonii de tip S, lactozo negative, semitransparente, cu diametrul de 1-2 mm
pe MacConkey sau ADCL (S. sonnei poate produce colonii care devin roz deoa
rece poate fermenta tardiv, lactoza) şi roşii pe XLD
• Caractere biochimici şi de mobilitate: ■ 1 - a:
• se pot investiga analizând rezultatele obţinute pe mediile multitest sau pe galeriile
API; caracterele biochimice sunt utile şi în diferenţierea subgrupelor genului !
• microorganismele clin genul Shigella sunt,giucozo pozitive, fără producere de gaz,
lactozo negative, nu produc H2S, imobile, urează negative, indol negative- 7
• pot fi necesare, teste biochimice suplimentare .j
• Caractere anţigenice: • 7
• se utilizează seruri imune polivalente pentru subgrup sau seruri imune'specifice ide
tip, prin reacţii de aglutinare pe iarnă, conform unor scheme stabilite ■
• în cazul. în care o tulpină izolată are un comportament biochimic sugestiv'dar
reacţia de aglutinare este negativă, trebuie să realizăm o suspensie (destul de densă)
(
• scheme suplimentare pentru testarea, caracterelor antigenice (serotipie) tifoidă sau paratifoidă utilizăm spre ex. 6 serii de tuburi, cu Ag cunoscute şi inactivate, pen
• teste suplimentare biochimice (biotipie) '• » ' tru a evidenţia Ac anti-0 (TO - S. typhi, AO - S. paratyphi A, BO - S. paratyphi B), şi anti-,
H (d - S. typhi, a - S. paratyphi A, b - S. paratyphi B). După realizarea diluţiilor, incubâm
• teste privind sensibilitatea la bacteriofagi spe^jfici (lizotipie)!,m mjn,:.-.::. .: -
tuburile pentru Ac anti-0 timp de .18-20 ore la 52°C urmat de 10 minute la temperatura
• teste de biologie moleculară (determinarea piofilului plăsmidic, ribotipia, studiul, camerei, iar tuburile pentru Ac anti-H timp de 2 ore ta 52°C urmat de 10 minute la tempe
unor secvenţe specifice la nivel cromdzomial $tc),' "• Slt *■■II ratura camerei şi citim reacţia. Un titra de 1/250 în cazul Ac anti-0 şi respectiv 1/250O în
5. Antibiograma esie recomandaiă de regulă numai în cazul pacienţiior.cu Vârste extreme cazul Ac anti-H ar putea fi sugestiv. Creşterea de 4 ori a titlului la 2 determinări succesive
sau pentru supravegherea‘apariţiei fenomenului' de;’ refeistenţă la antibiotice şi'chimiote- (interval de 7-10 zile) poate confirma diagnosticul. La persoanele vaccinate recent diagnos
rapice; se realizează prin metode difuzimetrice. f ticul serologic nu poate fi utilizat (rezultatele nu sunt interpretabile) şi este strict necesară
Diagnosticul de laborator microbiologic în febrele enterale este bacteriologic şi/sau izolarea în culturi a S. typhi.
serologic. , , Atât în cazul bolnavilor, dar mai ales în cazul convalescenţilor şi purtătorilor a fost reco
Diagnosticul definitiv (cert) este reprezentat de izolarea şi identificarea & typhi în p.p; mandată reacţia de aglutinare în tuburi pentru identificarea prezenţei şi litrului Ac anti-Vi.
Se consideră că un titra > 1/40 poate fi considerat sugestiv.
Diagnosticul bacteriologic, direct respectă etapele cunoscute ale acestui tip d& 'diag
nostic, cu anumite particularităţii iMulte din aspecte au, lost prezentate anterior.
HEMOCULTURA
Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile'
cunoscute (vezi capitolul 6), în special recoltarea cât mai rapid după debutul bolii şi înainte Arborele circulator este în mod normal steril.
de iniţierea antibioterapiei. Produsul patologic este ."reprezentat în prima săptămână, de Bacteriemia/fungemia reprezintă prezenţa tranzitorie şi de regulă interm itentă a bac-
sânge, ulterior putem recolta materii fecale, urină, lichid biliar, măduvă hematogenă etc. teriilor/fungiior în torentul circulator. O bacteriemie/fungemie se poate însoţi de creşterea
Hemocultura va fi discutată în cele ce urmează. în cazul în care p.p. este reprezentat de temperaturii şi/sau frison precum şi de alte semne sau simptome. Dintre situaţiile care pot
materii fecale, respectăm ceea ce am prezentat mai sus, cu o serie de sublinieri: conduce ia apariţia unei bacteriemii putem aminti: o extracţie dentară, penajul mai energic
- Sunt în studiu metode de identificare a prezenţei S. typhi, direct,în p.p. (ex. materii al dinţilor folosind o periuţă neadecvată (prea dură) precum şi multe acte medicale sau
fecale) prin latexaglutinareşi PCR •••* .» , , - medico-chirurgicaie invazive realizate la diferite niveluri anatomice (cateterisme etc).
i Coloniile de S. typhi pot să nu prezinte centrul de culoare neagră pe ADCL sau XLD. Bacteriemia/fungemia însoţesc infecţiile generalizate cu bacterii/fungi. Există o mare
- S. typhi în general nu produce gaz din glucoza, iar ;H2S poate.fi produs în cantităţi mici varietate de microorganisme capabile să producă infecţii generalizate (bacterii aerobe şi
şi tardiv; nu foloseşte citralul ca unică sursă de carbon şi este ornitindecarboxilază negativă. anaerobe, fungi, virusuri, paraziţi). Trebuie însă menţionat că, destui de frecvent, o hemo-
cultură pozitivă nu indică de fapt agentul etiologic al infecţiei ci o contaminare survenită pe
- Pentru identificarea Ag O poate fi necesară o inapţivare prealabilă (termică, folosind o parcursul diagnosticului microbiologic. Dintre agenţii contaminanţi întâlniţi mai frecvent
substanţă acidă suu acetonă). Pentru identificarea Ag' H poate fi necesară inactivarea cu putem aminti: Staphylococcus epidermidis, S. hominix, Micrococcus luteus, Corynebac-
formaldehidă. Prezenţa Ag Vi poate crea probleme în ceea ce priveşte.jderitificarea Ag O. teriuin spp„ Brevihactenum epidermidis, Propionebacterium acnes, Acinetobacter calco-
- Deşi lizotipia este'o metodă laborioasă, de multe ori se dovedeşte superioară din punc aceticux, streptococii non-hemolitici etc. Este importantă utilizarea noţiunilor de microbi
tul de vedere al rezultatelor obţinute în comparaţie inclusiv cu metode ale biologiei mole ologic clinică care trebuie foarte bine cunoscute de către medicul microbiolog în colaborare
culare. ■,, ,! .. cu restul membrilor echipei complexe, pentru stabilirea în mod corespunzător a etioiogiei
- Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapie© este recomandată pentru fiecare infecţioase şi atitudinii de urmat.
tulpină de S. typhi izolată. , ' , , 7i" Având în vedere cele menţionate mai sus, dorim să subliniem şi alte două dintre aspec
Diagnosticul serologic _ : u : / tele importante de care trebuie să se ţină seama în realizarea unei hemoculturj:
Unii autori consideră că nici unul dintre testele utilizabile în diagnosticul'serologic nu ®momentul recoltării sângelui
este suficient de specific, sensibil şi rapid. Diagnosticul serologic se realizează respectând e volumul de sânge recoltat.
principiile generale ale acestui tip de diagnostic. Reacţia W idal a fost imaginată înfinalul Cu privire la primul aspect este de reţinut că întotdeauna se recomandă recoltarea a
secolului al IX-lea şi standardizată la mijlocul secolului XX. Serodiagnostieul /Widal, minim 2 probe de.sânge, însă cel mai frecvent sunt recoltate 3 probe de sânge, în momente
folosind culturi vii de S. typhi nu se mai practică astăzi,.Cea mai cunoscută metodă utili diferite, pe parcursul a 24 de ore. în anumite cazuri (de ex. în endocardita bacteriană sub-
zabilă actual este analiza serică cantitativă, realizată tot prin tehnica aglutinării în tuburi. acută), bacteriemia fiind continuă, sunt suficiente 2 hemoculturi/24 ore. Pe de altă parte, în
Utilizăm serii separate de tuburi, câte o serie pentru fiecare Ag cunoscut folosit, serul de cazul în care presupunem că agentul etiologic poate face parte din flora normală vom recolta
cercetat fiind diluat corespunzător protocolului de lucru. Atunci când presupunem o febră
(
■• asigurarea calităţii mediilor de cultură va include atât controlul sterilităţii fiecărui.lot cât şi
minim 3 probe pentru hemocultura. în cele ce urmează o să listăm câteva din exemplele controlul eficienţei acestora (prin inocularea mediilor cu tulpini de referinţă, de colecţie).
posibile, în ceea ce priveşte momentul recoltării sângelui şi numărul de hemoculturi reco Pentru recoltarea sângelui trebuie respectate condiţiile impuse recoltării oricărui tip de
mandate: I-, !• . X . i: i” / ■!. I p.p. Subliniem însă importanţa respectării cu stricteţe a regulilor de prelevare aseptică şi
• endocardită acută - recoltăm 3 hemoculturi din 3 sedii'diferite, pe patcursul a 1-2 ore; respectiv a recoltării sângelui înainte de administrarea oricărui tratament antimicrobian.
• endocardită subacută - recoltăm minim 2 hemoculturi din 2 sedii diferite (vezi şi mâi Oricât de urgent ar fi considerat că trebuie începută terapia se poate „temporiza" până se
realizează recoltarea sângelui pentru hemocultură, ceea ce în astfel de situaţii ar necesita un
sus) la un interval mai mare de. 15 minute; .
interval de timp de numai 10-15 minute.
• sepsis - recoltăm 3 hemoculturi din sedii .diferite, pe parcursul a 10 minute (ideăl ar fi,
Utilizarea sistemelor,cu vacuum este relativ recentă în ţara noastră; în SUA a fost utiliza
pentru toate cazurile menţionate,.,şâ recoltăm sângele cu circa 30.minute înainte,de,
„vârful febril”, acest moment ar coincide cu cea mai nune concentraţie, de. .microor- tă încă înainte de 1974. Este recomandat ca recoltarea să fie urmată de însămânţarea direct pe
ganisme în torentul circulator, dar este dificil de precizat); rnediulde cultură, „la patul bolnavului", spre exemplu într-un sistem închis de recoltarea şi
însămânţare aşa cum a fost realizat de Prof. Dr. Matei Balş. Altfel spus, recoltarea ar trebui
• febră de origine necunoscută - recoltăm 2-3 hemoculturi, din sedii diferite, la, un inter
să fie urmată imediat de însămânţate, fără a mai exista o etapă de transport. Dacă această
val de timp de 45-60 minute etc. '.ii' ■ i'jV- j. recomandare nu poate fi urinată am putea folosi un tub care conţine 1 ml dintr-o soluţie
în ceea ce priveşte al doilea aspect, având în vedere faptul că de regulă în cursul bac- 0,25-0,50% de polianetol sulfonat de sodiu în care realizăm recoltarea sângelui şi pe care îl
teriemiilor/fungemiilor numărul de unităţi formatoare'de colonii/ml de sânge este destul de transmitem imediat către laborator pentru însămânţarea pe medii de cultură.
redus, trebuie să recoltăm un volum de sânge adecvat (pentru fiecare hemocultură în parte).
Mediile de cultură stint medii lichide, îmbogăţite (ex. bulion infuzie de cord-creier pen
Astfel, vom recolta circa 20 ml de sânge în cazul adulţilor şi 1-5 ml de sânge în cazul nou-
tru aerobi şi respectiv bulion Columbia cu cisteină pentru anaerobi) condiţionate în flacoane
născuţilor, sugarilor şi copiilor mici (deoarece numărul de UFC/ml poate fi de circa.3,ori
corespunzătoare cantităţii de sânge pe care trebuie să o recoltăm. Pentru bacteriile cu multi
mai mare la aceste grupe de vârstă).
plicare lentă este recomandată utilizarea mediului bifazic (mediu solidificat în pantă, de ex.
Atunci1când este necesară realizarea unei hemoculturi (de fapt a unui ,:,:set“ de hemocul geloză-chocolat plus mediul lichid bulion tripticază din soia). în finalul prezentării vom dis
turi) este necesar să ne gândim şi lâ următoarele aspecte:' '! cuta şi despre sistemele automate pentru hemocultură.
®cel mai adesea hemoculturile trebuie realizate „în urgenţă"; în cazul în care recoltarea afiost realizată simultan în două flacoane pentru hemocultură,
• sângele, fiind un produs biologic în mod normai steril, vom izola cel mai adesea un unul va fi incubatîn aerobioză iar celălalt în anaerobioză. Pentru unele microorganisme (ex.
singur agent infecţios (dar existaşi posibilitatea Onor asocieri);’ Brucella spp.) este necesară incubarea în atmosferă de 5-10% CO 2. Temperatura de
• dintre agenţii etiologici cu semnificaţie clinică izolaţi mai frecvent prin hemocultură, incubare este cel mai frecvent 35-37°C.
în ordine descrescândă a frecvenţei putem aminti; Staphylococcus aureus, diferite Examinarea flacoanelor de hemocultură se realizează de 2 ori/zi în primele 3 zile, apoi
enterobacterii, Pseudomonas aeruginosa, streptococi hemolitici (inclusiv pneumo- zilnic pentru minim 7 zile (în anumite situaţii flacoanele pot fi incubate timp de mai multe
cocul), enterococi, Haemophilus influenzae (tip b), Neisseria meningitidis, germeni săptămâni). Examinarea o facem macroscopic urmărind o serie de aspecte care ar putea să
anaerobi (Bacteroides fragilis, Fusobacterium spp., Peptostreptococcus spp., Clostri semnifice dezvoltarea microbiană (tulburarea mediului mai mult sau mai puţin uniformă,
dium perfringenş etc), stafilococi coagulazo-negativi, Listeria monocytogenes, apariţia unei pelicule la suprafaţa mediului lichid, apariţia unui depozit pe stratul de hematii
Leptospira spp.. Brucella spp., Candida spp,, Cryptococcus neoformans, Histoplqsma( din zona declivă a flaconului, apariţia unor bule de gaz, apariţia unor colonii pe mediul solid
capsulation, Aspergillus spp. etc.; .j în cazul în care am utilizat mediul bifazic etc). Din punct de vedere microscopic, manipu
o există anumite particularităţi în ceea ce priveşte etiologia infecţiilor generalizate în, lând aseptic flacoanele de hemocultură putem realiza frotiuri pe care le colorăm Gram.
funcţie de vârsta pacienţilor, poarta de intrare posibilă, focarul infecţios principal, în cazul apariţiei unor modificări precum cele descrise mai sus dar şi atunci când aces
starea din punctul de vedere ăl apărării (specifice şl ..nespecifice) a gazdei respective tea nu apar („treceri oarbe") vom realiza subcultivări pe medii de cultură solide (de ex.
etc.; • | geloză chocolat)-. -Prin utilizarea mediului bifazic subcultivarea se realizează uşor şi fără
» în sânge există o serie de factori antimicrobieni a căror acţiune trebuie pe cât posibil riscul contaminării, prin simpla înclinarea a flaconului şi „scăldarea" pantei cu mediul de
diminuată (aceasta se realizează pe de o parte prin diluarea 1/10 a sângelui Cultivat în cultură solid).
raport cu volumul mediului de cultură dar există şi o serie de substanţe chimice care După obţinerea culturii pure trecem la identificarea agentului etiologic şi stabilirea sensi
pot fi utilizate în acelaşi scop, spre ex. polianetol sulfonatul de sodiu are atât efect anti bilităţii la antibiotice şi chimioterapice a acestuia. în vederea testării sensibilităţii la antibiotice
coagulant cât şi de neutralizare a unor factori antimicrobieni); /' putem utiliza ca inocul bulionul de hemocultură, dar rezultatele obţinute vor fi confirmate prin
• mediile de cultură şi, condiţiile de incubare trebuie ales în aşa fel încât să permită dez- antibiograma difuzimetrică standardizată pornind de la coloniile izolate (cultura pură).
- voltarea agenţilor etiologici probabili;
i
178 Diagnosticul de laborator în microbiologie
9 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
în momentul de faţă există numeroase sisteme autom ate utilizate pentru hemocultură
(BacT/Alert, Isolator, BACŢEC, Septi-Chek, Vital etc).
3 A * ÎN INFECŢIILE PRODUSE MICROORGANISME
DIN GENUL KLEBSIELLA
Spre exemplu, sistemul BaeT/Alert reprezintă un instrument automat pentru detectarea
multiplicării microbiene, capabil să incubeze, să agite şi şă monitorizeze continuu (pe bază,dp
reflectometrie) aerob ,ţi anaerob prelevate de la pacienţi suspecţi de bacteriemie/fungemie.
Instrumentul prezintă: ■ ;;K. "y l' "
- un modul de control care include un ebrari ce permite operatorului să intervină (prin atin ' Microorganismele din genul Klebsiella sunt enterobacterii imobile, nesporulate, caracte
gerea cu degetul) în alegerea opţiunilor de încărcare şi descărcare a flacoanelor introduse, rizate prinţr-o intensă activitate metabolică asupra hidraţilor de carbon pe care îi hidrolizea-
- un modul de incubare ce poate prelucra 120 până la 240 flacoane însămânţate, ză cu producere de acizi şi uneori de gaz. Glucoza este degradată cu producere de gaz. Există
mai multe specii de exemplu Klebsiella pneumoniae, K. ozaenae, K. rhinoscleromatis şi K.
- posibilitatea realizării autovnate a controlului de calitate al „celulelpr în.care sunt
introduse flacoanele (nefiiiîd necesară intervenţia operatorului). . . , .. . . . . . , oxytoca. Klebsiella pneumoniae este, specia principală a genului şi include bacili gram nega
tivi, capsulaţi (capsula poate avea dimensiuni de 2-3 ori mai mari decât diametrul bacteriei),
Intervalul optim de funcţionare al instrumentului este jjiţuat între +5° şi 45°Q. Flacoanele
Considerat iniţial ea agent etiologic al pneumoniilor, s-a dovedit că numai 1-3 % din
introduse în instrument sunt recunoscute de acesta cu ajutorul unui. cititor de cod de bare
(codul .se află. pe partea laterală a flaconului). Flacoanele şi instrumentul sgnt produse în pneumonii (grave, necrotice şi hemoragice, în special la pacienţi cu un sistem de apărare
deficitar) sunt produse de Klebsiella pneumoniae. Microorganismul, condiţionat patogen»
conformitate cu standardele internaţionale de calitate în vigoare (ISO 9001, FDA şi Quality
poate fi implicat într-o mare varietate de boli precum toxiinfecţii alimentare de tip infecţios,
System Regulations). Flacoanele de cultură conţin mediu de cultură lichid (bulion}, care per
infecţii a!e tractului respirator superior, infecţii urinare etc. Din ce în ce mai frecvent
mit multiplicarea majorităţii speciilor bacteriene precum şi a furişilor, Fiecare flacon conţine
Klebsiella pneumoniae este izolată în infecţii nosocomiale (de spital), vezi şi capitolul 23.
un senzor LES (senzor emulsie lichidă), ce detectează producerea de CO 2, ea indicatoi al
multiplicării microbiene. ' Cu toate că nu este cea mai reprezentativă entitate clinică, vom discuta în continuare
diagnosticul pneumoniei produse de Klebsiella pneumoniae. Diagnosticul complet include
Există mai multe tipuri ,de flacoane, pentru incubare în aerobioză, anaerobioză, pentru
elemente clinice, panicii nice şi de laborator; diagnosticul bacteriologic fiind util în stabilirea
adulţi sau copii, pentru pacienţi la care nu s-au administrat medicamente andmicrobiene
etiologiei şi tratamentului antibiotic corespunzător.
anterior recoltării (varianta strict recomandată) sau chiar şt pentru pacienţi aflaţi sub trata
ment antibiotic. , Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic, direct, incluzând urmă
toarele etape.
Citirea se efectuează automat la fiecare .10 minute, rezultând o medie de 144 citiri/zi, prin
reflectometrie cu alîşaj pe monitor, semnal luminos sau sonor. în cazul unui rezultat pozitiv, 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie
flaconul respectiv este analizat prin metode ale microbiologici clasice sau moderne în vederea de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientul să fi primit antibiotice, cât
identificării speciei microbiene şi stabilirii sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice. mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de
asepsie şi antisepsie etc). în infecţiile produse de Klebsiella pneumoniae se pot recolta
Interpretarea rezultatelor hemoculturii
materii fecale, urină, sânge, puroi etc. în continuare vom discuta cazul în care p.p. este re
Având în vedere pe de o parte posibilitatea contaminării unei hemoculturi, iar pe de alta prezentat de spută (vezi şi capitolul 6). Din punct de vedere macroscopic, sputa poate avea
parte creşterea incidenţei hemoculturilor pozitive cu semnificaţie clinică,în care sunţ impli un aspect mucoid, de culoare roşu închis, „în jeleu de coacăze11.
cate microorganisme condiţionat patogene care fac parte din flora microbiană normala,
rezultatele trebuie interpretate cu responsabilitate şi în echipă. 2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două
frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu
Există argumente bacteriologice (de ex. izolarea aceluiaşi microorganism din mai multe albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic
flacoane de hemocultură) şi clinice care permit medicilor infecţipnişti în colaborare cu cu imersie şi se notează prezenţa celulelor de la nivel alveolar (ex. macrofage alveolare),
medicii microbiologi să stabilească etiologiţţ microbiană (uneori polimicrobiană) |i unei, prezenţa celulelor inflam atorii (ex. leucocite) şi prezenţa bacililor gram negativi, de
infecţii generalizate. ,. .* , • . . . . ' 4, , . j dimensiuni relativ mari, încapsulaţi (înconjuraţi de o capsulă voluminoasă). Examinarea
Fiind vorba de infecţii cu pronostic adesea rezervat, laboratorul are datoria să comunicş microscopică trebuie să demonstreze calitatea produsului patologic şi să realizeze o iden
rezultatele pe măsură ce acestea sunt obţinute (de ex. aspectul microscopic pe frotiul colorat tificare prezumtivă a microorganismului implicat (vezi şi capitolul 52). în coloraţia cu albas
Gram după tulburarea bulionului de cultura,, aspecte, microscopice,şi culturale observaţe tru de metilen, capsula apare ca un halou în jurul klebsielelor. Utilizând anticorpi anti-eapsu-
după dezvoltarea ijnor colonii, rezultatele antibiogramei nestandardizate etc, sau-faptul că lari, se poate realiza o identificare rapidă inclusiv direct, pe produsul patologic, prin reacţia
după o săptămână de observaţie nu.se poate evidenţia multiplicarea microbiană) pentru,ca de um flare a capsulei (vezi capitolul 12, punctul 12. 14).
să poată fi luate cele mai adecvate măsuri, în favoarea vindecării pacientului respectiv.
1 80
( \
Diagnosticul de laborator în microbiologie
3. Cultivarea pe medii de cultură a' produsului patologic seîreălizează îniaşa fel încât să se
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi capitolele ’ @ ÎN INFECŢIILE PRODUSE MICROORGANISME
9 şi 10). Klebsiella pneumoniae se poate dezvolta pe medii de cultură obişnuite în 18-24 ore, DIN GENUL PRO TEUS
la 35-37C. Se preferă utilizarea unor medii'de cultură slab selective (ex. MacConkey).
Klebsiella pneumoniae nu se dezvoltă pe medii înalt selective şi este parţial inhibată pe cele
moderat selective. Pe mediile solide Klebsiella pneumoniae formează colonii lactozo poziti
ve, mari, de tip M bombate, cremoase, în „picătură de miere", care dau aspectul de „curgere"
pe suprafaţa mediului de cultură, cu tendinţă de confluare. Se poate,realiza,şi inocularea la
animale de laborator sensibile (şoarecele alb); vezi îşi c a p i t o l u l . i l . , ..'Mni-' f.-ţ /■ -m Genul Proteus este format din germeni pleomorfi (de unde şi numele genului), foarte
4. Identificarea microorganismului-implicat patogenic se va;realiza pe‘baza mai-multor mobili, gram negativi, aerobi facultativ anaerobi, care nu fermentează lactoza, produc ure
ază, produc fenil-alanin-dezaminază, sunt. nesporulaţi, necapsulaţi. Există 2 specii princi
caractere: -■ " '
pale, Proteus mirabilis. şi Proteus vulgaris.
• Caractere morfotirictoriale: Sunt bacili' grăm-iiegatiVi, 'cu dimensiuni ’mări/*lcapsuldţi,
capsula fiind voluminoasă, dispuşi în lanţuri scurte, perechi 's‘au izolaţi. în mediul de De regulă microorganismele din genul Proteus sunt implicate patogenic în afecţiuni ce
cultură pot pierde capsula. v'- .>¥\y: ■ tnrJ-. ' apar în afara tractului digestiv (fac parte din flora microbiană intestinală). Există totuşi şi
toxiinfecţii alimentare de tip infecţios cu Proteus spp. în mod frecvent se discută despre
• Caractere de Cultură: Produc colonii lactozo pozitive, de tip:M, mari (2-3 mrii la;24 de
infecţiile tractului urinar (ITU), dar sunt posibile şi alte infecţii (tegumentare, genitale, cu
ore, peste 4 nun la 48 ore), bo mbate, vâscoase, cremoase, în „picătură de miere", care daţi
alte localizări în cursul unei bacteriemii la pacienţi cu status imun deficitar săli în spital/
aspectul de „curgere" pe suprafaţa mediului debultură, cu tendinţă la confinatei 1*\ '
infecţii nosocomiale). Vom discuta în continuare diagnosticul de laborator ai ITU.
• Caractere biochimice: ■/ ' (. (( ''„ a'
Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic, direct, incluzând urmă
• Klebsiella este un microorganism lactozo pozitiv, ceea ce se poate evidenţia încă toarele etape.
din etapa de izolare pe mediul MacConkey, ,
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie
• Alte caractere biochimice şi de mobilitate se, studiază după repicarea unor colorai, pe de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât
medii multi test (TSI, MIU), pe mediul Simmons sau în sisteme multi test comerciale mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de
de tip API. asepsie şi antisepsie etc). în infecţiile produse de Proteus spp. se pot recolta urină, puroi,
/ •Klebsiella pneumoniae'este glucozo pozitivă (cu producere de gaz), lactozo pozi- diferite exsudate purulente, materii fecale, lichid de vărsătură, alimente, sânge etc, în con
’ tivă, nu produce H2S, imobilă, urează pozitivă, indql negativă, care se dezvoltă tinuare vom discuta cazul în care p.p. este reprezentat de urină (vezi şi capitolul 29). Din
folosind cifratul ca unică sursă de carbon. punct de vedere macroscopic, urina ar putea fi tulbure, purulentă. Transportul urinei trebuie
• Produce acetoină, caracter evidenţiat prin reacţia Voges-Proşkauer. realizat rapid, în maxim 30 minute, iar dacă această recomandare nu poate fi îndeplinită, p.p.
• Caractere antigenice: trebuie transportat „la rece" (+ 4°C),
• Se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de Kleb 2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea unui preparat
siella, prin tehnici de aglutinare, coaglutinare sau latex aglutinare. Există peste.80 proaspăt între lamă şi lamelă, din sedimentul rezultat după centrifugarea urinei. Examenul
de tipuri de antigen K ia Klebsiella pneumoniae. -Aceste.reacţii, se pot practica în microscopic al urinei este foarte important pentru că este uşor de realizat, este ieftin şi per
laboratoare de referinţă, , ,.j, , . f rur / ' ' mite observarea unor elemente care orientează diagnosticul. Examinarea microscopică a
urinei ar putea conduce la economii importante (de timp, reactivi şi materiale, medii de cul
• Caractere de patogenitate: Se poate utiliza inocularea la şoarecele-alb (vezi capitolul 11).
tură); vezi şi capitolul 29. Proteus spp. prezintă un mare număr de cili peritrichi care con
• Alte caractere/teste utilizate în identificare Care se' pot utiliza (în centre de referinţă): feră mobilitatea caracteristică (există şi tulpini aciliate). Se poate realiza şi un frotiu colorat
• Testarea sensibilităţii la bac’teriofagf (unele dintre scheme au'fost stabilifeîn! Insti Gram din urina omogenizată. Germenii au un accentuat polimorfism pe frotiu putându-se
tutul Cantacuzino) .........' V. ‘ ' v’ ’ ' observa bacili,. cocobacili, forme filamentoase de până la 30 pm, Sunt necapsulaţi şi ne
• Gruparea în funcţie de rezistenţa la antibiotice şi chimioterapjce , \ sporulaţi. Prezenţa a cel puţin 1 leucocit/câmp microscopic la examinarea cu obiectivul de
• Caractere testate prin metode ale biologiei moleculare,(stabilirea spectntlui iplaşr imersie sugerează piuria, care într-un context clinic sugestiv ajută la definirea ITU. în cazul
midie cu identificarea plaşmidelor,implicate în virulenţă eţc),\, în caredin urina omogenizată prelevăm cu ansa calibrată de 0,01 ml urină iar în frotiul rezul
tat identificăm cel puţin 1-2 bacterii/cânip (în microscopia optică cu imersie) acest rezultat
5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii ia antibiotice şi chimîoterapice în vederea sta
sugerează prezenţa a IO5 bacterii (unităţi formatoare de colonii)/ml şi respectiv, infecţia trac
bilirii tratamentului) este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode difuzitnetriee.
tului urinar.
Determinarea CMI şi CMB poate fi necesară (vezi capitolul 14).
I
182 Diagnosticul de laborator în microbiologie Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Proteus \33
B o m ’Q s j y :3 a m r m m m .
3. Cultlvarea?^ n i^ jŞ 4 e î5 iil^ ^ 9 'P t^ ffs.u liii patblpgicftrebuierealizată;în aşa fel încât • Proteus sppr produce Fenil-aianin-dezaminază.
să se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cidţură pură,-care şe(.va, identifica (vezi şi • Proteus mirabilis este indol negativ şi ornitin decarboxilază pozitiv în timp ce
capitolele 9 şi 10). Cresc pe medii simgle inciâMv pe’îrt^dll pjrfonate libhide cu degajarea Proteus vulgaris este indol pozitiv şi ornitin decarboxilază negativ.’
unui miros caracteristic de putrefacţie. Suportă mari variaţii de temperatură şi de pH. Este
* Caractere antigenicc:
necesară realizarea uroculturii cantitative şi demonstrarea prezenţei a peste 105 bacterii/ml
de urină. Pe mediile simple uzuale, pe agar-sânge, pe AABTL etc.’nu se pot obţine colonii • Se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi (anti-0 şi anti-H) pentru identificarea
izolate, fiind cunoscut fenomenul de invazie (vezi şi capitolul 11). Acest aspect sugerează tulpinilor de Proteus, prin tehnici de aglutinare (ia nivelul laboratoarelor de refe
prezenţă Pmteys-bppjîn produsultpatftlogia'v',FenomenuPlipoateifi. inhibat dacă^Se realizează rinţă).
însămânţarea p.p.'ipe mediiJiselectivovdifefdnţiale fexiiMaciConkey sau;A',DCt;)i;şPe aceste • Alte caractere/teste utiljzaţe în identificare (jn centre de referinţă);......
mediii/îrafeMs'A'p/jdpfbduce^colonii lactozo negative, da-tipSttvibmintilr. lui;,), nubocf Avi, 1., ,» Testarea .sensibilităţii.la bacteriofagi , ...
4. Identificarea microorganismului implicat patogenii?'Se’.vă bSâliia pe baia mâi multor • Gruparea în funcţie d e‘rezistenţa la antibioticeşi chimioterapice. . :
caractere- -n oicjifo'!.', ui'., juciim-n.ua ■wjţi'rj'i lur-'i^ -nil» ck»i -itru—< < ;>,j
5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea sta
’■ ' • 'Caractere inoffdtinctqriâie': Sunt bâcili ‘Iram -'n^⪠vi/cu ’un’ ăccentââţ'ppiimodtsm bilirii tratamentului) este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice.
(bacili, cocobacili, ibnne filâmentoâse de până lâ 3(1 ptnj, necapsuiâţt şV'tiesponilâţi.; Determinarea CMI ’şi CMB poate fi necesară (vezi capitolul 14).
• ,i,«ij:oanmai!} r.itwlni u oi>ih.,-.oV; u,u< ,'.UIu iimnij tfl'flioj.it.alttjoM.'it
vl.ţ ;• Caracter? deţ^ulfui-ă:, , , , ' t p a , ; i ' .ir .m :.... ivn, vîlr
• Fenomenul de,invazisj;,repiezintă-<un; caracter,,de. identificare, preliminară pentru
Proteuş spp., o bactprie, .foarte mobţl|ţjf|acă .însămânţăm ,o, tulpină .care.apţiţţine
acestui gen la periferia unei plăci Petri cu mediu simplu (agarizat 2%), de la jocul
însământării cultura se „dezvoltă în valuri concentrice" (se întinde in aproape în
:..n- •- i>.i ,. . „«•»?•, -„i '1,- Ci q «• - i.'t,' -.r; Itiiv;..?. iwr. iy.r, ■Oi'.fC./ 5
; , aproaţje). pe toata suprafaţa mediului , j;. . j __ j ... ...^ ■ . (
• Pe anumite; medii, selective^ invazia este inhjbată şi şe poţ obţine coloşii izolate
i (adăugăm la piediul.de cultură acizi sau. săruri, bili.aşe,ţjosulfat de sodiu etc); aces
te colonii sunt lactozo negative.şi,de tip S ,.,; ■'••up
• Fenomenul „liniei de: demarcaţie", reprezintă un caracter util în studii, epidemio
logies* în cazul înicare tulpinile- implicate aparţin genului Proteus; dacă pe o placă
cu mediu solidtoultivăm 2 tulpini diferitei în 2 puncte opuse, tulpinile *se vor.dez
volta invadând până la un punct în apropierea liiiiei de întâlnire,iunde se Va crek b
„linte de demarcaţie" între cele.2 tulpini (distanţă deil -2 milimetri);,dacă tulpinile
nu sunt diferite.v»-avea loc „creşterea în valuri" fără;„demarcaţie",cu, dezvoltarea
unei „pânze de cultură" continuen:-,'-!;,; • . ; * < ; r ’jiţţ.xy,.»»:»».
Fenomenul de „căţărare", reprezintă o variantă-de'izolare' în-bultură-pură-a udei
'tulpini de Proteus: cultivarea unui produs' pafologiC'în lichidtilVde COndens-al uritii
tub cu geloză înclinată incubat în poziţie verticală va' cohduce'ţîn-cazul'în ’care în
1 ‘jj; p. e'xistă o:tulpină de >PtbiHus,'ipp.) la'dbţirief^âîn^.& re-a'uneî'cdri^H ^ur^dd
Proteus, c'âre'se dezvoltă Y.îri' valuri suprapuse" până Iâ'partea superioară ărne-
diului de cultură’’" '• ,?t «" ;,i îo-.ioy .iiiniicf. u ^ t i v i o
■; ... ■: -I .(•■ ii.', r! . . ■ ; I îi.- !J
« Caractere biochimice: .,
•:r . m. .1 vi;-.' -jf,■
,, • Proteps,spp.. include,nvicrporganjşiiie.Iacţpzp.negaţjyi,, -ji.uvi «nrfi «iu ' j ■}ni
* Alte caractere1biochihiice şi de mobilitate-se studiază;după repicarea ■unoneolopii pe
medii multi- test-(TSI, MIU),- pe,-mediul Simmorts sau în-Sisteme multi testicomerciale;-
Proteus spp. este glucozo pozitiv (uneori cu producere de gaz), lactozo negativ; produce
H2S, mobil, urează pozitiv, se poate dezvolta folosind titratul ca unică sursă de carbon.
ţ
f
,;■
34 Diagnosticul de laborator în infecfiile produse de Yersinia 185
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
4 • ÎN INFECŢIILE PRODUSE IVIICROORGANISIVIE
DIN GENUL YERSIN IA
de îmbogăţire, de ex. inocularea p.p. în tampon fosfat salin cu incubare la 4°C timp de 1-3
săptămâni urmată de treceri pe mediile menţionate mai sus. Coloniile suspecte se repică pe
mediile multitest clasice sau pe galerii API.
4. Identificarea se va realiza pe baza mai multor caractere:
« Caractere morfolinctoriale: Sunt cocobacili sau bacili gram-negativi cu dimensiuni de
0,5-3 j.tm/1-2 pm, posibil pleomorfi
• Caractere de cultură: ţ.
• Produc colonii de tip S, de 1-1,5 mm (2-3 mm după 48 ore)
Genul Yersinia include 1.1 specii dintre care Yersinia peştii (cauza ciumei), Y pseudo-
{ ...... • Pe mediul CIN coloniile sunt semitransparente, cu margini clare şi centrul roşu
tuberculosis şi Y. enterocolitica produc infecţii umane. Sunt enterobacterii de dimensiuni
mici, cu aspect de bacili sau cocobacili gram negativii care prezintă coloraţie bipolară. în Caractere biochimice şi de mobilitate:
produsul patologic prezintă un pleomorfism accentuat. Nu formează spori, pot prezenta struc «i • • se pot investiga folosind mediile multi-test clasice sau galeriile API ,
turi de tip capsular. Sunt aerobi facultativ anaerobi,,catalazo-pozitivi, oxidazţb-negativi. Cresc • fermentează glucoza fără producere de gaz, nu fermentează iactoza, nu produc H2S
pe medii simple şi produc colonii de tip S în 24-48 de ore; ultimele 2 specii sunt mobile la
■• sunt imobile la 37°C şi mobile la 22°C, riu produc indol, produc urează
22-30°C.
• Caractere antigenice:
în continuare vom discuta despre yersiniozele cu poartă de intrare digestivă, care pot avea
drept agenţi etiologici V enterocolitica sau Y. pseudotuberculosis. Y. enterocolitica repre • se utilizează, seruri specifice mli-Yersinia, prin reacţii de aglutinare pe lamă
zintă o cauză destul de frecventă a BDA, cel puţin din datele prezentate în literatura de spe • Testarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza în studii epidemiologice
cialitate internaţională. Poate determina infecţii cu caracter invaziv localizate pe ileonul ter sau în scop de cercetare, fiind rezervată laboratoarelor de referinţă
minal, cu „prinderea" ganglionilor mezenterici şi apariţia unor dureri în fosa iliacă dreaptă • Alte caractere/teste utilizate în identificareîa nivelul centrelor de referinţă:
ceea ce .poate conduce ia punerea eronată a diagnosticului de apendicită acută, mai ales la ® teste biochimice suplimentare
copii. în (cazul adulţilor s-a dovedit implicarea Y. enterocolitica în declanşarea unor artrite reac
• reacţii de aglutinare cu alte seruri imune, pentru tipuri mai puţin frecvent întâlnite
tive sau a eriternului nodos cu dificultăţi în ceea ce priveşte diagnosticul diferenţial. La pacienţii
cu variate grade de imunodepresie boala enterică poate fi urmată de manifestări extra-intesti- • bacteriocinotipiu
nale, uneori în cadrul unei infecţii generalizate. Bolile produse de Y. pseudotuberculosis au o • tehnici ale biologiei moleculare (digestia endoiutcieazică a ADN-ului cromozomi-
incidenţă mai redusă; pot apărea enterite subacute, adenopatie mezenterică etc. al, electroforeza în câmp pulsatil, ribotipia, PCR etc).
Diagnosticul de laborator în yersiniozele cu poartă de intrare digestivă este bacte 5. Este recomandată realizarea antibiogramei (verificarea sensibilităţii Ia antibiotice şi
riologic, direct. în cazul m anifestărilor extra-intestinale poate fi util diagnosticul sero chimioterapice), prin metoda difuzimetrică standardizată. Se pot utiliza şi sisteme automate, de
logic. exemplu trusa automată ATB G -5, cu citire şi interpretare după 18-24 ore de incubare (21
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând reg antibiotice), pentru bacili Gram negativi.
ulile cunoscute (vezi capitolul 6), în special recoltarea cfit mai rapid după debutul bolii şi
Diagnosticul serologic
înainte de iniţierea antibioterapiei. Produsul patologic poate fi reprezentat de m aterii fecale,
ganglioni recoltaţi intraoperator, sânge etc. în continuare vom discuta diagnosticul unjbi Diagnosticul serologic este util în determinarea etiologiei artritelor reactive, eritemului
BDA. Se poate folosi mediul de transport Cary-Blair. .j nodos sau în cazul altor manifestări extra-intestinale. Anticorpii apar la circa 4-7 zile de la
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea unui preparat debutul bolii, ating valoarea maximă după circa 14 zile şi persistă câteva luni. Se pot.prac
proaspăt între lamă şi lamelă (nu se efectuează frotiuri din materiile fecale). Preparatuljse tica diferite,tehnici, de ex, reacţia de aglutinare în tuburi. Se consideră că valoarea litrului
examinează la microscopul optic cu obiectivul 40x. Vom evidenţia prezenţa celulelor semnificativ este ;> 1/160. Este recomandată testarea serurilor pereche, în dinamică. ....
inflamatorii. / Trebuie să fie luată în considerare posibilitatea apariţia unor reacţii încrucişate, datorită
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să existenţei unor antigene asemănătoare la microorganisme din genurile Brucella sau
se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi capi Salmonella. .•
tolele 9 şi 10). în vederea izolării Y. pseudotuberculosis sau Y. enterocolitica se pot utiliza
diferite medii selective clasice (MacConkey, ADCL) sau mediul CIN (cefsulodină, irgasari,
novobiocină), eventual cu incubare la temperatura camerei (20-30°C). Există diferite metode
35 Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Pseudomonas 18 7
f d ia g n o s t ic u l de l a b o r a t o r
L
( (
190 Diagnosticul de laboruior în microbioiogie
D IA G N O S T IC U L D E L A B O R A T O R
i Bi f i i i A flO & iU ;ICi J U 2 ţ f 3 0 i t r M U U
ÎN IN F E C Ţ IIL E P R O D U S E M IC R O O R G A N IS M E
Luând în:considerare situaţi? în care se ridică;suspiciunea unei; infecţii; cu V. choierae. se
recomandăînsămânţarea p.p., direct sau după transportul îri mediui Gary Blair, în apă pep- D IN G E N U L HAEM OPHILUS
tonată alcalină (APA). După incubare pentru o durată de 6-8 ore Ia 35-37°C, facem trecerea
pe mediul selectiv (TCBS şi/sau BSA) luând 2 anse de Ia suprafaţa APA (în acest interval,
la suprafaţa APA poate să apară un „văl“, respectiv cultura de vibrioni).
Examenul microscopic al „vălului" (preparat proaspăt, între lamă şi lamelă: vibrioni
foarte mobili, cu mişcări de. rostogolire sau haotice) precum şi utilizarea unor anticorpi
j. Microorganismele-din genul Haemophilus sunt cocobacili polimorfi, imobili, nesporu-
specifici (reacţie antigen-anticorp) pot grăbi diagnosticul) ^ / î, ,• . /.A
laţi, gram negativi, aerobi, facultativ anaerobi. Sunt germeni pretenţioşi; pentru a se dezvolta
,4. Identificarea micrpprganismuiui ţmplicat patogenic se va realiza pe |baz;a mai. multor
au nevoie de prezenţa factorilor de]creştere, prezenţi în sânge (de unde şi numele genului).
caractere: < j ; . , v; ,:-«j ui ,-,qv du, Există mai multe specii, dintre care cele mai cunoscute .sunt Haemophilus influenzae şi
• Caractere morfotinctoriale: Sunt bâcili gram-negativi cu cu dimensiuni de 1-3 pm /0,5-0,8ptm Haemophilus ducreyi: multe dintre tulpinile de H. influenzae sunt capsulate.
• Caractere de cultură: ' •• -ioi-m ; . o v . u i x m ţ a i-
• Produc colonii de tip S, galbene, mari* cu diametrul de 2-4 mm'(pe TCBS) Haemophilus influenzae
1 ’ « P e mediul :BSA, K cholerae produce colonii de tip S rotunde, strălucitoare,trans-
1 parente câ picăturile tie 1rouă (spre deosebire de coloniile de Entioli care sunt mate). Haemophilus influenzae este patogen prin multiplicare şi invazivitate. Microorganismul
pătrunde pe cale respiratorie. Boala debutează ca o rinofaringită acută, probabil în asociere
• Caractere biochimice:', I.'V.'B'q,-. ' , 7 .7 , '. '7• ■i' T-d'■’iC'Ptusii cu o infecţie virală la nivelul tractului respirator. Aceasta poate fi urmată de epiglotită,
, • V. cholerae este oxidazo pozitiv (vezi capitolul 12) _7,v7 <
>7 laringotraheită, otită, sinuzită, mai rar de. pneumonie dar şi de celulita sau de meningită
• alte teste,biochimice, prin metpde clasice şa.u utilizând galeriile manualp. sau,auto acută purulentă la.copiii mici preşcolari. Sinusurile sau urechea medie pot fi afectate prin
mate (ex, API 20E, ID 3.2E),lşp efectuează la,nivelul unui laborator de niv.el supe
extensie locală (se poate nota faptul că Haemophilus influenzae tip b şi pneumococul se
rior sau la nivelul centrului naţional de referinţă; testele biochimice,pot diferenţia
numără printre agenţii etiologici foarte-comuni ai-otitei medii bacteriene şi ai sinuzitelor
biotipul clasic de biotipul Ef Tor (se apreciază dă V. cholerae 0:139 este un mutant
■, .T,.; , . . .>• • ■>•*. />>•,>•• i v • o ;îîj ! acute). Dacă microorganismul pătrunde în torentul sanguin, pe această cale poate infecta
al biotipulm El Tor)
meningele. Ocazional infecţia cu Ii. influenzae poate duce la o laringotraheită obstructivă
• Testul „şuviţei" de ADN se poate utiliza pentru a diferenţia tulpini care sunt oxidazo-
fulminantă care necesită traheotomie sau intubare.promptă a copilului respectiv. în vederea
pozitive şi formează colonii cu'aspect asemănător (V. cholerae şi Aeromonas spp'.); în
acest scop suspensionăm o colonie suspectă într-o picătură de soluţie 0i5% dezoxîcolat discutării examenului de laborator vom-avea în vedere meningita produsă de H. influenzae.
de sodiu, pe o lamă de microscop. în cazul în,care este vorba.de o colonie:de.vibrioni, Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu Haemophilus influenzae este
aceştia sunt lizaţi şi eliberează ADN-ul care poate fi „tras" cu -ansa ca o şuviţă bacteriologic, direct, incluzând etapele care vor fi prezentate în continuare.
• Caractere antigenice: ; „ ■, - ; în m eningita produsă de H. influenzae diagnosticul este urgent (risc de evoluţie cu
• Se utilizează ser ânti-holeric 0:1 şi se practică reacţia de aglutinare peTamăJLa sechele şi/sau deces), de importanţă maximă fiind recoltarea şi transportul rapid al LCR
nivelul centrului de referinţă se confirmă reacţia pozitivă şi Se identifică serotipu! către laborator. Este de preferat realizarea unei cultivări „la patul bolnavului", chiar dacă
(Ogawa, Inaba sau Hikojima), iar în cazul unei reacţii negative se realizează o pentru concentrarea germenilor ar putea fi: necesară centri frigarea LCR. Analiza citologică
reacţie de aglutinare pe lamă folosind ser anti-holeric-Oi 139 ,! ■’*■ •*h i-..-,■ j. i şi biochimică a LCR este utilă în stabilirea-etiologiei. . ,
• Testarea sensibilităţii la bacteriofagi-(lizotipia) se poate utiliza în 1studii epidemîb- 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie
logice sau în scop de cercetare, fiind rezervată, laboratoarelor de referinţă. Există
de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât
sisteme de lizotipare care definesc peste 140 de.lizotipuri diferite.i.:
mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de
• Alte caractere/teste, utilizate în identificare la nivelul centrelor de referinţă: --- -- •<■>■■/■■ asepsie şi-antisep,sie etc).-în infecţiile produse de Haemophilus influenzae se pot recolta
• testul sensibilităţii la agentul vibriostatic'cu 0/129 (10 pg şi 50 jig) 11 . « p f f ’-l secreţii:de Ia nivelul tractului respirator superior sau inferior, secreţii din sfera ORL, lichide
« determinarea toxinogenezei tulpinilor de V. cholerae prin reacţia' 'VET-RPIiA recoltate prin puncţie, sânge, LCR etc. în continuare vom discuta cazul în care p.p. este
(latex aglutinare pasivă inversată) . / reprezentat de LCR (vezi şi capitolul 6). Aşa cum am mai menţionat, recoltarea LCR prin
®tehnici de tip ELÎSA pentru identificarea unor structuri 'caracteristice V. cholerae puncţie (după verificarea presiunii din artera centrală a retinei prin examinarea fundului de
• tehnici ale biologiei moleculare (ribOtipie. PCR etc). ' ochi) trebuie făcută pe cât posibil la patul bolnavului, având la dispoziţie tot ce este necesar
5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimidterapice) se realizează pentru pregătirea frotiurilor, cultivarea pe diferite medii de cultură, repartizarea unei can
prin metoda difuzi metrică standardizată, în special în scopul supravegherii, apariţiei 'unor tităţi de LCR pentru examenul citolpgic şi biochimic (vezi şi capitolul 6 ). în cazul în care
tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene. .,, “ ,
192 Diagnosticul de laborator în microbiologie y 8 ir .
Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Haemophilus 193
p.p. urmează a fi transportat către laborator, transportul trebuie irealizat fără întârziere (la o
temperatură apropiată de 37°C, refrigerarea este contraindicată); H. influenzae ar putea fi dp,şptelitism). Pe geloză-sânge cu infuzie de inimă-creier apar colonii mici, rotunde, con
izolat şi prin hemocultură, cultivarea secreţiilor nazale sau faringiene etc. Din punct de vexe, de tip S, care în primele 24 ore prezintă irizaţii puternice, caracteristice. Nu apare
hemoliză.
vedere macroscopic, LCR poate avea aspect purulent.
• Caractere biochimice:
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două
frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător', care se vor colora cu ” * Majoritatea tulpinilor (70%) simt indol pozitive (transformă triptofanul'în indol).
albăstrii de rhetilen (AM) şi respectiv’ Gram. Dacă-.’L CR este franc purulent’frbtitifile’sd pot • Fermentează inconstant diferiţi carbohidraţii. Pe baza unor teste biochimice specia
executa direct din p.p., în caz contrar fesilizăm iniţial centrifugarea LCR. Frbtiurile se exa * ' a putut fi împărţită în biotipuri.
minează la microscopul optic cu imersie şi se: notează prezenţă Celulelor inflam atorii (ex. • Utilizând galeria API NH (manuală) putem identifica specii de Neisseria,
leucocite) şi prezenţa cocobacililor gram- negativi, fini, capsulaţi,'dispuşi separat sau în ,, Haemophilus şi Branhamella catarrhalis, în numai 4 ore. .
grămezi „aranjate în âce'elişi direcţie", uneori'dispuşi în .lanţuri scurte, situaţi intră său extra-
... • Caractere antigenice:
leucocitar. Datorită faptului că aceste microorganisme se colorează relativ slab în coloraţia
• Se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de Hae
Gram ar putea fi necesară colorarea frotiului de rezervă printr-6 alt'â' mfeiodă i’au.'recdîorarea
mophilus influenzae, prin tehnici imunologice.în funcţie de Ag K. Tipurile (a-f) se
prelungită cu fucsină. .... ■'i;. :/
••%.p.ot diferenţia prin reacţii de umflare a capsulei şi de imunofluorescenţă.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului.patologic se realizeazăîn. aşa fel,încât şă
-> .Tulpinile capsulate (Ag K) se pot identifica îh p.p. (LCR sau urină după centrifu-
se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care.se va identifica (vezişi capi
,:!;.gai:e) prin contraimunoelectroforeză, iatex aglutinare sau ELISA.
tolele 9 şi 10). H a e m o p h i l u s influenzae este un microorganism, foarte pretenţios'care nu se
poate dezvolta pe medii de cultură obişnuite. .Unele tulpini de Haemophilus influenzae nece i*(Fulpinile necapsulate se pot identifica şi tipiza prin Muitilocus Enzyme
sită pentru iniţierea creşterii 5-10% CO2. Este necesară .pentru incubareţ o atmosferă umedă, j; ^'Electrophoresis (MLEE).
la 35-37°C, şi o durată de minim 24-48 de ore, Pentru cultivare sunt necesari .factori de • Alţă,ţeste: există sonde nucleotidice produse comercial pentru identificarea H. influenzae.
creştere precum hemina (factor,X) şi factorul V care poate fi înlocuit prin NAD,' NADP sau 5. Antjbiograina (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea sta
alte coenzime. Ambii factori se obţin din eritrocite, însă este,necesară,eliberarea conţinutu bilirii tratamentului) este necesară şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. Este
lui acestora în mediu (de exemplu prin căldură, sau prin digestie peptică). Factorul V, este recoinaniată utilizarea unui mediu special, respectiv Haemophilus test medium (HTM). Se
sintetizat şi de stafilococul auriu, astfel că pe geloză sânge coloniile-de Haemophilus pot utiliza, şi truse automate pentru testare (ex. ATB HAEMO cu citire şi interpretare după
influenzae sunt mai numeroase şi de.dimensiuni mai, mari,în apropierea,unei linii pe care a 18-24 ore’sau rapid ATB E 4 cu citire şi interpretare după 4-5 ore incubare). Determinarea
fost însămânţată o tulpină hemolitică de Staphylococcus aureus (fenomenul de satelitism). CMÎ şi GMB poate fi necesară şi se realizează prin metode clasice sau cu ajutorul testului
Coloniile sunt de tip S sau M şi ating.un diametru de 0,5-0,8 mm după 24 de ore, respectiv E (vezi capitolul 14).
1-2 mm la 48 de ore, având aspectul unor picături de rouă pe geloză chocolat. Pe geloză-
sânge cu infuzie dc inimă-creier apar colonii mici, rotunde, convexe, de tip S, care în pri Identificarea răspunsului imun faţă de Haemophilus influenzae
mele 24 ore prezintă irizaţii puteriiice, caracteristice. Nu apare hemoliză, identificarea prezenţei de anticorpi faţă de H. influenzae ar putea fi utilă pentru verifi
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor carea ris'punsului imun în urma vaccinării. în acest scop au fost utilizate RIA şi ELISA.
caractere: / •: ’
• Caractere morfotinctoriale: Sunt cocobacili gram negativi, mici (1-1,5