Sunteți pe pagina 1din 134

( r

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE


„CAROL DAVILA“

Mircea loan Popa M.D., Ph.D., M.P.H.


Conferenţiar universitar

e d i t u r a

BMedica
Bucureşti
( f i

VI

Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale CUPRINS


POPA, MIRCEA IO AN
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN MICROBIOLOGIE /
Mircea loan Popa - Bucureşti; Infomedica, 2004
Bibliogr.
Cuvânt înainte...................................................................................................................Vil
ISBN 973-7912-37-3

579.616.074 1. Elemente legate de controlul calităţii în laboratorul de bacteriologie/


microbiologie.................................................................................................................. .1
Mircea loan Pupa .

® 2004 - Infomedica s.r.l.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN MICROBIOLOGIE PARTEA GENERALĂ


MIRCEA IOAN POPA 2. Elemente legate de conduita în laboratorul de bacteriologie/microbiologie.
Norme de protecţie a muncii în laboratorul de microbiologie.........................................4
ISBN: 973-7912-37-3 Mircea loan Popa

Toate drepturile rezervate Editurii INFOMEDICA. 3. Date privind echipamentul şi aparatura utilizate în laboratorul de
Nici o parte din acest volum nu poate fi copiată; microbiologie................................................... 9
fără permisiunea scrisă a Editurii INFOMEDICAi Mircea h a n Popa
Drepturile de distribuţie în străinătate aparţin în exclusivitate editurii.
Copyright ©2004 by INFOMEDICA s.r.l. All rights reserved. 4. Metode de dezinfecţie şi sterilizare utilizate în laboratorul
de microbiologie............................................. i.................................................................. 12
APĂRUT 2004 Mircea loan Pupa
REFERENŢI ŞTIINŢIFICI:
ADRIAN STREINU-CERCEL M.D., Ph.D.
LUCIA DEBELEAC M.D.. Ph.D. 5. Schema generală a diagnosticului de laborator microbiologic........................................18
Conferenţiar universitar
Profesor universitar Mircea loan Popa, Gabriela Loredana Popa
UMF „Carol Davila" Bucureşti UMF „Carol Davila" Bucureşti
Director general al Institutului de Boli Infecţioase 6. Norme privind prelevarea şi transportul produselor patologice
„Praf. Dr. Matei Balş" în diagnosticul microbiologic direct.................................... ........................................... .22
GHEORGHE DIMACHE M.D., Ph.D. Mircea h a n Popa, Gabriela Loredana Popa
Cercetător ştiinţific principal gr. I 7. Preparate microscopice, frotiuri Şi principalele coloraţii utilizate
Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare în microbiologie.........................................................................................'.........................33
pentru Microbiologie şl Imunologie „Cantacuzlno"
Mircea loan Popa, Gabriela Loredana Popa
8 . Tehnica examenului microscopic în diagnosticul microbiologic....................................39
REDACTARE: Mircea loan Popa, Gabriela Loredana Popa
Mircea loan Popa
Gabriela Loredana Popa 9. Medii de cultură..............i........................................................................... .......................45
Gabriela Loredana Popa, Mircea loan Popa
10. Tehnici de cultivare.......................................................................................................... 52
Tehnoredactare computerizată: Editura Gabriela Loredana Popa, Mircea loan Popa
Tehnoredactare: Ing. Nicoleta Anghel 11. Examinarea caracterelor de cultură, metabolice precum şi a
Dr. Mircea loan Popa altor caractere fenotipice utile în identificarea microorganismelor.............................. 61
Bucureşti Gabriela Loredana Popa, Mircea loan Popa
Editura INFOMEDICA
Şos. Panduri 35, Bl. P1B, Sc. A, Ap. 33-34 12. Teste de identificare având la bază diferite caractere biochimice
Tel./Fax: 021/410.04.10; 410.53.08; Tel.: 410.61.63
ale bacteriilor şi fungilor..................................................................................................70
e-mail: redactla@infpmedica.ro
www.infomedica.ro Gabriela Loredana Popa, Mircea loan Popa
Tipar executat la Tipografia INFOMEDICA
Cuprins y

31. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme


din genul Salmonella. Hemocultura....................................................................£........ 172
Mircea loan Popa
32. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse microorganisme din
gen u I Klebsiella............................................ .................................... .................. ......... 179
Mircea loan Popa
33. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse microorganisme
din genul Proteus............................................................................................................ 181
Mircea loan Popa
34. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse microorganisme
din genul Yersinia................................................................. 184
Mircea loan Popa
35. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse microorganisme
din genu! Pseudomonas.................................................................................................. 186
Gabriela Loredana Popa, Mircea h a n Popa
36. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse microorganisme din
genul Vibrio.............................................. .......................................................................189
Gabriela Loredana Popa, Mircea h a n Popa
37. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse microorganisme
din genu! Haemophilus...................................................................................................191
Mircea loan Popa
38. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse microorganisme
din genul Bordetellci.........................................................................................................195
Mircea loan Popa
39. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse microorganisme
din genul Brucella............................... 198
Gabriela Loredana Popa, Mircea loan Popa
40. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de
Corynebacterium diphtherias........................................................................................ 202
Mircea loan Popa
41. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme
din genul Listeria ............................................................................................................ 205
Mircea loan Popa
42. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme
din genul Mycobacterium................... ...208
Gabriela Loredana Popa, Mircea loan Popa, Mireta Stefan
43. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Bacillus anthracis ...................... 211
Mircea h a n Popa, Gabriela Loredana Popa
44. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme
din genul Clostridium......................................................................................................214
M ircea h a n Popa
IV Diagnosticul de laborator în microbiologie

13. Teste de identificare rapide/moderne............................................................. ......... .......87


Mircea loan Popa CUVÂNT ÎNAINTE
14. Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice................................................... 95
Mircea loan Popa
15. Reacţii antigen-anticorp utilizate în microbiologie...................................................... 105
Mircea h a n Popa
16. Reacţia de precipitare................................................................................;...................'0® Acest manual de lucrări practice apare la peste 2 decenii după manualul publicai
Mircea loan Popa sub redacţia dlui. prof. dr. Mărăşel Georgescu, la Bucureşti.
17. Reacţia de aglutinare...................................................................................................... ' Cele mai multe dintre datele prezentate reprezintă elemente de bază ale diag­
Mircea loan Popa nosticului microbiologic în infecţiile produse de bacterii sau levuri. Pornind de la
18. Reacţia de fixare a complementului..... ............................................... ........................ 117 noţiuni privind controlul de calitate, conduita în laboratorul de microbiologie
Mircea h a n Popa (inclusiv norme de protecţia muncii), echipamentul şi aparatura necesare în labo­
19. Reacţia de neutralizare (seroneutralizare)........................... .................................... .....120 rator, dezinfecţia şi sterilizarea am continuat cu schema generală a diagnosticului
Mircea h a n Popa microbiologic prezentând în capitole separate principalele norme privind prele­
20. Reacţii în care componentele sunt marcate..................................................... ............. 123 varea şi transportul produselor patologice, realizarea preparatelor microscopice,
Mircea loan Popa tehnica examenului microscopic, principalele medii de cultură utilizate şi tehnicile
21. Testarea imunităţii de tip celular.......................................................... •........................128 cultivare mai frecvent folosite. în capitolele următoare am prezentat modalităţile de
Mircea h a n Popa identificare a tulpinilor bacteriene sau levurice prin metode fenotipice şi geno-
22. Biopreparate................................. ..................................................................................*33 tipice, un capitol separat fiin d dedicat studiului sensibilităţii la medicamentele
Mircea h a n Popa antimicrobiene. După discutarea reacţiilor antigen-anticorp şi o trecere în revistă
p a r t e a s p e c ia l a
a principalelor produse biologice de uz uman am realizat trecerea către partea
23. Introducere în diagnosticul de laborator microbiologic............................................... 138
specială în care sunt abordate modalităţile diagnostice în infecţiile produse de
Mircea h a n Popa
principalele microorganisme. Capitolul 52 realizează o sinteză a noţiunilor prezen­
24. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme
tate în manual în timp ce ultimul capitol prezintă unele elemente privind importanţa
din genul Staphylococcus...............................................................................................142
diagnosticului microbiologic în cadrul sistemului de supraveghere al bolilor trans­
Gabriela Loredana Popa, Mircea h a n Popa
misibile, în România.
25. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme
din genul Streptococcus......................................................................................... *......'45 Alte date suplimentare pot fi studiate şi aprofundate de către cei interesaţi în o
Mircea loan Popa serie de manuale şi tratate de specialitate din literatura medicală românească şi
26. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse Streptococcus pneumoniae...............148 internaţională.
Mircea loan Popa După opinia noastră (formată în 14 ani de activitate teoretică şi practică în care
27. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme am colaborat cu studenţi la medicină sau colegii medicale, medici rezidenţi sau
din genul Neisseria......................................................................................................— specialişti, asistenţi medicali etc), microbiologia reprezintă una dintre materiile
Mircea hem Popa fa ţă de care interesul trebuie să fie sensibil mai ridicat comparativ cu ceea ce per­
28. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de enterobacterii. Coprocultura.A.... 156 cepem că se petrece în momentul actual. Microbiologia aduce „uneltele “ necesare
Mircea loan Popa, Gabriela Loredana Popa
unui diagnostic, de .multe ori rapid şi de cele mai multe ori foarte precis, de mare
29. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Escherichia coli. Urocultura...... 162 ajutor pacientului.
Mircea loan Popa, Gabriela Loredana Popa
Aşteptăm sugestiile cititorilor, în special pe cele critice, pentru a putea îmbu­
30. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse microorganisme
nătăţi conţinutul prezentului volum. Acestea pot f i transmise prin email la adresa:
din genul Shigella ....................................... .................................................................
Mircea loan Popa, Gabriela Loredana Popa popalore@ hades. ro.

Autorii
( (
Diagnosticul de laborator în microbiologie
VI
ELEMENTE LEGATE DE CONTROLUL CALITĂŢII ÎN
• LABORATORUL DE BACTERI0L0GIE/MICR0BI0L0GIE
45. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme
din genul Treponema.....................................................................................................218
Miivea loan Popa
46. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme
din genul Leptospira................................................... .................................................. 224 Cu toate că aceste noţiuni nu par a fi de utilitate imediată, trebuie să avem în vederefap­
Mircea loan Popa, Cabriela Loreclana Popa tul că ele sunt incluse într-unul dintre cele mai importante capitole ale activităţii, în orice
47. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme tip de laborator şi nu numai în laboratorul de microbiologie.
din genul Borrelici.................... ...................................................... ...............................227 De fapt, cu cât sunt înţelese mai de timpuriu, cu atât pot fi mai utile în dezvoltarea
Mircea loan Popa viitoare a oricărui medic, care mai devreme sau mai târziu va trebui să înţeleagă importanţa
48. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme laboratorului clinic în general şi respectiv a laboratorului de microbiologie în particular, în
din familia Rickettsiacaae...................................................... I......... i............................230 colaborare cu celelalte specialităţi medicale. Am decis să introducem aceste elemente în
Mircea loan Popa primul capitol al manualului de lucrări practice. Considerăm necesară parcurgerea acestor,
noţiuni de către toţi colegii implicaţi în diferitele activităţi desfăşurate în sistemul sanitar.
49. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme
Recomandăm citirea şi altor materiale redactate pe această temă, din literatura medicală
din genul C h la m y d ia ...................................................... ............................................... 233
românească sau internaţională.
Mircea loan Popa
.în orice laborator, inclusiv în laboratorul de microbiologie al UMF „Carol Davila", este
50. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme
necesară stabilirea unor responsabilităţi. Chiar şi în cazul în care activitatea practică se
din genul Mycoplasma ......................................................... 235
rezumă la o serie de demonstraţii şi prezentarea unor anumite aspecte pentru tinerii aflaţi în
Mircea loan Popa ,
stagiu, elementele legate de controlul calităţii nu trebuie să fie ignorate.
51. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme
Atunci când este vorba de un laborator clinic de microbiologie, iar de rezultatele obţinute
din genul C a n d id a ................................................................... 237
poate depinde evoluţia şi uneori chiar viaţa unui pacient, controlul intern de calitate intră
Mircea loan Popa în responsabilitatea şefului de laborator, care trebuie să supervizeze (direct sau prin delegare
52. Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile acute ale de responsabilitate) toate activităţile desfăşurate şi să contrasemneze buletinele de analiză.
căilor respiratorii inferioare............................................................................................ 241
1. într-un sistem medical bine pus la punct, buletinele de analiză nesemnate, semnate
Mircea loan Popa, Cabriela Loreclana Popa
indescifrabil, verificate numai de către personalul medical cu pregătire medie etc., trebuie
53. Elemente privind importanţa diagnosticului microbiologic în să dispară şi să fie înlocuite de buletine de analiză redactate după toate rigorile, incluzând
sistemul de supraveghere al bolilor transmisibile.........................................................255 supervizarea menţionată mai sus.
Mircea loan Popa 2 . în fiecare laborator trebuie să existe şi să fie accesibil oricărui membru al personalu­
lui de laborator un document scris, fie sub forma unui manual tehnic, fie sub forma unui
dosar în care să fie incluse o nene de materiale, după cum urmează:
®Un tabel nominal al personalului, date tehnice despre fiecare membru precum şi date
care să permită contactarea unei anume persoane în caz de necesitate
• Un regulament de ordine interioară, inclusiv normele de protecţie a muncii şi normele
de securitate microbiologică, precum şi descrierea sarcinilor fiecărui membru al per­
sonalului de laborator
• O listă cuprinzând toate formularele utilizate în laborator precum şi descrierea fiecărui
formular în parte, inclusiv recomandări privind modul de completare al formularelor
• Un plan al laboratorului
• O listă a analizelor care pot fi efectuate în laborator
• Tehnicile de identificare a microorganismelor izolate, pornind de la normele de
recoltare, conservare şi transport (pentru fiecare tip de produs în parte), testele uti-
( :(

Diagnosticul de laborator în microbiologie î Elemente legate de controlul calităţii în laboratorul de bacteriologie/microbiologie

lizate, lista mediilor de cultură şi a reactivilor utilizaţi, inclusiv modul de preparare al unui examen de laborator este făcută fără responsabilitate, fără colegialitate şi fără a avea
acestora. suficient în vedere interesul pacientului. Atât personalul medical din laborator cât şi cel din
în mod ideal (pentru că deocamdată aceste recomandări nu sunt aplicate în toate labora­ clinică trebuie să acţioneze în strânsă colaborare. Numai în acest caz rezultatele obţinute pot
toarele din ţara noastră) ar trebui ca manualul (dosarul tehnic) să fie revizuit şi completat fi corect interpretate, eventualele rezultate care par incorecte pot fi analizate şi corelate cu
periodic şi să includă normele metodologice redactate şi transmise de către instituţia care situaţia concretă, particulară a unui anume pacient, iar în cazul persistenţei Suspiciunii unei
se ocupă de coordonarea şi controlul activităţii desfăşurate în sistemul laboratoarelor de erori de laborator se poate solicita în cunoştinţă de cauză repetarea unei analize sau se poate
microbiologie din România precum şi actele normative (recomandări, ordine de ministru, realiza prelevarea unui nou produs patologic sau a unei probe de sânge pentru obţinerea
serului de cercetat.
ordonanţe de guvern, legi etc) apărute în legătură cu activitatea de laborator.
Cele menţionate mai sus sunt valabile pentru laboratoarele de microbiologie, dar în în vederea stabilirii unei bune colaborări trebuie să existe o comunicare permanentă între
colegii care îşi desfăşoară activitatea în clinică şi în laborator.
parte, se pot aplica oricărui tip de laborator clinic.
3. în mod necesar, periodic, în cadrul laboratorului trebuie organizate scurte întâlniri Trebuie să recunoaştem că din păcate buna colaborare şi comunicare între verigile sis­
care să permită schimbul de opinii între membrii personalului de laborator, prezentarea unor temului de sănătate reprezintă încă un deziderat neatins în ţara noastră, cu relativ puţine
referate alcătuite după materiale de specialitate apărute în literatura naţională sau inter­ excepţii. Pornind de la buletinul de analiză şi documentele tehnice care trebuie să fie
disponibile atât pentru laborator cât şi pentru clinică, continuând cu scrisorile metodologice
naţională, discutarea unor aspecte legislative legate de activitatea de .laborator etc.
care au devenit din ce în ce mai rare în ultimii 10-15 ani trebuie găsite cele mai bune soluţii
4 .0 modalitate obiectivă a controlului intern de calitate este reprezentată de solicitarea (de de comunicare colegială şi ştiinţifică, Este datoria managerului instituţiei medicale ca,
către şeful de laborator, care va efectua şi verificarea rezultatelor) realizării unor teste având împreună cu şeful laboratorului şi şefii secţiilor clinice, să faciliteze organizarea unor întâl­
la dispoziţie probe „oarbe", rezultatul corect fiind cunoscut numai de către cel care a pregătit niri periodice între colegi.
proba respectivă şi respectiv de către şeful de laborator.
Trebuie discutate şi agreate în mod colegial criteriile care pot conduce, spre exemplu, la
5. în protocolul de lucru, pentru fiecare test în parte, este notificată utilizarea unui control
respingerea unor probe. Trebuie desfiinţată modalitatea de lucru în care se acceptă pentru
pozitiv şi respectiv a unui control negativ (spre exemplu în cazul testului susceptibilităţii la lucru în laborator orice probă, indiferent de modul în care a fost recoltată, transportată şi
bacitracină, controlul pozitiv va fi reprezentat de o tulpină de Streptococcus pyogenes, iar con­ indiferent dacă este însoţită (sau nu) de un buletin care solicită o anumită examinare şi care
trolul nşgativ va fi reprezentat de o tulpină de Streptococcus agalactiae), astfel putându-se va­ ar trebui să menţioneze o serie de date strict necesare. în loc să fie prelucrate probe fără cali­
lida rezultatele obţinute. tate, care nu au cum să conducă la realizarea unui diagnostic microbiologic corespunzător
în mod complementar, controlul de calitate extern ar trebui să condiţioneze autoriza­ şi util pacientului care prezintă o infecţie de etiologie probabil microbiană, este de preferat
ţia eliberată pentru funcţionarea oricărui laborator de microbiologie clinică, atât în sistemul ca aceste probe să fie respinse şi să se solicite o nouă recoltare, corespunzătoare calitativ şi
public cât şi în cel privat. Din punct de vedere operaţional, fiecare laborator ar trebui să cantitativ.
primească: înainte de a încheia această destul de sumară prezentare, dorim să subliniem încă o dată
• un număr de cod, care este cunoscut de laboratorul respectiv şi de către instituţia care că aceste noţiuni ar trebui cunoscute şi aplicate deopotrivă în sistemul public şi privat.
organizează controlul extern de calitate; Controlul intern şi extern de calitate trebuie să reprezinte o prioritate absolută pentru sis­
• periodic, un număr de probe, al căror rezultat va fi verificat (pentru examene bacteri­ temul naţional de sănătate iar elementele legate de acesta ar trebui să fie cunoscute încă din
ologice, micologice şi serologice); perioada de pregătire de bază a oricărui medic, biolog sau asistent medical.
• formulare standardizate pentru re-transmiterea rezultatelor obţinute.
îndeplinirea recomandărilor menţionate mai sus va conduce implicit la protecţia pacien­
ţilor, identificarea unor anumite erori, compararea rezultatelor la nivel naţional, posibilitatea
colaborării la nivel internaţional, realizarea ,unei standardizări în microbiologia clinică
românească, creşterea încrederii tuturor partenerilor din sistemul sanitar.
Identificarea unor modalităţi de lucru necorespunzătoare ar trebui să conducă la retra­
gerea autorizaţiei de funcţionare cu reacordarea acesteia numai după îndeplinirea tuturor cri­
teriilor necesare unei activităţi utile diagnosticului şi care să nu pună în pericol sănătatea sau
viaţa pacienţiloî.
Controlul calităţii la nivelul oricărui laborator va atinge eficienţa maximă cu condiţia
unei colaborări între clinică şi laborator. Sunt încă prea frecvente situaţiile în care solicitarea
(
Elemente legate de conduită în laboratorul de bacteriologie/microbiologie 5
■ P A R T E A G E N E R A L Ă
• identificării contaminării de laborator;
ELEMENTE LEGATE DE CONDUITA ÎN
2 • LABORATORUL DE BACTERIOLOGIE/MICROBIOLOGIE.
NORME DE PROTECŢIE A MUNCII
• depistării purtătorilor de germeni etc.
Chiar dacă cele menţionate mai sus par complicate, ele reprezintă o simplificare în raport
cu complexitatea activităţii din laboratorul de bacteriologie.

ÎN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE Pentru îndeplinirea obiectivelor, laboratorul de bacteriologie trebuie astfel conceput
încât condiţiile de lucru să fie optime. în plus, trebuie să avem în vedere că în momentul
efectuării oricărei tehnici de laborator, este necesar să fie asigurată protecţia personalului de
laborator precum şi prevenirea contaminării probelor de lucru. Toate elementele necesare
trebuie să apară scrise manualul tehnic menţionat în cadrul capitolului precedent.
Clădirea laboratorului de bacteriologie medicală trebuie să asigure, pe cât posibil, pre­
venirea expunerii la praf, curenţi de aer, să fie luminoasă şi în măsura posibilităţilor spaţiile
Ţinta activităţii în laboratorul de bacteriologie/micologie ar putea fi definită foarte pe
de lucru să fie orientate astfel încât să prevină incidenţa directă a razelor solare (având în
scurt drept stabilirea tratamentului care trebuie urmat în cazul unui pacient care prezintă o
vedere efectul bactericid al radiaţiilor UV; acest element este de maximă importanţă în la­
boală infecţioasâ de etiologie bacteriană/fungică. De fapt lucrurile sunt mult mai compli­
boratorul de mycobacteriologie).
cate, datele de laborator nu pot fi interpretate în lipsa unei pregătiri serioase atât din punct
de vedere teoretic cât şi practic, în lipsa unei activităţi susţinute în perioada de pregătire care Fiecare încăpere a laboratorului de bacteriologie trebuie să aibă o destinaţie precisă iar pla­
durează mai mulţi ani şi de fapt continuă toata viaţa. nul laboratorului în ansamblu trebuie să prevadă un anumit „flux“, pe cât posibil într-un sens
unic în vederea prevenirii contaminării preparatelor de laborator şi respectiv prevenirea „întâl­
Ceea ce trebuie să fie însă foarte clar încă de la început este că, fără respectarea unor
nirii" dintre materialele contaminate şi materialele sterile.
principii, în condiţiile efectuării sau interpretării mecanice a unor teste etc., diagnosticul de
laborator microbiologic corect devine imposibil. Laboratorul de bacteriologie medicală include încăperi (spaţii) în vederea desfăşurării
corespunzătoare a următoarelor activităţi:
în vederea atingerii scopului, în laboratorul de bacteriologie se vor efectua tehnicile
necesare: • recepţionarea probelor recoltate în afara laboratorului;
« stabilirii prezenţei sau dovedirii absenţei unor anumite bacterii la nivelul unui anumit • recoltarea probelor în laborator;
substrat; • prelucrarea probelor în vederea cultivării, identificării bacteriilor implicate etiologic,
prin diferitele tehnici bacteriologice;
o studierii bacteriilor izolate pentru identificarea genului, grupului, speciei, tipului (de la
• realizarea diferitelor tehnici imunologice utile în diagnosticul bacteriologic sau imuno-
caz lâ caz) având la bază o serie de caractere ale bacteriilor, precum:
logic;
» caracterele morfotinctoriale; • pregătirea materialelor necesare în laborator;
» caracterele de cultură; sticlărie;
o caracterele biochimice (pigmentogeneza, sinteza altor factori care pot fi evidenţi­ * alte instrumente de laborator;
aţi macroscopic, sinteza unor enzime, sinteza de bacteriocine, capacitatea de a fer­ reactivi;
menta un anumit substrat, capacitatea de a folosi un anumit substrat drept unică ❖ medii de cultură etc;
sursă de carbon etc); • depozitarea materialelor necesare în laborator;
• caracterele antigeriice (utilizând tehnici din domeniul imunologiei); • spălarea materialelor înainte de sterilizare etc.
o caracterele de patogenitate; în afară de cele menţionate mai sus, în laboratorul de bacteriologie mai există spaţii des­
• sensibilitatea faţă de bacteriofagi; tinate activităţilor administrative (birouri), vestiare, grupuri sanitare etc.
• caractere legate de sinteza anumitor metaboliţi sau structuri moleculare identifica­ în cazul unor laboratoare specializate (de ex. studiul acizilor graşi prin tehnici de cro­
bile spre ex. prin tehnici de cromatografie; matografie, studiul caracteristicilor bacteriene prin tehnici de biologie moleculară etc.),
există anumite particularităţi în planificarea şi distribuirea spaţiilor funcţionale din labora­
o caracterele genetice etc;
tor; elementele tehnice legate de aceste structuri sunt prezentate în diferite manuale tehnice
®stabilirii faptului că bacteria izolată este implicată în procesul infecţios respectiv; care pot fi consultate de către cei interesaţi.
®stabilirii sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice;- încăperile, spaţiile, mobilierul din laboratorul de bacteriologie vor fi construite în aşa fel
®monitorizării evoluţiei sub tratament (dovedirea eficienţei tratamentului antibacterian încât să permită realizarea unei curăţenii şi dezinfecţii la cel mai înalt nivel; în cazul aces-
ales);
( ( j
6 Diagnosticul de laborator în microbiologie Elemente legate de conduită în laboratorul de bacferiologie/microbiologie

tui tip de laboratoare se poate vorbi de necesitatea atingerii perfecţiunii. Va fi acordată toată 5. Mâncatul şi băutul sunt interzise în sala de lucrări practice de microbiologie. Fumatul
atenţia pentru ca laboratorul să fie organizat în vederea este interzis, conform legii, în orice instituţie medicală din România şi cu atât mai mult nu
• realizării scopului menţionat mai sus prin tehnicile enumerate; este acceptat într-un laborator de microbiologie.
• prevenirii contaminării probelor de laborator; - 6. Se interzice aplicarea de cosmetice, lăcuirea unghiilor, purtarea de unghii false,
manipularea lentilelor de contact etc,
• prevenirii răspândirii germenilor în mediul ambiant;
7. Este interzisă introducerea în gură a oricărui obiect.
• prevenirii infecţiilor de laborator, '
8. Pipet.area cu gura este strict interzisă. în vederea pipetării se vor utiliza dispozitive de
înainte de a încheia prezentarea principalelor încăperi (spaţii) din laboratorul de bacteri­
pipetare adecvate.
ologie, dorim să. menţionăm că:
9. Nu este permisă depozitarea obiectelor de uz personal pe masa de lucru (haine, genţi,
• structura prezentată pentru laboratorul de bacţeriologie nu diferă în mod esenţial de
serviete, caiete etc). Se recomandă ca hainele să fie lăsate la garderobă sau într-un spaţiu
structura unui laborator de microbiologie în general;
special amenajat.
• în structura laboratorului este de dorit să fie incluse (în măsura posibilităţilor şi în
10. Manipularea materialului contaminat se va realiza cu maximă precauţie pentru
funcţie de nivelul laboratorului, de exemplu în cazul unui laborator de spital universi­
evitarea răspândirii microorganismelor. Activităţile se vor desfăşura în vecinătatea becului
tar) spaţii în care să se poată desfăşura activităţi de învăţământ şi. pregătire teoretică şi
Bunsen aprins.
practică, spaţii în care ar putea avea loc şi diferite întâlniri tehnice între membrii per­
sonalului de laborator; 11. însămânţările se efectuează „ia flacără11. Se vor flamba gurile tuturor recipientelor
(tub, eprubetă, flacon de sticlă etc) utilizate, atât la deschidere cât şi la închidere.
• laboratorul trebuie să fie legat funcţional de clinică.
12. Ansa bacteriologică se va steriliza „la roşu11, atât bucla cât şi firul ansei (iar portansa
Datele privind funcţionarea laboratoarelor care efectuează analize medicale sunt incluse
se va flamba) înainte şi după folosire. Atunci când s-a terminat lucrul cu ansa încărcată cu
în Ordinul ministrului sănătăţii nr. 119/2004, normativ aduce la zi Ordinul ministrului
produs patologic, în vederea sterilizării bucla ansei va fi introdusă iniţial „la baza flăcării11
sănătăţii şi familiei nr. 609/2002, precedat de Ordinul ministrului sănătăţii nr. 915/2000.
unde temperatura este mai scăzută, pentru a preveni împroşcarea cu particule infecţioase.
Aceste acte normative trebuie revizuite şi adaptate periodic.
Atunci când se lucrează într-un laborator de analize se vor lua preacauţii suplimentare.
13. Se vor utiliza anse bacteriologice corect şi complet închise şi cu o buclă cu diametrul
NORME DE PROTECŢIE A MUNCII ÎN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE
mai mic de 3 milimetri pentru a se evita descărcarea spontană. Nu se vor face mişcări bmşte
în laboratorul de microbiologie se lucrează cu microorganisme potenţial patogene sau atunci când ansa este încărcată cu produs patologic. Se vor evita gesturile ample şi se va
dovedite a fi patogene, care se pot identifica în diferite produse patologice (ex. sânge, menţine un permanent control asupra mişcărilor efectuate în laboratorul de microbiologie.
materii fecale, urină etc) sau au fost izolate în culturi la nivelul laboratorului. Există şi posi­
14. Recomandăm ca toate activităţile care pot fi efectuate în laborator să fie înscrise şi
bilitatea ca un anumit laborator să primească spre identificare culturi: şi izolate de la un la­
detaliate în manualul tehnic al laboratorului. înainte de începerea oricărui test sau a oricărei
borator cu un nivel de competenţă inferior.
manevre, trebuie să avem în minte toţi „paşii11pe care urmează să îi facem (conform proto­
Chiar dacă activitatea se desfăşoară într-un laborator dedicat lucrărilor practice şi
colului de lucru) astfel încât să avem un control mental permanent al fiecărei manevre pe
demonstraţiilor făcute sub supravegherea unui cadru didactic pentru studenţi sau tineri
medici rezidenţi, există o serie de reguli care trebuie aplicate cu stricteţe în vederea elimi­ care urmează să o executăm.
nării riscurilor de contaminare: 15. Nu este permisă fuga şi nici mersul rapid prin laborator.
1. Este strict interzis accesul persoanelor străine în laborator. Tinerii medici sau viitori 16. Pipetele contaminate (pipete Pasteur, pipete gradate etc) nu se vor decontamina ia
medici vor accede în laborator şi vor participa la desfăşurarea lucrărilor practice numai după flacără, ci vor fi introduse (evitând producerea de stropi potenţial infectanţi) în flaconul cu
audierea şi însuşirea (dovedită prin semnătura pe un proces verbal pregătit în acest sens) re­ dezinfectant (lichidul dezinfectant trebuie să depăşească nivelul până Ia care a ajuns pro­
gulilor de protecţie a muncii. 1 ■ dusul contaminant), unde vor fi menţinute pentru circa 24 ore (în funcţie de substanţa dez-
2. Toate produsele biologice vor fi considerate ca potenţial infectante.' f infectantă utilizată). Flaconul cu amestec dezinfectant este obligatoriu. Tot în amestecul
3. Este obligatorie purtatea echipamentului de protecţie; halatul de protecţie reprezintă nive­ dezinfectant vor fi introduse cu aceleaşi precauţii lamele de sticlă folosite.
lul minim acceptat. Halatul trebuie să fie curat şi corect încheiat. în anumite situaţii se va reco­ 17. Toate celelalte obiecte contaminate (exceptând ansele bacteriologice, pipetele şi
manda utilizarea mănuşilor, ochelarilor, măştii, bonetei, şorţului, încălţămintei de protecţie. Se
lamele) se vor introduce la finalul activităţii practice, cu precauţie, într-un recipient (ex. o
recomandă ca echipamentul de protecţie să fie păstrat separat de hainele utilizate în exterior.
găleată din metal, cu capac) care va fi autoclavată.
4. Nu se vor purta mănuşi de latex în momentul manipulării becului Bunsen.
Diagnosticul de laborator în microbiologie
8 DATE PRIVIND ECHIPAMENTUL SI APARATURA
UTILIZATE ÎN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE
18. Se va restrânge pe cât posibil utilizarea obiectelor ascuţite, tăietoare şi înţepătoare.
19. Pentru îndepărtarea obiectelor ascuţite de unică întrebuinţare recomandăm utilizarea
de „cutii sigure" în care acestea să fie colectate. Aceste cutii vor fi ulterior incinerate.
20. în cazul în care are loc accidental contaminarea unei suprafeţe cu produse patologice
sau culturi, în cazul în care acest eveniment se datorează unui tânăr inedic sau viitor medic
în diferitele încăperi (spaţii) ale laboratorului de microbiologie putem întâlni o serie de
aflat în pregătire, în primul rând trebuie anunţat fără întârziere asistentul responsabil cu
echipamente, elemente de birotică, diferite aparate.
pregătirea respectivei grupe de lucru. Se recomandă acoperirea cu o pânză a suprafeţei
Spre exemplu, în încăperea unde are loc recepţionarea produselor patologice trebuie să
contaminate după care se toarnă o soluţie dezinfectantă care se va menţine pe loc în funcţie
existe registre sau un sistem computerizat de înregistrare a datelor (înregistrarea corectă a
de recomandările producătorului, dar nu mai puţin de 30 minute. Ulterior se poate trece
datelor în sistemul sanitar trebuie să reprezinte o prioritate pentru oricare dintre unităţile
(după caz) la curăţirea locului. medicale indiferent de sistemul public sau privat), stative pentru tuburi, eprubete, flacoane
21. La sfârşitului lucrului în laborator se vor spăla mâinile cu apă şi săpun. etc, un incubator la 37°C, un frigiderele. în locul unde se desfăşoară diagnosticul microbi­
22. în afară de aceste măsuri, se vor avea în vedere toate cele necesare evitării oricărui ologic trebuie să existe la îndemână anse bacteriologice, diferite pipete, pense, baghete de
risc care ar putea rezulta în urma utilizării unor substanţe caustice, manipulării diferitelor lemn, tampoane de diferite dimensiuni, becul Bunsen, microscopul, lupa, lame şi lamele,
truse de colorare, centrifuga, balanţa, baia de apă, un incubator, un frigider, plăci Petri, epru-
aparate electrice etc. bere, containere pentru materialul contaminat, cabinetul de siguranţă biologică etc.
în ceea ce priveşte utilizarea cabinetelor de siguranţă biologică (hote, boxe, nişe), vor fi
în cele ce urmează vor fi enumerate o parte dintre ustensilele şi aparatele care se pol găsi
prezentate unele noţiuni în capitolul al 3-lea. în laboratorul de microbiologie.
Respectarea acestor norme de protecţie este strict necesară.
1. Microscoape, lupe şi truse de coloranţi;
Trebuie să avem în vedere şi faptul că recomandările şi directivele Uniunii Europene în
- microscop optic (câmp luminos);
domeniul biosecurităţii trebuie să fie adoptate de către ţara noastră; după integrarea Româ­
niei în EU respectarea acestora va deveni obligatorie. - alte tipuri de microscop, care pot fi utilizate în cameră obscură (microscop cu fond
întunecat, microscop cu contrast de fază, microscop cu fluorescenţă) în situaţii particulare
de diagnostic;
- truse pentru coloraţii uzuale (albastru de metilen, Gram, Ziehl-Neelsen etc) şi speciale;
- lupă de mână şi lupă stereoscopică (pentru studierea morfologiei coloniilor).
2. Cabinete de siguranţă biologică (incinte, boxe, nişe):
- cabinetul de clasă I, în care aerul curat antrenează aerosolii produşi dinspre persoana
care lucrează şi care se află în laborator către mediul exterior, printr-un filtru care reţine
majoritatea particulelor periculoase;
- cabinetul de clasă if, în care aerul curat pătrunde filtrat, este recircuiat prin filtre astfel
încât suprafaţa de lucru vine în contact cu aer steril; în boxă nu se vor introduce surse de căl­
dură;
- cabinetul de clasă ill este complet închis; medicul îşi introduce mâinile în zona de lucru
prin mănuşi fixate etanş la aparat; aerul este atât admis cât şi evacuat prin filtre;
3..Termoslate şi băi de apă sau de nisip:
- termostate reglate la diferite temperaturi, în funcţie de profilul laboratorului şi a ger­
menilor studiaţi (ex. 33-37°C pentru bacterii, 28°C pentru fungi etc);
>
- camere termostat;
- băi de apă de diferite mărimi (ex. pentru decomplementarea serurilor la 56°C);
- băi de nisip (ex. pentru coagularea unor medii de cuitură/Loeffler etc).
f (
10 Diagnosticul de laborator In microbiologie Date privind echipamentul şi aparatura utilizate în laboratorul de microbiologie 11
\

4. Frigidere: - pipete gradate de diferite dimensiuni;


- frigidere de diferite dimensiuni, cu temperatura interioară de + 4°C/este de preferat uti­ - baghete de sticlă;
lizarea unui frigider separat de congelator, deoarece frigiderul se deschide mai frecvent şi - baloane;
aceasta va influenţa temperatura din compartimentul congelator; - flacoane (ex. Erlenmeyer);
- camere frigorifice; - pahare (ex. Berzelius);
- congelatoare de - 20°C şi de - 70°C (pentru anumite laboratoare specializate); - exsicatoare;
5. Centrifugi şi balanţe: - cilindrii gradaţi de diferite dimensiuni;
- în mod curent sunt utilizate centrifugi cu viteza de 3000 x g, preferabil cu rotor ori­ - plăci Petri;
zontal (pentru diminuarea cantităţii de aerosoli); în apropierea centrifugii se va plasa o ba­
- lame şi lamele pentru microscopie etc.
lanţă, pentru echilibrarea tuburilor;
14. Inventar de material plastic şi cauciuc:
- centrifugi cu viteze superioare, în laboratoare specializate (ex. mycobacteriologie);
- dispozitive adaptate la pipete pentru a elimina pipetarea cu gura;
- centrifugi cu viteze superioare şi sistem de răcire (ex. biologie moleculară);
- tuburi de centrifugă;
- balanţe tehnice (pentru medii de cultură, reactivi, soluţii în volume mari);
- containere pentru produsele patologice;
- balanţe farmaceutice (pentru soluţii de coloranţi, alte soluţii în volume mici);
- plăci Petri;
- balanţă analitică (pentru reactivi în cantităţi foarte mici);
- anse calibrate etc.
- balanţă electronică (pentru biologie moleculară).
15. Alte articole de laborator: trepiede, stelaje de lemn sau metal, coşuri de sârmă, site
6. Mojare, agitatoare, dispozitive de triturare a ţesuturilor. de azbest, becuri Bunsen, casolete, foarfeci, bisturie, pense, sonde, seringi, anse bacterio­
7. Aparate pentru distilarea şi demineralizarea apei. logice (cu buclă, anse-fir, din platină sau nichelină), tampoane diferite, tije cu tampon şi alte
8. Aparate pentru stabilirea pH-uiui. instrumente pentru recoltarea produselor patologice, termometre etc.
9. Fotometre sau colorimetre Fără a încerca să menţionăm toate dispozitivele, echipamentele, aparatele întâlnite într-un
laborator de microbiologie am considerat că această listare este utilă atât pentru medicul sau
10. Distribuitoare pentru medii de cultură.
biologul care lucrează în laborator cât şi pentru viitorul medic, indiferent de specialitate.
11. Aparate şi dispozitive pentru sterilizare şi dezinfecţie:
- incinerator (de regulă, în vederea incinerării se încheie un contract de prestări servicii
cu o firmă de profil);
- etuvă (pupinel, cuptor Pasteur);
- autoclav;
- filtre de diferite tipuri;
- lămpi cu UV etc.
12. Containere pentru materialul contaminat:
- găleţi de metal cu capac;
- saci din material plastic; i
- saci rezistenţi la temperaturile atinse în autoclav;
- borcane cu soluţii dezinfectante etc.
13. Inventar de sticlărie:
- eprubete de diferite dimensiuni (ex. 12/120 mm, 16/160 mm); /
- tuburi de Centrifugă;
- ţeava de sticlă pentru confecţionarea de pipete Pasteur;
-i
! I

( f
WIETODE DE DEZINFECŢIE Şl STERILIZARE Metode de dezinfecfie şi sterilizare utilizate în laboratorul de microbiologie 13
UTILIZATE ÎN LABORATORUL DE IVIICROBIOLOGIE
Sterilizarea prin căldură uscată
Sterilizarea prin căldură uscată are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea structurilor
bacteriene.
j l e f in iţ ii de bază 1. SteriIizareamrin-mcăizkaJaJncandescentă (..la roşu“) reprezintă introducerea şi men­
ţinerea în flacăra becului Bunsen până la înroşire, pe toată lungimea, a obiectului care urmează
Sterilizarea reprezintă distrugerea sau îndepărtarea tuturor microorganismelor patogene sau a fi sterilizat. Se poate aplica pentru ansa bacteriologică (cu buclă sau fir) sau pentru spatulă.
nepatogene, forme vegetative sau spori, de pe o suprafaţă sau dintr-un mediu (lichid sau solid). Flambarea reprezintă trecerea prin flacără (de câteva ori) a unui obiect, fără a se atinge
Septic înseamnă contaminat cu microbi patogeni sau infectat (de exemplu infecţia unei plăgi). temperatura de incandescenţă. Flambarea se aplică pentru portansă, gâtul unui recipient de
Aseptic înseamnă lipsit de microbi, indiferent dacă microbii sunt patogeni sau nepatogeni. sticlă (tub, eprubetă, flacon etc) sau pentru capilarul pipetelor Pasteur.
Asepsia reprezintă ansamblul de metode prin care evităm contaminarea mediului ij? 2 / Sterilizarea cu aer cald se realizează în etuvă (pupinel, cuptor Pasteur). Etuva este o
ambiant cu germeni microbieni sau prin care putem menţine “sterilitatea” ţesuturilor, medii­ cutie metalică cu pereţi dubli. Cu ajutorul unor rezistenţe electrice şi a unui termostat se
lor de cultură, medicamentelor injectabile etc. obţine şi menţine temperatura pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii în interiorul
aparatului este realizată cu ajutorul unui sistem de ventilaţie.
Dezinfectia reprezintă distrugerea formelor vegetative microbiene (uneori şi a sporilor)
din anumite medii (lichide, solide) sau de pe suprafeţe. Se realizează cu ajutorul unor agenţi Pentru majoritatea materialelor care urmează a fi sterilizate, temperatura din etuvă tre­
fizici sau cu ajutorul substanţelor dezinfectante. buie să atingă J80°C,_ pentru o durată de 1 oră. în-unele situaţii timpul de sterilizare poate
depăşi 60 de minute (ex. pentru ambalaje de dimensiuni mari).
Antisepsia reprezintă înlăturarea sau distrugerea formelor vegetative microbiene de pe
tegumente, mucoase sau din plăgi. Se realizează cu ajutorul substanţelor antiseptice. Sterilizarea cu aer cald este indicată pentru obiecte de sticlă, obiecte de porţelan, pulberi
inerte şi termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (pentru instrumentarul meta­
lic este de menţionat faptul câ repetarea sterilizării, în timp, conduce la decălirea oţelului) etc.
STERILIZAREA Nu se vor steriliza în etuvă soluţiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc, vată,
Toate materialele utilizate în laboratorul de microbiologie trebuie să fie sterile înainte de bumbac, fibră sintetică, alte materiale termolabile, materiale contaminate din laborator.
utilizare. Există o mare diversitate de materiale care trebuie sterilizate, astfel încât şi meto­ Incinerarea reprezintă arderea până la obţinerea de cenuşă. Există anumite reguli
dele de sterilizare sunt destul de variate, după cum urmează: stntfejîfivind incinerarea, pentru a preveni diferitele tipuri de poluare.
l t î. Metode de sterilizare prin căldură în cazul spitalelor, de multe ori sunt prevăzute incineratoare în structura unităţii sanitare
respective. De regulă, în vederea incinerării se încheie un contract de prestări servicii cu o
« căldura uscată;
firmă de profil. Din punctul de vedere al laboratorului de microbiologie ar putea fi supuse
• căldura umedă. incinerării materiale de unică folosinţă din plastic, reziduuri organice solide, gunoi, cada­
£%}Metode de sterilizare prin filtrare vrele animalelor de experienţă etc.
^ M e to d e de sterilizare utilizând radiaţiile
Sterilizarea prin căldură umedă.
Metode chimice de sterilizare.
Metodele de sterilizare care utilizează radiaţiile (cu excepţia radiaţiilor ultraviolete) şi Sterilizarea prin căldură umedă este cea mai eficientă metodă de sterilizare şi are ca
metodele chimice de sterilizare (ex. cu oxid de etilenă) sunt utilizate rareori în laboratorul mecanism coagularea proteinelor si degradarea enzimelor. ___
de microbiologie. /(jy ’Autoclavarea este esenţială atât pentru laboratoarele de microbiologie, cât şi pentru
Sterilizarea va fi întotdeauna precedată de pregătirea materialului care urmează să fie unităţile sanitare în general, indiferent de sistemul public sau privat. Vaporii de apă rea­
sterilizat: ' j lizează la 0,5 atmosfere o temperatură de 115°C, la 1 atmosferă o temperatură de 121°C şi
respectiv 134°G la 2 atmosfere.
e spălare, uscare, ambalare în cazul materialelor curate, necontaminate;
Autoclavul are ca piesă principală un cazan cu pereţi metalici, care se închide etanş cu un
• autoclavare, spălare, uscare, ambalare/în cazul materialelor contaminate refolosibile.
capac prevăzut cu un sistem special de închidere şi în interiorul căruia, vaporii de apă sunt
Există o serie de metode pentru a controla eficienţa sterilizării, prin indicatorii fizici (ex. ter­ comprimaţi la presiunea necesară în vederea sterilizării. Există mai multe tipuri de autoclave:
mometru), chimici (ex. floare de sulf, tiouree) sau biologici (ex. spori de Bacillus steamer- • autoclave cu perete simplu;
mopkilus). • verticale;
• orizontale;

1
14 Microbiologie Metode de dezinfecfie şi sterilizare utilizate în laboratorul de microbiologie 15

e autoclave cu manta de aburi; ^ jT in d a liz a rc a (sterilizarea l'racţionată) este o metodă de sterilizare prin căldură umedă
o verticale; care evită depăşi lea'll ne i temperaturi de 100°C. Substanţele de sterilizat se menţin la S£-
• orizontale. 100°C timp de 30-60 minutelfT jk n ă la 8 zile succesiv. Astfel, utilizând medii care permit
în continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu, verti­ germinarea, după prima încălzire timp de 30-60 minute sunt distruse, formele vegetative iar
cal, ia care vaporii provin din apa aflată în cazanul de presiune şi ajung în camera de sterilizare după răcire are loc germinarea sporilor. în ziua următoare sunt distruse prin încălzire formele
de jos în sus. Presiunea din interiorul cazanului este înregistrată de un manometru. Pentru pu­ vegetative rezultate din germinarea sporilor iar după răcire are loc germinarea sporilor care
nerea în funcţiune a autoclavului, în dotare există 2 robinete; unul superior (robinetul de aer şi nu au germinat în prima zi etc.
vapori, care permite legătura între cazan şi mediul exterior) şi unul inferior (robinetul care per­ Din punct de vedere tehnic pot fi utilizate autoclave la. care se va menţine permanent
mite evacuarea apei din cazan). Pentru a evita accidentele există o supapă de siguranţă care se deschis robinetul de vapori (şi astfei nu se va depăşi în interior temperatura, de 100°C), băi
deschide şi permite evacuarea vaporilor atunci când, accidental, presiunea vaporilor depăşeşte de apă sau băi de nisip.
limita de siguranţă. în momentul de faţă pentru evitarea riscului de a veni în contact cu vapori Prin tindaiizare se pot steriliza alimente, unele medii de cultură etc.
de apă fierbinţi aflaţi sub presiune, autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu permite
deschiderea capacului până când presiunea din interior nu o egalizează pe cea din. exterior. Pasteurizarea şi fierberea nu reprezintă metode de sterilizare, dar sunt utilizate în anu­
Cazanul de presiune este inclus într-un perete exterior solid care la partea inferioară are un mite situaţii. Pasteurizarea foloseşte căldura umedă şi are aplicaţii in conservarea pentru
scurtă durată a unor alimente (lapte, bere ele). Există o pasteurizate joasă (30 minute la 56-
spaţiu în, care se află sursa de căldură.
65°C), o pasteurizare medie f 15 miinite la 65-75IIC) şi ojxisteurizare întiltă (2-5 minute ia
în partea inferioară a cazanului de presiune se află un suport pe care se aşează o placă 85-90°C).'~Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile în formă vegetativă dar nu şi sporii.
de metal perforată. Pe suport se aşează materialele care trebuie sterilizate iar faptul că placa Fierberea poate fi utilizată atunci când nu dispunem de alte metode eficiente de sterilizare.
este perforată permite trecerea vaporilor de apă produşi după încălzirea apei. în vederea ste­ Fierberea timp de 30 minute distruge bacteriile în formă vegetativă, fungii şi virusurile, dar
rilizării se procedează astfel; nu şi sporii bacteriei». Timpul se înregistrează după ce apa a început să fiarbă. Eficienţa
» verificăm nivelul apei din partea inferioară a cazanului, care trebuie să fie până ia o acestei metode poate Fi crescută prin adăugarea de carbonat de sodiu 1-2%,
distanţă de 2-3 centimetri de suport; dacă nivelul a scăzut, se completează (recoman­
dabil se va utiliza apă distilată);
® aşezăm pe suport obiectele şi materialele de sterilizat, ambalate corespunzător Microorganismele pol fi reţinute mecanic şi electrostatic în porii unui filtru. Trecerea
* închidem etanş capacul, folosind sistemul special de etanşeizare cu care este dotat unui lichid pjrinlr-o substanţă prevăzută cu pori care va reţine microorganismele din lichidul
autoclavul pe care îl avem Ia dispoziţie; respectiv poartă numele de sterilizare prin filtrare.
e conectăm sursa de căldură; De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de filtre clasice (porţelan, sticlă poroasă.
* deschidem robinetul pentru evacuarea aerului şi vaporilor (dacă rămâne aer în cazanul .azbest impregnat cu caolin, pământ de infuzorO^ Actualmente se folosesc din ce în ce mai
cu presiune eficienţa sterilizării va scădea considerabil; vaporii de apă fiind mai uşori, frecvent, membrane filtrante din acerat de celuloză cu porozităţi între S şi 0,025 ret. în ve­
vor încălzi în special partea superioară a cazanului în timp ce aerul, care va atinge tem­ derea filtrării suni necesare o serie de piese precum: un recipient în care se introduce lichidul
peraturi inferioare, fiind mai greu, va rămâne în partea inferioară a cazanului); care urmează a fi filtrat, un recipient în care se va colecta lichidul sterilizat, o pâlnie care se
* închidem robinetul .după evacuarea aerului şi apariţia unui jet continuu de vapori; montează etanş între cele 2 recipiente, o pompă de vid care va aspira lichidul din primiţi în
» presiunea din cazan începe să crească şi .este urmărită cu ajutorul manometrului; atunci al doilea recipient, prin membrana filtrantă. Toate aceste piese sunt sterilizate prin auto­
când presiunea atinge, valoarea dorită (de ex. 1 atmosferă), reglăm sursa de căldura în aşa clavare înainte de începerea filtrării. *
iei încât această presiune să fie menţinută pentru toată durata sterilizării (de ex. 30 minute); Există şi. alte variante tehnice. Cu o importanţă practică particulară ar fi de menţionat fil­
® după trecerea celor 30 minute întrerupem sursa de căldură şi lăsăm autoclavul să se trele pentru sterilizarea aerului din cabinetele de siguranţă biologică (clasa 11 şi clasa 111),
răcească până când presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii atmosferice; ir .Filters}.
* deschidem lent robinetul de vapori; Sterilizarea prin filtrare este utilizată pentru decontaminarea aerului, it unor medii de cul­
» deschidem sistemul de etanşeizare şi capacul autoclavului; tură (care nu se pot steriliza prin autoclavare), â unor reactivi care sunt sensibili la tempe­
» lăsăm obiectele şi materialele să se răcească în autoclavul deschis; / raturile atinse în cazul sterilizării prin căldură etc.
« atunci când.temperatura ajunge iu circa 80°C putem scoate materialele sterilizate.,
Prin autoclavare putem steriliza diferite substanţe în soluţie, sticlărie (cu excepţia
pipetelor şi lamelor), materiale contaminate din laborator, instrumentar chirurgical (metalic, Radiaţiile neionizante (IJV) sau ionizante (X ele) au efecte bactericide prin ruperea legă-
de cauciuc sau bumbac), medii da cultură, aparate de filtrat etc. iunie: do hidrogen, oxidanta legăturilor duble ele.
* i AAetode de dezinfecfie şi sterilizare utilizate în laboratorul de microbiologii
1<5 __________ ___________________________• Microbiologie

NA*^*\AA^T»W ^ţ _ . Derivaţii fenolici: „


Radiaţiile UV sunt utile în sterilizarea suprafeţelor de lucru (pentru repartizarea mediilor ®datorită toxicităţii, potenţialului carcinogenetic şi corozivităţii, fenolii nu se folosesc
de cultură, alte manevre aseptice etc) în cazul în care nu există cabinete de siguranţă bio­ ca atare, ci sub forma derivaţilor fenolici;
logică cu flux laminar. Lămpile cu UV sunt numite lămpigermicider * soluţiile fenolice se prepară periodic (pentru cel mult 24 ore);
o ) Radiaţiile ionizante se pot utiliza în sterilizări industriale (pentru alimente, medicamente, ®concentraţia poate fi diferită în funcţie de scopul urmărit (de obicei este de 2-5%);
"seringi de unică întrebuinţare etc). • au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, fungiior, unor virusuri (ex.
HIV e inactivat de soluţia 0,5%);
« efectul este diminuat pe suprafeţele de cauciuc, lemn sau material plastic.
Antisepticele şi dezinfectantele sunt substanţe cu acţiune antimicrobiană nesclectivă, Glutaraldehida:
alterând structuri şi funcţii comune microorganismelor şi organismelor superioare.
• cel mai frecvent este utilizată concentraţia de 2%, la un pH alcalin;
Antisepticele pot fi utilizate pe tegumente şi mucoase, dezinfectantele pot fi utilizate numai
• are efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă (în cazul mycobacteriiior
pe suprafeţe şi structuri care nu sunt vii.
este necesar un timp mai lung de expunere), fungiior, virusurilor;
Clasificare în funcţie de mecanismul de acţiune. • datorită faptului că nu corodează metalele (aşa cum se întâmplă în cazul substanţelor
fa). Substanţe care denaturează proteinele (au în general .efect bacterici.d): acizii, bazele, prezentate mai sus) se poate folosi şi la dezinfectarea suprafeţelor metalice;
alcoolii (de exemplu alcoolul etilic de 70°, folosit pentru antiseptizarea tegumentelor). * nu poate fi folosită pentru suprafeţe, datorită vaporilor iritanţi şi timpului mare de
b) . Substanţe care oxidează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): expunere; ideală pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate ce pot fi imersate o
hipermanganatul de potasiu l%o, util în antiseptizarea mucoaselor, peroxidul de hidrogen, perioada mai mare de timp în containere menţinute închise.
soluţie 3 % în apă, utilizat în antiseptizarea plăgilor, halogenii (CI2, I2, Br2) şi derivaţii lor hcloforiţ— -
(hipocloriţi, cloramine, soluţii iodurate etc) în concentraţii corespunzătoare etc.
• sunt substanţe care complexează iodul pe care îl eliberează în soluţii apoase;
c) . Substanţe care blochează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH):
* au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, unor spori bacterieni,
metale grele sărurile de mercur, preparatele organomercuriale (exemplu merthiolat de
fungiior, unor virusuri (ex. virusuri cu înveliş lîpidic);
sodiu), sărurile de argint, compuşi de argint coloidal (exemplu colargol, protargol) cu efecte
bactericide, grupările alchil ale formaldehidei, glutaraldehidei, oxidului de etilen etc. * sunt inactivaţi de substanţe organice (în special proteice), mase plastice, detergenţi;

r d)..Substanţe care lezează membranele celulare: ex. fenolii; acidul fenic are utilizări lim­ ®pot fi utilizaţi pentru dezinfecţia suprafeţelor, dezinfecţia pipetelor contaminate.
itate datorită proprietăţilor caustice şi toxicităţii sale; este etalonul faţă de care se măsoară Sterilizarea cu etilenoxid (CH2 CH2 O):
activitatea antimicrobiană a antisepticelor şi dezinfectantelor (indicele fenolic), crezolii, • exercită activităţi bactericide prin aîkilarea acizilor nucleici şi prin înlocuirea hidro­
hexaclorofenul, clorhexidina (cu efecte toxice mai reduse) etc, detergenţii anionici (săpunuri, genului labil printr-o grupare hidroxietil (-CH2CH 2OH);
perlan etc), cationici (săruri cuaternare de amoniu, de exemplu brotnocet), amfolitici (de
» sporii de Bacillus xiibtilis nu sunt distruşi;
exemplu acidul dodecilaminoacetic), neionici (de exemplu propilenglicolul).
* acest tip de sterilizare se utilizează pentru materiale care nu rezistă atunci când sunt
e). Substanţe care alterează acizii nucleici:.coloranţii bazici (violet de genţiană, albastru
de metilen, fucsină bazică etc), derivaţii de acridină, de exemplu rivanolul. supuse acţiunii temperaturii sau radiaţiilor (ex. materiale din cauciuc, plastic, echipa­
ment electronic etc);
în continuare vom prezenta pe scurt câteva dintre substanţele dezinfectante, ţinând cont
de faptul că nu există nici un dezinfectant ideal. Există numeroase substanţe şi numeroşi * etiienoxidul poate exploda; variantele pentru evitarea exploziei includ; 1. utilizarea
producători de antiseptice şi dezinfectante. etilenoxidului în camere speciale care permit menţinerea unei presiuni negative 2. com­
Hipoclorijii: . binarea cu CO 2 în camere de oţel speciale 3. combinarea cu hidrocarburi fluorinate;
• soluţiile de hipoclorit se prepară periodic (se inactivează după mai mult de 24 ore); ; » indiferent de Varianta folosită trebuie respectate toate recomandările producătorului;
®concentraţia în clor activ este diferită în funcţie de scopul urmărit (ex. 2.500 ppm plor « există o serie de inconveniente în ceea ce priveşte acest tip de sterilizare (efecte car-
activ pentru dezinfectarea pipetelor contaminate); < cinogenetice, efecte ia nivelul sistemului nervos etc);
®au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, sporilor bacterifeni, » sterilizarea este în principiu influenţată de; concentraţia etiienoxidului, temperatură,
fungilor ( l 60 ppm în o oră), virusurilor (200 ppm Î11 10 minute); umiditatea relativă şi timpul de expunere (spre ex. o dublare a concentraţiei va reduce
o efectul este diminuat considerabil în prezenţa substanţelor organice (în special pro­ la jumătate timpul necesar pentru sterilizare).
teine), maselor plastice, detergenţilor.
5 Schema generală a diagnosticului de laborator microbiologic 19

SCHEMA GENERALĂ A
DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR MICROBIOLOGIC la microscopul optic a i imersie, si se notează prezenţa diferitelor celule (eventual mo­
dificate faţă de normal), prezenţa celulelor inflamatorii (dovada reacţiei organismului faţă
de infecţie, ex. ieucocite polimorfonucleare neutrofile), precum şi eventuala prezenţă a
microbilor, care va fi interpretată cu precauţie, în contextul dat.
Atunci când produsul recoltat este reprezentat de sânge, urină sau materii fecale, de
Diagnosticul de laborator în microbiologic poate fi un diagnostic bacteriologic sau mico- regulă nu se realizează frotiuri fixate şi colorate. Spre exemplu, în cazul materiilor fecale,
logic (direct), un diagnostic imunologic (indirect) sau o combinaţie a celor două variante se va face o coprocitogramă, un preparat proaspăt între lamă şi lamelă, căutându-se în spe­
cial prezenţa leucoeitelor (dar şi a unor structuri care pot da anumite informaţii cu privire la
menţionate.
funcţionalitatea tractului digestiv). în cazul suspicionării unei infecţii urinare—se. va obţine
în continuare vor fi prezentate succint principalele etape ale diagnosticului microbio­
un sediment tirmarid u p ă centrifugarea urinei), care se va examina între lamă şi lamelă în
logic, pe o schemă care va fi urmată pe parcursul următoarelor capitole. Fiecare dintre etape
vederea aprecierii prezenţei şi eventual a numărului de Ieucocite prezente pe câmp, precum
va fi tratată din punct de vedere practic, constituind un îndrumar al activităţii din cursul
şi a altor celule normale sau patologice, date care pot fi deosebit de utile în vederea unui
lucrărilor practice dar şi un suport pentru reţinerea acestor noţiuni din punct de vedere teo­ diagnostic corespunzător.
retic.
în cazul suspiciunii unei infecţii micotice sunt utile atât preparatele proaspete (de ex.
Astfel, începând cu normele privind prelevarea şi transportul probelor, continuând cu
preparatul umed montat în soluţie de KOH-glicerol 10-20%), frotiurile cu coloraţii negative
prepararea frotiurilor şi coloraţiilor, tehnica examenului microscopic, prezentarea princi­ (tuş de India, nigrozinâ) precum şi frotiurile colorate May-Griinwald-Gieinsa sau Qjam.
palelor medii dc cultură şi a tehnicilor de cultivare, după prezentarea metodelor de identifi­
care, partea „generală" se va încheia cu testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice. ,5 ^Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se va face în funcţie de situaţie
(mediile şi condiţiile de incubare se vor alege în funcţie de presupusul microorganism pe
în partea de „imunologie", după o discuţie succintă a noţiunilor de antigen, anticorp şi a
care dorim să-l izolăm). Cultivarea se va realiza în aşa fel încât să se poată obţine colonii
reacţiilor antigen-anticorp, vor fi prezentate succesiv reacţiile de precipitare, aglutinare, de
izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica.
fixare a complementului, seroneutralizarea, reacţiile în care reaclanţii sunt marcaţi precum şi
utilizarea unor metode moderne în testarea imunităţii. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere:
Capitolul 22 va fi dedicat preparatelor biologice pentru uz uman.
/ tţTfcaractere morfologice (se va face un frotiu din colonia izolată, frotiu care se va colo­
ra oram sau Ziehl-Neelsen, după caz, şi se va examina microscopic. în această situaţie se
A. Diagnosticul de laborator bacteriologic/micologic^
vor evidenţia numai microorganisme care au formă şi tinctorialitate similară);
Diagnosticul de laborator bacteriologic/micologic are mai multe etape, şi anume: |^b ) caractere de cultură (se-xpr examina coloniile izolate apărute pe mediilgjje cultură
/ f rŢ)Recoltarea şi transportul produsului patologic (se va face cât mat aproape de debutul bolii, solide-şTcare pot tTderiip S’jientru majoritatea bacteriilor studiate, defiip R .în cazul
înainte ca pacientului să i 7e fi administrat antibiotice sau chimioterapice, cât mai rapid şi corect Cormebpcterium dinhteriaţ~Mvcobaclerium tuberculosis şi Bacillus a n th n ich rf pespectiv
din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie, de: tip M în cazul bacteriilor capsulate, de exemplu Klebsiella pneumoniae sau alte caractere
prelevând un anumit produs patologic în funcţie de manifestarea clinică în cazul respectiv, de în cmuI fungilor);
exemplu urină în cazul unei infecţii urinare, materii fecale în cazul unei boli diareice, lichid fc)Caractere biochimice, care pot fi foarte variate de la o specie de microbi la alta şi care
cefato-rahidian în cazul suspiciunii unei meningite, scuame în cazul unei micoze cutanate pot fi foarte utile spre exemplu în cazul diferenţierii enterobacteriilor (mediile multitest),
supgrficiale ele). fungilor (auxanograma) etc;
• 2a) Examinarea macroscopică a produsului patologic poate fi uneori foarte utilă (ex. ' ( dfearactere antigenice «jre vor fi examinate bazându-ne pe structura microorganismelor
puroiul colorat albastru sau albastru verzui este sugestiv pentru o infecţie cu Pseudomonas şi pe specificitatea reacţiilor antigen-anticorp, utilizând anticorpi cunoscuţi pentru a iden­
aeruginosa etc). tifica antigenele microbiene necunoscute; spre exemplu, prin reacţii de aglutinare pe lamă
2b. Examinarea microscopică a produsului patologic reprezintă de multe ori o etapă se vor identifica antigenele genului Shigella, Vibrio etc; există anticorpi specifici polivalenţi
esenţială şi poate orienta paşii următori. Se vor realiza minim două frotiuri din produsul sau monovalenţi care vor fi utilizaţi de la caz la caz;
patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de meailga- ,'''7e)'«aractere de patogenitate. atunci când se vor examina spre exemplu capacitatea unui
(AM) si respectiv Gram. Este de preferat să avem întotdeauna cel puţin încă un frotiu de re­ microorganism de a elabora anumite substanţe cu rol în patogenitate (exemplu coagulaza
zervă, mai ales în cazul în care produsul patologic este „preţios" (LCR, produs recoltat prin produsă de S. aureus) sau infecţia experimentală la animalul de laborator (de exemplu, izo­
puncţie-biopsie etc). în cazul suspicionării unei jnfectii mvcohactetiene^este necesară larea pneumococilor de Ia un pacient cu pneumonie după inocularea sputei la şoarecele alb;
realizarea unui frotiu suplimentar, care se va colora Ziehl-Neelsen. Frotiurile se examinează
( i (

20 Diagnosticul de laborator în microbiologie


♦5 Schema generală a diagnosticului de laborator microbiologic 21

în cazul în care în sputâ există pneumococi, animalul va muri în 24-48 de ore, iar din sân­
gele lui se va izola o „cultură pură'1de pneumococi); Iniţial vor fi studiate din punct de vedere practic noţiunile de bază (microbiologie gene­
f) lizotipiş. (sensibilitatea la un anumit bacteriofag specific); rală şi imunologie) pentru ca în ultima parte să trecem la studierea diagnosticului ca atare, în
cursul microbiologici speciale, urmărind maladiile produse de principalele microorganisme.
g) caracterc-genetice care vor fi „examinate" prin tehnici de biologie moleculară;
Considerăm că pentru orice medic, indiferent de specialitatea aleasă, multe dintre prin­
hî alte caractere utile în identificarea microorganismelor (bacterii, fungi).
cipiile de bază ale microbiologici sunt foarte utile, merită a fi înţelese şi aplicate corespun­
,f S.^Antibiograma şi -respectiv antifungigrama (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi zător. Pentru cei care se dedică microbiologici, aceste noţiuni reprezintă o bază care poate
chimioterapice anti-bacteriene sau antî-fungice, îfr vederea stabilirii tratamentului) se va fi completată utilizând diferitele tratate medicale în domeniu dar şi experienţa personală
realiza de obicei prin metode difuzimetrice, dar în cazul unor infecţii grave trebuie să fie dezvoltată atât din punct de vedere teoretic cât şi practic.
însoţită de alte determinări. Spre exemplu pot fi necesare în cazul infecţiilor bacteriene
determinarea concentraţiilor minime inhibitorii (CMI).şi respectiv bactericide (CMB). în
anumite situaţii poate deveni necesară determinarea nivelului de eficienţă pentru antibioti­
cul utilizat, respectiv nivelul de eficienţă inhibitorie (NEI) şi nivelul de eficienţă bactericidă
(NEB). Există şi metode moderne pentru determinarea sensibilităţii la antibiotice, (ex. E test,
metode care utilizează tehnici de biologie moleculară etc).

d ia g n o s tic u l de laborator imunologic (serologic şi/sau Imunobiologic)


' B.l. în cadrul diagnosticului de laborator serologic se va determina prezenţa (sau se va
doveăi absenţa) anticorpilor necunoscuţi, în serul pacientului respectiv, utilizând antigene
cunoscute. în diagnosticul serologic ne bazăm pe specificitatea reacţiilor antigen-anticorp şi
utilizând diferite tehnici trebuie să putem răspunde la minim trei întrebări esenţiale, şi anume:
- există anticorpi în serul pacientului investigat?
r care este titrul anticorpilor?
- cuin evoluează în dinamică (în timp) acest titru, motiv pentru care se vor realiza minim
două determinări diferite la un interval de 7-10 zile (pentru majoritatea infecţiilor care pot fi
diagnosticate astfel); această analiză ne va permite să diferenţiem situaţia unei afecţiuni acute
(titrul anticorpilor este mai crescut la a doua determinare, în mod clasic de 4 ori), de situaţia
în care pacientul este deja în convalescenţă (titrul anticorpilor la a doua determinare va fi mai
scăzut) sau de situaţia unui pacient cu o afecţiune cronică (titrul anticorpilor va fi asemănă­
tor sau foarte apropiat la cele două determinări succesive). în vederea identificării unei
infecţii acute, o altă variantă de lucra ar fi determinarea anticorpilor specifici de tip IgM.
B.2. în cadrul diagnosticului de laborator imunobiologic se va studia de exemplu reac-
tiVîîatgâ pacientului faţă de un anumit antigen inoculat. Intradermoreacţia la tuberculină
(PPD, derivat proteic purificat) sau la candidată, reprezintă exemple clasice în acest sens.
Tehnica intradcrmoreacţiei este folosită în mai multe scopuri şi trebuie să avem în vedere că
în funcţie de scopul urmărit şi respectiv în funcţie de antigenul inoculat (şi de mecanismul
implicat), modul de citire al rezultatelor va fi diferit,
* i
i]C ■ $
• • !
Aşa cum am menţionat mai sus, această „schemă" de diagnostic este utilă şi este bine să
fie reţinută şi aplicată pentru fiecare infecţie în parte. Fiecare dintre capitolele care urmează
îşi găsesc locul într-un anume punct al schemei generale.
I

Norme privind prelevarea şi transportul produselor patologice 23


NORME PRIVIND PRELEVAREA Şl TRANSPORTUL
PRODUSELOR PATOLOGICE • oprirea, dacă este posibil, tratamentului pentru 24 - 48 ore, cu recoltarea p.p. şi
ÎN DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC DIRECT începerea diagnosticului microbiologic;
• recoltarea p.p. imediat înainte de următoarea doză de antibiotic;
• încercarea de „antagonizare" a efectului antibioticului, în mediul de cultură (ex. cu
în schema generală a diagnosticului microbiologic direct, fie că diagnosticul se adre­ sulfat de magneziu în cazul în care s-au administrat tetracicline); v
sează unei infecţii bacteriene, fie uneia fungice, recoltarea (prelevarea) şi transportul pro­ • diluarea inoculului (mai ales dacă pacientul a primit un tratament bacteriostatic) în
dusului patologic reprezintă o etapă esenţială. De altfel această afirmaţie este perfect vala­ mediul de cultură fără antibiotic;
bilă şi în diagnosticul virusologie sau parazitologic. Utilizăm termenul de „produs patolo- şi • notificarea în formularul în care se solicită analiza de laborator şi care însoţeşte p.p.
_giU‘ în relativ exces, adică de regulă recoltăm un anumit produs care este potenţial patolo-*; precum şi în buletinul de analiză, a tuturor datelor privitoare la tratamentul primit
gic; faptul că este patologic îl vom dovedi (sau infirma). în cursul diagnosticului de labora%.|: de către pacientul investigat.
tor. Pentru a simplifica modul de exprimare, vom accepta utilizarea acestor termeni ca ataie„r. ®recoltarea şi transportul p.p, trebuie să se realizeze cât mai aproape de debutul bolii,
Prelevarea şi transportul produsului patologic (p.p.) efectuate corespunzător va permită:® dar trebuie ales momentul cel mai potrivit (optim), respectiv momentul în care este cea
realizarea etapelor următoare de diagnostic, culminând cu stabilirea sensibilităţii la antibio-?; mai mare probabilitate ca agentul etiologic să se găsească în produs
tice şi chimioterapice a microorganismului implicat patogenic în infecţia dovedită la miji • în funcţie de evoluţia bolii (de ex. coprocultura în febra tifoidă se va efectua „după"
pacient anume („nu există boli, ci bolnavi"). j* ; prima săptămână de evoluţie);
• *!%•••• o în funcţie de specificul fiziopatplogic al bolii respective (de ex. se recomanda efec-
Reguli privind recoltarea produselor patologice tuarea hemoculturii în „accesul febril").
•o • produsul patologic din câre estimăm că vom putea izola agentul eliologic al bolii sus-
Se cunosc o serie de reguli care trebuie respectate cu stricteţe în cursul acestei etape: picionate va fi ales în funcţie de maladie şi va putea fi reprezentat spre exemplu de
• este recomandabil ca recoltarea şi stabilirea modalităţii de transport a p.p. să fie făcută ®o secreţie de ia nivelul presupusei porţi de intrare (ex. secreţie nazală sau faringiană
de medic sau sub îndrumarea unui medic de specialitate; '> v în difterie, secreţie genitală în cazul unei boii veneriene etc);
* prelevarea p.p. trebuie să aibă ioc înainte ca pacientul să fi primit antibiotice sau chi-^şv: » un produs de la nivelul căilor de răspândire în organism (ex. sânge, ţesut recoltat
mioterapice; JjML prin biopsie de la nivelul ganglionilor limfatici);
0 acest deziderat este îndeplit din ce în ce mai rar ceea ce crează multe probleme în ® ui) produs de la nivelul căilor de eliminare din organism (ex. urină Î11 infecţiile
diagnosticul microbiologic „contribuind" şi la selectarea microorganismelor reziş®®^ tractului urinar, materii fecale într-o boală diareică acută ele);
tente la medicamentele antimicrobiene; » un produs de Ia nivelul focarului infecţios (cx. lichid cefalo-rahidian/LCR în
• eforturile privind îndeplinirea lui trebuie să aparţină atât pacientului cât şi medi-, V meningită, spută în pneumonie etc);
cilor implicaţi (medic de familie, medic de altă specialitate); • în vederea alegerii produsului care urmează a fi recoltat este necesară cunoaşterea
patogeniei, evoluţiei şi elementelor clinice legate de bolile infecţioase, ceea ce este
®chiar dacă boala este gravă iar tratamentul antibiotic „pare" urgent, trebuie reţinut că;'.-
esenţial în căzui practicării cu adevărat a microbiologici clinice.
pentru recoltarea p.p. care poate duce la un diagnostic care ar putea salva viaţa pacien- s
tulul sunt necesare numai câteva minute; după recoltarea p.p. se poate administra,'*)' ®periodicitatea cu care se realizează recoltarea de .p.p. poate influenţa rezultatul în anu­
prima doză de antibiotic sau chimioterapie, ales „empiric", pe criterii de probabilitate;, | | mite cazuri, spre exemplu
• în cazul în care evoluţia sub tratament antibiotic este nefavorabilă, diagnosticul ” ’ • în suspicîonarea unui sepsis (denumirea acceptată actual pentru septicemie); se
microbiologic va permite (între timp) izolarea agentului etiologic şi stabilirea sen- J r recomandă recoltarea a 2-3 probe de sânge în 24 ore, pentru hemocultură;
sibilităţii Ia antibiotice şi chimioterapice astfel încât „schimbarea" tratamentului se • în suspicîonarea unei boli diareice acute se recomandă recoltarea a câte unei probe
va putea face în mod riguros, ştiinţific;. de materii fecale, trei zile consecutiv, pentru coprocultură;
• în suspicîonarea unei tuberculoze pulmonare se recomandă recoltarea a câte unei
« alternativele sunt reprezentate de „schimbarea" tratamentului în mod mai puţin *:■
probe de spută, trei zile consecutiv etc.
raţional sau chiar iraţional, cu posibile urinări nefaste pentru pacient sau apelarea (5
la „cocteil-ul" (asocieri) de antibiotice cu riscurile de rigoare. ş!;'. • ceea ce a fost prelevat şi transmis pentru examinare trebuie să reprezinte cu adevărat p.p.
(acei produs care conţine cu mare probabi 1iltate microorganismul infectant), spre exemplu
■în cazul în care (dintr-un motiv sau altul) tratamentul cu antibiotice a fost început
înainte de prezentarea la spital/laborator, în funcţie de boala suspectată se pot reco- • în cazul în care este suspicionat diagnosticul de meningită şi a fost recoltat LCR, în
manda următoarele abordări: cazul în care meningita este de etiologie bacteriană sau fungică, microorganismul
implicat patogenic va putea fi identificat Î11cursul diagnosticului microbiologic;
( (
Norme privind prelevarea şi transportul produselor patologice 25
24 Diagnosticul de laborator în microbiologie

• recipientele pentru recoltare şi transport trebuie să fie marcate corespunzător în aşa fel
• în schimb, dacă în cazul în care este suspicionată tuberculoza pulmonară se vor încât să nu fie posibilă apariţia unor confuzii; ceea ce se notează pe recipient trebuie
trimite spre examinare salivă sau secreţii de la nivelul arborelului respirator supe­ să corespundă cu ceea ce a fost notat pe formularul de solicitare a respectivei analize;
rior în ioc de spută, diagnosticul microbiologic este imposibil etc.
• datele de identificare şi alte date semnificatice vor fi trecute în următoarele documente
• din p.p. se vor preleva şi utiliza în cursul diagnosticului microbiologic porţiunile cele
• registrul unităţii sanitare/secţiei/clinicii care solicită analiza respectivă (în cazul în
mai reprezentative, respectiv acele porţiuni în care sunt cele mai mari şanse de identi-
care recoltarea produsului patologic se face în afara laboratorului);
ficare/vizualizare prin microscopie/cultivare şi izolare a microorganismului infectant,
, * formularul prin care se solicită analiza microbiologică;
spre exemplu în cazul recoltării de materii fecale (suspiciune de boală diareică acută)
se vor selecta porţiunile muco-purulente (eventual muco-sanguinolente) • registrul de lucru al laboratorului;
• formularul prin care se anunţă rezultatul analizei (buletinul de analiză);
o este necesar să se recolteze o cantitate de p.p. suficientă pentru efectuarea diagnosti­
• pentru simplificare, un singur formular poate include atât partea corespunzătoarea
cului microbiologic (preparate proaspete, frotiuri, cultivări pe medii de cultură, ino­
solicitării analizei cât şi buletinul de analiză microbiologică;
culări la animale de experienţă, reluarea unor manevre în cazul că este necesar
• o altă modalitate de simplificare ar putea fi reprezentată de înregistrarea „electro­
• recoltarea şi transportul p.p. trebuie să se realizeze în condiţii stricte de asepsie, pen­ nică" a datelor şi utilizarea metodelor moderne de transmitere a lor; există doar
tru prevenirea contaminării celui care recoltează, pentru prevenirea supra-infectării câteva unităţi sanitare în România unde sunt utilizate aceste metode;
pacientului şi pentru prevenirea contaminării p.p. o pentru reducerea cantităţii de date şi respectiv asigurarea confidenţialităţii, se recurge
• se vor respecta precauţiunile universale privind prevenirea contaminării în unităţile la „număml unic de identificare", un grup de cifre şi litere care permit codificarea şi
sanitare; asocierea a câte unui astfel de număr fiecărui pacient în parte;
• se va evita, pe cât posibil, contaminarea p.p. cu microorganisme care aparţin florei • cu toate că înregistrarea datelor pare pentru majoritatea celor implicaţi în actul
rnicrobiene normale (spre ex. prin tehnica de recoltare/vezi recoltarea urinei sau medical o „simplă" şi inutilă birocraţie, această modalitate de apreciere este com­
prin manevre invazive care şuntează căile naturale prin care sunt eliminate plet eronată; înregistrarea datelor şi fluxul informaţiilor în sistemul sanitar sunt
microorganismele/vezi recoltarea sputei prin lavaj bronhoalveolar); extrem de importante şi este necesar să fie depuse toate eforturile în vederea efec­
• se vor utiliza instrumente sterile şi recipiente (containere/recoitoare) sterile. tuării lor în mod corespunzător (din păcate orele de studiu dedicate acestor aspecte
sunt mult prea reduse atât pe parcursul studenţiei cât şi în cursul rezidenţiatului).
Regulile prezentate mai sus reprezintă elemente fundamentale în vederea obţinerii unui
• elemente importante care trebuie notificate atunci când se solicită o analiză de labora­
diagnostic corect şi, după opinia noastră, trebuie cunoscute de orice persoană implicată în
actul medical, inclusiv de studenţii la medicină, chiar dacă nu vor alege pentru viitor pre­ tor microbiologică
gătirea în domeniul medicinei de laborator sau în domeniul bolilor infecţioase. • pentru identificarea produsului patologic care urmează a fi prelucrat se vor nota
numele, prenumele, vârsta pacientului (sau „numărul unic de identificare"), data şi
înainte de a încheia această parte a capitolului privind normele privind recoltarea şi
locul recoltării (unitate sanitară, clinica, secţia, salonul);
transportul p.p. în diagnosticul microbiologic direct dorim să subliniem câteva aspecte care
®pentru facilitarea alegerii celei mai potrivite modalităţi pentru prelucrarea p.p. se
nu trebuie să fie neglijate, după cum urmează:
vor nota diagnosticul prezumtiv, natura p.p., examenul solicitat, data debutului
e instrumentele pentru recoltare trebuie să fie nu numai sterile dar şi adecvate, de ex. bolii, ce medicaţie antimicrobiană a fost administrată respectivului pacient (anti­
. foarte frecvent este utilizat tamponul de vată, însă recoltarea cu tampon ar trebui să fie biotic sau asociere de antibiotice, data începerii administrării, doze, durată);
recomandată doar recoltării şi transportului p.p. = secreţie de la suprafaţa mucoaselor ®în acelaşi sens se vor nota data şi ora recoltării, data şi ora recepţionării în labora­
şi tegumentelor cu leziuni tor, cine şi cum a făcut recoltarea, cum a fost asigurat transportul p.p.;
® vata poate conţine substanţe inhibitoare pentru microorganisme; • subliniem faptul că, cel mai adesea venim în contact cu formulare incomplete/comple-
• cantitatea de p.p. recoltabil este mică; tate indescifrabil/completate cu erori şi chiar dacă ar putea părea incredibil, formulări
• microorganismele şi leucocitele „rămân" în proporţie mare pe vată şi nu pot fi uşor de genul „nume X, prenume Y, probă Z, rugăm toată bateria de analize" sunt încă mult
transferate pe frotiu, mediu de cultură; pred frecvente şi ar trebui ca de fiecare dată să conducă la o discuţie fermă cu „expe­
® pentru anumite microorganisme (ex. Bordetella pertussis) utilizarea tamponului cu ditorul" până când asemenea comportamente vor fi eliminate, în beneficiul pacienţilor.
vată este total contraindicată;
Motive pentru care un p.p. ar putea ti respins de la analiza microbiologică
• recipientele pentru recoltare şi transport trebuie să fie întâi curăţate (dar prin clătire să
fie eliminate orice substanţe chimice cu posibil efect antimicrobian) şi apoi sterilizate, Respingerea p.p. ar trebui să reprezinte o excepţie în activitatea unui laborator de anali­
preferabil prin autoclavare; închiderea recipientelor trebuie să fie perfectă, pentru a ze medicale, dar există anumite motive care pot conduce la această decizie. înainte de a
preveni orice contaminare pe parcursul transportului;
Diagnosticul de laborator în microbiologie Norme privind prelevarea şi transportul produselor patologice 27
26

prezenta câteva exemple în acest sens dorim să subliniem faptul că activitatea medicală se « este necesară menţinerea condiţiei iniţiale a produsului patologic (conţinut microbian,
desfăşoară într-un sistem în care există mai multe verigi care trebuie să funcţioneze perfect citologie etc) pentru a putea înregistra o „imagine" cât mai apropiată de ceea existen­
(fiecare în parte) iar între verigile sistemului ar trebui să existe o perfectă colaborare. tă la nivelul procesului infecţios
în vederea stabilirii diagnosticului şi tratamentului corespunzător în cazul unui pacient • diferitele microorganisme au diferite temperaturi optime pentru supravieţuire;
care prezintă o anumită boală transmisibilă (infecţioasâ) nu există o subordonare ci o core­ • celelalte condiţii necesare supravieţuirii microorganismelor diferă în funcţie de
lare a activităţilor. Atât laboratorul cât şi clinica au de îndeplinit funcţii foarte importante, fiecare grup de microorganisme în parte (pH, deshidratare, radiaţii >UV sau radiaţii
uneori decisive pentru viaţa pacientului. solare în general, prezenţa oxigenului, prezenţa substanţelor antimicrobiene,
Pentru ca în situaţiile „limită1*funcţionarea să fie perfectă este necesar un continuu antre­ fenomene de autoliză etc);
nament atât din punct de vedere teoretic şi tehnic dar şi în ceea ce priveşte colaborarea din­ o microorganismele din flora asociată se pot miiltiplica în cursul transportului (de
tre parteneri. Respingerea unui p.p. şi solicitarea de către laborator a recoltării unui nou p.p. regulă mai lesne decât microorganisţhele patogene);
de calitate, care să permită stabilirea diagnosticului microbiologic, trebuie înţelese ca un • utilizarea mediilor de transport modifică aspectul citologie al p.p.;
gest normal atunci când anumite reguli de recoltare şi transport sunt neglijate.
®este necesară prevenirea contaminării p.p. precum şi prevenirea contaminării mediului
în anumite situaţii, chiar dacă sunt sesizate diferite disfuncţionalităţi în ceea ce priveşte
extern sau a personalului care asigura recoltarea, transportul şi ulterior prelucrarea p.p.;
modul în care p.p. a fost recoltat şi transportat către laborator, problemele pot fi rezolvate
prin telefon sau o discuţie directă, spre exemplu în vederea identificării unui p.p, care a fost ®în anumite situaţii (rezistenţa microorganismului în mediul exterior este deosebit de
recepţionat fără datele de identificare. însă, în cazul în care această discuţie nu poate con­ redusă) se va recomanda recoltarea şi prelucrarea p.p. „la patul bolnavului" sau, dacă este
duce la stabilirea identităţii p.p., respectiva probă nu trebuie prelucrată în laborator. posibil, pacientul va fi invitat în laborator pentru recoltare;
în cazul în care p.p. a fost identificat dar este necorespunzător din punct de vedere cali­ • pentru foarte multe dintre p.p. se poate accepta un timp de transport de 1-2 ore
tativ, prelucrarea acestuia ar trebui temporizată (p.p. menţinut la +4°C) până în momentul (repetăm propoziţia de mai sus: p.p. trebuie să ajungă în laborator în cel mai scurt timp
în care se ia legătura cu medicul care a solicitat analiza şi se analizează dacă recoltarea ar posibil);
putea fi repetată şi urmată de trimiterea unui p.p. corespunzător. în cazul în care o nouă ®în cazul în care timpul de transport al p.p. nu poate respecta ceea ce este indicat se
recoltare este posibilă primul p.p. se îndepărtează şi se va prelucra al doilea. în cazul în care poate recurge la „conservarea" acestuia după cum urmează
nu este/posibiiă o nouă recoltare şi se estimează că prelucrarea p.p. chiar necorespunzălor • menţinerea la temperatură scăzută (container izoterm cu gheaţă la 0°C sau frigider
poate aduce vreun beneficiu pacientului examinat, se încearcă obţinerea datelor care pot fi la +4°C); de menţionat că Neisseria meningitidis, Neisseria gonorhoeae,
obţinute (cu rezervele de rigoare care vor fi menţionate în buletinul de analiză). Haemophilus influenzae etc nu rezistă la aceste temperaturi;
Iată câteva motive de respingere a unui produs patologic: • utilizarea unui mediu de transport (Cary Blair, Stuart etc./vezi capitolul 9)
• spută recoltată pe parcursul a 24 de ore; • adăugarea de penicilină, streptomicină şi cloramfenicol atunci când se urmăreşte
o „spută11care de fapt conţine salivă şi secreţii din tractul respirator superior; izolarea unui fung (agenţii etiologici ai micozelor cutanate superficiale pol rezista
• urină recoltată cu mai mult de 60 de minute în urmă (care nu a fost menţinută la +4°C); împachetate în hârtie sterilă şi introduse într-o cutie Petri până la 48 de ore fără să
necesite adăugarea de antibiotice);
o exsudat faringian, exsudat nazal, spută, urină, materii fecale etc pentru care se solicită
izolarea şi identificarea germenilor anâerobi; • aspirarea p.p. lichid în seringă, cu eliminarea rapidă a bulelor de aer şi „închiderea"
• produse patologice pentru care este evidentă contaminarea (de ex. datorită unui reci­ seringii cu ajutorul unui dop de cauciuc steril în care introducem imediat acul
(atenţie la manevrarea acului de seringă în condiţiile recoltării unui produs pato­
pient de colectare necorespuzător) etc.
logic uman/risc de înţepare şi transmiterea altor infecţii ex. HIV) atunci când
urmărim izolarea unei bacterii anaerobe care ar putea supravieţui în acest caz circa
Transportul produselor patologice
30 de minute etc;
în ceea ce priveşte transportul produselor patologice este semnificativă propoziţia urmă­ ® transportul către laborator se va realiza
toare: produsele patologice trebuie să ajungă în laborator în cel mai scurt tim p posibil, Faţă
• numai de către un curier instruit în acest scop;
de această recomandare cu caracter general, ar fi de discutat o serie de aspecte concrete.
• în recipiente etanşe pe care se va lipi pietograma pentru „risc microbiologic";
Transportul cât mai raptd/sau prelucrarea imediată a unui p.p. recoltat chiar Ia nivelul
laboratorului sunt recomandate ferm datorită următoarelor considerente; • iar în cazul în care p.p. trebuie expediat prin poştă se vor respecta normativele
legale în vigoare precum şi recomandările speciale recunoscute la nivel inter­
naţional dintre care cele mai utilizate sunt elaborate de World Health Organization

j
I (
t, f
28 ___________ Diagnosticul de laborator în microbiologie
Norme privind prelevarea şi transportul produselor patologice 29

(WHO), Center for Diseases Control and Prevention (CDC) sau National
3. Sputa
Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) cu menţiunea că primele 2
pot fi obţinute în mod gratuit. • în diagnosticul microbiologic al infecţiilor acute ale căilor respiratorii inferioare
(1ACRI) se pot examina
Exemple de recoltare şi transport pentru câteva produse patologice ® prelevate care se pot contamina în cursul recoltării cu flora bacteriană normală:
spută, tampon nazal/faringian, aspirat nazal/faringian, aspirat hipofaririgian, produs
1. Exsudate otice sau nazale recoltat prin bronhoscopie simplă etc şi/sau
®pacientul stă pe scaun, cu faţa spre sursa de lumină (preferabil lumina naturală); ® prelevate care permit evitarea contaminării orofaringiane: aspirat transtraheal,
aspirat transtoracic, aspirat bronhoscopie prin cateter protejat cu canule telesco-
« utilizăm tampoane cu vată obişnuite uşor umezite cu soluţie salină fiziologică sterilă,
pate/lavaj bronhoalveolar, biopsie transbronşicâ, biopsie pulmonară pe torace
ceva mai mici decât în cazul recoltării exsudatului faringian
deschis, aspirat pleural, hemocukuri.
• un tampon va fi utilizat pentru examen microscopic direct;
• cu toate că este contaminată cu flora normală orofaringiană, sputa reprezintă produsul
• un tampon va fi utilizat pentru însămânţare pe medii de cultură; patologic recoltat cel mai frecvent, în majoritatea IACR1. Se pot obţine probe calitativ
®în cazul suspicionării difteriei se vor utiliza 3 tampoane. corespunzătoare în momentul în care pacientul se prezintă în unitatea sanitară (este
• tamponul trebuie încărcat cât mai bine cu p.p. (îl rotim relativ ferm pe suprafeţele unde recomandabil să se recolteze prima spută eliminată matinal şi în nici un caz sputa din
este prezent p.p.); , 24 de ore). Pacientul trebuie să înţeleagă diferenţa dintre „a expectora" şi „a tuşi şi
scuipa".
» este de preferat utilizarea imediat a p.p. iar în cazul în care acest lucru nu este posibil,
tamponul va fi trimis către laborator în mediu de transport. • înaintea prelevării se recomandă periajul simplu al dinţilor, clătirea energică a gurii şi
gargara cu apă (sau cu soluţie salină fiziologică);
2. Exsudatul faringian i® clacă proba apare constituită în principal din salivă, trebuie să solicităm imediat prele­
« se recoltează preferabil dimineaţa înainte ca pacientul să mănânce şi fără să se fi spălat varea unei noi probe care să permită ulterior definitivarea diagnosticului. în IACRi o
pe dinţi, fără să fi utilizat gargarisme cu diferite soluţii (iar dacă aceste condiţii nu au probă mucopurulentă în volum de 2-3 ml ar putea fi suficientă;
fost respectate, recoltarea se va face după minim 4 ore) • stimularea expectoraţiei prin inhalarea de aerosoli calzi cu soluţie salină (3%) oferă,
®pacientul stă pe scaun, cu faţa spre sursa de lumină şi gâtul în uşoară extensie de regulă, probe citologie nesatisfăcătoare (sputa indusă ar putea fi utilă în izolarea
® ne aşezăm puţin lateral faţă de pacient pentru a evita contaminarea cu picături elimi­ Pneumocystis carinii). în cazul în care se presupune o infecţie mycobacteriană sau
fungică este recomandată recoltarea şi prelucrarea a 3 produse, în 3 zile consecutive;
nate în cursul unui eventual acces de tuse (de preferinţă vom purta mască şi ochelari);
• spălarea sputei intens mucopurulente (în 3 băi succesive de soluţie salină izotonă)
® deprimăm baza limbii cu ajutorul unui apăsător de limbă steril şi în condiţii de ilu­
reduce contaminarea orofaringiană fără a influenţa semnificativ concentraţia bacteriei
minare adecvată examinăm faringele posterior, pilierii, amigdalele pentru a sesiza care
infectante prinsă în trama fibrinoasă a probei. Fluidifierea (de ex. cu N-acetil-L-cis-
sunt zonele inflamate (roşii, cu depozite, ulceraţii etc) şi eventualele depozite puru­
teină) permite omogenizarea produselor patologice; se realizează în câteva minute;
lente;
• în cazul suspicionării unei infecţii fungice, probele fluide se concentrează prin cen­
® utilizăm tampoane cu vată obişnuite
trifugare 20 de minute la 3000 rot/min., apoi se examinează sedimentul. Din probele
® un tampon va fi utilizat pentru examen microscopic direct; bioptice se disecă mici fragmente suspecte cu volume de circa 1 mm care sunt apoi
• 'un tampon va fi utilizat pentru însămânţare pe medii de cultură; examinate la stereomicroscop (mărire 30). Ţesutul cazeos, fibros şi grăsimea ascund
®în cazul suspicionării difteriei se vor utiliza 3 tampoane; în mod frecvent hifele iar tratarea cu KOH nu clarifică preparatul fiind necesară diso­
• solicităm pacientului să pronunţe „A“ şi printr-o mişcare de ştergere, circulară, fermă, cierea şi omogenizarea probei;
recoltăm secreţia de la nivel faringian, amigdalian insistând în zonele unde există • produsele patologice recoltate pentru diagnosticul microbiologic trebuie transmise
ulceraţii, depozite (în căzui în care se remarcă prezenţa unei false membrane o detaşăm prompt către laborator (preferabil în maxim 1 oră, acceptabil în 1-2 ore);
cu grijă înspre periferie şi recoltăm secreţia care există sub această structură); • produsele recoltate într-un recoltor steril de 50-200 ml, cu capac care permite o
®trebuie să evităm atingerea bazei limbii sau a palatului moale; închidere etanşă, sunt etichetate şi expediate imediat la laborator pentru a fi examinate.
Nu există modalităţi optime de conservare a probelor. Menţinerea la o temperatură de
» este de preferat utilizarea imediat a p.p., sau în cel mult 1-3 ore; în cazul în care acest
4°C previne multiplicarea contaminanţilor, conservă unii patogeni, dar scade până la
lucru nu este posibil, tamponul va fi trimis către laborator în mediu de transport.
anulare şansa de izolarea a aitora (ex. H. influenzae, N. meningitidis).
i

( ,
Diagnosticul de laborator în microbiologie & Norme privind prelevarea şi transportul produselor patologice 31

• utilizarea unui mediu de transport perturbă raportul dintre bacterii şi reperele citolo- unei meningite este necesară efectuarea unor examinări biochimice adiacente celor
gice ale probei, esenţiale pentru apreciare calităţii probei şi interpretarea rezultatelor citologice şi microbiologice astfel încât este de dorit recoltarea (la adult) a unei can­
sputoculturii, dar în cazul în care se apreciază că se va depăşi timpul de transport reco­ tităţi de 5-10 ml LCR; recoltarea p.p. este invazivă şi va trebui să fim în stare să exe­
mandat se poate utiliza mediul Stuart sau Amies. în cazul în care se urmăreşte, spre cutăm toate testele necesare fără a solicita repetarea puncţiei lombare;
exemplu, izolarea M. pneumoniae, cultivarea trebuie făcută cât mai rapid; produsul • recomandăm recoltarea LCR în 2-3 tuburi sterile (2 tuburi vor fi centrifugate iar din al
patologic poate fi conservat maxim 4 ore în lipsa unui mediu special şi până la maxim treilea tub se vor realiza testele biochimice şi alte teste utile pentru a sugera etiologia);
24 de ore dacă se utilizează mediul de transport pentru molicute. în cazul în care ar fi dacă LCR este franc purulent, examenul microscopic direct se face fără centrifugare;
necesară o conservare prelungită, este necesară utilizarea unei temperaturi de -70°C • în mod ideal, LCR trebuie prelucrat imediat, cu alte cuvinte recoltarea şi procesarea
(în nici un caz temperatura congelatorului obişnuit). p.p. trebuie să înceapă „la patul bolnavului"; recomandăm ca pe lângă trusa necesară
manevrei de recoltare să avem la dispoziţie o spirtieră, stative pentru eprubete, medii
4. Puroiul de cultură diverse (agar-sânge, Lowenstein, Sabouraud etc);
• există numeroase condiţii clinice în care apar supuraţii (superficiale sau profunde) iar • dacă LCR urmează a fi transportai, transportul trebuie să se facă cât mai rapid şi la o
tehnica de recoltare variază în funcţie de „originea" puroiului (arsuri şi plăgi suprain- temperatură apropiată de temperatura corpului uman (în nici un caz la +4°C; atât
fectate, abcese, flegmoane etc); Haemophilus influenzae cât şi Neisseria meningitidis, agenţi etiologici recunoscuţi ai
• este recomandat ca pentru recoltare să folosim tampoane cu vată sterile numai în cazul meningitelor bacteriene sunt distruşi prin refrigerare);
în care nu avem o altă soluţie; • un al motiv în favoarea unui transport şi o prelucrare foarte rapidă a LCR este
• puroiul poate fi recoltat cu ansa bacteriologică, pipeta Pasteur, prin biopsiere, cliiu- reprezentat de studiul citologic al p.p. şi mai precis de numărarea leucocitelor polimor-
retare sau, atunci când este vorba de colecţii profunde, prin puncţie şi aspirare; fonucleare care încep să fie distruse în număr semnificativ încă din primele 30-60
• în special pentru situaţiile în care vom recolta p.p. dintr-o colecţie profundă, colabo­ minute după recoltare.
rarea între clinică şi laborator trebuie să fie foarte bună; 9. Secreţii recoltate de la nivelul aparatului genital
• atunci când suspicionăm o infecţie cu microorganisme anaerobe sunt necesare
» există mai multe tipuri de secreţii care tu- putea fi recoltate în funcţie de manifestarea
pregătiri speciale şi cel puţin utilizarea seringii care se „închide" cu dop (vezi mai sus);
clinică; în materialul de faţă vom discuta doar o parte dintre acestea;
există germeni anaeobi care pot fi distruşi în câteva secunde de contact cu oxigenul;
• în cazul secreţiei uretrale, la bărbat
o transportul către laborator se va realiza utilizând medii de transport sau containere spe­
ciale (pentru asigurarea anaerobiozei); p.p. trebuie să fie prelucrat în 1-2 ore. * recoltarea p.p. trebuie să se facă dimineaţa, înainte de micţiune, sau la cei puţin 2
ore după aceasta; în cazul în care pacientul nu se prezintă dimineaţa şi nu este
5. M ateriile fecale (vezi capitolul 28) respectată condiţia de mai sus iar după 2 ore de la micţionare secreţia este în can­
6 . U rina (vezi capitolul 29) titate prea mică, îi vom recomanda să consume cât mai puţine lichide în restul zilei
7. Sângele (vezi capitolul 31) şi să revină în dimineaţa următoare, înainte de micţiune;
8. Lichidul cefalo-rahidian * sunt necesare tampoane de vată sterile (un tampon pentru examenul microscopic şi
• se recoltează în cazul suspicionării prezenţei unui sindrom meningeal, după exami­ al doilea pentru cultivare) sau, alternativ o ansă bacteriologică sterilă; este reco­
narea fundului de ochi (verificăm presiunea în artera centrală a retinei, semne de stază' mandabil ca ansa să aibă firul şi bucla de platină (sau ar putea fi o ansă bacterio­
logică de unică întrebuinţare)
papilară);
* se observă penisul şi .meatul urinar precum şi dacă există secreţie uretrală
• suspiciunea este ridicată de medicul de specialitate (boli infecţioase, neurologie, medi­
cină internă etc) iar recoltarea se va face la patul bolnavului de către medicul care are * dacă există secreţie uretrală, aceasta este recoltată cu tamponul (sau cu ansa);
competenţa de a executa această manevră (ex. prin puncţie lombară); * în cazul în care nu se evidenţiază secreţie uretrală în mod spontan, cu mâna prote­
« tehnicile de asepsie trebuie să fie riguroase în toate situaţiile, dar în cazul recoltării jată de o mănuşă de latex, exprimăm uretra utilizând degetul mare şi indexul şi
LCR atenţia trebuie să fie şi mai sporită; recoltăm secreţia care apare;
• chiar dacă acest manual de lucrări practice se adresează numai infecţiilor bacteriene şi « dacă nici prin această manevră nu putem obţine p.p. vom recurge la recoltarea
fungice, trebuie să privim lucrurile în ansamblul lor şi drept exemplu, să nu uităm că intrauretrală cu tamponul (sau cu ansa);
există meningite infecţioase şi meningite neinfecţioase iar meningitele infecţioase pot * în acest scop sunt necesare tampoane de dimensiuni mai mici, preferabil din algi-
fi fungice, bacteriene, parazitare, virale, prionice; în plus, pentru elucidarea etiologiei nat de calciu (sau dacron în suspiciunea unei infecţii cu Chlamydia spp. sau
32 ______________________ Diagnosticul de laborator înmicrobiologie J PREPARATE MICROSCOPICE, FROTIURI
/ • SI PRINCIPALELE COLORAŢII
Mycoplasma spp.); după introducerea blândă, pe circa 2 centimetri lungime şi UTILIZATE ÎN MICR0BI0L0GIE
rotirea intrauretral a primului tampon, al doilea tampon va fi inserat cu aproxima­
tiv 1 centimetru mai profund; •/■■■, ■■■ ... t -ş; L,. ţi; ■ ■c
• în suspiciunea de gonoree se recomandă cultivarea imediat dupărecoltâre pe medi­
ul de cultură încălzit la 37°C; în cazul în care acest lucru nu se. poate realiza, tam­ Microorganismele studiate au dimensiuni foarte mici, de ordinul micronilor, astfel încât
ponul cu p.p. va fi transmis laboratorului în mediu de transport (ex.; mediul Amies pentru examinarea lor este necesară o mărire de circa 1.000, aşa cum vom discuta şi în capi­
cu cărbune activat pentru Neisseria gonorhoeae sau alte variante-pentru (j/xIdfiyciiq^ tolul următor. Există diferite tehnici prin care se poate pune în evidenţă prezenţa unor
spp. sau Mycoplasmaspp. ) . , î ..fu-, r/'â-î microorganisme însă, de mare utilitate este examenul microscopic care se poate adresa unor
preparate microscopice proaspete (umede, între lamă şi lamelă) sau unor frotiuri fixate şi
• în cazul secreţiilor cervicale, la femei Ai •.•••nVm. . .:k i .âşnu., f ii.. ; , ., ...•
colorate în funcţie de suspiciunea diagnostică, p.p. examinat etc.
• recoltarea se va face preferabil în 1primele-10 zile după ciclul menstruali pe masa
în schema generală de diagnostic microbiologic (direct) vom examina microscopic pro­
ginecologică, după introducerea valVelor ginecologice şi exăminarelf vizuală a
dusul patologic (etapa a 2-a) sau colonia apărută pe mediul de cultură (etapa a 4-a, punctul
vaginului şi colului uterin; • ’-.t-;;,»/. i r \ ' . r '* vr .,.: >
b, identificarea pe baza caracterelor morfotinctoriale).
o dacă se remarcă o‘ secreţie purulerttă, cti ajutorul unor comprese'sterile se înde­
Uneori examenul microscopic este decisiv pentru diagnostic, alteori are un rol orienta­
părtează secreţia de la nivelui colului extern; '■■■ ' , => .« -
tiv, însă, chiar din al doilea an de studiu ar fi bine ca viitorii medici să înţeleagă, reţină şi
• folosim 3 tampoane sterile introduse şi rotite uşor 1-2 centimetri în colul uterin (2 ulterior să aplice cele învăţate, indiferent de specialitatea pe care o vor urma.
dintre tampoane le vom Utiliza pentru frotiuri Gram şi Giemsa, iar al treilea pentru
cultivare procedând aşa Cum am menţionat mai sus). Preparate microscopice proaspete (umede, native, între lamă şi lamelă)
10. Diferite p.p. recoltate în suspiciunea unor infecţii fungice • este de preferat să folosim lame şi lamele noi supuse următoarelor proceduri succesive
• în infecţiile fungice, în funcţie de localizare se pot recolta p.p. foarte variate; (imersare în amestec sulfo-cromic câteva zile, spălare, clătire, păstrare în alcool 50%);
• spre exemplu, în micozele cutanate superficiale • lamele se usucă (folosim o cârpă curată) apoi se degresează suplimentar prin Hambare
(trecere de câteva ori prin flacăra becului Bunsen);
j «după antiseptizarea leziunii cu alcool medicinal (70°) raclăm tegumentul şi uti-
I lizăm pentru examinare scuamele produse; ' • depunem pe lamă o picătură din produsul care urmează a fi studiat;
« atât scuamele cât şi alte structuri (fire de pâr, fragmente de unghie etc) se împa­ • dacă produsul patologic are consistenţă lichidiană (ex. urină, sediment urinar, ma­
chetează în hârtie sterilă care se introduce într-o cutie Petri şi se trimite pentru pre­ terii fecale, LCR, serozitate din şancru presupus sifilitic etc) va fi utilizat ca atare;
lucrare şi examinare în laborator (în maxitn 48 de ore). penU-u o mai bună vizualizare putem adăuga albastru de metilen, lugol, tuş de
• în micozele profunde, în funcţie de localizare India, nigrozină etc;
• dacă cultura este realizată în mediu lichid (ex. pentru Leptospira spp.) se va utiliza
• recoltăm p.p. şi îl transmitem către laborator având grijă să prevenim deshidratarea
ca atare;
produsului; ,
• dacă vrem să studiem spre exemplu mobilitatea microorganismelor care au format
• se recomandă prelucrarea şi examinarea imediată (unii fungi sunt fragili; este, de
colonii pe un mediu solid vom descărca o ansă din colonie într-o picătură de soluţie
dorit să putem evalua situaţia fungilor foarte aproape de momentul recoltării pen­
salină fiziologică, apă distilată sau bulion;
tru a putea înţelege care a fost situaţia in vivo); ■
• dacă p.p. este recoltat într-o suspiciune, de micoză superficială, pe lama de micro­
• iar în caz contrar adăugăm penicilină, streptomicină şi cloramfenicol pentru
scop se va depune o picătură dintr-o soluţie, 10-20% KOH-glicerol în care se va
inhibarea multiplicării bacteriene şi menţinem pip., la ,+4°C (supravieţuirea la
descărca şi dispersa p.p; , i
această temperatură depinde de fungul implicat şi poate varia de la ore la 2 /săp-
_ fămâni, aşa cum se întâmplă în cazul unor fungi dimorfij.' " " l'" ' 1/ • dacă vrem să studiem aspectul fungilor filamentoşi (mucegaiuri) dintr-o colonie,
pe lamă se va depune o picătură de soluţie lactofenol-albastru coton în care vom
Aşa cum am menţionat, datele prezentate nu cuprind toate posibilităţile şi variantele. Am
descărca un fragment din periferia coloniei respective;
încercat să dăm doar câteva exemple care sunt orientative. Pentru cei interesaţi există ma­
nuale dedicate exclusiv recoltării şi transportului produselor patologice, în microbiologic. • acoperim picătura cu o lamelă;
Pentru trei dintre p.p. am ales o altă modalitate de prezentare. Recoltarea urinii, materii­ . • cel mai frecvent presăm uşor lamela pentru a elimina eventualele bule de aer;
lor fecale şi sângelui va fi discutată în partea specială. ‘
Diagnosticul de laborator în microbiologie Preparate microscopice, frotiuri şi principalele coloraţii utilizate în microbiologie 35
34

• în cazul p.p. recoltat într-o suspiciune de m icoză’superficială, încălzim uşor • Şupă ce am flambat lama, o aşezăm cu partea.flambată în sus; :
preparatul prin trecere cu grijă, de 2-3 ori, pe deasupra 'flăcării becului Bunsen; • cu ajutorul flaconului cu picurător sau.cu ansa bacteriologică sterilizată şi.răcită
®dacă vrem să studiem aspectul fungilor filamentoşi (mucegaiuri) dintr-o colonie, depunem în centrul iamei o picătură deşoluţie salină fiziologică sau. apă distilată;
nu trebuie să mişcăm sau să presăm lamela; • sterilizăm ansa bacteriologică şi aşteptăm să se răcească; , . '
• în microscopia optică pe câmp luminos aşezăm preparatul pe platina microscopului şi ;.-w , • pfelpvăm aşeptic.R.p./un fragmenţ din colonie şj depunem produsul în picăţura de
examinăm iniţial cu obiectivul 10, apoi cu obiectivul -20 sau4 0 (de regulă nu folosim v fluid de pe lamă; .... .
obiectivul de imersie);: se pot folosi.şi alte tehnici microscopice. "-ţ n,Ţi iu tu; , - * omogenizăm foarte Jbine p.p./fragmenţul de colonie îri picătura de fluid;
• procedăm ca mai sus pentru întinderea, uscarea şi fixarea frotiului;
Frotiuri (preparate microscopice fixate şi colorate) u' ■
• Executarea amprentelor de organ/alte p.p.
Structura peretelui microbian determină 9 .anumită, afinitate faţa de coloranţi, ceea ce • flambăm lama; ' '•> • t *■•••» •• s ,
permite examinarea şi diferenţierea bacteriilor sau fungilor în frotiuri,. . ' f ţ•
• cu partea flambată atingem suprafaţa de secţiune a organului respectiv;
• frotiurile se pot realiza pornind de la produse patologice (recoltate de ja om sau de la • lama se poate aplica şi pe suprafaţa de secţiune a unor prelevate bioptice sau
animale de experienţă) sau din cultura microbiană (în mediu lichid sau solid); . obţinute prin necropsie;
• frotiul trebuie întins în strat cât mai subţire (preferabil în unistrat) : u • procedăm ca mai sus pentru uscarea şi fixarea frotiului.
u este de preferat să folosim lame şi lamele noi supuse următoarelor proceduri succesive
(imersare în amestec sulfo-cromic câteva zile, spălare, clătire, păstrare în alcool 50%) Colorarea frotiurilor ‘ 1 <
• lamele se usucă (folosim o cârpă curată) apoi se degresează suplimentar prin flambate
Există foarte numeroase metode de colorare a frotiurilor. Dintre acestea vom prezenta
(trecere.de câteva ori prin flacăra becului Bunsen) ' . . . . . . ... ■
doâr câteva dintre coloraţiile folosite mai frebveht.
• Executarea frotiurilor din p.p. cu consistenţă fluidă sau din culturi microbiene
în vederea colorării avem nevoie de o trusă pentru colorare (stativ de colorare, coloranţi
realizate în mediu de cultură l i c h i d ------- -r—
conform „reţetei" de colorare, apă distilată sau apă curentă pentru spălare, stativ de uscare).
/• după ce am flambat lama, o aşezăm cu partea flambată în sus
Pentru colorarea frotiurilor din produs patologic folosim cel mai frecvent coloraţiile
I • sterilizăm ansa bacteriologică şi aşteptăm să se răcească .'i cu albaştrii de metilen (A.Mlj, Giemsa^ Gram şi după caz’, Ziehl-Neelsen, jn funcţie de'sus­
« prelevăm aseptic p.p./cultură şi depunem produsul în centrul lamei piciunea diagnostică şi p.p. examinat se pot folosi şi alte coloraţii (de ex. coloraţia Gimenez
• întindem prin mişcări de „dute-vino" (de ,,haşurare“) pe axul lung al lamei pro­ pentru depistarea rickettsiilor pe amprente de organ de la animale infectate, experimental sau
dusul prelevat, în strat cât mai subţire, având grijă să nu ne apropiem de mar­ coloraţia.'^‘albastru de toluidină pentru evidenţierea Pneumocystis cătinii).
ginile lamei/întinderea se poate face şi prin mişcări circulare, excentrice; în cazul multora dintre coloraţiile uzuaie au fost realizate diferite modificări îp funcţie de
• lăsăm lama să se usuce lângă becul de gaz (nu grăbim uscarea prin eventuale experienţa autorilor şi scopul urmărit. De ex. coloraţia cti Ă.M poate avea următoarele variante:
treceri ale frotiului prin flacără) - în cazul în care avem în dotare un dispozitiv • albastru de metilen Loffier pentru cele mai multe coloraţii simple sau ca un al doilea
în care lama se poate aşeza şi usca la +70°C, vom utiliza această metodă; colorant în coloraţia Ziehl-Neelsen; C jP -
• fixăm frotiul; există metode chimice de fixare, însă cel mai frecvent folosim; • albastru de metilen policrom pentru evidenţierea Bacillus anthracis în p.p., pentru
fixarea prin căldură, distrugând în acelaşi timp şi microorganismele (care pre­ corynebacterii sau înlocuind coloraţia de mai sus;
zintă o afinitate tinctorială mai mare decât celulele vii); . • albastru de metilen (varianta Wayson) pentru p.p., cu o sensibilitate mai bună decât
• în acest scop, trecem frotiul prin flacără (aşa cum am procedat şi pentru flambareji . ., , .utilizarea A.fyl. Loffier etc. ~~ , .
lamei, înainte de executarea frotiului) însă de această dată partea pe care am întins în cursul lucrărilor practice precum şi în manualul de faţă se va. discutamumai, câte o
p.p. sau cultura este orientată în sus; ca o modalitate de control, atingem dosul variantă cu referire la principalele.coloraţii folosite în microbiologie. Cei interesaţi .au la.dis-
mâinii cu lama flambată, iar temperatura atinsă prin flambare nu trebuie să fie mai poziţie pentru studiu un bogat material teoretic iar după încheierea antrenamentului perso­
mare decât pe care o putem suporta; j nal în ceea ce priveşte realizarea de frotiuri şi coloraţii, fiecare va putea alege o variantă,
• frotiijl fixat este gata pentru colorare; , ! % aplicabilă în funcţie.de situaţie. 1 ’
• Executarea frotiurilor din p.p. cu consistenţă solidă sau din culturi microbiene Pentru colorarea frotiurilor obţinute din cultură vom folosi în special coloraţiile Gram,
realizate în mediu de cultură solid Ziehl-Neelsen şi alte coloraţii specifice, după caz (coloraţii pentru cili, capsulă, spori etc).
36 ■ Diagnosticul de laborator în microbiologie
/ Preparate microscopice, frotiuri şi principalele colora)ii uim-cuic m micr 37

^Coloraţia cu albastru de metilen


• examinăm la microscop, notăm observaţiile, interpretăm.
• acoperim frotiul cu soluţie de albastru de metilen, pentru -3-4 minute (nu are rost să
' ‘ acoperim cu colorant IamaBn întregime);i u- *, >.< -■■■ * wi.;- A Coloraţia Ziehl-Neelsen
• spălăm cu apă distilată său apă de ld robinet; .ukswiiv»’ •. ■■ Este o coloraţie utilă în identificarea prezenţei de barili acid-alcool,rezistenţi (BAAR),
• aşezăm frotiul în stativ pentru uscare (de preferat) sad grăbim Usdarea prim tamponare şolubilizând peretele bacterian prin creşterea temperaturii, facilitând penetrarea colorantu­
cu sugativă sau hârtie de filtru; , si- nb'bmri lui. . . ,_ .
0^ .
—. * examinăm la microscop, notăm obsâfvaţiile/‘interpretăm.' •sou.'iGaii.S'ţniMo * • punem frotiul uscat şi fixat pe un suport situat deasupra tăviţei,de coitame;; ;. , B
'.r v ; 81 Ir. i f f O l liO f r i ( i . ‘ ; ■■
\ (L Coloraţia Giemsa Mataugto -.>!> iofa.'i«y.{n«s synfiir- xd »
• acoperim complet lama cu fucsină bazică nediluată (fiiuutţt extemporaneu);
• trecem becul de gaz aprins pe sub lama acoperită de fucsinăj.până începe emiterea de
fixarea frotiului nu se face „la cald“ ci chimic, cii alcool meţiljc (de ex. ţimp d e j .
vapori (nu atingem temperatura de fierbere). în cazul în care lama nu mai este acope-l
minut); V' . rită complet cu fucsină, adăugăm colorant. Timpul ele lucru este de 10 minute, perioadă
• scurgem lama şi aşteptăm evaporarea alcoolului metilic; . , în care repetăm dc^Hari operaţia de încălzire a lamei până lă emiterea de vapori; 1
o acoperim frotiul cu soluţie May-Grtinwald^(diluată în părţi egale .cu tampon fosfat), " • spălăm insistent cu apă distilată sau apă de la robinet;
pentru 3 minute;
• adăugăm amestecul decolorant acid-alcool (3 ml acid clorhidric concentrat/97 ml
« înclinăm lama şî scurgem soluţia colorantă (care are şi rol fixator); alcool etilic 90-95°), pentru 2-3 minute;
• acoperim frotiul cu soluţie Giemsa, pentru 10 minute; 7 • spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet; w ,c. ,
• spălăm cu tampon fosfat; i, • recolorăm cu albastru de metilen, 1 minut; . ’ . ; ;■
o aşteptăm ca frotiul să se usuce şi examinăm cu un obiectiv intermediar; dacă colorarea
• spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet; 11 : <du-.. ■ 1
celulelor este mai slabă decât cea aşteptată acoperim din nou frotiul cu soluţie Giemsa,
încă' 10 minute; • aşezăm frotiul în stativ pentru uscare (de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare
<
ri cu sugativă sau hârtie de filtru; '■ ! '
• spălăm cu tampon fosfat
•> . , i• ><• « examinăm la microscop, notăm observaţiile, interpretăm.
• aşezăm frotiul în stativ pentru uscare (Be preferat) sau grăbim uşparea prin ţaniponare
cu sugativă sau hârtie de filtru; C oloraţia Kinyoun
• f
• examinăm la microscop/ notăm obseryaţiiIe,-interpretăm. , • ■> ...... ...
Este o coloraţie utilă în identificarea prezenţei de BAAR, fără a utiliza încălzirea în cursul
r '-î/^ !.f .U.q /' :n«». G
{ O/ f Coloraţia Gram ) etapelor de colorare (coloraţie „la rece“).

o diluăm într-un recipient fucsină (9 părţi apă distilată/!, parte, fucsină); • acoperim lama complet cu o hârtie de filtru decupată în acest scop;
• acoperim frotiul cu violet de, metilsau criştal yiolet (violet de genţiană din puncfcle, vedere • picurăm soluţie de fucsină fenicată Kinyoun până când hârtia de filtru se îmbibă com­
istoric), pentru J_-3 minute (nu are rost să acpperirtîcu CQlorantlamaîn,întregime); plet şi aşteptăm 5 minute;
• îndepărtăm hârtia de filtru;
®îndepărtăm colorantul; şj,,r. îwf»»*>{* t,, .n.U*s i,;«:r ■ ou: ;
« acoperim frotiul cu lugol (mordant, fixator):pentru*£-3'minute; ma.o.H-.m vt$ • spălăm insistent cu apă distilată sau apă de la robinet;
• îndepărtăm lugoliil;:1 <• v. ...u.q M -w C tu w v 'A V i ; !<u:n<v<i u .-li.•••(, o ', u v -><:î»; acoperim lama cu amestecul decoloram acid-alcool pentru circa 30 secunde;, vărsăm
• acoperim frotiul cu un amestec de alcooj-acetonăjl parte âcetonă/3 părţi alcool de amestecul decoloram şi repetăm operaţia pentru încă 30 secunde
■if;96°) pentar un timp foarte scurtj^-8 secunde; j'/.v/J vŢTÎămĂ uunliraiî U*:-*«wrfî / r • spălăm insistent cu apă distilată sau apă de la robinet;
® spălăm insistent cu:ăpătdiStilată săti'apă'de lă'robineti ‘ vţri J jlfa.t/i.u • acoperim frotiul cu albastru de metilen, pentru 1 minut (nu are rost să acoperim cu co­
• acoperimfrotiul cu fucsina diluată l/ld pentru' I m inut;'
.iP.i.u,;* 1- 7, - ,0, 1,x V^TTli.'. .'.j—-n: ■i-v.: i'!n'.;' MV CVj.i 7
......... . ,
<; luni
lorant lama în întregime);
• şpălătn cu apă distilată sau apă de la robinet; i,;,,,;,. -j> i' jr /i m , • spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet;
. ,-i, •; aşezăm frotiul în .stativ pentru uscare.(de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare • aşezăm frotiul în stativ pentru uscare (de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare
■: cu, sugativă sau hârtie de,.filtru; ■) . cu sugativă sau hârtie de filtru;
• examinăm la microscop, notăm observaţiile, interpretăm.
Iis
JJl
’ll
ill
'li
Ml. 38 Diagnosticul de laborator în microbiologie

TEHNICA EXAMENULUI MICROSCOPIC


Coloraţii fluorescente 0 # ÎN DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC
Există mai multe variante, inclusiv coloraţii în care se utilizează anticorpi marcaţi fluo­
rescent. Vom prezenta în continuare coloraţia fluorescentă cu auramină O. Este o coloraţie
utilă în identificarea prezenţei deB Â A R !(sensibilitated-fescută),i;. flhJi' ţi ; '
" • colorăm cu soluţie de atiramină O (amestec de ăuramină O; alcool etilic,'fenol, apă dis­
tilată), pentru 15 minute; ,
Microscopul este un instrument absolut necesar în vederea stabilirii unui diagnostic bac­
• spălăm cu apă distilată; r j'V ; l : ' r f ‘j" l : ' ;i
teriologic direct (există tehnici de microscopie care pot fi utile şi în diagnosticul microbio­
• decolorăm c£t!amestec de1âcid-albbol,; pentru 5 ‘rhinute; !r,!, logic indirect). Există mai multe categorii de microscoape. în mod uzual examenul micro­
• spălăm cu a p ă 'd is til a tă ;'; ! -tlhtfl • *» cu;- oiw jsu i scopic utilizează microscopul optic (microscopia optică pe câmp luminos). în anumite situ­
• ,,contracolorăm’v!cu soluţie de pertnangânat de potasiu, ppntru 2 ‘minute;' aţii se poate recurge la microscopia cu fond negru, microscopia cu contrast de fază sau la
microscopia cu fluorescenţă. în cazul utilizării ultimelor trei tipuri de microscop este nece­
• şpŞăm cu apăfdistilată sau apă de,la robinet;, ,, n
sară o cameră obscură. Microscopia electronică, microscopia protonică sau alte tehnici
• aşezăm frotiul în stativ pepţru uscare (de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare sofisticate de microscopie nu fac obiectul materialului de faţă (aceste tehnici ar putea fi uti­
cu sugativă sau hârtie de filtru; lizate în cercetare, de ex. pentru a evidenţia inter-relaţia dintre bacterie şi bacteriofag).
■.. ii?- •> ■ . ' < ■ . r , ■■■■?•• •<<:>.- . ■ i. .
• examinăm la microscop, notăm observaţiile, interpretăm. _
Microscopul optic şi microscopia optică pe câmp luminos
Coloraţia Gimenez ' . v. î ,
Microscopul optic este un instrument care permite observarea obiectelor mai mici decât cele
Este o coloraţie utilă în identificarea rickettsiilor pe amprente de organ de la animale
care pot fi văzute cu ochiul liber (sau cu lupa). Microscopul formează imagini virtuale, mărite
infectate experimental sau în culturi precum şi pentru identificarea, incluziilor de Chlamydia
şi răsturnate ale obiectului cu ajutorul unui sistem de lentile obiectiv şi de lentile ocular.
trachomatis sau Chlamydia spp. .
Distanţa minimă dintre două puncte ale unui obiect care mai pot fi văzute separat unul
• acoperim iama cu xilol, pentru 5 minute;
de celalalt prin microscop este:
• îndepărtăm xilolul; .tu.; ,-,r* , 0 ,- / •• .
• acoperim lama cu alcool etilic (96°), pentru 2-3 minute; . 1.22A
d = -----------
• îndepărtăm alcoolul; 2« simt
• acoperim frotiul cu soluţia de fucsină fenicată preparată după reţeta Gimenez, pentru unde X reprezintă lungimea de undă a radiaţiei folosite, n este indicele de refracţie al
1-2 minute, fucsină se picură pe frotiu printr-o pâlnie prevăzută cu o hârtie de filtru; mediului străbătut de radiaţie între obiect şi ocular, iar u este unghiul dintre axa optică şi
• spălăm insistent cu apă distilată sau apă de la robinet; razele cele mai îndepărtate de axă care mai pătrund încă în obiectiv. Pentru a micşora
• acoperim frotiul cu soluţie de verde malachit, pentru 6-9 secunde; această distanţă şi respectiv pentru a îmbunătăţi performanţele microsopului există mai
multe metode dintre care vom menţiona două, utilizate şi în studiul microbiologic:
• spălăm insistent cti apă distilată sau apă de la robinet;......
• aşezăm frotiul în stativ pentru uscare; ' ' 1 !, >. ® utilizarea unor radiaţii cu lungime de undă X cât mai mică (de ex, pentru radiaţia ultra­
violetă se pot distinge obiecte cu dimensiuni de 0,15 pm);
• examinăm la microscop, notăm observaţiile, interpretăm.'
• mediul transparent dintre obiect şi obiectiv să aibă un indice de refracţie n cât mai
în capitolul următor, după prezentarea microscopului optic (în câmp luminos), vom enu­ mare (aşa cum se procedează în cazul microscopului cu imersie),
mera o serie de date privind structurile1care pot fi observatei’ ,-j
în microscopia optică pe câmp luminos lumina este transmisă de-a lungul axului optic al
instrumentului,"prin preparat, în aceste condiţii obţinându-se un câmp vizual puternic luminat,
în care obiectele, pentru a putea fi văzute, se disting pe fondul luminos fie prin opacitate, fie
prin culoarea lor (în special după utilizarea unor tehnici de colorare - a se revedea capitolul 7).
Pot fi realizate şi măsurători cu ajutorul micrometrelor (utile mai mult în diagnosticul para-
zitplogic); micrometrele sunt plăcuţe de sticlă pe care sunt marcate scale fin divizate, de dimen­
siuni cunoscute, a căror imagine se poate suprapune peste imaginea obiectului ele cercetat.

'
Tehnica examenului microscopic în diagnosticul microbiologic 41
40 Diagnosticul de laborator în microbioiogie

Se pot examina astfel: sedimentul urinar, materii fecale provenind de la un pacient cu


Părţile componente ale microscopului optic diaree, suspensii de bacterii care se presupune că sunt mobile, preparate umede realizate în
Microscopul optic are urm ătoarele părţile componente: cazul suspicionării unei micoze cutanate superficiale etc
1. Piciorul microscopului, alcătuit dintr-o masă metalică cu rol de susţinere, pe care se • sediment urinar/putem_vizualiza: celule epiteliale (malpighiene, vezicale, uretrale etc),
sprijină platina microscopului. Pe platina microscopului se aşeaza preparatul. Platina pre­ celule sanguine (leucocite, hematii), cilindrii urinari (hialini, leucocitari, eritrocitari,
zintă un orificiu central care permite trecerea razelor luminoase şi orificii laterale în care epiteliali, granular! etc), cristale urinare, levuri (eventual înmugurite, cu blastoconidii),
sunt prinşi „cavalerii*1 cu ajutorul cărora preparatul este fixat pe platină. Cu ajutorul a 2 Trichomonas vaginalis etc; examenul sedimentului urinar este foarte util;
şuruburi ce se găsesc sub platformă, aceasta se poate deplasa pe 2 direcţii perpendiculare. • preparat montat în soluţie KOH/putem vizualiza: levuri (număr, formă, dimensiuni),
2. Tubul microscopului susţine ocularul şi; obiectivul. Tubul poate fi deplasat mai rapid blastoconidii, artroconidii, pseudohife, microorganisme asociate;
şi grosier cu ajutorul măcrovizei şi mai lent şi fin cu ajutorul microvizei. La capătulfstiperior • preparat colorat cu tuş de India (coloraţie „negativă“)/putem vizualiza: levuri capsu­
al tubulul se pot pune dcîtlarbcu diversb puteri de mărire,’1care se pdt schimba uşor. Frecvent late, înconjurate de un halou clar pe fondul întunecat al preparatului, ex. Cryptococcus
utilizăm în microbioiogie oculare cu puterea de mărire 10. V • neofornums;
Obiectivul se monteazăîn revolver, situatîa capătul inferior al tubului. Revolverul este » în cazul în care se urmăreşte mobilitatea microorganismelor, trebuie să putem deosebi
un suport special care permite'montarea mâi multor obiective şi ihter-scliimbarea lor prin mişcarea reală de mişcarea browniană (oscilaţie pe loc a particulelor); urmărim
rotire. Obiectivul 'este compus:dintr-un' sistein centrat de lentile aşŞizate într-uri tub metalic reperele aflate în vecinătatea microorganismelor etc.
care se înşurubează la revolver; Puterea separatoare ă microscopului este determinată de pu­
terea separatoare a obiectivului a cărui putere de mărire este cu atât mai mare cu cât distanţa
© /EE xam inarea unui p rep arat fixat si colorat
focală a acestuia este mat mîcă. , ■'* • 'î "’ ;; ■ Frotiul se aşează pe platina microscopului şi se fix’Saz
îază cu ajutorul „cavalerilor**.,
Există obiective uscate (ex.JOx, 20x sau 40x) şi cu imersie (ex.90x sau lQOx). Obiec­ Centrăm zona pe care dorim să o examinăm. Procedăm ca mai sus utilizând obiectivul
tivele uscate primesc fasciculul de lumină ce trebe prin preparat direct prin'aer, astfel că o 40x; alegem câmpul pe care îl vom examina ulterior cu obiectivul cu imersie (de ex. un
parte din razele trimise de obiect către lentila concavă se pierd prin fenomenul de reflexii:
câmp în care sesizăm prezenţa leucocitelor).
totală. Pierderea razelor de lumină datorită acestui fenomen se poate înlătura priit inter­
punerea între lamelă şi obiectiv a unei picături de ulei de cedru sau de alt lichid cu indice de Ridicăm tubul microscopului, punem o picătură de ulei de cedru pe lamă, în zona pe care
refracţie/apropiat de cel al sticlei din care este făcută lentila frontală a obiectivului: aşa cum urmează să o examinăm. Condensatorul este ridicat până sub platina microscopului şi are
se petrece în cazul obiectivelor cu'imersie, foarte frecvent utilizate în microbioiogie. diafragrnul deschis.
3. Dispozitivul de iluminare este format din oglindă şi condensator. Privind din lateral, folosim macroviza şi coborâm obiectivul cu imersie (90x sau lOOx)
Oglinda are rolul de a dirija razele de la sursa de lumină spre axul optic al microscopu- până atingem suprafaţa lamei realizând contactul şi cu uleiul de cedru. Manevra trebuie rea­
lui; prezintă o suprafaţă plană şi una concavă şi este fixată pe un suport, în aşa fel încât se lizată cu grijă pentru a nu sparge frotiul.
poate roti în jurul a două axe perpendiculare. , ' I Privim prin oculare şi rotim foarte încet macroviza ridicând foarte încet tubul micro­
4. Condensatorul este format din 2-3 lentile cu ajutorul cărora lumina reflectată de oglindă scopic, până prindem imaginea câmpului. Cu-ajutorul microvizei punem lâ punct imaginea.
este concentrată asupra obiectului; fasciculului paralel de raze de lumina care cade pe condensa­ Se pot examina: morfologia celulelor din produsul patologic, prezenţa leucocitelor şi
tor deyine convergent. Pentru a obţine o imagine,clară, condesatorul se poate deplasa pe vertica­ dacă acestea sunt modificate, prezenţa bacteriilor şi dispunerea acestora (ex. intra sau extra-
lă până când obiectul se gdseşfe în focarul fasciculului coriveigent care iese din condenbatof.'Ra­
leucocitar), morfologia bacteriilor, morfologia unor paraziţi, morfologia levurilor, aspectul
zele de lumină, înainte de intrarea în condensator, trec printr-un suport de filtre şi o diafragmă
frotiurilor de sânge etc
iris (diafragmă de apertură). Condensatorul contribuie în mod esenţial la luminozitatea imaginii.
• frotiu colorat cu albastru de metilen (A.M.)/putem vizualiza: bacterii colorate în albas­
Examinarea folosind microscopul optic iîn câmp luminos tru închis, în cazul bacteriilor capsulate, capsula va apărea ca un halou necolorat, celule
diferite (în funcţie de sediul recoltării) şi celule inflamatorii pentru care nucleul apare
; -1. Exam inarea unui p re p a ra t proaspăti(între lamă,şi temelă)kif. in; ii J
într-o culoare albastru mai închis în timp ce citoplasmă apare Cu nuanţe de albastru;
Pe lamă se depil ne o picătură di n suspensia care Urmează a fi examinată, se acoperă' cir1'6 coloraţia cu A.M. perm ite o. mai bună diferenţiere a detaliilor structuralei
lamelă, se aşează pe platina microscopului şi se fixează cu ajutorul „cavalerilor**. ■ • j • frotiu colorat Giemsa/putqm vizualiza: hematii (roz-roşii), poiimorfonucleare neuţrp-
Condensatorul este coborât circa 1,5 cm sub platină, diafragrnul este semi deschîsi 'iâr fileicitoplasmă roz, granulaţii brune, nucleu violaceu), poiimorfonucleare eozinofilq,
obiectivul 40x este coborât până deaSupra lamelei (privind prin lateral). ■'/ (citoplasmă roz, granulaţii brune, nucleu violaceu), limfocke şi macrofage (citoplasmă
Privind prin oculare, rotim foarte încet macroviza ridicând uşor tubul microscopului albastră, nucleu violaceu), bacterii colorate în .vinlet. fonne tioRce de Pneunwcysiis
până apare câmpul microscopic. Punem la punct imaginea cu âjutbriiî microVizei $ reglând carinii (nucleu roşu, citoplasmă albastră), Histoplasma capsulai uni; In citoplasmă
lumina prin modificarea fantei condensatorului.
\ r » ~ < Q *> (
Diagnosticul de laborator în microbioiogie S Tehnica examenului microscopic în diagnosticul microbiologic

celulelor fagocitare (levuri colorate în roşu), incluziuni de Chlamydia trachomatis Pentru a evita reflexia totală a razelor, înainte ca obiectul să fie luminat, acesta este imer-
(corpusculii reticulaţi apar albaştri, corpusculii elementari apar roşii) etc; sat într-o peliculă de lichid (lichid de imersie cu indice de refracţie mai ridicat, ex. gliceri­
na). Lamele trebuie să aibă grosimea de 1 milimetru (distanţa focală a condensatorului fiind
• frotiu colorat Gram;
1,2 milimetri).
• în cazul în care frotiul a fost realizat din cultură purăputem vizualiza micro--
organisme cu aceeaşi formă, aceleaşi dimensiuni (excepţie Prbteus spp:), o anu­ Tehnica de examinare v .

___
mită dispoziţie, cu sau fără capsulă (halou necolorat), grarb pozitive (colorate în
violet)jjau gram negative (colorate în roşu), levurile se colorează în violet; După centrarea diafragmei de câmp folosind obiectivul cu mărire 10x şi condensatorul
• în cazul în care frotiul a fost realizat din produs patolojic putem vizualiza celule pentru câmp luminos, trebuie să înlocuim acest condensator cu condensatorul cardioid.
diferite (în funcţie de sediul recoltării) şi celule inflamatorii pentru care nucleul şi Condensatorul cardioid este cu diafragma închisă. Ridicăm condensatorul până la nivelul
citoplasmă apar în diverse nuanţe de roşu, bacterii gram pozitive şi/sau gram nega­ platinei microscopului şi punem pe lentila condensatorului o picătură de glicerină.
tive, fibrină şi levuri care se colorează în violet etc; 1 ! Pregătim preparatul proaspăt (între lamă şi lamelă) şi îl plasăm pe platina microscopului
• frotiu colorat'Ziehl-Neelsen sau Kinyoun/putem vizualiza: bacili de culoareîoşie, re­ astfel încât să vină în contact cu glicerina de pe lentila condensatorului. Fixăm preparatul cu
ajutorul „cavalerilor". . . .
lativ fini (în cazul prezenţei BA'AR), alte bacterii (ne-AÂR) ' celule djferite (în funcţie
de sediul recoltării) şi celule inflamatorii de culoare albastră (toate structurile ne-AAR Examinăm iniţial cu obiectivul 10x, apoi cu obiectivul 40x coborât până aproape de
apar colorate albastru) etc; în cazul colorării unui frotiu din cultură pură vom evidenţia suprafaţa lamelei; punem la punct imaginea cu ajutorul microvizei. Când obţinem imaginea
numai bacili de culoare roşie. ■-J curgerii curentului de lichid ştim că am „prins" câmpul microscopic. Utilizând mai departe
microviza punem la punct detaliile şi apoi înregistrăm ceea ce am examinat.
întreţinerea microscopului Examinarea la microscopul cu fond negru este indicată în mod special pentru exami­
narea morfologiei şi mobilităţii pentru Treponema pallidum în serozitatea din şancrul sifili­
După terminarea examenului microscopic trebuie efectuate următoarele proceduri:
tic sau pentru Leptospira spp. în produs patologic (ex. urină) sau din medii de cultură.
• închidem sursa de lumină; • lichidul clar recoltat şi şancrul sifilitic trebuie examinat în maxim 20 minute după
• ridicăm cu ajutorul macrovizei tubul microscopului; recoltare; putem vizualiza spirochete luminoase, fine, lungi, cu spire regulate, capete
• coborâm condensatorul; ,• efilate, cu mişcări de înşurubare, flexie, translaţie, pe fond negru;
• scOatem lama (sau lama şi lamela) de pe platina microscopului; • în preparatul proaspăt care conţine leptospire putem vizualiza filamente luminoase, spi­
o preparatele proaspete le punem în borcanul cu amestec dezinfectant; ralate, foarte mobile, cu mişcări de înşumbare şi flexie, pe fond negru.
• preparatele fixate (pe care urmează să le păstrăm) se introduc într-un container cu
xilol (1-2 minute) apoi, după evaporarea xilolului se pun într-o cutie; Microscopul cu contrast de fază
• ştergem lentila obiectivului cu imersie cu pulpa degetului sau cu o hârtie moale, spe­ Pentru acest tip de examinare este necesar să avem în dotarea microscopului o serie de
cială, pentru a o curăţa de uleiul de cedru (periodic, vom şterge lentila acestui obiec­ piese strict necesare, respectiv: un condensator special care include o serie de diafragme
tiv cu un tifon foarte curat îmbibat în xilol); inelare, obiective de fază (de fapt obiective obişnuite la care în planul focal superior a fost
• curăţăm platina microscopului şi lentila condensatorului cu tifon curat îmbibat în xilol; montată o placă de fază; obiectivele de fază sunt gravate cu ,,Ph“), oculare de centrare,
• acoperim microscopul cu o husă de plastic sau pânză, pentru a-1 feri de praf; , lampă cu intensitate luminoasă mare, filtru verde.
• pentru a preveni efectul nedorit al multiplicării unor fungi asupra sistemului optic, (o Folosind microscopia cu contrast de fază este posibilă observarea obiectelor transparente
recomandare ar fi menţinerea microscopului într-un ambalaj de polietilenă împreună care prezintă variaţii de grosime sau variaţii ale indicelui de refracţie în structura lor. Sunt
cu o substanţă desicantă, spre exemplu silicagel. . c m: utilizate preparate microscopice proaspete. Faptul că aceste preparate nu sunt fixate şi co­
lorate permite examinarea unor caracteristici care ar putea fi alterate în cursul acestor pro­
Microscopul cu fond întunecat (negru). '. I cese. Se pot examina structuri citoplasmatice, morfologia celulară, dar şi structuri bacteriene
sau fungice.
Pentru acest tip de examinare este utilizatun microscop optic obişnuit la care se adap­
tează o sursă de lumină cu intensitate mare şi un condensator cardioid (cu oglinzi sferice
Microscopul cu fluorescentă
concentrice), cu posibilităţi de diafragmare a luminii. Condensatorul pentru câmp întunecat
(fond negru) opreşte accesul spre obiectiv al razelor de lumină directe, iar obiectul este ilu­ Microscopul cu fluorescenţă trebuie să fie dotat cu următoarele piese speciale: sursa de
minat oblic. Astfel o pane dintre razele difractate şi reflectate de obiectul iluminat oblic radiaţii (de ex. o lampă din sticlă de cuarţ cu vapori de Hg care emite radiaţii ultraviolete),
pătrund în obiectiv careapare luminos pe fondul întunecat al câmpului. setul de filtre (caloric, de excitaţie, de baraj), condensatorul pentru fond întunecat.
44 Diagnosticul de laborator în microbiologie

Filtrele au următoarele roluri. Filtrul caloric absoarbe radiaţiile calorice emise de lampă MEDII DE CULTURA
(sursa de radiaţii emite atât radiaţii ultraviolete cât şi radiaţii luminoase şi calorice). Filtrele
de excitaţie permit numai radiaţiilor cu lungime de undă mică (ex. ultraviolete) su acceadă
către preparatul microscopic. Aceste radiaţii reprezintă radiaţii de excitaţie. Filtrele de baraj
sunt de fapt filtre de protecţie pentru că nu permit trecerea radiaţiilor de excitaţie nocive să
treacă spre ocular şi respectiv spre ochiul examinatorului, în
rocromi trece şi poate fi percepută. Filtrele de excitaţie şi de baraj sunt alese în funcţie de
Populaţia = o multitudine de indivizi ai unei specii care habitează într-un anumit
fluorocrcţinul,Utilizat. M. , r :;Fj Ţ .;; v.i.ifi x»t :ţî<’«v-y. tîfi' biotop. Clona reprezintă populaţia care rezultă dintr-o'singură celulă prin înmulţire
Condensatorul măreşte contrastul imaginii mai bine decât un condensator obişnuit. •••
vegetativă. Tulpina = populaţia microbiană alcătuită din descendenţii unei singure
Pentru examinarea În fluorescenţă mai suht.hecesare câteva elemente, respectiv obiec­ izolări în cultură pură.
tivele acromate (cu menţiunea că obiectivul cu imersie trebuie să aibă diafragmă iris), uti-
1izarea unui lichid‘de imersie care nu se usucă1uşor, şi•este lipsit; de proprietatea de fluo­ în funcţie de temperatura de dezvoltare, microorganismele pot fi mezofile, psi-
rescentă (ex. glicerina tamponată neutră) şi respectiv lame cu grosimea de ^milimetru. Este chrofile sau termofile. Bacteriile studiate de microbiologia medicală sunt în imensa
preferabilă utilizarea unui dispozitiv monocular, . lor majoritate mezofile (au temperatura optimă 'de dezvoltare cuprinsă între 30-
37°C). Pentru fungi, temperatura optimă de dezvoltare este în jur de 28°C.
Examinarea folosind microscopul cu fluorescentă Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecţii trebuie ca dintr-un produs
Preparatele microscopice (care pot include bacterii) sunt tratate cu flurocromi (coloranţi
recoltat de la pacient să obţinem mai întâi respectivul microorganism în cultură pură,
fluorescenţi). Fluorocrbmii sunt compuşi organici care, după „iradiere" cu radiaţii ultravio­ pentru ca ulterior să i se poată studia caracterele fenotipice sau genotipice. Cultivarea
lete absorb radiaţia excitantă, intră în stare de excitaţie, iar atunci când revin în „starea nor­ este esenţială şi pentru determinarea sensibilităţii la antibiotice şi,chimioterapice.
mală" pierd energia acumulată emiţând radiaţii luminoase. Dintre fluorocromi ani putea Metodele de cultivare a bacteriilor sau fungilor urmăresc trei obiective: obţine­
aminti auramina O, rhodamina B, acridin-oratij R sau tripaflavina. Lumina vizibilă emisă rea unei populaţii microbiene suficiente cantitativ pentru investigaţiile propuse, pre­
depinde de fluorocromul utilizat (spre exemplu culoarea este galbenă pentru auramina O, venirea contaminării produsului cercetat cu un microorganism, străin şi izolarea
gaiben-portocalie pentru combinaţia de auramina O - rhodamină B etc).
fiecărei tulpini microbiene urmărite în cazul unui produs plurimicrobian în culturi
Sun/de menţionat în mod special acele substanţe care se pot legă covalent de anticorpi, monomicrobiene denumite „culturi pure". Nu există un mediu unic, valabil pentru
marcând astfel complexele antigen-anticorp care devin fluorescente. Atunci când marcajul
cultivarea oricărui microorganism.
se realizează cu izotiocianat de fluoresceină lumina emisă va avea culoare verde, iar dacă
marcajul se realizează cu lisamin-rhodamină, lumina emisă va avea culoare portocalie. Termenul „însămânţare" defineşte operaţia de introducere a unei cantităţi de ger­
Drept exemplu privind utilizarea microscopiei cu fluorescenţă vom menţiona exami­
meni într-un mediu de cultură artificială, în timp ce pentru culturile celulare, ouă
narea fiotiurilor colorate fluorescent sau imunofluorescent în diagnosticul bacteriologic al embrionate şi mai ales animale de experienţă folosim termenul „inoculare".
tuberculozei sau al leprei.,Alte exemple vor fi prezentate în cadrul capitolului 20. Cultivarea se realizează prin însămânţarea microorganismelor pe medii de cul­
tură. Mediile solide sau lichide care asigură nutrienţii şi condiţiile fizico-chimice
necesare creşterii şi multiplicării se numesc medii de cultură. Totalitatea microor­
ganismelor acumulate prin multiplicarea într-un mediu de cultură poartă numele de
cultură (bacteriană, fungică etc).
••• . ' î • "••• , . ' ••• i • \ ) .'fii' :* *5?/
: î|î:Mî ,,
: ;■ ii- (:%,• A'*. '■\ V, '•*/ . f * *J: ; .. t;vşrf,' (/: -jj:
Există o foarte mare varietate de medii de cultură.
Mediile de cultură se pot clasifica după măi multe criterii. în primul rând, în
funcţie de conţinutul în celule vii avem la dispoziţie:
1. Medii necelulare (artificiale, medii de
f: i 2. Medii celulare (care includ celule vii) şi anume animale de laborator, ouă de
, j; găină embrionate sau culturi de celule.
Diagnosticul de laborator în microbiolcgie Medii de cultură
46 47

. Există anumite microorganisme (ex. virusuri, 'Rickettsii, Chlamydii) care nu pot Culturi de celule
fi cultivate decât pe substraturi care includ celule vii. Majoritatea bacteriilor, fungii
Există posibilitatea utilizării unor culturi de organ sau a culturilor de celule disper­
şi unele protozoare se pot cultiva şi pe medii de cultură (necelulare, artificiale).
sate. Acestea din urmă se pot clasifica în culturi primare, tulpini celulare şi linii celulare.
Culturile primare derivă din dispersia enzimatică (de ex. cu tripsină-EDTA) a
Gazdele vii (medii celulare)
celulelor unui organ proaspăt recoltat şi pot fi menţinute in vitro pentru 3-5 pasaje.
Tulpinile celulare reprezintă culturi cu un singur tip de celule (culturi omogene) şi
Animalele de experienţă .. _ ...,, ,s
pot fi menţinute in vitro pentru 50-60 pasaje. Liniile celulare continue (stabile) sunt
Fie în situaţia microorganismelor care nu se dezvoltă pe medii artificiale, fie în populaţii celulare care derivă din ţesut normal sau malign şi pot fi subcultivate
cazul în care se studiază caracterele de patogenitate, se pot utiliza în funcţie de spe­ (respectând indicaţiile din protocol) în mod nelimitat. Au fost puse la punct foarte
cia microbiană şi scopul urmărit: şoarecele alb, cobaiul, şobolanul, hamsterul şi multe linii celulare spre exemplu:
iepurele. Pentru producerea de seruri imune sunt folosiţi, cai. Animalele de labora­ • linii celulare derivate din rinichi de maimuţă (Vero, BSC-1, BGMK etc),
tor necesită condiţii speciale de întreţinere iar biobaza trebuie, să respecte o serie de şoarece (McCoy), ovar de hamster (CHO);
norme care să garanteze calitatea acestor gazde vii. Astfel se explică costurile ridi­ • linii celulare derivate din carcinom de col uterin (HeLa), laringe (HEp-2);
cate în ceea ce priveşte acest,tip de „medii",,. . ,, . .. . . • lipii celulare limfoblastoide (MT-4, H9 etc) etc.
Având în vedere microorganismul inoculat, susceptibilitatea gazdei şi scopul Pentru Chlamydia trachomatis se pot utiliza liniile celulare BGMK, HeLa,
urmărit se pot inocula animale cu vârste diferite (embrioni, nou-născuţi, animale tinere, McCoy, pentru Chlamydia pneumoniae se pot utilizat liniile celulare HeLa, HEp-2,
adulţi) pe căi diferite de inoculare (per cutanat, prin scarificare, subcutanat, instilare la pentru Chlamydia psittaci se poate utiliza linia celulară McCoy etc. Liniile celulare
nivelul anumitor mucoase, per os, intramuscular, intravenos, intrateşticuiar etc). pot fi utile şi în vederea studierii efectului unor exotoxine, spre exemplu în cazul
Aşa cum, spre exemplu, virulenţa Mycobacterium tuberculosis scade pe măsură toxinelor produse de E. coli 0157:H7 şi respectiv de Shigella shiga se poate utiliza
ce microorganismul este cultivat pe anumite medii de cultură (aspect dovedit şi prin linia celulară Vero în timp ce pentru toxinele produse de Vibrio cholerae şi E. coli
obţinerea'tulpinii vaccinale BCG.deM. tuberculosis varianta bovis), în sens invers, '!# entero-toxigen se poate utiliza linia celulară CHO.
este necesară uneori exacerbarea virulenţei, prin pasaje repetate realizate pe gazde
susceptibile. Alte exemple pot fi discutate în raport cu Streptococcus pneumoniae, M edii artificiale (neceluiare)
Shigella spp., Klebsiella pneumoniae, Treponema pallidum, Rickettsia spp.,
Mediile de cultură artificiale sunt mai ieftine, se pot prepara mai uşor (folosind
Chlamydia spp şi Candida spp. , < . reţete foarte asemănătoare celor „de bucătărie" sau alte variante despre care vom
Oul de găină embrionat discuta pe scurt în continuare) şi, fără a fi „ideale", sunt cel mai frecvent utilizate în
practicat microbiologică.
Are avantajul unui preţ mai scăzut, este în mod normal steril (în condiţiile pro­
Condiţii impuse mediilor de cultură artificiale:
ducerii acestor „gazde vii“ în unităţi specializate), nu prezintă factori antimicrobi-
eni în perioada în care se realizează în mod obişnuit inocularea (la 6-14 zile de - să*!# sterile,
incubaţie). 1!\ ■>' ' ■ r. - să fie nutritive (să conţină factorii de creştere necesari),
Oul de găină este întâi examinat la ovoscop pentru evaluarea embrionului şi j - să aibă un anumit pH (cel mai adesea între 7,2-7,6),
prezenţei unor eventuale modificări nedorite. în ‘condiţii de strictă asepsie puljde/ - să aibă o anumită presiune osmotică,
găină embrionat se poate inocula intraembrionar (intramuscular, intracerebral,etc)/ - să aibă umiditatea favorabilă multiplicării germenilor
la nivelul membranei chorioalantoidiană, în sacul alantoidian sau în sacul amniotic,! - alte condiţii.
Oul inoculat se introduce în incubator, la 37°C în condiţii, de bună ventilaţie a aeru­
Clasificarea mediilor de cultură artificiale
lui şi umiditate corespunzătoare, pentru 1 sau mai multe zile! Se poate utiliza
această metodă pentru izolarea şi identificarea tulpinilor rickettsiene (utilizând , Mediile de cultură artificiale se pot clasifica după o serie de criterii.
metode imunologice, ex . reacţia de microaglutinare).
("
I Medii de cultura 49
1
48 Diagnosticul de laborator în microbiologie

albastru de brom-timol lactozat (AABTL) permite diferenţierea bacteriilor lactozo-


• după starea de agregare, mediile de cultură artificiale pot fi: pozitive (cum este E. coli) de bacteriile lactozo negative (Shigella, Salmonella etc).
• solide (agar/geloză, agar-sânge, AABTL, ADCL, Bordet-Gengou, Chapman, Alte exemple: ADCL (agar dezoxicolat citrat lactoză), TSI (3 zaharuri şi fier), MIU
Loffler; Lowenstein, Mueller-Hinton, Sabouraud, TCBS.TSI etc) (mobilitate indol uree).
®lichide (apă peptonată alcalină, bulion Mueller-Hinton, bulion nutritiv, bulion- Iniţial, toate mediile de cultură erau preparate în laborator, din ingredientele sta­
sânge, bulion, selenit, bulion tioglicolat, Middlebrook 7H9, OCST etc) bilite conform reţetei. Etapele generale pentru producerea unui mediu sunt asemă­
• semisolide (Cary-Blair, MIU, Stuart etc) t <■•.«.: ■ :; ■•■; •■ nătoare:
® după com plexitatea ingredientelor, m ediile pot f i : : ••••:>••• r:. . mumv ■ • cântărirea ingredientelor; i
®simple (agar, bulion simplu etc) • dizolvarea în apă distilată sau apă deionizată;
o complexe (agar-sânge, geloză-chocolat, agar cu factori X şi V, Bordet-
• verificarea pH-ului şi ajustarea la pH-ul corect;
Gengou, Mueller-Hinton etc) ' .‘
• filtrarea;
• după scopul urmărit mediile de cultură artificiale pot f i i '' j- ;
®de transport (apă peptonată alcalină, Cary-Blair, Stuart etc) • sterilizarea (de regulă prin autoclavare);
• de izolare (agar-sânge, Bordet-Gengou, Loffler, Lowenstein; Sabouraud etc) • repartizarea în tuburi, flacoane etc.
®de identificare (TSI, MIU, truse API etc) în momentul de faţă foarte frecvent se recurge la cumpărare de medii deshidra­
o de conservare (agar nutritiv în coloană etc) tate, situaţie în care este necesară doar adăugarea apei distilate, demineralizate sau
• după conţinutul în apă, mediile pot fi: distilate şi demineralizate (conform recomandărilor producătorului), condiţionarea
şi sterilizarea prin autoclavare sau metoda recomandată pentru mediul respectiv.
®cu umiditate obişnuită j
o medii uscate (deshidratate) Există de asemenea medii gata pentru utilizare, condiţionate în plăci Petri sau tuburi.
• medii speciale: , . Indiferent de forma de condiţionare a mediilor de cultură precum şi indiferent de
• Elective (Loffler etc) , ii: , modul de procurare al acestora, laboratorul care le utilizează trebuie să le supună
• selective (agar-sânge azid de sodiu, BSA, Chapman, Mac Conkey, controlului de calitate.
Tinsdale cu telurit de potasiu, medii cu antibiotice etc) * . <; 1 Spre exemplu, pentru a testa sterilitatea mediului agar-sânge, incubăm 2 plăci la
-y 37°C timp de 48 de ore; nu trebuie să apară modificări macroscopice. Pentru a testa
o de îmbogăţire (apă peptonată alcalină, bulion selenit, OCST etc)
V
• diferenţiale (AABTL, ADCL, agar-sânge, MIU,TSI, TCBS etc): performanţa mediului (eficienţa biologică) utilizăm o alta placă. Pe câte o jumătate
» există şi alte criterii de clasificare. de placă vom cultiva o tulpină de colecţie de Streptococcus pyogenes şi respectiv o
i;î
tulpină de colecţie Streptococcus pneumoniae; incubăm placa Petri pentru 18-24
Mediul electiv conţine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltării unei anumi­
ore la 35-37°C şi apoi analizăm dezvoltarea culturii, caracterele coloniilor şi respec­
te bacterii (de exemplu mediul Loffler, cu ser coagulat de bou, pentru barilul difteric).
tiv caracterele hemolizei produse.
Prin conţinutul său în substanţe antimicrbbiene, mediul selectiv inhibă dezvol-,
în general, mediile de cultură după producere şi până în momentul utilizării sunt
tarea altor bacterii decât cea a cărei izolare se urmăreşte. De exemplu, mediul cu
conservate la adăpost de lumina solară, +4°C, în folie de plastic închisă ermetici
telurit de potasiu pentru izolarea bacilului difteric sau medii îri care includem antibi­
Mediile pentru anaerobi (bulion tioglicolat, alte medii) se păstrează în dulapuri, la
otice (faţă de care bacteria care se doreşte a fi izolată este rezistentă).! j
întuneric şi temperatura camerei.
Mediul de îm bogăţire favorizează înmulţirea anumitor 'bacterii patogene,
inhibând dezvoltarea florei de asociaţie dintr-un produs patologic. Funcţionează Descriere succintă pentru unele medii mai frecvent folosite
concomitent ca mediu selectiv şi ca mediu electiv. "■■■•/
Mediul diferenţial conţine un indicator de pH şi un anumit substrat (de exeln- Agar-sânge
plu un zahar) care poate fi sau nu metabolizat, determinând modificarea pH-ului şi Include agar nutritiv bază care se dizolvă la temperatură ridicată şi prin agitare
a culorii indicatorului sau modificarea aspectului culturii. De exemplu, agarul cu în apă distilată; autoclavăm (15 minute la 121°C) şi apoi răcim până la 50°C. La
Diagnosticul de laborator în microbiologie Medii de cultură
50 51

această temperatură adaugăm în proporţie de 5% sângele .defibri nat (sânge de Cary-Blair este un mediu de transport în special pentru germeni gram negativi.
berbec, cal, bou sau de iepure; sângele de om ar putea fi utilizat numai dacă nu Lowenstein-Jensen
există o altă posibilitate, folosind de exemplu sânge care a depăşit limita de vala­
bilitate într-o bancă de sânge). Distribuim mediul în condiţii aseptice, în plăci Petri. Reprezintă mediul clasic utilizat în mycobacteriologie. Include 3 componente
Poate fi menţinut la +4°C până la 4 şăptărrţâpi.Ss , principale: o soluţie de săruri şi amidon, soluţia de verde malachit şi omogenizatul
de ouă (proaspete şi bine antiseptizate). După filtrare produsul se repartizează în
Agar-chocolat ! tuburi (cu capac înşurubat, ţinând cont de timpul lung de incubare, 2-8 săptămâni).
Mediul este coagulat în pantă, la 85°C şi după răcire se poate menţine la tempe­
Procedăm ca mai sus, până la obţinerea amestecului de agar-sânge. Introducem fla­
ratura frigiderului câteva luni, până la utilizare.
conul cu mediu în baie de apă şi menţinem timp de 10 minute la 80°C; astfel eritrocitele
vor elibera factorii nutritivi necesari dezvoltării unor. bacterii mâi pretenţioase din M ac Conkey
punct de vedere nutritiv. Când temperatura revine la 50°C turnăm mediul în plăci Petri. Este un mediu slab selectivo-diferenţial care include hidrolizat de gelatină,
Se poate conserva la temperatura frigiderului pentru nu mai mult de 4 săptămâni. hidrolizat de cazeină, lactozâ, săruri biliare, clorură de sodiu, roşu neutru (indicator
. ' . . . I
de pH), cristal violet şi agar, dizolvate în apă distilată şi autoclavate timp de 15
Amies minute la 121 °C. Poate fi menţinut la +4°C până la 4 săptămâni.
Include agar, tioglicolat de sodiu, cărbune farmaceutic neutru (pentru a facilita Medii pentru anaerobi
supravieţuirea microorganismelor fragile, de ex. Neisseria gonorrhoeae) şi o soluţie
tamponată de săruri anorganice. Nu conţine indicator redox. Este sterilizat prin Există mai multe tehnici pentru a asigura condiţiile de anaerobioză. Relativ
autoclavare şi poate fi menţinut la -f4°C timp de 12 luni. frecvent se utilizează montarea plăcii Petri, care conţine deja mediul de cultură răcit
şi însămânţat, răsturnată pe capacul propriu, pe care se găseşte un pliculeţ care
Este un mediu de transport care limitează şi multiplicarea unor eventuali coli-
conţine amestec reducător (pirogalol, talc, carbonat de potasiu). Utilizăm parafină
fonni de contaminare (ceea ce nu se realizează prin folosirea mediului Stuart).
/■: ■ • • încălzită pentru a etanşeiza placa. După solidificarea parafinei, mediul de cultură
Apă peptonată alcalină este incubat în vederea obţinerii coloniilor.

Este un mediu utilizat pentru transportul probelor în care se suspectează prezenţa Medii pentru fungi
Vibrio cholerae. Include peptonă şi clorură de sodiu dizolvate prin încălzire în apă Vom discuta pe scurt doar un mediu mai frecvent utilizat, respectiv mediul
distilată, cu ajustarea pH-ului la o valoare de 8,6-9,0. Mediul este repartizat în Sabouraud. Acesta include glucoză, digestie pancreatică de cazeină şi agar care se
tuburi. Sterilizăm prin autoclavare (15 minute, 121°C). Valabilitatea este de circa 6 dizolvă prin uşoară agitare, la cald, în apă distilată. După ajustarea pH-ului la 5,6
luni (la temperatura de 4°Q- urmează fierberea şi filtrarea mediului, la cald. Apoi are loc repartizarea în plăci
Petri sau în tuburi şi acestea se autoclavează timp de 15 minute la 12i°C. înainte de
Bulion selenit /- utilizare, plăcile cu mediu Sabouraud pot fi stocate la temperatura frigiderului pen­
Este un mediu de îmbogăţire, utilizat pentru izolarea Salmonella spp. Include i tru circa 2 luni. De multe ori acest mediu devine selectiv prin adăugare de antibio­
printre alte componente selenit acid de sodiu. Datorită riscurilor acest ipediu nu va 1 tice (cloramfenicol, gentamincină etc).
fi pregătit de femei însărcinate, iar cei care îl produc vor avea grijă să nu.inhaleze Despre mediile multitest TSI (triple sugar iron) şi MIU (mobilitate indol uree)
sau înghită această substanţă. Sterilizarea mediului turnat în tuburi se face în baia vom discuta în cadrul capitolelor 12 şi 28.
de apă la temperatura de fierbere şi nu prin autoclavare. Se poate conserva la tem­ Stuart
peratura frigiderului timp de 6 luni. j
Include agar, tioglicolat de sodiu, glicerofosfat de sodiu, clorură de calciu şi
Cary-Blair albastru de metilen, dizolvate prin încălzire la temperatura de fierbere în apă disti­
.. ■_ ...» - /
Include agar,. tioglicolat de sodiu şi o soluţie tamponată de săruri anorganice, lată. Este sterilizat prin autoclavare şi poate fi menţinut la +4°C timp de 2-3 luni.
dizolvate (prin încălzire şi agitare) în apă distilată. Este sterilizat prin autoclavare şi Este un mediu de transport universal; bacteriile pot supravieţui 1-3 zile.
poate fi conservat la temperatura frigiderului mai multe luni.
O Tehnici de cultivare 53

TEHNICI DE CULTIVARE v;;


V:1.
A şa cum am m enţionat şi în capitolul 9, tehnicile de cultivare urm ăresc trei
fi obiective:
• obţinerea unei populaţii microbiene suficiente cantitativ pentru scopul propus;
® prevenirea contaminării produsului cercetat cu alte microorganisme şi •
•i • izolarea fiecărei tulpini microbiene urmărite în cazul unui produs plurimicro-
Tehnicile de cultivare se folosesc pentru obţinerea de colonii izolate prin însă-
mânţareă produsului patologic pe medii solide şi pentru repicarea coloniilor izolate bian în culturi monomicrobiene denumite „culturi pure". .
în vederea obţinerii de cultură pură, precum şi în alte situaţii:1' rinh.t 1 : fi - Nu există un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricărui microorganism.
Pentru a corela noţiunile pe care le vom prezenta cu ceea ce a fost prezentat în Este esenţial să se înţeleagă necesitatea obţinerii coloniilor izolate precum şi a
capitolele anterioare, facem următoarele menţiuni: culturilor pure în diagnosticul de laborator bacteriologic şi micologic (direct). în
• în capitolul 5 am discutat schema generală a diagnosticului microbiologic; cazul în care coloniile izolate reprezintă o cultură pură (formată din acelaşi tip de
f : microorganism), aceasta va fi utilizată în vederea identificării agentului etiologic
• acest diagnostic nu poate fi realizat în lipsa cunoştinţelor privind - ,i) & (bacteria izolată de la un pacient cu o presupusă boală infecţioasă) precum şi la efec­
o conduita în laborator şi a nOnnelor de protecţie a muncii (capitolul 2); î • tuarea antibiogramei în vederea stabilirii tratamentului „ţintit" (antibioticul la care
• echipamentul şi aparatura necesare (capitolul 3); ubhV- bacteria izolată este sensibilă). în situaţia în care nu s-a reuşit obţinerea culturii pure,
• dezinfecţiaşi sterilizarea.(capitolul 4).. . , >> pornind de la coloniile obţinute se vor face repicări pe medii de cultură neselective.
Toate acestea trebuie înţelese în contextul unei activităţi care să prevină erorile, O bţinerea de colonii bacteriene izolate dintr-un produs patologic se poate reali­
să realizeze protecţia pacienţilor, şă permită compararea rezultatelor la nivel, naţio­ #i za prin epuizarea inoculului pe m ediile de cultură folosind:
■)
nal şi internaţional, să contribuie la realizarea unei standardizări în microbiologia •rii; - ansa bacteriologică;
clinică românească şi să crească încrederea tuturor partenerilor din sistemul sanitar - pipeta Pasteur;
din ţara'noastră (capitolul 1), 1
1 - tamponul de vată montat pe o tijă;, .
Pornind de la aceste noţiuni de bază, în capitolele următoare am discutat:
- bagheta de sticlă în form ă de „L“ ;
• prima etapă a diagnosticului direct (bacteriologic sau micologic), în capitolul 6;
- alte tehnici de însămânţare.
• utilizarea examenului microscopic în a doua şi respectiv în a patra etapă (de
Ansa bacteriologică trebuie sterilizată înainte şi după fiecare utilizare a sa prin
identificare) a diagnosticului direct (capitolele 7 şi 8); i
încălzirea până la incandescenţă („la roşu") a buclei şi firului urmată de flambarea
e substraturile pe care se poate realiza a treia şi respectiv a patra etapă (câteva portansei, pe când celelalte ustensile pentru însămânţare vor fi sterilizate prin alte
dintre caracterele examinate), în capitolul 9. metode (vezi capitolul 4).
în capitolul de faţă vom avea în vedere o parte dintre tehnicile indispensabile
diagnosticului microbiologic în general, subliniind utilizarea acestora în a treia şi ă Obţinerea coloniilor izolate prin epuizarea inoculului
patra etapă de diagnostic. : cu ansa bacteriologică
în capitolele următoare (11-13) vom pfezema o parte din elementele care defi­
însămânţarea „în pentagon deschis" a mediului solid aflat într.-o placă Petri
nesc complexitatea etapei de identificare ţ microorganismelor, iar în capitolul 14
folosind ansa bacteriologică, pentru obţinerea de cplonii bacteriene izolate, pornind
vom discuta o parte dintre modalităţile de stabilire a sensibilităţii la antibiotice, şi
chimioterapice (antibacteriene sau antifungice) cu ajutorul cărora, după încheierea de, la un produs patologic recoltat şi transportat către laborator într-o eprubetă/tub
închis cu dop de vată include următoarele etape:
unui diagnostic corect microbiologic, putem stabili în mod ştiinţific tratamentul
andmicrobian.ee trebuie prescris unui .anumit pacient care prezintă o boală infec-, • atenţie: toate activităţile se desfăşoară în stricta vecinătate a becului de gaz!
ţioasă de etiologic bacteriană sau fungică. / • atenţie: pe suprafaţa mediului de cultură poate'exista lichid de condens
care ar putea facilita contaminarea culturii bacteriene; este necesar ca placa
Petri cu mediu de cultură pe care dorim să facem cultivarea să fie menţi-
Diagnosticul de laborator în microbiologie 1 0 Tehnici de cultivare 55
54

nută în termostat, cu mediul în sus, întredeschisă, pentru evaporarea con­ logic se vor trasa linii (striuri) aproximativ paralele între ele, ca un „zig-zag“
densului! (fără a se ridica ansa de pe mediul de cultură) reprezentând o primă latură a
'• se sterilizează ansa bacteriologică la flacăra becului de gaz prin aducerea la unui pentagon deschis; ' 1
incandescenţă a buclei şi firului ansei urmat ,de flambarea portansei (trecere • se închide placa Petri;
prin flacără de 2-3 ori); •, p -vT.v ■■■ • ansa se sterilizează la flacără, portansa se flambează;
• se notează pe placa cu. mediu de cultură data! inoculării,, numărul de identifi­ • se răceşte ansa (se poate încerca răcirea ei prin atingere pe suprafaţa mediului
care ,şi tipul produsului (tipuţ produsului ppaţe- fi. inclus,printij-un simbol în solid steril, neînsămânţat, lângă peretele exterior al plăcii Petri);
numărul unic de identificare); j; , : .v . , ; ... -i . ..vi ... • fără să se mai încarce ansa cu produs patologic se trasează a doua latură a pen­
• se iareprubeta.eu produs patologic în, mâna, stângă ,,(în;,cazul,în careTiind tagonului intersectând-o pe prima, tot ca „linii paralele", după care ansa se va
dreptaci, ansa bacteriologică este ţinută în mâna drgaptă, ca un creion), sp scoate steriliza din nou;
dopul eprubetei utilizând în acest scop degetele 4-5 de la . mâna (jlreapţă;. ' • se va proceda la fel ca mai sus şi pentru următoarele laturi având grijă să nu se
• atenţie: să nu se scape dopuldin mână = pericol de contaminare'a mesei unească ultima latură cu prima latură
delucru! ■ ■ ■ '■ - v '■ "Jl! o în momentul intersectării cu ansa a laturii precedente a poligonului, ansa
• atenţie: dopul nu trebuie strâns îii podul pâlniei = pericol de cbntâniinare! este „reîncărcată" cu microorganisme, dar în „cantitate" din ce în ce mai
i. ■, . : V 'liio : - i * n i 'V. •.-•îlltlj' - : mică, până ce se va ajunge la câteva celule microbiepe izolate care, disemi­
• se flambează gura eprubetei (trecere prin flacără de 2-3 ori, imprimând o
• „ . , ■■ . ■... :• “ li.‘ i.■'.(';!?'■!;; >1. ‘ ym: •" nate pe placă vor da naştere la colonii microbiene izolate
uşoara mişcare de rotire m ambple sensuri);
• se introduce placa Petri pe care a fost realizată cultivarea în termostat, răstur­
• se introduce ansa în eprubetă fără să se atingă gura sau pereţii acesteia în
partea superioară, se răceşte bucla pe pereţii eprubetei în vecinătatea produsu­ nată (cu mediul în sus şi capacul în jos), la temperatura optimă multiplicării
lui patologic şi se încarcă bucla ansei din profunzimea produsului patologic, microorganismului suspectat (pentru cele mai multe bacterii termostatul va fi
( reglat pentru o temperatură de 35-37°C, pentru fungi la 28°C);
recoltând fragmente care ar putea include cu o mai mare probabilitate bacterii
implicate în procesul infecţios (ex. porţiuni cu aspect purulent); • după o perioadă de incubare de 18-24 ore (pentru cele mai multe dintre micro­
organismele studiate), pe prima latură se va obţine cea mai importantă canti-
• se scoate ansa fără sa atingem pereţii sau gura eprubetei;
tate de cultură (cultură microbiană confluentă), pe următoarele laturi se va
• atenţie: contaminarea pereţilor eprubetei în porţiunea în care se va,,mon- remarca „scăderea cantitativă" a culturii iar cel puţin pe ultima latură a „pen­
ta“ dopul, va duce la contaminarea dopului şi respectiv la o mare probabili­ tagonului deschis" se vor obţine colonii izolate.
tate de contaminarea a celui care va utiliza ulterior eprubeta/tubul cu pro­
Dacă mediul de cultură pe care s-a realizat cultivarea „în pentagon deschis" este
dus patologic! . 'i •/, neselecti v, coloniile izolate obţinute pot fi utilizate în etapele ulterioare (identificare
• se flambează gura eprubetei; ...... , , prin diferite metode, testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapiqe). în cazul
• se montează dopul la eprubetă printr-o mişcare de răsucire ce are ca scop ' în care cultura primară este obţinută pe un mediu selectiv, este obligatorie repicarea
fixarea lui; coloniilor izolate deoarece coloniile izolate vizibile pot fi asociate cu microorga­
• atenţie: gura eprubetei poate fi fierbinte după flambare! -vrji. i;.;ifc;'-/î jj nisme inhibate datorită selectivităţii mediului, cate nu se văd cu ochiul liber sau cu
lupa şi care se vor multiplica pe mediile de identificare făcând Imposibilă inter­
• atenţie: în toată această perioadă se contraindică efectuarea unor mişcărf
pretarea rezultatelor.
bruşte cu ansa încărcată cu produs patologic; mişcările bruşte şi'hecoritro|
late pot determina contaminarea cu produs patologic a mesei de lucru, a Tehnica descrisă este o tehnică de bază şi cu anumite modificări se poate utiliza
şi în alte situaţii (spre exemplu atunci când produsul patologic este recoltat în alte
mediului de lucru sau a celui care manipulează produsul patologic! •' /
tipuri de recipiente).
o după ce eprubetă a fost aşezată în stativ, m âna stângă eliberată va lua o placă
Petri pe care o va aşeza pe m asă cu capacul în jo s şi m ediul în sus;
® tot cu mâna stângă se va deschide placa iar cu ansa încărcată cu produs pato-
l
(

t
Diagnosticul de laborator în microbiologie Tehnici de cultivare 57
56

fiecare dată; alte lucruri cu im portanţă generală, m enţionate la tehnica


Alte tehnici de cultivare (însămânţare)
obţinerii coloniilor izolate prin epuizarea inocului cu ansa bacteriologică
Am ales pentru o prezentare am ănunţită tehnica obţiiierii cploniilpr,izolate prin răm ân valabile;
epuizarea inoculului cu ansa bacteriologică (însăm ânţarea „în pentagon deschis")
• scoatem tam ponul din tubul protector cu primele trei degete de la mâna
deoarece considerăm că această reprezintă o tehnică esenţială, care poate fi reţinută
dreaptă;
încă din al doilea an de studiu). în continuare vom prezenta alte tehnici de cultivare,
• flam băm gura tubului protector şi îl aşezam p e un stativ;
fără a epuiza toate variantele posibile. -<■ s ‘*
• cu m âna stângă luăm o placă Petri (caic nu mai prezintă lichid d e condens
în s ă m â n ţa r e a cu a n s a c a lib ra tă interior) pe care o aşezăm pe m asă cu capacul în jo s şi m ediul în sus;
® se, poatei utiliza pentru- urocultura şi în; ,alte, scopuriîn,care; aproximarea • tot cu m âna stângă deschidem placa iar cu dreapta descărcăm tam ponul
numărului de microorganisme dezvoltate pe mediul de cultură este utilă; încărcat cu produs patologic (există mai m ulte m odalităţi de descărcare a
• putem utiliza anse de platină sau anse de unică folosinţă pentru: 0,01 sau pen­ tam ponului, dintre care vom prezenta două).
tru 0,001 ml/calibrul anselor de platină trebuie verificat în fiecare lună;-, « descărcăm tam ponul prin rulare, pe toate feţele pe 6 rază, a plăcii, urm ând ca să
• urina recoltată corespunzător (vezi capitolele 6 şi 29)' se omogenizează prin dispersăm produsul cu o baghetă de sticlă în „L“, sterilă, pe toată suprafaţa plăcii;
răsturnarea de câteva ori a recipientului de recoltare (închis etanş); ® descărcăm tam ponul prin rulare, pe toate feţele p e un cadran al plăcii, urm ând
• respectând regulile lucrului aseptic, înclinăm recipientul de colectare în aşa fel încât ca să dispersăm produsul cu ansa bacteriologică în celelalte cadrane, ca în
să putem să punem bucla ansei, paralel pe suprafaţa urinei şi să prelevăm p.p.; m etoda „pentagonului deschis" (după însuşirea tehnicii, pentru econom ie, se
• pe o placă Petri cu mediul de cultură se descarcă urina în striu, pe unul dintre poate realiza cultivarea pe jum ătatea unei plăci).
diametre; apoi epuizăm inoculul pe toată suprafaţa plăcii în striuri perpendi­
culare pe striul „de descărcare", cu mişcări de zig-zag; : . ■ i! T e h n ic a d ilu ţiilo r succesive în lich id u l d e co n d en s al m e d iilo r solide
• după incubare, în ziua următoare vom număra coloniile apărute şi spre exem­ • mediul de cultură este turnat în eprubete sau tuburi; utilizăm mai m ulte eprubete;
plu vom înmulţi numărul de colonii cu 1000 dacă am utilizat pentru însă­ ® prelevăm cit ansa p.p. şi îl descărcăm în picătura de lichid de condens al
mânţare ansa de 0,001 ml; prim ului tub;
® din motive economice putem să realizăm însămânţarea în mod asemănător a
® fără să încărcăm din nou ansa cu p.p. o descărcăm în picătura de condens a
urinei pe o jumătate sau chiar pe o pătrime de placă.
celui de al doilea tub ş.a.m .d;
însămânţarea cu tamponul sau cu bagheta de sticlă în “L”
® după însăm ânţare, înclinăm eprubetele pentru a „scălda" suprafaţa mediului
• aceste tehnici se pot folosi atât pornind de la produs patologic (metodă prefe­ înclinat, cu picătura respectivă de lichid de condens, realizând în acest mod
rată în unele laboratoare) cât şi de la colonii care sunt utilizate pentru obţinerea dispersia m icroorganism elor din picătura de inocul, pe suprafaţa m ediului.
de cultură pură; r;ţ; .
• însămânţarea cu tamponul poate fi folosită şi pentru, realizarea antibiogramei T e h n ic a ep u iz ă rii an sei p e m ed ii solide
difuzimetrice;.■, , ■■ ;.>■/,-.j#■•..iA::'.-;.-' •r;:-J> .. .. • constă în efectuarea unei serii de însăm ânţări cu ansa bacteriologică încărcată
• vom prezenta în continuare vârianttr.în: care se,utilizează tamponul.pentru /cul­ o singură dată cu am estecul de m icroorganism e, într-un şir de eprubete cu
tivarea unui produs patologic (exsudat faringian etc), presupunând că suntem geloză înclinată, fără a steriliza sau a reîncărca ansa bacteriologică p e parcurs
dreptaci , , ,, , ■ ::;t; H ® însăm ânţăm pornind de la baza eprubetei, atingând mediul şi „urcând" prin
• notăm pe placa cu mediu de cultură data inoculării, numărul de identificare descrierea unor striu ri în zig-zag, pentru fiecare eprubetă în parte
şi tipul produsului (tipul produsului poate fi inclus printr-un simbol in nu­
o realizăm astfel o „epuizare" a conţinutului ansei, în final, ajungând să însă­
mărul unic de identificare) - nu vom mai nota această etapă la prezentarea
mânţăm num ai câteva celule m icrobiene, din care vor apărea după incubare
următoarelor tehnici dar menţionăm acum faptul că este obligatdrie, de
colonii izolate.
Diagnosticul de laborator în microbiologic Tehnici de cultivare
58 5.9

în s ă m â n ţa r e a p r in în ţe p a r e a m e d iu lu i t u r n a t în tu b u ri sa u e p ru b e te • se poate fold?! pentru depunerea inocuiului în vederea realizării antibiogram ei


difuzim etrice, pentru verificarea sensibilităţii la bacteriofag (lizotipie) etc;
• metoda se poate utiliza pentru conservarea culturilor pure ale unor tulpini con­
siderate reprezentative, a tulpinilor de colecţie, a tulpinilor de referinţă, pentru • după încărcarea pipetei cu cultura pură, inoculul se descarcă pe suprafaţa
însămânţarea unor medii multitest (TSI, MIU etc) etc; < a mediului solid din placa Petri, apoi se înclină în m o d 're p etat placa pentru
însăm ânţarea uniform ă a suprafeţei m ediului; v ■;
• se preferă utilizarea unei anse fir, sau a unei anse cu,o buclă mică’(după caz);
• excesul de inocul se aspiră cu pipeta Pasteur şi se descarcă în soluţia dezin­
o în funcţie de scopul urmărit există anumite variante ale acestei tehnici, iar tu­ fectantă;
burile (eprubetele) utilizate au dimensiuni diferite §i o cantitate de mediu care
• placa se lasă apoi lângă flacără pentru uscare, cu capacul întredeschis.
diferă (respectând protocolul de lucru corespunzător);
• spre exemplu în cazul însămânţării mediului TSI •<••• ■■ '••••? Tehnica diiuţiilor succesive în medii lichide
® se utilizează tuburi de dimensiuni mici, cantitatea ele mediu utilizată pentru • poate fi folosită pentru diluare unor suspensii antigenice, seruri, fagi etc;
un tub fiind de 3 ml; ■■i- ■>>•■■■■
• în acest scop folosim un şir de eprubete; în toate eprubetele repartizăm cu
« iniţial se însămânţează partea „dreaptă1*prin înţepare, fără a se atinge Baza tu­ aceeaşi pipetă o cantitate constantă soluţie salină fiziologică (ex. 0,9 ml în
bului; " fiecare eprubetă);
• ulterior se însămânţează partea „înclinată** prin realizarea unor striuri în e pipetele gradate sterile şi îm pachetate în hârtie se desfac în m om entul uti­
zig-zag, atingând suprafaţa mediului. lizării în m odul urm ător: rupem hârtia chiar la mijlocul pipetei, printr-o
m işcare de răsucire în sens opus a celor două m âini; tragem partea de hâr­
în s ă m â n ţa r e a cu se rin g a ■■■.,. i . tie care se term ină cu un capăt răsucit liber (corespunde porţiunii superioare
® produsele lichide (în special sânge pentru hemocultură dar şi alte p.p.) se pot a pipetei), de care vom ţine pipeta în tim pul lucrului; scoatem a doua ju m ă­
însămânţa direct cu seringa cu care s-a făcut recoltarea. tate a hârtiei fără a atinge partea efilată a pipetei şi astfel pipeta răm âne
sterilă pentru lucru;
în s ă m â n ţa r e a c u p ip e ta (P a s te u r sa u p ip e ta g r a d a tă , d u p ă caz)
• cu o . altă pipetă prelevăm 0,1 ml din cantitatea de suspensie m icrobiană şi
e la deschiderea şi închiderea recipientelor flambăm gura fiecăruia în parte, aşa introducem inoculul în prim a eprubetă; aspirăm şi elim inăm lichidul din pipetă
cum am prezentat mai sus; de câteva ori pentru om ogenizarea suspensiei; apoi punem pipeta se pune în
o înainte de a folosi pipeta, deşi sterilizată în prealabil, o vom flamba prin tre­ am estec sulfocrom ic;
cere pe aproape toată, lungimea prin flacără; • luăm o nouă pipetă cu care aspirăm 0,1 ml lichid din tubul 1 şi introducem
® pentru a preleva p,.p. din recipientul de transport precum şi pentru însămânţare acest lichid în tubul 2, aşa cum am m enţionat mai sus; schim băm pipeta şi
în mediul lichid sau solid, folosim un pipetor cât de simplu,(este contraindir repetăm m anevra p ân ă la ultimul tub; din ultim ul tub scoatem 0,1 ml p e care
îi elim inăm în am estecul dezinfectant.
cată aspirarea cu gura); ■ .7
®după încheierea însămânţării eliminăm lichidul rămas eventual în pipetă în fla­ Câteva tehnici de izolare speciale
conul cu amestec sulfo-cromic, introducem pipeta în amestecul sulfo-cromic 1. Metode fizice
şi aspirăm soluţia dezinfectantă până aproape de dopul de vată al pipetei; j
• încălzirea în, baie d e apă, tim p de 10 m inute la 8Q°C a p.p. reco ltat în mod
• toate pipetările se realizează cu ajutorul dispozitivului adaptat la pipeta; j corespunzător şi suspensionat în bulion V F (m ediu anaerob) din care se
• pipeta va fi menţinută timp de 24 ore în amestecul sulfo-cromic. doreşte izolarea unor germ enii sporulaţi anaerobi.
2. Metode chimice
în s ă m â n ţa r e a cu p ip e ta , p rin „ in u n d a re "
• utilizarea m ediilor selective sau a m ediilor de îm bogăţire.
• reprezintă o variantă a tehnicii prezentate mâi sus;
■ I

Diagnosticul de laborator în microbiologies !


60
EXAMINAREA CARACTERELOR DE CULTURĂ, METABOLICE
1 1 • PRECUM SI A ALTOR CARACTERE FENOTIPICE
« adăugarea la 1 ml de p.p. recoltat în mod corespunzător (şi suspensionat în
bulion V F) a 1 m l de alcool etilic de >95° urm ată de agitarea tubului tim p de o îl UTILE ÎN IDENTIFICAREA MICROORGANISMELOR
oră la tem peratura cam erei;, produsul rezultat se însăm ânţează pe m edii anae­
robe, de exem plu pentru izolarea unor germ eni.sporulaţi. 1,..!,,, Aj.,,;:.., n ,•
3. Metode biologice V '(* 'm u ' '< tu- ,
a inocularea sputei în care se suspectează .prezenţa S. pneumoniae, la şoarecele , în capitolul 5 am prezentat „Schem a generală a diagnosticului de laborator
alb; . ■><<■'■ y f II m icrobiologic'1 şi pe această, schem ă am încercat să „evoluăm ", adăugând treptat
O după 1-4 zile de la inoculare, şoarecele face o infecţie septicemică t u pneumococ; t i noi date teoretice şi practice. în acest capitol vom continua discutarea celei de a 4-a
etape a diagnosticului direct (care include şi verificarea din punct d e vedere m icro­
• se poate izola o cultură pură de pneumococ; din sânge, cord, .splină, ficat etc.
scopic a coloniilor izolate), strict necesară pentru identificarea m icroorganism elor
A plicarea acestor tehnici va fi discutată în capitolelor urm ătoare, iar unele din­ izolate de la pacienţii cu boli transmisibile.
tre tehnici vor putea fi executate sau prezentate dertiohstrativ în .cadrul1lucrărilor
If Iniţial vom relua câteva definiţii şi elem ente teoretice urm ând ca m ai departe să
p ractice; ' ,ţr': : lv• M "■
. il}VO• 5 prezentăm principalele caractere studiate în unele dintre sub-etapele acestui
m om ent diagnostic, m ai precis caracterele de cultură, câteva noţiuni privind carac­
terele biochim ice, m etabolice, de patogenitate; în cursul lucrărilor practice se va
J- 's\i f'V '•' i.î' .■
discuta şi despre alte caractere microbiene.
■ ; i ! ■' 'iH'ţ ii'1 a !>,

I Definiţii şi alte aspecte teoretice


A C o lo n ia izo lată
«:
Pe medii solide, germ enii însăm ânţaţi în suprafaţă produc colonii. Colonia este
IJS totalitatea bacteriilor rezultate din m ultiplicarea unei singure celule bacteriene. O
li/Aiţ
colonie este o clonă bacteriană. Coloniile izolate se pot obţine de exem plu prin
... . tehnica însăm ânţării prin dispersie (cu ansa bacteriologică sau cu tam ponul), aşa
cum a fost prezentat în capitolul 10.
.■■it
Incubarea constă în m enţinerea m ediilor de cultură însăm ânţate, în condiţiile
necesare pentru d ezvoltarea culturii. M ajoritatea speciilor bacteriene se dezvoltă şi
,\\ . r.ţ ■. duc la apariţia unei culturi în circa 18-24 de ore de incubare la tem peratura optimă
i.a ’‘ ' ■' i de dezvoltare asigurată în term ostat (de regulă 35-37°C). Pentru bacteriile care
? . i. ;..-s • [■y !.?«:• ;»i •<*» } i: ; ;s a necesită o atm osferă de 3-5% CO 2 (carboxifile), plăcile cultivate se vor pune în
exsicator, îm preună cu o lum ânare aprinsă. Pentru bacteriile strict anaerobe este
'.'h;,.u ■. yk v a *• *• î
necesară incubarea în anaerobioză. O m are parte dintre fungi, în special levuri, au
: Vv::y.\ AmîV/;--'' ‘fj" tem peratura optim ă de dezvoltarea în ju ra i a 28-30°C.
V■
.:! :f| ţAi)' i U’ ; jşi VlfbN. h D ezvoltarea m icroorganism elor pe medii de cultură poate perm ite evaluarea
'1 1 anum itor aspecte m acroscopice sau m icroscopice (ex. coloniile produse de Myco­
plasma spp.) care pot reprezenta, după caz, m odalităţi de identificare sau de ori­
entare în alegerea algoritm ului de identificare. Caracterele de cultură includ:

M. ® necesităţile specifice în vederea cultivării;


• bacterii nepretenţioase (care se pot cultiva pe medii sim ple ex. E. coli)
. ,.. ■•■■ ■ i
Diagnosticul de laborator în microbiologie 1 I Examinarea caracterelor de cultură, metabolice, a altor caractere fenotipice 63

« bacterii pretenţioase (care necesită medii com plexe, îm bogăţite sau/şi • mediul este tulburat om ogen (ex. Staphylococcus spp.);
adăugarea în m edii a unor factori de creştere ex. Haemophilus influenzae); ® mediul este clar, cu depozit grunjos pe pereţi şi la baza tubului (ex. S. pyogenes);
» bacterii strict aerobe (Bordetella pertussis), aerobe facultativ anaerobe (E. ® mediul este clar, cu văl la suprafaţă (V. cholerae în apă peptonată alcalină);
coli, S. aureus, S. pyogenes etc), carboxifile (S. pneumoniae etc), m icro- © dezvoltarea culturii se realizează ca un „inel“ aderent de'pereţii tubului, la su­
aeroftle (Campylobacter spp., etc), strict anaerobe (Clostridium spp.); prafaţa m ediului (ex. E. coli);
0 tem peratura optim ă de cultivare (20-30°C pentru. Listeria monocytogenes, © m ediul este clar cu dezvoltarea unei m em brane uscate, ia suprafaţă (ex.
42°C pentru Campylobacter jejuni, 3 5 -3 T C pentru m ajoritatea bacteriilor, Bacillus subtilis); *
28-30°C pentru unele levuri etc); ,
» mediul este clar cu apariţia unui depozit floconos aderent la baza tubului (B.
• intervalul de tim p pentru apariţia coloniilor izolate,rin funcţie ;de tim pul de anthracis); . i
generaţie; ■ : ‘ • mediul este clar, iar la suprafaţă se dezvoltă o m em brană groasă, plisată (M.
« 18-24 ore pentru m ajoritatea bacteriilor; | tuberculosis).
* 24-48 ore pentru m ajoritatea fungilor;
Aspectul culturilor pe medii solide
» săptăm âni pentru Mycobacterium tuberculosis etc; ., ,. .
• aspectul, consistenţa şi aderenţa coloniilor/culturii; , C ondiţiile de cu ltiv are şi aspectul culturii sunt caractere cheie în identificarea
o m odificările apărute pe m ediu în vecinătatea coloniilor/culturii etc. bacteriilor. Aspectul co loniilor variază în funcţie de m icroorganism ul im plicat, fără
a perm ite diferenţieri de specie definitive (dar au utilitate în contextul studierii
Exam inarea culturilor/coloniilor izolate este un proces foarte im portant, necesită
tuturor caracterelor); în anum ite cazuri sugerează diagnosticul, dar întotdeauna ori­
cunoaşterea teoriei, m ult exerciţiu, atenţie şi experienţă. Pentru a obţine cele mai
entează spre alte testări necesare.
bune rezultate este necesară o bună ilum inare (preferabil lum ina naturală), iar ilu­
m inarea ţnediuiui care urm ează a fi „citit“ se va face cel puţin şi în incidenţă oblică. T re b u ie să e x a m in ă m u rm ă to a re le elem en te:
Exam inarea se poate face cu ocfiiul liber (cel puţin iniţial) dar ar trebui com pletată
• d im e n siu n e a (coloniile pot fi'm ari, de peste 2 mm aşa cum se form ează în
cu exam inarea făcută cu ajutorul unei lupe sau a unui stereom icroscop pentru a
cazul Staphylococcus spp., K. pneumoniae etc sau în cazul ievarilor; medii, de
putea înregistra toate aspectele im portante şi pentru a putea sesiza apariţia colonii­
circa 1-2 mm pentru m ulte dintre bacteriile studiate; m ici, sub 1 m m , spre
lor de dim ensiuni mici sau foarte mici. exem plu în cazul Streptococcus viridanS, etc şi foarte mici, care se pot exam i­
na cu ajutorul stereom icroscopului, aşa cum se întâm plă în cazul Mycoplasma
A apnctui c u ltu rilo r p e m e d ii lich id e spp. sau Ureaplasma Spp.);
B acteriile şi fungii facultativ anaerobi se dezvoltă în toată m asa de lichid, tul- • m a rg in ile (regulate, neregulate, întregi, circulare, erodate, zim ţate, ondulate,
burându-1. B acteriile strict aerobe se dezvoltă preponderent la suprafaţa.m ediului..., lobate, filamentoa.se, acoperite cu miceliu pufos, invadând mediul în valuri etc);
Se acceptă că de obicei tulpinile care pe m ediile solide form ează colonii d e tip © fo rm a (punctiform ă, circulară, neregulată, dendritică, filamentoasă, lenticulară);
/ •
,,S“ tulbură om ogen m ediul (m ajoritatea bacteriilor) în tim p ce tulpinile care • reliefu l (plat, acum inat, convex, bombat, om bilicat, papilat);
form ează colonii de tip „R “ realizează o tulburare mai puţin om ogenă. „V ariantele » s u p r a f a ţa (netedă, um edă, lucioasă, m ată, uscată, granulară, rugoasă, papilată,
R“ pot lăsa mediul lim pede, form ând flocoane care se depun sau un strat (văl) ţâ zbârcită, m ucoidă, pufoasă etc);
suprafaţa mediului (de exem plu bacilul difteric sau bacilul. tuberculos). ' /
© c u lo a re a (pigm entate, pigm entarea este la nivelul coloniei, sau al mediului,
în urm a dezvoltării m icroorganism elor în medii de cultură lichide se mai pot nepignientaţe; acest caracter depinde de pigm enţii produşi sau/şi d e indicatori
rem arca şi pigm entogeneza (ex. Pseudomonas aeruginosa) sau utilizând simţul de culoare din m ediu);
olfactiv se. poate constata apariţia unui miros caracteristic (ex. un m iros de corn ars
« o p a c ita te a (transparente, sem itransparente, opace);
in cazul closlridiilor).
o consistenţa, a d e re n ţa la mediu (examinate de ex. cu ajutorul ansei bacteriologice);
Vom prezenta câteva exem ple, m enţionând că există şi variaţii dc la regulă:
va

64 Diagnosticul de laborator în microbiologie I s Examinarea caracterelor de cultură, metabolice, a altor caractere fenotipice 65

® a lte c a ra c te re , care vor fi prezentate în continuare. • apariţia coloniilor pufoase; spre exemplu pe m ediul Sabouraud, la 28-30°C
după circa 7 zile, coloniile de Coccidioides immitis dezvoltă un m iceliu aerian,
T ip u ri de colonii
devin pufoase, cresc şi acoperă în câteva zile suprafaţa m ediului; iniţial albe,
C olonia S (sm ooth) are suprafaţă bom bată şi netedă, um edă, m argini circulare şi devin în tim p galben-m aronii; colonii pufoase p ot apărea şi în cursul dez­
adesea aspect strălucitor. G erm enii păstrează structura antigenipă şi nu aglutinează voltării în anaerobioză a unei tulpini de Clostridium (etani etc. v ,
spontan cu soluţie salină fiziologică. G erm enii capsulaţi îşi'p ăstrează capsula. V i­
rulenţa este conservată. M ajoritatea bacteriilor studiate precum şi levurile form ea­ Caractere metabolice
ză colonii de tip S (S. aureus, S. pyogenes, E. coli, Candida albicans etc).
Colonia R (rough) este plată, mată, uscată, suprafaţa ei prezintă rugozităţi, marginile E xistă num eroase teste care perm it investigarea acestor caractere ale m icroor­
sunt crenelate (zimţate). Stăietură antigenică nu este caracteristică. N u păstrează capsula. ganism elor. în continuare vom prezenta doar câteva dintre aceste teste (vezi şi capi­
V iralenţa nu este conservată (excepţii B. anthracis, M . tuberculosis, C. diphteriae). tolul 12 precum şi diferite capitole din partea specială). în capitolul 11 vom m ai dis­
cuta şi despre câteva dintre testele care evidenţiază caractere d e patogenitate ale
C olonia M (m ucoid) este m are, strălucitoare, um edă, m ucoasă. E ste dată de
bacteriilor sau fungilor. E ste de rem arcat faptul că unele dintre testele care vor fi
exem plu de bacteriile care prezintă capsulă (exem plu Klebsiella pneumoniae).
discutate ar putea fi incluse atât în grupul caracterelor m etabolice cât şi în grupul
A sp ecte p a r tic u la re caracterelor de patogenitate (ex. hem oliza în cazul anum itor m icroorganism e, pro­
ducerea unor enzim e cu caracter de toxine etc).
• fenom enul de „invazie", reprezintă un caracter de identificare prelim inară pen­
tru Proteus spp., o bacterie foarte mobilă; dacă însăm ânţăm o tulpină care .lv; 1. P ig m en to g en eza
aparţine acestui gen la periferia unei plăci Petri cu mediu sim plu (agarizat V; Pigm entogeneza este caracteristică bacteriilor crom ogene şi este dependentă de
2% ), de la locul însăm ânţării cultura se „dezvoltă în valuri concentrice" (se
întinde din aproape în aproape) pe toată suprafaţa m ediului; pe anum ite medii ■'v1: condiţiile de cultivare. Poate reprezenta un elem ent util pentru identificare (de
selective, invazia este inhibată şi se pot obţine colonii izolate (adăugăm la % exem plu pentru Pseudomonas aeruginosa sau pentru Staphylococcus spp.).
m ediul de cultură acizi sau săruri biliare, tiosulfat de sodiu etc); ,, D upă localizarea pigm entului, bacteriile pot fi crom ofore (pigm entul este legat
a fenom enul „liniei de dem arcaţie", reprezintă un caracter util în studii epi- în citoplasm ă); paracrom ofore (pigmentul este prezent în perete sau în stratul
dem iologice, în cazul în care tulpinile im plicate aparţin genului Proteus; dacă m ucos, de exem plu pigm entul auriu la S. aureus, pigm entul galben-citrin la S.
pe o placă cu mediu solid cultivăm 2 tulpini diferite, în 2 puncte opuse, tulpi­ '’’■Jr saprophyticus); crom opare (pigm entul albastru, galben-verzui, sau de altă culoare
nile se vor dezvolta invadând până la un punct în apropierea liniei de întâlnire, ■W: este difuzibil în mediu, de exem plu la Pseudomonas aeruginosa).
’,'v1.
unde se va crea o „linie de dem arcaţie" între cele 2 tulpini (distanţă de 1-2 m i­ A Fungii pot produce o serie de pigmenţi, spre exemplu coloniile de Candida albicans
lim etri); dacă tulpinile nu sunt diferite va avea loc „creşterea în valuri" fără au culoare albă. M ucegaiurile produc o varietate mult mai mare de pigmenţi (ex.
„dem arcaţie" cu dezvoltarea unei „pânze continue" de cultură ( I Aspergillus deflectus - colonii cenuşii cu periferia roz sau cu pete galbene, Aspergillus
• fenom enul de. „căţărate", reprezintă o variantă de izolare în cultură pură a uneţ
tulpini de Proteus; cultivarea unui produs patologic în lichidul de condens a)
M
' :;
fla m s - colonii galben verzui până la verde închis, iar privite pe partea cealaltă a plăcii
sunt roşii-brune, Aspergillus fumigatus - colonii iniţial albe care devin albastre-verzui
unui tub cu geloză înclinată incubat în poziţie verticală va conduce (în cazul sau albastre, iar privite pe cealalaltă parte a plăcii sunt colorate brun sau în alte culori,
în .care în p. p. există o tulpină de Proteus spp.) la obţinerea în 24 ore a unei Aspergillus niger - colonii iniţial albe care devin brun negre păstrând o culoare albă pe
culturi pure de Proteus, care se va dezvolta „în valuri suprapuse" până (a circumferinţă, iar privite pe cealalaltă parte a plăcii sunt colorate în galben etc).
partea superioară a m ediului de cultură; 1 -/
2. P ro d u c e re a u n o r hem o lizin e
• apariţia coloniilor în „cap de m eduză"/„coam ă de leu", aspect care poate/fi
caracteristic în cazul izolării unei tulpini de Bacillus anthracis; coloniile spnt U nele m icroorganism e produc enzim e (hem olizine) care lizează hem atiile din
m ari, alb-cenuşii, de tip „R“, iar la periferia coloniei, cu ajutorul unei lupe,' se m ediile de cultură cu sânge. H em oliza are diferite aspecte în funcţie de m ecanism ul
pot observa prelungiri ondulate care au dus la denum irile m enţionate m ai sus; de acţiune şi specia de origine a hem atiilor (cal, berbec, iepure etc). C âteva exem ­
ple de hem olizine:

L
66 Diagnosticul de laborator în microbiologie 1 1 Examinarea caracterelor de cultură, metabolice, a altor caractere fenotipice 67

1. a-hem olizina produce o liză incom pletă a hem atiilor, zona având o culoare Patogenitatea este un atribut de specie şi este determ inată genetic, Virulenţa repre­
verzuie (ex. Streptococcus viridans, Streptococcus pneumoniae); zintă gradul diferit de patogenitate exprim at în cadrul unei specii. E ste un atribut al
tulpinii m icrobiene im plicate.
2. a-hemolizina produce liza hematiilor în 7,2 zone“ în apropierea coloniei
există un halou de hemoliza incompletă înconjurat de o zonă de hemoliza completă ’- Caracterele de patogenitate p o t fi evidenţiate in vitro sau in vivo.
(ex. unele tulpini d e Streptococcus spp.);
V".• Teste
*s efectuate in vitro
f
3. p-hemolizina produce liza completă a hematiilor, zona de hempHză este clară
(ex. Streptococcus pyogenes, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Haemophilus • exam inarea aspectului coloniilor (m ajoritatea speciilor bacteriene sunt pato­
ducreyi); .,_ ... ■. -y gene în form a „S “, cu excepţia bacililor antraxului, difteric şi tuberculos); are
aspect orientativ;
4. P-hem olizina care produce o hem oliza de tip ,,cald-rece“ (zone de hem oliză
incom pletă la 37°C care, după m enţinerea culturii .la +4°G tim p .de câtev a ore, • efectuarea anum itor teste biochim ice/m etabplice, cu aspect orientativ (exam i­
devine com pletă; ex. anum ite tulpini .de Staphylococcus .aureus);-.'. , •> , narea pigm entogenezei, ferm entarea m anitâi, testul coagulazei, testul fibrino-
lizei, producerea de hem olizite etc); dintre testele m enţionate este de luat în
5. 7 -hemolizina produsă de Staphylococcus spp. lizează de iepure, om,1oaie, dar'
consideraţie în prim ul rând testul coagulazei ;
nu produce zone de hemoliză pe agar-sânge; în cazul streptococilor, „y-hemoliza“
• evidenţierea producerii unor toxine;
indică absenţa hemolizei. . -.j- .-.vi •
® endotoxine (testul Limulus; prezenţa endotoxinei produce gelificarea unui
3. P ro d u c e re a a lto r enzim e lizat de Limulus polyphemus);
• catalază (ex. Mycobacterium spp., Staphylococcus spp.); • exotoxine (testul E LEK /vezi capitolul 16, ELISA , efecte citopatice, testul
• carbohidraze (evidenţiate pe medii diferenţiale, vezi capitolele 12 şi 28-34); producerii d e lecitinază, testul plăcilor sem i-neutralizate etc).

®gelatinază (cultura microbiană lichefiază gelatina, ex. Clostridium peifringens); Teste efectuate in vivo
• lecitinază (ex. Bacillus anthracis, Clostridium spp.); In acest scop se utilizează anim ale de laborator sensibile faţă de infecţia experi­
o nitrat-reductază (ex. Mycobacterium spp.); m entală cu diferite m icroorganism e sau faţă de anum ite toxine m icrobiene (ex.
® oxidază (ex. Neisseria meningitidis, N, gonorrhoeae, Pseudomonas aerugi­ şoareci albi, cobai, iepuri, pisici etc., în funcţie de specia m icrobiană pentru care se
nosa, Vibrio cholerae ) ; . ’ .......... .. efectuează testul/specia de animal cea mai sensibilă şi calea de inoculare cea mai
©termonuelează (ex. Staphylococcus aureus) etc. potrivită). A nim alele de laborator trebuie să fie sănătoase, verificarea se face prin
exam inarea acestora în ain te de efectuarea testării, pe parcursul a 10-14 zile. După
4. A lte c a ra c te re m etab o lice inoculare, anim alele sunt m arcate şi ţinute sub observaţie (ferite de orice contam i­
» acţiunea reducăţoare (evidenţiată de ex. la C. diphteriae cultivat pe m ediu cu nare); observaţia este clinică urm ărindu-se evoluţia curbei febrile şi apariţia sem­
nelor de boală. Pentru orice test se recom andă utilizarea unui Iot de anim ale pentru
teiurit de K); ,j
acelaşi tip de inoculare, ceea ce creşte suplim entaf costul acestui tip de testare. în
• sensibilitatea la diferite temperaturi; :■ î continuare vom prezenta câteva exemple:
® toleranţa la un anumit pH (ex. V. cholerae se multiplică la pH alcalin);; ‘ ‘ f
• identificarea Bacillus anthracis: pregătim o suspensie a tulpinii care urm ează a fi
® toleranţa la o anumită concentraţie ă ţ NaCl (ex. Staphylococcus aureus); f testată în soluţie salină fiziologică şi injectăm subcutanat, câte 0,2 ml pentru fie­
®sensibilitatea la optochin (ex. S. pneumoniae) sau Ia bacitracină (ex. S. pyo­ care animal, la u n lot de şoareci albi; urmărim evoluţia timp de 2-3 zile şi efectuăm
genes) etc. I frotiuri din sângele recoltat prin puncţionarea cordului sau am prente de splină;
© testarea toxigenezei unei tulpini de Corvnchactcrimn diphtenn&t obţinem o
Caractere.de patogenitate ' cultură de 24 ore a tulpinii de identificat; inoculăm subcutanat, în regiunea
abdom inală câte 2-5 ml de cultură pentru fiecare anim al, la 2 loturi de cobai
Patogenitatea reprezintă capacitatea unui germen de a declanşa în organismul
(un lo t neprotejat, al doilea lot protejat cu câte 1000 UI de ser antidifteric pen-
gazdă fenomene morbide, patogene, modificări locale, generale şi „functio laesa“.
(

Examinarea caracterelor de cul.turâ, metabolice, a altor caractere fenotipice .. 1.. 4


69
68 Diagnosticul de laborator în microbiologie
AH•
« testarea patogenităţii unor levuri (ex. Candida albicans): pornind de la o cul­
tru fiecare anim al); în cazul în care tulpina este toxigenă, anim alele neprote­
tură de 24 de ore în m ediul Sabouraud lichid separăm sedim entul şi realizăm
jate vor muri în 1-4 zile, cu sem ne de intoxicaţie difterică (congestia capsu­
o suspensie 0,2% a acestuia în soluţie salină fiziologică sterilă; inoculăm în
lelor suprarenale, lichid seros, serofibrinos sau fibrinos în pleură, pericard,
venele cozii la un lot de şoareci (câte 0,2-0,8 ml pentru fiecare anim al) sus­
peritonea şi edem gelatinos, la locul de inoculare) în tim p „ce,anim alele;prote­
pensia obţinută şi urm ărim evoluţia anim alelor timp de 4-10 zile; dacă este
ja te nu prezintă nici o reacţie;
vorba de o tulpină de C. albicans patpgenă, anim alele vo r,m u ri,d u p ă circa 1
o toxinodpia în cazul suspicionării unei toxi-infecţii alim entare du Ctostridium _ ^ săptăm ână, (ăriaţom opatoiogic .vom putea evidenţia abcese, m iliare renale,
botulihunt: se obţine supernatant după centrifugarea.unor:produse patologice splenice, hepatice) etc.
sau alimentelor, incrim inate şi triturate la care se adaugă antibiotice p entru a
inhiba m ultiplicarea florei de asociaţie; se va utiliza supernatant,ca .a ta re şi 3*■r’ :iI' cjî'ii: o 1 i; ■
supernatant după m enţinere timp de 15 m inute la 100°G.(şi răcire) toxina bo- i1 O . : . j ; 1, ... > ■ ' ■'• v'.Ii „ . r , 'i ) \

tulinică fiind term olabilă; se vor inocula 4 loturi de şoareci (0,5 ml/şoarece) erii- At >1. , Io; t
, .sau,,cobai (1 m l/cobai) după cum urmează; , ,:u ,,
© supernatant ca atare; . . . . ■ :
' .it.fi'..,
o supernatant inactivat; . .-i a, : .■ u:.* *
■M.li ,■
O 0,1 ml ser antitoxină A urm at la 30 m inute de supernatant;
o 0,1 ml ser antitoxină B urm at la 30 m inute de supernatant;
© spre exem plu, în cazul în care anim alele din ioturile 1 şi 4 mor, iar ani­ îtn . X cfVM . , , n.,1
malele din loturile 2 şi 3 supravieţuiesc, în p.p. există toxină botuli ni că de
tip A.
© identificarea infecţiei pulm onare cu Streptoccus pneumoniae sau cu Klebsiella
1{ . . *î
prieumoniae: realizăm un am estec de spută şi soluţie'salină fiziologică sterilă
şi inoculăm subcutanat sau intraperitoneal câte 5 ml de p.p. pentru uri anim al,
la un lot de şoareci albi; prezenţa m icroorganism ului va produce în 24-48 de
ore o septicem ie m ortală; facem frotiuri şi culturi din sângele1recoltat prin
puncţie cardiacă, lichid peritoneal şi am prentă de splină; pentru determ inarea
tipului capsular putem face reacţia de um flare a capsulei (vezi capitolul 12);
® identificarea etiologici stafilococice a unei toxi-infecţii alim entare (producerea
enterotoxinei): după ce se obţine în cultură tulpina de stafilococ (pornind de la
materii fecale, lichid de vărsătură, alim ente) se repică în .a g a r 0,5% şi. se
incubează 48 ore în atm osferă de CO 2; se filtrează m ed iu l iar lichidul obţinut
se menţine la tem peratura de fierbere timp de 50 m inute:.(enţerotoxina este tef- ■A'UC,i
mostabilă); testul D olm an se face la pisoi de 2-3' luni la care se inoculează
intraperitoneal 1-3 ml din filtratul r ă c iţi după 2 0 -1 2 0 ’m inute; în 'baiul pre­
zenţei enterotoxinei apare o stare ele nelinişte, agitaţie urinate de diâfeefvărşă-
turi şi som nolenţă; după 1-2 zile anim alele inoculate îşi revin; /
• cercetarea patogenităţii unei' tulpini de. stafilococ se face la iepure, ca're’e'ste
anim alul -de la b o ra to r cel m ai sensibil la in fecţia ex p erim en tală cu
Staphylococcus aureus; ' , V J
(

I £, Teste de identificare pe baza.caracterelor biochimice ale fungilor şi bacteriilor 71


TESTE DE IDENTIFICARE AVÂND LA BAZĂ
DIFERITE CARACTERE BIOCHIMICE ALE BACTERIILOR
într-un tub steril cu capacitatea de 30 ml introducem aseptic 20 ml de m ediu, 2 ml
Şl FUNGILOR soluţie de vitam ine şi 0,25 ml din suspensia fungică (levurică) după care am estecul
este turnat într-o placă Petri sterilă şi se aşteaptă solidificarea m ediului îm preună cu
" w .'< i -jtcş'-y !■ '■■■« t i; celelalte com ponente.
.-;s.1 ;; ..',>1 ;rif, . D epunem aseptic 5 rondele din hârtie de filtru, una în centru şi 4 spre periferia
Există numeroase teste utile în identificarea bacteriilor şi fungilor, având la bază fiecărui cadran al plăcii şi im ediat, utilizând o ansă cu diam etrul buclei d e 3 mm,
diferite proprietăţi biochimice ale acestora; câteva dintre teste vor fi prezentate în depunem pe fiecare dintre rondele ceea ce vom preleva din diferite (5) soluţii de
continuare. carbohidraţi

A ceste teste de identificare au o importanţă diferită la diferitele genuri şi specii • obligatoriu vom p releva din soluţia de glucoză;
bacteriene şi respectiv fungice şi „fac parte" din etapa a patra a diagnosticului de la­ • dacă dorim să testăm pentru 9 carbohidraţi diferiţi avem nevoie de 2 plăci
borator bacteriologic sau m icologic. Schem a de prezentare este însă asemănătoare. Petri.
E xistă sisteme com erciale m anuale şi autom ate utile pentru identificarea speci­ Incubăm la 28-30°C pentru 24-48 ore, apoi urm ărim apariţia culturii în ju ru l ro n ­
ilor m icrabiene. Spre exem plu, sistem ul sem iautom at d e identificare şi testare a delelor.
sensibilităţii la antibiotice a bacteriilor izolate, m in iA P I, perm ite identificarea unei E xistă şi alte m odalităţi tehnice în realizarea auxanogram ei.
gam e foarte largi de specii m icrobiene; necesită utilizarea unui inocul standard
realizat pornind de la o cultură bacteriană pură. Interpretare
• trebuie să existe m ultiplicare levurică (cultură prezentă) în ju ru l rondelei pe
12.1. Utilizarea unui carbohidrat ca unică sursă de carbon - Auxanograma care am depus o ansă din soluţia 5% de glucoză; toate levurile pot folosi glu­
coza drept unică su rsă d e C;
P rin c ip iu
• se notează dezvoltarea culturii în jurul rondelelor unde aceasta este evidenţiată
D iferitele levuri prezintă un anum it echipam ent enzim atic cu ajutorul căruia pot,
şi utilizând rezultatele obţinute, în contextul celorlalte date d e laborator, se sta­
spre exem plu, să utilizeze un anum it carbohidrat ca unică sursă de carbon. D ez­
bileşte specia levurică.
voltarea unei levuri pe un m ediu în care este inclus un singur carbohidrat dem on­
strează utilizarea acestuia c a unică sursă de carbon (asim ilarea carbohidratului Control de calitate
respectiv). în mod asem ănător se poate testa capacitatea asim ilării unor substanţe
• tulpina de referinţă de Cryptococcus laureaţii;
azotate de către levuri.
• tulpina de referinţă d e Candida pseudotropicalis.
M a te ria le necesare
• cultura pură a levurii de identificat, pe pantă de agar Sabouraud; 1 2.2. Testul sensibilităţii la bacitracină
o mediu pentru asim ilarea carbonului de către levuri; Principiu:
• soluţie de vitamine; M ultiplicarea streptococilor de grup A este inhibată de bacitracină (antibiotic
• soluţii 5% ale carbohidraţilor (ex. glucoza, m altoză, zaharoză, lactoză, galac- produs de Bacillus licheniformis). Se apreciază că dintre tulpinile de Streptococcus
toză, trehaloză etc) în apă distilată, sterilizate prin filtrare; : ij pyogenes, mai puţin de 1% sunt rezistente la bacitracină.
• rondele din hârtie de filtru, sterile (diam etru 6 m ilim etri). I
M ateriale necesare
T eh n ica de lu c ru ! • colonii (3-hemolitice izolate pe geloză-sânge;
C ultura fungică este suspensioriată în 5 ml de apă distilată sterilă. M ediul de cul­ o m icrocom pîim âte d e bacitracină cu 0,04 U şi cu 0,1 U (şi nu cu 10 U /m icro-
tură pentru asim ilarea carbonului este încălzit până la topire şi apoi răcit la 50°C. com prim at).
72 Diagnosticul de laborator în microbiologie 12 Teste de identificare pe baza caracterelor biochimice ale fungilor ţi bacteriilor
T e h n ic a de lu c ru .ro: , ./ ? Interpretare n . ■; < '■ ■ >;>
Se prelevează 3-4 colonii p-hem olitice şi se însăm ânţează în striuri foarte apro­ • Testul este pozitiv (bacteriile au fost lizate în prezenţa dezoxicolatului de so­
piate, suprapuse în 3 direcţii, pe o jum ătate de placă P etri cu geloză-sânge .(din diu şi sunt pneum ococi) dacă suspensia s-a clarificat în tubul în care am adău­
m otive de econom ie se poate utiliza şi un sector de placă). ' ,‘l‘ ' ' ...... gat dezoxicolat şi nu s-a clarificat în tubul îri care am adăugat apă distilată;
Plasăm în centrul ariei însăm ânţate un m icrocom prim ăt cu bacitracină şi incu- • Testul este negativ d acă am bele tuburi au răm as opace. V v ‘‘1 r c ■

băm pentru 18-24 ore la 35-37°C . , Control de calitate i :b;. ' . ; , ' Sî
I n te r p r e ta r e ,;i';" ,nt • Martor pozitiv^Streptococcus pneumoniae; .,.. ,v,
• M artor negativ - Streptococcus vindem .
Testul este pozitiv (bacteria este sensibilă lă bacitraciriă) în câZul'în care:
® rezultă o inhibiţie a creşterii bacteriene, indiferent de diam etru, în jurul m icro- 1 2 .4 . Testul CÂMP
com prim atului cu 0,04 U bacitracină;
Principiu
* rezultă o inhibiţie a creşterii bacteriene cu diam etrul g 11 m m , în jurul micro-,
com prim atului cu 0,1 U bacitracină. Streptococii de gm p B produc o substanţă extracelulară de natură proteică denu­
m ită factorul CA M P (după iniţialele cercetătorilor care au pus la punct testul/ Christie,
C o n tro l d e c a lita te • I',::..;"- Mi l Atkins, M unch-Petersen); care acţionează sinergie cufl-lizina produsă de unele tulpi­
e M artor pozitiv - Streptococcus pyogenes; ni de Staphylococcus aureus. D acă aceste 2 microorganism e sunt cultivate în 2 striuri
perpendiculare (fără să se atingă), acolo unde cele 2 striuri se învecinează, liza hemati­
• M artor.negativ - Streptococcus agalactiae. j ilo r (de berbec sau de bou) apare mărită, în „form ă de vârf de săgeată".

1 2 .3. Testul bilolizei (Neufeld) Materiale necesare

: P rin c ip iu u-.; ■>.■,. ,< • colonii de streptococi hem olitici sau nehem olitici (dacă un anum it context sau
anum ite teste sugerează prezenţa unui streptococ de grup B);
Pneum ococii (Streptococcus pneumoniae) capsulaţi sunt lizaţi în prezenţă bilei
• plăci Petri cu geloză sânge de berbec sau de, bou;
sau sărurilor biliare (unele tulpini necapsulate nu suferă acest proces) prin activarea
1 • tulpina de S. aureus producătoare de p-lizină (A TC C 25923)/alternativ am
unei enzim e autolitice.
'•putea utiliza fâşii din hârtie de filtru impregnate cu P-lizină stafilococică;
M a te ria le n e c e s a re • ATCC = American Type Culture Collection;
© colonii izolate, a-h em o litice; • tulpini de cercetat.
• soluţie de dezoxicolat de sodiu 10%; Tehnica de lucru ’
• soluţie salină izotonă; Inoculăm în striu o tulpină d e S. aureus producătoare de p-lizină, pe unul din
• apă distilată. ..... . . ., . , ... ;.j. =;, diametrele plăcii cu agar-sânge. Perpendicular pe acest striu vom inocula (fără să
T eh n ica de lu c ru • ! ' , ',-t
i: '■ ' " " ’• :'L " '/*■'i’,‘ atingem striul de stafilococ) o tulpină CA M P pozitivă, o tulpină CA M P negativă şi
1 . ' :.!ji ; . , v tulpini de cercetat.
S e prepară în soluţie salin ă fiziologică o suspensie pornind de la coloniile hem o- •t.fin. - ■ .
Incubăm la'35-37°C aerob până a doua zi sau tim p de 6 ore în atm osferă de 5-
litice izolate. T urbiditatea suspensiei trebuie să fie asem ănătoare cu turbidjtatea
10% C 0 2. •" - ■v
etalonului M cFarland 0,5 sau 1. :■ '. li- . *. I . . . . .. . | .. *
Repartizăm câte 0,5 m l din suspensie în 2 eprubete de sticlă. J , . . Interpretare , ;.. - , . •„ ; . ..... , l!lt
în primul tub adăugăm 0,5 ml dezoxicolat de sodiu, iar în al doilea tub adăugăm o apariţia unei zone de hem oliză lărgite, în „vârf de săgeată" (vârful spre ttilpina
0,5 ml apă distilată. Incubăm tim p de 2 ore la 35-37°C. de stafilococ) reprezintă un test pozitiv (confirmat de martorul pozitiv);
Diagnosticul de laborator in microbiologie 1 2 Teste de identificare pe baza caracterelor biochimice ale fungilor şi bacteriilor 75
74

• heraoliză nemodificată - test negativ (confirm at de m artorul negativ ) , j • M artor negativ - m£diu neinoculat peste care se adaugă soluţie d e peroxid de
hidrogen.
C ontrol de calitate
12.5.B. pentru alte microorganisme (spre exem plu diferenţierea stafilococilor
• M artor pozitiv - Streptococcus flgalacţiae;. . n.., de alte microorganisme)
• Martor negativ - Streptococcus pyogenes sau un streptocqc de grup D.
E xistă mai m ulte tehnici dintre care vom prezenta testul realizat pe 6 suspensie
bacteriană şi respectiv testul catalazei prin suspensionarea culturii pe lam ă. .
12.5. Testul producerii de catalază i ; <?>
P rin cip iu Materiale necesare

Catalaza descompune peroxidul de hidrogen în apă şi oxigen. • colonii izolate dezvoltate pe medii fără sânge/în cazul în care urm ează să testăm
o bacterie care s-a dezvoltat pe geloză-sânge, deoarece pot apărea reacţii fals
12.5. A. pentru mycobacterii pozitive datorită catalazei eritrocitare, urm ează să prelevăm cultura bacteriană
fără a atinge mediul de cultură; în acest sens vom utiliza o ansă „fîr“ şi să
M a teriale necesare prelevăm cultură din porţiunea cea mai bom bată a coloniei de identificat);
• cultura pură a m icroorganismului care urmează a fi testat, pe mediu Lowenstein; • soluţie de peroxid de hidrogen 3%;
• soluţie de peroxid de hidrogen în Tw een 80 şi apă distilată. • apă distilată.

T ehnica de lu c ru Tehnica de lucru

Peste cultura bacteriană se adaugă 1 m l de soluţie de peroxid de hidrogen şi se B l.


lasă tubul la tem peratura cam erei. R ealizăm o suspensie bacteriană densă în 1-2 ml d e apă distilată la care adăugăm
Se măsoară înălţimea coloanei de bule de oxigen şi se înregistrează valoarea în mm. 1-2 picături de soluţie de peroxid de hidrogen 3%.
O bservăm im ediat şi după trecerea a 5 m inute apariţia bulelor de oxigen.
I n te rp re ta re
B2.
Acesta este un test sem i-cantitativ, care ajută la diferenţierea speciilor de P e o lam ă de sticlă punem o picătură din soluţie de peroxid de hidrogen.
mycobacterii în funcţie de cantitatea de catalază produsă. în vederea unei diferen­ S uspensionăm cultura în picătura de H 2O 2 şi urm ărim timp de 30 de secunde
ţieri suplimentare, se poate utiliza testul term osensibilităţii catalazei (Mycobac­ apariţia bulelor de oxigen.
terium tuberculosis, sp re exem plu, produce o catalază term osensibilă).
N otificarea se poate face în modul urm ător Interpretare
• peste 20 m m + + + ' ' • apariţia bulelor de gaz sem nifică un test pozitiv, bacteria produce catalază;
• 10-20 mm ++ j • absenţa bulelor de gaz sem nifică un test negativ.
• 5-10 mm + j Control de calitate
• 5 mm - ' ' -j
• M artor pozitiv - Staphylococcus aureus;
/• ij
C ontrol de c a lita te • • M artor negativ - Streptococcus pyogenes.

• M artor pozitiv - M. fortuitum ; I


1 2 .6 . Testul utilizării citratului ca unică sursă de carbon (Simmons)
• M artor mai slab pozitiv (test semicantitativ) - M. tuberculosis/în cazul testu­
lui pentru term osensibilitateă catalazei rezultatul va fi negativ după încălzire Principiu
20 minute la 68 °C ; / , U nele dintre enterobacterii deţin un echipam ent enzim atic care perm ite asim i­
larea şi utilizarea citratului ca unică sursă de carbon. U tilizând un m ediu care con-
Diagnosticul de laborator în microbiologie
76 Teste de identificare pe baza caracterelor biochimice ale fungilor şi bacteriilor 77

ţine citrat şi un indicator de pH, putem indentifica alcâiiirizarea'm ediului şi respec­


• plasm ă de iepure (d e preferat)/în cazul în care plasm a de iepure nu este dispo­
tiv acea enterobacterie care poate utiliza citratul ca unică sursă de carbon:
nibilă se poate folosi plasm ă um ană (cu sensibilitate mai m are la coagulaza
Materiale necesare
uV’.sn irftn
',vv' '’ produsă d e S. schleiferi şi S. lugdunensis);
• lam e, tuburi. ' 1 ' ( ■•vr.mliij Scji
« o suspensie relativ densă obţinută din colonia (cultură pură) bacteriei p e care
* 1 ‘dorim să 6 identificăm ;
.■■■■• • j •
; ’•1 i
.. . . .
’h l-“): ■Jl ''
Vi' ; 'T iJii.-.- i V :.-V i’Ul.Mt . .,;tj
Tehnica de lucru :•*>./: 'o
® m ediul care conţine acid citric 0,2% (Sim m ons), turnat în pantă în eprubete a. Testul coagulazei pe lamă .... ,i:.;
mici; în prezenţa indicatorului de pH şi la pH neutru, m ediul neînsăm ânţat are V erifică prezenţa coagulazei legate. Pe lam ă se depune o picătură de apă disti­
o culoare verde. ru'd i " '..i i i .4! ';î ,J!' lată (nu soluţie salină fiziologică). Suspensionăm şi om ogenizăm 1-2 colonii în
> .ii'.'. Vj ■■it : r r ,-i -.iii t o i " o picătura de apă distilată (suspensia trebuie' să fie' tulbure omogen).
T e h n ic ă d e lu c ru
.1 î t Jj . U. ?ilt'OJjd- ii:')ti.' -iii
.. .■. ,. /i■ , » . . ! ;h;> .’i î i vt al'-.ii A şteptăm circa i 0 secu n d e şi urm ărim apariţia unei eventuale autoaglutinări (caz
• cu- ajutorul unei anse, prelevăm suspensie bacteriană, p e ,care o însăm ânţăm în care nu putem interpreta rezultatul testului; trecem la efectuarea testului coa­
într-un singur striu în „zig-zag“ pe suprafaţa m ediului Sim m ons; j.vr il | gulării în tub). D acă picătura răm âne tulbure om ogen, adăugăm 1 picătură de plas­
• incubăm Ia 37°C şi exam inăm dezvoltarea culturii şi eventuala m odificare a m ă şi urm ărim apariţia „coagulilor" timp de 10-15 secunde.
culorii m ediului. . .iut.iu.ii> i/in; * A lternativ se pot utiliza truse comerciale.
I. I... r 'l - ,
I n te r p r e ta r e • -a >>r..U:g.*i" Interpretare.
• apariţia unei culturi bacteriene de-a lungul 'striului, însoţită de m odificare • apariţia „coagulilor" în 10-15 secunde sem nifică un test pozitiv;
culorii care devine albastră,, sem nifică,un test pozjtiy = bacteria,.utilizează • absenţa „coagulilor" sem nifică un test negativ/5% din S. aureus dau reacţii fals
citratul ca unică sursă de carborţ; jţ01i,K. ;w. , j . b ■■uiihm.j-u-i negative la testul pe lamă, fiind necesară realizarea testului coagulazei în tub.

• /în prezenţa,unui tub fără-,dezvoltarea, culturii, cu lo area m ediului;,fiind verde b. Testul coagulazei în tuburi
(putem notifica un rezultat negativ. rj.. V erifică prezenţa coagulazei libere. Pipetăm aseptic 0,5 ml de p lasm ă într-un tub
steril. Prelevăm o colonie şi o descărcăm în plasm a din tub (alternativ putem
C o n tro l de c a lita te ': însăm ânţa o colonie de testat în 0,5 ml bulion glucozat, incubăm 18-24 ore la 35-
•■ , . i . 11C;i|,.j^ *-,»• |i,J ...I.ţ...
» M artor pozitiv - Klebsiella pneumoniae/Ehterobacter cloacae;, , ,, ,;., 37°C şi vom am esteca plasm a cu suspensia m icrobiană rezultată după cultivare).
Incubăm tubul tim p de 4 ore la 35-37°C (pentru unele tulpini reacţia poate fi p o ­
• M artor negativ - Escherichia coli.
zitivă chiar şi mai repede de 4 ore). Rezultatul reacţiei este exam inat prin înclinarea
tubului. Dacă reacţia este negativă la 4 ore, reincubăm până la 24 ore.
12.7. Testul coagulazei '.i • ■i;j ii a l;.a ; lo b itjd Hif f l '.>■]:>
1 ,i'i i:. i ' oi: :.. . "iolii!i.n• i:i t . A tenţie, cheagul poate fi lizat destul de rapid d upă m om entul form ării (unele
Principiu tulpini de S. aureus produc fibrinolizină). D in acest m otiv, unii autori recom andă
Stafilococii coagulazo pozitivi produc o enzim ă care ac tiv ează coagularea-; plas­ exam inare tubului test din 30 în 30 minute, în prim ele 4 ore.
mei. Există 2 tipuri de coagulază: coagulaza liberă ^ c o a g u la z a leg ată.d e(peretele Interpretare o.;
celular („dum ping factor"). Coagulaza liberă acţionează pe protrom binK C oaguiaza • form area unui cheag, sem nifică un rezultat pozitiv;
legată acţionează direct pe fibrinogenul plasmatic. Stafilococii coagulazo pozitivi • absenţa cheagului sem nifică un rezultat negativ.
sunt consideraţi Staphylococcus fţureiu..t ■ ,.:ît : a . . ,. .ţ.ţjţu ti k f
Control de calitate
Materiale necesare • M artor pozitiv - S. aureus;
• colonii izolate p e’mediu neseldctiv ale tulpinii care u rm ează să fie testată ( • M artor negatiy - S. epidemidis.
.. ........ .. a ' 1'-- . . iu -i.;. ' . tb îi t b j i » o i . , i r ' itÎH'Uiu i . - n r " ; ; r ' i : ' r c o -. ■!
... . / iaio • > ^Diagnosticul de laborator în microbiologie 12 Teste de identificare pe baza caracterelor biochimice ale fungilor şi bacteriilor
78 79

12.8. Testul filam entării, pentru Candida albicans Materiale necesare


• tuburi de dim ensiuni m ici cu mediul M IU ;
P rin d Piu ,V. "a, lUubor:
D upă cultivare în ser uman, ser bovin, ser de berbec etc tim p <p?, 1%35- • hârtiuţe indicator cu reactiv Ehrlich (se poate folosi şi reactiv K ovacs) sau
37°C, blastoconidiile individuale de C. albicans produc filam ente scurte (tubi ger­ reactiv E hrlich/K ovacs condiţionat în sticluţe de culoare brună; v ..........
minativi). . ' . OTi)Uil*jL • colonii d e identificat (colonii izolate, cultură pură);
Materiale necesare riu»\ wţ Wmwţrrr-v.twv m ‘.n • ansă fir etc.

, • colonii izolate, în'scopul identificării; 11 1■ 1 ; - . ' , Tehnica de lucru


• ser uman, ser bovin,,ser de|ber]}ec, ,ser, feţal de^jdţşl, ^ r n ^ b jt n c ii n ă bovină,eţc;; Utilizăm: pentru însăm ânţare o ansă fir. Prelevăm din colonia izolată p e mediu
• aplicaţogre de.lem n sau sterile, pipete .Pasteur:cu^^,yMul efilat, lam e şi lamele, neselectiv (dacă p en tru cultivare au fost utilizate m edii selective trebuie să pre­
tuburi mici. , . • s u t ir . v T t n r liiir . : p l t t q v t t n i « r r i t t '{ tm // io v
levăm cu grijă, fără să atingem mediul de cultură) şi însăm ânţăm m ediul prin înţe­
;iv . . . r . - ’ -i-î ii r iu r ş î - '; : i i 'î R b n r .'ii •.! .t *.!■•! i i i ifu :b .“ j
p are încercând să realizăm o însăm ânţare în „linie dreaptă1*. Fixăm de dop hârtiuţa
Tehnica de lucru indicator în aşa fel în c ât să ajungă deasupra coloanei de mediu, fără să î l atingem.
f i i .;:i; h i. n c o o , >•(''iB r ,*-'.1f'i.T .it " if. tivi
într-un tub de dimensiuni mici (ex. 12/120 mm) introducem aseptic 0 ,5 -l.jn l de Incubăm la 35-37°C tim p de 24 ore. în cazul în care nu are loc virarea culorii m e­
ser uman sau alt tip de ser. Cu un aplicator sterii (ca un beţigâş)1atingem colonia diului, incubăm până la ,48 de ore.
care trebuie identificată şi apoi îl introducem în tub. Incubăm tim p de 2-4 ore, la 35-
Interpretare
37°C. ’ ■ • : ■ j ,ţj; ir .! iHJifSW "î?t -U ! :'1, , 'r . r ' v ' . - ■' '■! .-’V;' ,v
Realizăm un preparat între lam ă şi lamelă şi exam inăm ia;m icroscopul optic. • din punctul de vedere al mobilităţii;
• opacifierea apare num ai pe traiectul de însăm ânţare - b acteria este imobilă;
Interpretare . , \ o • opacifierea este uniform ă în coloana de m ediu - bacteria este mobilă;
•(prezenţa unor.tubi. germinativi cu un calibru m ai îngust d ar cu o lungim e de 3- • din punctul de vedere al producerii ureazei;
4 ori mai m are decât diametrul celulei de origine, care continuă direct, fără nici
• culoarea coloanei răm âne galbenă - bacteria este ureazo negativă;
o strangulare sau sept blastoconidia, sem nifică un test pozitiv;:, , j i).T,
• culoarea devine roşie - bacteria este ureazo pozitivă;
• absenţa aspectului m enţionat mai sus sau prezenţa unor. pseudotubi germ ina­
tivi care sunt delim itaţi printr7o strangulare şi un sept de blastoconidie sem ­ • apariţia unui inel de culoare roşie la suprafaţa m ediului nu reprezintă un
test pozitiv;
nifică un test negativ. ■ . .t • ;■
• din punctul de vedere al transformării triptofanului în indol;
Control de calitate
• schim barea culorii hârtiei la roşu-violet - bacteria este indol pozitivă;
• M artor pozitiv - C. albicans; • culoarea hârtiei răm âne albă - bacteria este indol negativă;
• M artor negativ - C. tropicalis: • alternativ, în lipsa bărbuţelor indicator se poate picura reactiv Ehrlich Ia
suprafaţa m ediului şi interpreta m odificarea/lipsa m odificării culorii.
12.9. A. M ediul multitest M IU (mobilitate îndoi uree)
/• ir .: ui i’f H u r v . '. " !..• fc'
Principiu /, Control de calitate

Mediul conţine uree, ti'iptofan, roşu fenol (indicator d e pH ) şi este condiţionat în • M artor pozitiv - Proteus m im bilis M + U + 1+ ;
tuburi de dim ensiuni mici. G eloza este m oale perm iţând m obilitatea m icroorganis­ ® M artor negativ - Shigella spp. M - U- I- 1
mului însăm ânţat; hidroliza ureei va duce la alcalinizare m ediului (culoarea virează
de la galben la roşu); producerea de indol din triptofan v a fi indicată de înroşirea
reactivului Ehrlich.
Teste de luentificare pe baza caracterelor biochimice ale fungilor şi bacteriilor 81
'■'1
80 Diagnosticul de laborator în microbiologic

Control de calitate
12.9. B. M ediul multitest M IL F (mobilitate indol lizin-decarboxilază fen il-
o M artor pozitiv - Proteus mirabilis M + 1+ FD -ază+ LD-ază-;
alanin-dezaminază) ... „ l h ,
® M artor negadv - Klebsiella pneumoniae M -1 - FD -ază- LD -ază+.
Principiu ,.u ••ilru /p u m :«n<u>ihi.T p b .i K *
M ediul conţine o cantitate scăzută de glucoza, peptonă cu D t-tr'iptofănl L-lizină, 12.10. Mediul m ultitesi TSI (triple sugar iron)
DL-fenil-alanină, brom crezol p u rp u r soluţie12% ’(indicator de p H )'şi"eite condiţio­ / Principiu
nat în tuburi de dim ensiuni mici. G eloza esta?nioale perm iţând m obilitatea m icroor­ 4
ganism ului însăm ânţat. Producerea de indol din triptofan va fi indicată d eîn ro şire a M ediul este agarizat, condiţionat în două „zone“ (în coloană la b az ă şi în pantă)
reactivului Ehrlich. D ecarboxilarea lizinei va duce la alcalinizâfe m ediului (în şi conţine glucoza (în raport de 1/10 faţă de celelalte zaharuri), lactoză, zaharoză,
absenţa lizin-decarboxilazei rezultă o uşoară acidifiere a mediului: datorită .fermen­ citrat feric şi un indicator de pH (roşu neutru). P artea dreaptă (coloana) nu vine în
contact cu aerul şi oferă condiţii relative de anaerobioză. Partea în clin ată (panta)
tării glucozei). D ezam inarea fenil-alaninei duce la apariţia1de acid fenil-piruvic şi
oferă condiţii de m ultiplicare în aerobioză.
am oniac; adăugând clorură ferică rezultă o culoare verde.” ';.
>V i- j • f t l ’s i U ' . i r \fi ■ 7 V . - l Concentraţia glucozei este mai mică, pentru ca ferm entarea acestui zahar să
Materiale necesare a , ; , . J ■. ,.v t.v ii i-,-. n.-.-d . ;t m ;i,u m L v poată fi detectată chiar dacă este singurul zahar m etabolizat. Dacă o bacterie se dez­
• tuburi de dimensiuni mici cu mediul M ILF; ••■ y J voltă în partea dreaptă vor fi eliberaţi am inoacizi, care în zona aerobă v o r fi decar-
boxilaţi oxidativ şi vor m odifica pH -ul spre alcalin. în cazul în care lactoza şi/sau
• hârtiuţe indicator cu reactiv Ehrlich (se poate folosi şi reactiv K ovacs) sati
zaharoza nu sunt ferm entate, cantitatea de acid produsă prin ferm entarea glucozei
reactiv Ehrlich/K ovacs condiţionat în sticluţe de culoare brună;
(toate enterobacteriile ferm entează glucoza) este suficient de m ică pentru ca pH-ul
• colonii de identificat (colonii izolate, cultură pură);
de la nivelul pantei să revină rapid la neutru. în acelaşi timp, pH -ul răm âne acid (şi
• ansă fir etc. culoarea mediului răm âne galbenă) la nivelul coloanei pentru că în condiţii de rela­
tivă anaerobioză nu are loc decarboxilarea oxidativă. D acă zaharurile de la nivelul
Tehnica de lucru >,
pantei sunt ferm entate, cantitatea de acid produsă este suficient de m are pentru ca
T ehnica de lucru este asem ănătoare cu cea expusă la punctul 12.9. A. pH -ul de la acest nivel să răm ână acid şi respectiv culoarea pantei să răm ână galbenă.

Interpretare P rezenţa citratului feric, în cazul în care bacteria produce H 2S duce la apariţia
unei culori negre (se form ează sulfit feros).
• din punctul de vedere al m obilităţii ,, , , , .
L a nivelul coloanei se mai înregistrează şi producerea de gaz (de la apariţia unor
• opacifierea apare numai pe traiectul de însăm ânţare —bacteria este imobilă
bule fine pe traseul de însăm ânţare, până la fragm entarea sau „ruperea" coloanei).
• opacifierea este uniform ă în coloana de m ediu - bacteria este m obilă
o din punctul de vedere al transformării triptofanului în indol )( Materiale necesare
o schim barea culorii hârtiei la roşu-violet - bacteria este indol pozitivă j ® tuburi de dim ensiuni mici cu mediul TSI;
• culoarea hârtiei răm âne albă - pacteria este indol negativă • colonii de identificat (colonii izolate, cultură pură);
• din punctul de vedere al producerii lizin-decârboxiiazer ( , , ii ® ansă fir etc.
• alcalini zarea coloanei ttaduce prezenţa enzim ei - /
Tehnica de lucru
• acidifierea uşoară a coloanei trtţduce absenţa enzim ei -■» ' ' ■'
• din punctul de vedere al producerii fenil-alanin-dezam inazei | U tilizăm pentru însăm ânţare o ansă fir. Prelevăm din colonia izolată pe mediu
• apariţia unui „inel" de culoare verde la suprafaţa m ediului şi la niVelul neselectiv (dacă pentru cultivare au fost utilizate medii selective trebuie să prele­
traiectului de însăm ânţare după adăugarea unei picături de clorură ferică văm cu grijă, fără să atingem mediul de cultură) şi însăm ânţăm co lo an a prin înţe­
10% traduce prezenţa enzimei pare, apoi retragem ansa şi atingând suprafaţa coloanei descriem un striu în „zig­
zag". incubăm la 35-37°C tim p de 24 ore.
82 Diagnosticul de laborator fn microbiologie 1 2 Teste de identificare pe baza caracterelor biochimice ale fungilor şi bacteriilor
83

Interpretare ,! v Tehnica de lucru

• în ceea ce priveşte ferm entarea glucozei; Folosim o subcultură m ycobacteriană cu creştere confluentă. A dăugăm cu ajuto­
• culoarea coloanei este galbenă - glucoza este ferm entată; rul unei pipete P asteur ap ă distilată sterilă sau soluţie salină fiziologică. Cu ajutorul
pipetei Pasteur (sau cu ajutorul unei anse) raclăm coloniile pentru a perm ite extrac­
• culoarea coloanei răm âne roşie - glucoza nu este ferm entată (nu este
ţia niacinei din m ediu. T uburile rămân 1 oră la tem peratura cam erei. * ,
enterobacterie);
T ransferăm câte 0,5 m l în fiecare dintre tuburile de testare. A d ăugăm succesiv
• ferm entarea glucozei poate fi sau nu însoţită de producere:de gaz;
' 0,5 ml anilină 4% şi respectiv 0,5 ml brom ură de cianogen. E xam inăm după 5
• interpretarea se face sim ilar pentru ferm entarea lactozei/zaharozei, la nivelul
m inute pentru a o bserva apariţia culorii galbene în cazul reacţiei pozitive. înainte de
pantei; . elim inare, vom „neutraliza11 tuburile prin adăugarea unui volum egal (aproxim ativ
• în cazul în care.se produce H 2S, rem arcăm apariţia unei culori negre la nivelul 3 m l) de N aO H 10 % în fiecare tub.
coloanei;
Interpretare
o alte elem ente privind interpretarea acestor rezultate vor fi prezentate în capi­
tolul 28. • apariţia unei culori galbene, reprezintă un test pozitiv;
• absenţa culorii galbene, reprezintă un test negativ.
Control de calitate
Control de calitate
• M artor pentru pH acid la nivelul coloanei şi pantei, fără producere de H 2S -
E. coli; • M artor poziti \ - Mycobacterium tuberculosis;
• M artor pentru pH acid la nivelul coloanei, pH neutru la nivelul pantei şi pro­ • M artor negativ - Mycobacterium avium.
ducere de H 2S - Salmonella typhimurium;
• este posibilă şi utilizarea altor tulpini martor.
12.12. Testul producerii de citocrom oxidază
Principiu
1 2 .jh . Testul producerii de niacină
U nele bacterii produc citocrom oxidază, enzim ă care lipseşte la bacteriile strict
Principiu anaerobe. A ceastă hem oproteină acţionează şi asupra unei substanţe, tetra-m etil p-
fenilendiam ină rezultând un com pus de culoare purpurie
M ycobacleriile produc în timpul m ultiplicării niacină (acid nicotinic) pe care o
utilizează în sinteza N A D şi N A DP. M ajoritatea m ycobacteriilor posedă o enzim ă D intre bacteriile oxidazo-pozitive am intim Vibrio spp., m ajoritatea speciilor de
care poate transform a niacina liberă în acid nicotinic m ono-nucleotid. Dacă Pseudomonas , Alcaligenes spp, Neisseria spp. (dintre germ enii gram negativi) şi
Micrococcus spp. (dintre germ enii gram pozitivi)
m icroorganism ele nu prezintă această enzim ă (ex. M. tuberculosis), în m ediul de
cultură se va acum ula niacină. N iacina este solubilă în apă şi poate fi extrasă din Materiale necesare
mediu (dc ex. în soluţie salină fiziologică) iar în reacţie cu brom uravde cianogen
• soluţie apoasă de tetra-metil p-feniiendiam ină 1% conservată în sticlă d e culoare
(atenţie la utilizare!) în prezenţa andinei rezultă un com pus de culoare galbenă.
brună la tem peratura frigiderului sau fâşii de hârtie indicator im pregnată în
Materiale necesare reactiv (preparate com ercial).
• hârtie de filtru;
• soluţie de anilină 4% (conservată în sticlă de culoare brună la 2-8°C); j
• ansă cu fir de platină sau pipetă Pasteur (cudată);
• soluţie de brom ură de cianogen 10% (ar fi de preferat datorită riscurilor să uti­
• colonii izolate dezvoltate pe agar-sânge, agar-chocolat sau agar M ueller Hinton.
lizăm fâşii de hârtie indicator im pregnate în soluţie de brom ură d e cianogen,
produse com ercial); ' / Tehnica de lucru
• folosim culturi (realizate pe m ediul L ow enstein-Jensen), în vârstă de m inim 3 E xistă mai m ulte variante tehnice, dar vom discuta doar una dintre acestea.
săptăm âni. P unem într-o cutie Petri un fragm ent de hârtie de filtru p e care depunem 1-2 pică-
l
34 Diagnosticul de laborator Tn microbiologie
I* Teste de identificare pe baza caracterelor biochimice aie fungi lor şi bacteriilor 85

~~* ~~ ’
turi de soluţie apoasă de tetra-m etil p-fenilendiam ină 1%. După,, sterilizarea şi ră­
cirea ansei, prelevăm dintr-o colonie izolată şi descărcăm cultura p e hârtia de filtru © absenţa inhibiţiei în ju ru l discului sem nifică un test negativ;
prin m işcări circulare de m ică am plitudine. . * interpretarea este diferită dacă se folosesc discuri de optochin cu alte dimensiuni
Urm ărim apariţia unei reacţii de culoare în interval de 10 secunde ' (ex. cu diam etrul de iO mm).
î _ •,
I n te r p r e ta r e ' ,1'v i;' '' C o n tro l d e ca lita te
• apariţia unei zone de c u lo a r e purpurie în 10 secunde;1reprezintă tin test pozitiv; >• M artor pozitiv - Streptococcus pneumoniae;
o absenţa culorii purpurie, sem nifică un teist n e g a t i v ; . : . ' \ ’ ‘ • M artor negativ - Streptococcus viridans.
• apariţia zonei colorate m ai tardiv nu perm ite interpretarea testului, în principiu Fără îndoială că aceste teste reprezintă doar câteva exemple din multitudinea
este vorba despre un rezultat negativ. - .. testelor utilizate în laboratorul de microbiologie. Numai în vederea identificării dife­
ritelor specii mycobacteriene se pot utiliza, spre exemplu, peste 130 de teste fenotipice.
C o n tro l de ca lita te
înţelegerea lor din punct de vedere teoretic precum şi utilizarea lo r în m od prac­
« M artor pozitiv - Pseudomonas aeruginosa; tic sunt utile atât pentru studenţi, medicii rezidenţi aflaţi la debutul pregătirii în spe­
« M artor negativ - Escherichia coli. cialitatea de m edicină de laborator, pentru viitorii m edici din alte specialităţi cât şi
pentru medicii şi biologii im plicaţi în diagnosticul de laborator la nivel clinic sau în
12.13. Testul sensibilităţii la optochin interesul sănătăţii publice.
A vând la bază noţiunile teoretice învăţate, diferitele exem ple precum şi m anu­
P rin c ip iu
alele care prezintă din punct de vedere practic diagnosticul m icrobiologic, fiecare
M ajoritatea tulpinilor de pneum ococi (Streptococcuspneumoniae) sunt sensibile dintre cei im plicaţi va putea să aplice aceste elem ente,.deprinzând arta acestui diag­
la concentraţii scăzute (< 5 gg/m l) de optochin (hidroclorid de etU-hidrocupreină). nostic atât de util în practica m edicală la nivel individual sau populaţional.
Unele tulpini ale altor streptoci care produc hem oliză viridans pot fi sensibile, dar
U ltim ul test pe care îl vom prezenta în finalul acestui capitol nu se bazează pe
la concentraţii mai m art ale substanţei active, in tim p ce alte tulpini sunt rezistente.
proprietăţile biochim ice ci are la bază caracterele antigenice (structura antigenică)
M a te ria le n ec esare ale m icroorganism elor din specia Streptococcus pneumoniae.
D atorită faptului că nu există un capitol special al tehnicilor im unologice unde
• discuri cu optochin (5 pg/disc), cu diam etrul de 6 m ilim etri; - / r:
ar putea fi integrat, precum şi datorită faptului că în paginile precedente am prezen­
® plăci, cu agar-sânge; ' ' v ' ■ •' :l ■■ tat testul bilolizei şi respectiv testul sensibilităţii la optochin (am bele teste fiind
« tam poane sterile; necesare în diferenţierea Streptococcus pneumoniae de Streptococcus viridans) am
® colonii a-h em o litice izolate, care urm ează a ii testate. decis să includem aici, acest test.

T eh n ica de lu c ru r ., 12.14. Testul umflării capsulei (Meufeld, Quellung test)


Prelevăm cu un tampon steril de preferat'2-3 colonii şi realizăm 6 insamanţare pe
P rin c ip iu
jum ătatea unei plăci cu agar-sânge, în aşa fel încât să rezulte o cultură confluenta (din
motive de economie, însăm ânţarea s-ar putea realiza şi pe o pătrim e de^pjaclfPetri). Com plexul antigen-anticorp form at în urma cuplării antigenului capsular .pneu­
Plasăm un disc cu optochin în centrul zonei însămânţate şi presării uşor pentru ca dia­ m ococi c cu anticorpii anti-capsulari are o refringenţă superioară m ediului înconjură­
cul să adere uniform. Incubăm timp de 18-24 ore la 35-37°C în atmosfera de 5% COg. tor şi apare, la exam inarea cu microscopul optic, ca un halou clar dispus în jurul bac­
teriilor, halou care are dim ensiuni mai mari decât haloul identificat prin m icroscopie
I n te r p r e ta r e •' 17 (preparat colorat cu albastru de metilen) în lipsa serului anti-capsular.
• apariţia unei zone de inhibiţie cu diam etrul mai m are de 14 m m , sem nifică un
M a te ria le n ec esare
. test pozitiv; , .. ‘‘ ■■ ■ i\■:'h
• cultura unei bacterii care se presupune că aparţine speciei 5. pneumoniae;
f
86 Diagnosticul de laborator în microbiologie
*
, *
TESTE DE IDENTIFICARE RAPIDE/MODERNE
o se pot utiliza şi produse patologice (ex. LCR);
o ser anti-capsular polivalent; seruri anti-capsulare m onovalente (de tip);
• soluţie de albastru de m etilen (1%); , :
• soluţie salină fiziologică;
• lam e şi lam ele;
• m icroscop optic. .-VMSb'ţuţiv-■ v. > N oţiunile care urm ează nu au im portanţă din punctul de vedere al unui examen.
O pinia noastră este că un viitor medic, indiferent de specialitate, ar trebui să fie
Tehnica de lucru inform at, să ştie că există şi aceste tehnici de identificare/diagnostic. în funcţie de
A., examinarea.preparatuM m a r t o p , , . ,, opţiunile personale, fiecare dintre cei interesaţi se poate docum enta suplim entar, fie
la curs sau în cadrul lucrărilor practice, fie citind im presionanta docum entaţie care
• realizăm o suspensie omogen,: opaleşcentă din cultura bacteriană în, 0,5 ml
a apărut în acest dom eniu în ultimii ani. Subliniem din nou faptul că cititorul tre­
soluţie salină fiziologică şi adaugăm 0,5 ml soluţie de albastru de metilen;
buie să fie conştient că în cele ce urm ează sunt prezentate doar câteva exem ple, care
• depunem o picătură din suspensie pe o lam ă de m icroscop, acoperim cu o la­
ar putea fi considerate drept o „sensibilizare" faţă de vastul dom eniu al tehnicilor
m elă şi exam inăm dim ensiunea haloului care apare datorită prezenţei capsulei.
m oderne care sunt la îndem ână, după caz, în m om entul de faţă.
B. examinarea preparatului test <■•••. ' . ••••■' • a '
A ceste tehnici au fost puse la punct din diferite m otive (creşterea sensibilităţii
• depunem pe o altă lam ă de m icroscop o picătură din suspensia bacteriană şi în şi/sau specificităţii, obţinerea unui rezultat mai rapid, im posibilitate cultivării anu­
stricta vecinătate a acesteia depunem o picătură din serul polivalent anti-cap- m itor m icroorganism e etc); m etodele de testare/identificare/diagnosticare m oderne
sular; ■1 o v ;\ vin să com pleteze m etodele clasice care răm ân şi astăzi foarte utile. D e cele mai
• am estecăm prin m işcări circulare cele 2 picături; m ulte ori tehnicile de identificare m oderne sunt practicate numai la nivelul centrelor
• aşteptăm 10 m inute (preparatul se m enţine în „cam eră um edă“). ’ de referinţă.
/ ■ Subliniem faptul că nim ic nu trebuie absolutizat, iar diagnosticul în m edicină
Interpretare trebuie să ţină cont de datele epidem iologice, clinice, paraclinice, de laborator, la un
• identificarea unor coci coloraţi în albastru, dispuşi izolat sau în pereche, încon­ pacient anum e (întotdeauna diagnosticul se va pune într-un caz concret, la un
juraţi de un halou clar, mai bine definit şi de dim ensiuni mai m ari decât haloul anume pacient cu o boală transm isibilă, fiecare pacient poate reacţiona într-un mod
vizualizat prin exam inarea preparatului m artor sem nifică un test pozitiv, particular, interacţiunea dintre gazdă şi m icroorganism ul parazit poate varia în de la
respectiv prezenţa pneum ococilor; caz la caz). în acelaşi sens putem discuta şi despre „raportul" dintre testele „m icro­
• în cazul în care nu este sesizată nici o diferenţă între preparatul test şi prepara­ biologici clasice" şi testele „m icrobiologici m oderne" care se com pletează reciproc.
tul m artor ne aflăm în situaţia unui test n egativ ;’
Tehnici de biologie moleculară
• după identificarea unui test,pozitiv faţă de serul polivalent, putem utiliza seruri
m onovalente, specifice de tip pentru a indentifica tipul capsular; Din m ultitudinea tehnicilor existente, vom discuta numai utilizarea sondelor
o testul um flării capsulei se poate realiza şi pornind pe produs patologic. • nucleotidice şi tehnica de am plificare genetică.
. ... . , , . .ii
Control de calitate '* *’ I. Utilizarea sondelor nucleotidice
• M artor pozitiv - tulpină capsulată de Streptococcus iţneupţqniae; j. Principiu
o M artor negativ - Streptococcus viridans.
H ibridizarea acizilor nucleici (AN) reprezintă unirea a. 2 fragm ente de AN mono-
catenare, în structuri bicatenare stabile, în condiţii potrivite de tem peratură, pH şi con­
centraţie ionică. H ibridizarea este condiţionată de com plem entaritatea secvenţelor
bazelor celor două catene. în momentul actual se utilizează din ce în ce mai frecvent
I «3 Teste de identificare rapide/moderne 89
88 Diagnosticul de laborator în microbiologie

Control de calitate
sondele nucleotidice m arcate ne-radioactiv, reactivii necesari fiind produşi şi livraţi
comercial. Vom prezenta în continuare, drept un exemplu, modul de lucru în cazul în funcţie de specia m ycobacteriană suspectată (pe baza altor criterii clinice, pa-
unei truse com erciale. A cesta are la bază hibridizarea A D N-A RN 16s şi este utilizată raclinice, de laborator) vom utiliza:
în identificarea tulpinilor m ycobacteriene aparţinând speciilor din com plexul M. • M artor pozitiv - M. tuberculosis sau M. avium sau M. kansasii etc;
tuberculosis, din com plexul M. avium precum şi speciilor M. kansasii, M. avium, M. • M artor negativ - un tub în care nu se introduc celule b ac te rie n e."
intracellulare şi M. gordonqe; există şi alte variante tehnice,, în funcţie deţproducător.
Reactivii utilizaţi au în com ponenţă un ester de acridinium , ceea ce v a perm ite II. Tehnica de Amplificarea genetică * Polymerase Chain Reaction (PCR)
evidenţierea reacţiei pozitive cu ajutorul unui lum inom etru. >• Principiu
M ateriale necesare i ... ,. tSs ,,, T ehnica PCR pentru secvenţe specifice de A D N (direct în produsele clinice sau
• reactivul 1, reactivul 2, reactivul 3 şi reactivul „sondă"; noi- după izolarea m icrobiană în culturi) constituie o m etodă rapidă de detectare a diferi­
ţilor agenţi infeeţioşi. A ceastă tehnică presupune utilizarea unor am orse oligonu-
• baie de apă cu u ltra su n ete ;' :- ' : 1 ‘
cleotidice specifice A D N -ului ţintă. în urm a denaturării term ice a catenelor de
• aparat term ostat 50- 100°C; ’ '
A D N , am orsele vor hibridiza cu secvenţe com plem entare de pe acestea. A num ite
o lum inom etru „L eader"; condiţii de tem peratură precum şi prezenţa, unei polim eraze term ostabile (Taq
® pipetă m ecanică 100-1000 pi; polim eraza) vor perm ite copierea A D N-ului ţintă într-o catenă com plem entară
® vortex (om ogenizator); situată în prelungirea am orselor hibridate.
® tuburi cu medii de cultură solide pe care au fost cultivate m ycobacteriile de R epetarea procedeului, în condiţii diferite d e tem peratură necesare denaturării,
identificat; , . . . . hibridizării şi polim erizării pe m atriţa A D N -ului ţintă (utilizând un sistem automat,
• tuburi cu substrat pentru liza celulelor m ycobacteriene. într-un aparat construit în acest scop care se num eşte term ociclor), conduce la acu­
m ularea mai m ultor m ilioane de copii ale fragm entului de A D N definit de amorse.
Tehnica de lucru , • r ‘ ■ r *'
Prin m etoda PCR se poate reduce timpul necesar diagnosticului infecţiei cu M.
Putem începe identificarea tulpinilor mycobacteriene după apariţia coloniilor pe me­ tuberculosis de la 3-8 săptăm âni (cât durează cultivarea pe mediu solid) la 2-3 zile.
diile de cultură. După ce pipetăm primii 2 reactivi în tuburile de liză, transferăm în tuburi M etoda poate fi . utilă şi în identificarea tulpinilor de M. tuberculosis sau de
câte o ansă de cultură şi.agităm pentru omogenizare („vortexăm ").Punem tuburile în m ycobacterii ne-tuberculoase („atipice"),
baie de apă cu ultrasunete (15 minute), în scopul lizării bacteriene şi extragerii ADN- s*
ului cromozomi al. încălzim 1.0 minute la 95°C pentru inactivarea mycobapteriilor. M a te ria le n ec esare

Transferăm 10 0 p l de lizat în tubul în care am pus reactivul „sondă" şi incubăm • term ociclor
15 m inute la 6 0 °C , după care adăugăm reactivul 3 şi vortexăm .'.Incubăm la160,°C • m icrocentrifugă şi centrifugă dotată cu sistem de răcire;
pentru o durată care variază în funcţie de apartenenţa ipotetică a tulpinii de testat şi • vortex (om ogenizator);
anume: 10 m inute pentru com plexul M. tuberculosis, 8 m inute pentru M. kansjisii • aparat de electroforeză;
şi respectiv 5 m inute com plexul M. avium, M. gordonae, M : avium şi M. mtmpel-
• transilum inator UV;
lulare. Lăsăm tuburile să se răcească la tem peratura cam erei după care le intro­
• sistem foto Polaroid;
ducem pe rnd pentiu citire într-un luminometru. ........... I
• pipete autom ate P2, P20, P200, P1000; vârfuri; tuburi Eppendorf;
Interpretare / • gheaţă şi Cutii pentru gheaţă;
® în cazul com plem entarităţii dintre A D N -ul extras din tulpina testată şi sonda • am estec dN TP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP);
nucleotidică, va avea loc hibridizarea şi respectiv va fi evidenţiată em isia • Taq A DN polim eraza şi tampon de am plificare;
luminoasă, reacţia este pozitivă; ' • primeri (am orse) pentru M. tuberculosis sau pentru M. avium;
® lipsa em isiei lum inoase sem nifică o reacţie negativă.
( ■

90 Diagnosticul de laborator în microbiologie Teste de identificare rapide/mpderne

• ADN de am plificat; • 9. centrifugăm (la rece) 30 de m inute la 12000xg; , , i:;,


• ADN M. tuberculosis+ sau M. avium+; 10. aspirăm lichidul cu precauţie, pentru a nu antrena şi sedim entul (precipitatul);
• m arker de greutate m oleculară (DNA ladder 1 kb); d in acest m om ent tubul de lucru trebuie m enţinut în perm anenţă rece (utilizăm în
• apă bidjstilată sterilă, ulei miner,al, fenol saturat cu Tris-ED TA , am estec de acest scop o cutie cu gheaţă); '
cloroform -alcool izoam ilic, etanol 70% , soluţie «bleu»; 11. spălăm cu etanol 70% 600-1000 pi, fără să agităm tubul şi efectuăm even­
- r - .titc ■ ■ -■■■'i; u nc'roi <!«}*« to ;,.:M » tu a l o scurtă centrifugare
• agaroză;
. 12. aspirăm etanolul (cu precauţie, pientru a nu antrena şi precipitatul) şi Uscam
• b ro m u răd e etidium;.,.,;V,f .:, •.wjjjv/V* \nrţi,i ftjj jr'iiadaY î|
precipitatul, fie sub protecţia hotei biologice (cteva ore) fie cu ajutorul unui aparat
• tampon pentru electroforeză.
ttirţ&iis; ■ speed-vac (20-30 m inute); între timp putem prepara am estecului de reactivi nece­
Tehnica de lucru sari pentru am plificarea genetică j [tam pon pentru Taq polim erază 10 X , nNTP
■ uo », : ; • ■ :• ■,i: - . Mir
10mM , primul prim er (ex. M T ]),; al doilea prim er (ex. M T 2), ap ă distilată, Taq
D in punct de vedere practic, ţestul PCR pentru diagnosticul infşcţiilorm ycqbqc-
polim erază la care se va adăuga A D N ru l„ex tras"] , , , V] ...
teriene com portă 4 etape m ajore: .;;j, i - , ) , . jj,
13. suspendăm ;A D N ru l extras în 50 p l apă distilată şi îl congelăm (-20°C) până
1..-Tratarea produselor c lin ic e (spută, aspirat bronic; lic h id pleural etc) sau a cuL
în m om entul utilizării; . . .. , ,
turii, în vederea lizei celulelor şi eliberării A D N-ului m ycobacterian; .-om:. :<4CI '
14. preparăm am estecul de reactivi (se lucrează „în gheaţă"); T aq polim eraza va
2. A m plificarea propriurzisă în cursul căreja A D N -ul este supus unei succesiuni
fi scoasă ultim a din congelator, doar înainte de includerea ei în am estec;
de cicluri de tem peratură, în prezenţa am orselor (prim eri) specifice, a nucleotidelor
15. în vederea adăugării A D N-ului „extras", în fiecare tub cu reactiv i vom intro­
şi a enzimei term ostabile T aq polim eraza. A ceastă etapă.se realizează în term ociclor;
d u ce câte 2 picături d e ulei m ineral; ulterior, trecând cu precauţie p r in uleiul m i­
3. D etecţia fragm entului am plificat prin m igrarea produsului de am plificare
neral vom include în tuburi şi ADN-ul.
genetică în gel.de agaroză 2% , în prezenţa brom urii de etidium şi vizualizare după
utilizarea radiaţiilor U .V . (rezultatul se poate fotografia); . ,.( 2. Amplificarea propriu-zisă : . :
4. Confirm area specificităţii reacţiei PC R prin transferul fragm entelor am plifi­
cate din gelul de agaroză pe o m em brană de celuloză sau nylon şi hibridizarea cu o T uburile cu reactivi şi A D N -ul purificat, vor fi introduse în term o ciclo r şi sunt
sondă specifică, m arcată neradioactiv.. supuse unui ciclu de denaturare iniţială (94°C, 5 m in) urm at de un n u m ăr de 35 de
cicluri de am plificare, fiecare ciclu constând din: denaturare la 94°C (2 m inute),
1. Extracţia ADN-ului mycobacterian comportă următoarele etape: hibridizare la 50°C (2 m inute), extensie la 72°C (2 m inute). La sfârşitul celor 35 de
1. realizăm tratam entul term ic, pentru liza peretelui m ycobacterian şi Vortexăm; cicluri de am plificare urm ează o etapă de extensie la 72°C, 10 min.
2. prelevăm 500-600 pi din produs şi transferăm într-un tub Eppendorf de, 1,5-2 ml;
3. Detectarea fragmentelor amplificate prin reacţia PCR
adăugăm un volum echivalent de fenol saturat cu Tris-ED TA ;
3. centrifugăm 15/ininute la 12000 xg; ‘ 1 ........ ‘ ' 1. turnăm un gel de agaroză 1 % în care după răcirea la 50°C, adăugăm 20 pl bro-
4. prelevăm cu grijă faza apoasă (superioară) şi o transferăm într-un alt tub m ură de etidium ; turnăm gelul (folosim un „piepten" cu 15 dinţi);
Eppendorf; eventual repetăm extracţia cu fenol (până când nu m ai apare un precipi­ 2. pregătim probele pentru migrare, am estecând într-un tub E ppendorf 5 pl din
tat alb proteic la interfaţă); ’ • I,: , , produsul de am plificare cu 3 pl soluţie «bleu»; centrifugăm scurt şi depunem în
5. prelevăm ultim a fază apoasă şi o transferăm într-un alt tub Eppendorf; adău­ godeurile gelului; într-un godeu al gelului depunem markerul de greutate m oleculară;
găm un volum echivalent de cloroform -alcool izoam ilic (24:1); 3. supunem m igrării la tensiune constantă de 80V în T B E lx până când co­
6. centrifugăm 15 m inute la 12000 xg; , j lorantul se deplasează circa 2,5 cm ; . • !■ « '
7. prelevăm faza apoasă rezultnd un volum notat cu „X “ ; adăugăm acetat de 4 . exam inăm şi fotografiem în UV.
amoniu 10 M, pH 5 (în aşa fel încât să rezulte în final o concentraţie de 0,3 M ) şi
2,5 volume (raportat la volum ul X ) de etanol absolut; / 4. Confirmarea specificităţii reacţiei PCR
8. introducem tubul (tuburile) de lucru pentru 10-30 de m inute la -70°C; în acest
S pecificitatea reacţiei s-ar putea controla prin hibridizare cu un oligonucleotid
interval reglăm centrifuga la 0°C; i m arcat, a cărui secvenţă este derivată din secvenţa studiată (ex. 1S6110). ; '
92
Diagnosticul de laborator în microbiologie 13 Teste de identificare rapide/moderne 93

Interpretare .. I î : n :.i: *' 1. Diagnosticul rapid al infecţiilor, pornind de la produse patologice sau cultură
• o reacţie pozitivă pentru M. tuberculosis (1561.10) este reprezentată d e un Prin tehnici cromatografice se pot identifica anumiţi compuşi care sunt în m od carac­
ăm plicon (produs de am plificare genetică) având o dim ensiune de 201 pb în teristic asociaţi cii 'agefitul etiologic al unei anum ite boli transmisibile, spre exemplu:
tim p ce pentru M. tuberculosis (Mt308), este reprezentată de un ăm plicon
• identificarea şi analiza unui am estec de acizi graşi cu lanţ s c u rt (volatili şi
avand o dim ensiune de 276 pb ,
!.:jţoii tJnxr iii !>.■->:-1 îxiuî nevolatili) în puroi, lichid pleural, lichid de ascită etc, sem nificând o infecţie
• o reacţie pozitivă pentru M.^avium e ste reprezentată ,de, un ăm plicon,având o . cu bacterii angerobe (GC-FID);
dimensiune de 205 pb; . , . iiiy ^ u m • determ inarea prezenţei m anozei şi D -arabinolului la pacienţi cu candidoză sis
• din cauza sensibilităţi foarte crescute a reacţiei de polim erizare în lanţ (am pli­ tem ică (G C -FID );
ficarea unei singure m olecule ADN) trebuie luate o serie.d e m ăsuri care să • determ inarea prezenţei acidului -hidroxim iristic, pentru a dem onstra existenţa
provină contam inarea cu acizi nucleici exogeni, spre exem plu unei infecţii cu bacterii gram negatice (GC, M S, M S-SIM );
• nn se prepară A D N , reactivi şi am estecurile pentru reacţie în spaţiile în care • identificarea acidului tuberculostearic în spută sau LCR şi/sau acizilor m icoce-
so m anipulează produşii PC R ; se recom andă c a diferitele etape să fie exe- rozici în cultură de 5 zile, pentru diagnosticarea infecţiilor produse de myco-
eiitate în cam ere separate; în plus, este recom andată folosirea h o te lo r cil bacterii; m etoda ar fi extrem de utilă în m eningita tuberculoasă, o adevărată
flux lam inar dotate cu surse de lumină UV pentru inactivareă A D N conta- problem ă de diagnostic (TLC, GC);
,*• .. ... ." - •. .... *»i’'?.ffii
.. >V i î .i>biv;?»)1’ V-'Ş
1‘.i* ■it
niim n t;
• determ inarea unor concentraţii crescute de acid lactic în LCR, lichid de ascită,
lichid pleural etc pentru a diferenţia inflam aţia bacteriană de cea ne-bacteriană

(GC) etc.

aerosoli; 2. Identificarea rapidă a unor microorganisme


• sc lucrează num ai cu m ănuşi care se schim bă frecvent; ;v::» 1 ... ;
• determ inarea prezenţei acizilor graşi cu lanţ lung (ex, acizi m icolici), carac­
• reactivii se păstrează în-eşantioane m ici (de regulă pentru ,o singură folosire), teristici pentru Mycobacterium spp., Nocardia spp. etc (TLC, G C, M S);
.de preferat într-un spaţiu* de congelare special destinat acestui scop; • analiza acizilor m icolici care perm ite identificarea a peste 40 de specii din ge­
• întotdeauna se include un tub-m artor negativ, care conţine toate com ponen­ nul Mycobacterium (H PLC);
tele reacţiei de am plificare cu excepţia'A D N ; acesta'se pregăteşte ultim ul • analiza produşilor de m etabolism (acizi organici cu lanţ scurt, alcooli) pentru
etc. *■■* .. .:.:■.!!': j;ţvi ,.i j;. identificarea bacteriilor strict anaerobe; fiecare acid pus în evidenţă într-o
anum ită cultură este identificat prin com parare cu datele dintr-o crom atogram ă
Control de calitate , -Ui1.
standard (GLC) etc.
• Martor pozitiv - ADN extras din tulpina'de referinţă pehtru 'M : tuberculosis,
H 37r v; ■ - t ; ■>: - ; - v UK ju h !
Câteva elemente tehnice
• Martor negativ - tub cu toţi reâctivii în âfafâ de ÂDN. v ■' \ţ ■! 1 T oate m etodele crom atografice necesită existenţa unei faze m obile şi unei faze
IT ’ - i li V . - ,K J . -iii :Kf. '■* «K "■ - 1 -A f staţionare. Faza m obilă poate fî un gaz sau un lichid. Faza staţionară poale ii un
Tehnici cromatografice " ^ im ,,! lichid sau un solid. D iferitele com ponente ale unui am estec se absorb în m od «Iile
renţiat la o suprafaţă sau se dizolvă în m od diferenţiat în cele două faze imişcibile.
Cromatografia a început să fie utilizată încă din 1905,iînsă metoda a.fost mujt Pentru că fiecare com pus are o anum ită solubilitate specifică în raport cu celo două
îmbunătăţită în timp. Cromatografia reprezintă o tehnică de separare şi/sau identifi­ faze, extracţia com puşilor din am estec dintr-o fază sau alta se va face cu eficiente
care a unor structuri chimice aflate în amestec, dacă acestea au solubilităţi diferite diferite.
în două faze, una mobilă şi alta staţionară. Prin realizarea acestei tehnici rezultă o In funcţie de fenom enul „utilizat" (absorţie, adsorbţie, partiţie, schim b de ioni
cromatogramă cu ajutorul căreia se pot face analize calitative sau cantitative. etc) există diferite tehnici crom atografice. A şa cum am enum erat m ai sus (între
Tehnicile cromatografice se pot utiliza în microbiologie în următoarele scopuri: paranteze) tehnica crom atograficâ se alege şi în funcţie de substanţa care urm ează
Diagnosticul de laborator în microbioîogie
94
TESTAREA SENSIBILITĂŢII LA ANTIBIOTICE
a fi analizată. M odul de detectare pentru diferitele m olecule este şi el diferenţiat în SI
» CHIIVIIOTERAPICE
funcţie de sem nalul biologic (determ inare şpectrofoţom etrică a absorbanţei lum inii
în funcţie de concentraţia substanţei, delectarea pH -ului, deţectareg unor. substanţe
care se colorează prin diferite tehnici etc).
liif..
r) u u . a . . f m î ><:■ .•smji-r.vipii sb awfţprris >ums i.-vcnm. p: *,t)myftiwî.’>i/t *•
GC = gaz cromatografie; F I D * detector qu ionizare în flacără (flam e ionization detector); MS
; •' -• : • •; . ■ ', r ‘{ -î *. • : - i i / ’ .**
= spectrometrie de masă (mass spectrometry); SIM = monitorizare selectată a.ionilor (selected ion
monitoring); TLC = cromatografie in strat subfire (thin layer chrbmatography); HPLC''='lichid cro- Testarea sensibilităţii la. medicamentele, antimicrobiene s e . realizează (din punct de
matografie de înaltă performanţă (high performance liquid’chromatography); GL€.= gaz lichid cro­
vedere didactic) în a cincea etapă a diagnosticului de laborator microbiologic, pentru majori­
matografie: ( v -',in,. ; - ' '
tatea microorganismelor implicate etiologic. Testarea , este necesară’.datorită apariţiei şi
/iT.' ..o.î'i'i.Vţ î i i . a i sbi':1' extinderii rezistenţei multor microorganisme la antibiotice şi‘chimioterapice (rezistenţa =
,:P "tiri ii./ fijua'tn 1 t St 1
.!.: capacitatea de a supravieţui şi de a se multiplica în prezenţă medicamentului antimicrobian).
'(•rifcv'ijjsdri hi U ih > . i ti iii'i'tţ.i Rezistenţa poate fi naturală sau dobândită. Rezistenţa naturală este determinată: genetic.
■Vii v=-î». 'j PP: î h: -., m ril'd
Rezistenţa dobândită este „achiziţionată1* de anumite subpopulaţii-dintr-o anumită specie
; ,t i u ''.i: î i c-Vi U P i ^ y P iii sro ri : t j ..»Tî T ■h ivi» î i
microbianâ, în circumstanţe date; de exemplu antibioticul acţionează ca un presor selectiv.
' '-ii/ ,:)U -nî in ;('li' U : .. of rf ir oi o vil
Antibioticele şi chimioterapicele antimicrobiene reprezintă un grup de■substanţe
a P P ‘ ' X r ; . i i r i " i . ni.b :)jj urii. : h k ' V ţ
medicamentoase capabile să distrugă sau să blocheze multiplicarea microorganismelor (în
î'î ri'l.i ? i; ., ţji. jr; - ■ .iU i ' . ii.iţi .vSŢHlf "i îri lo i. i r
continuare vom utiliza numele de „antibiotice" pentru ambele tipuri de produse medica­
. li-i. ■:;»«-I
mentoase). Au o acţiune'selectivă asupra celulelor microorganismelor, exercitând acţiuni
(! i£i,.
minime asupra celulelor organismului gazdă, în continuare vom discuta numai despre
medicamentele antibacteriene şi antifungice.
« .sj >. O O O ’■ . „ t i t f, .-i» ’i i ' i v i ,il

•; ,jrJ i-;'d
:/:0. .1 4' Alegerea corectă a antibioticelor în tratamentul bolilor infecţioase
. w ,\\ 1 •A l , .'iik'.rj : i î t d A i Modificări ale spectrului antimicrobian iniţial
U ; . "î. ? ■’ / VrV/ : U ' p î - P P
p
i " ■\ • ‘'.'fi. 1' i i ' f . T i i . : 'I. •• f, ’•.iţi,ii': K
Implicaţiile clinice, terapeutice, epideiniologice şi administrative ale fenomenului de
rezistenţă bacteriană la antibiotice şi chimioterapice sunt extrem de mari. Selectarea tul­
, .'(U ■:> 'iii .■ . :i'ţi : '.fi : o pinilor rezistente (adeseori datorită unor abuzuri de prescriere, în spitale, alte unităţi sanitare
• ■. ».■ ‘ ... AV- ’ sau prin auto-medicaţie), duce la variate aspecte negative: infecţii cu germeni rezistenţi,
apariţia şi transmiterea „germenilor de spital11, devalorizarea şi pierderea unor medicamente
antimicrobiene etc. Este strict necesară supravegherea fenomenului de rezistenţă la antibio­
tice şi chimioterapice, testarea sensibilităţii germenilor, notificarea şi evaluarea statistică,'
■ t.'.o: v., j' -‘ ■< .1 ■■ , publicarea periodică a datelor şi punerea lor la dispoziţia sistemului sanitar.

.. Ji ■ ' •• , Etape de urmat în vederea instituirii corecte a unui tratament cu antibiotice


•,!■■■ ....... : ■:.> •• <■ !OI|l . I . 1. Se ia decizia de a recurge la antibioterapie; în acest scop trebuie să ne punem cel puţin
-;( ,t• ••
•i;-»*., :■ i. ’ ■•; ■ •: :■■ •' .1 .!. UU următoarele 2-întrebări: a. este în discuţie o infecţie certă sau foarte probabilă? b. care este
I: u -/■ ** ■ ' • .i. ' • • ) i: . ’.Jiu:
|a.: o<i .J ! il i :.■
i i i)i;/
n b■iî „terenul11pe caras-a instalat infecţia (este o gazdă normo-competentă imunologic)?
• I. ■. .. ,• h 2. Se aleg antibioticele care urmează a fi prescrise; în acest scop trebuie să avem în
■'î ■ i):> vedere: a. stabilirea diagnosticului etiologic, b, testarea sensibilităţii la antibiotice, c. pro­
prietăţile farmacologice ale antibioticelor propuse pentru a fi folosite, d. criteriul economic,
e.posibilitatea şi oportunitatea utilizării unor asocieri de antibiotice etc.
f ; , 3. Precizarea căii şi modului de administrare pentru antibioticul ales.
x\ •
•nfî'iî.
96 Diagnosticul de laborator în microbiologie 14 Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice 97

Controlul terapiei antimicrobiene se va realiza pe tot parcursul administrării şi va Testarea sensibilităţii la agenţi antimicrobieni
cuprinde metode clinice (ex. ameliorarea simptomatologiei) şi de laborator (examene para-
în general, o tulpină poate fi considerată sensibilă atunci când germenii sunt în mod efi­
clinice, dozarea antibioticelor în ser etc).
cient afectaţi de către antibiotic, iar efectul terapeutic poate fi obţinut cu doze şi pe căi de
Erori frecvente în utilizarea antibioticelor administrare „obişnuite". Tulpina va fi considerată moderat sensibilă dacă germenii sunt
afectaţi într-o măsură mai mică, iar efectul terapeutic nu poate fi obţinut decât în condiţii
Antibiotico-terapia se află într-un impas constatat clinic prin numeroase eşecuri terapeutice speciale (ex. prescrierea unor doze mai mari decât cele „obişnuite", utilizarea unor căi de
şi confirmat prin studii de laborator. Principalele probleme sunt reprezentate de un număr imens administrare speciale/injectare intravenoasă, intrarahidiană etc). în mod absolut se consideră
de prescrieri abuzive şi de folosirea iraţională a unor antibiotice. Ck rezultat se dbnkta't'ăiapariţia că o tulpină este rezistentă dacă rezultatul testării sensibilităţii in vitro este negativ.
de specii sau de tulpini („mutante") bacteriene cu1rezistenţă la antibiotice şi înmulţirea reacţii­
lor adverse fală deaceste medicamente.' \ ’[ ‘‘ ‘ M etode de testare a sensibilităţii bacteriilor la agenţi antimicrobieni
Soluţia cea mai bună pentru prevenirea acestor problemei este, folqşirea raţională a medi­ Deoarece între rezultatele testării in vitro şi efectul terapeutic in vivo pot exista anumite
camentelor antimicrobiene deja existente, în acest sens fiind necesar, să cunoaştem care sunt diferenţe, metodele de testare a sensibilităţii pot fi diferenţiate în:
cele mai frecvente erori în folosirea antibioticelor.;; , , , , , .ytk^ nril.-ir.dot -.n.S a. metode de testare a sensibilităţii in vitro
1. Este incorectă utilizarea'antibioticelor în -lipsa unui diagnostic clinic, folosirea acestor b. metode in vivo, care ţin cont de relaţia agent terapeutic-infecţie.
medicamente în orice „stare febrilă" (temperatura trebuie, monitorizată corespunzător), în
„bănuiala, unei infecţii", în cursul unui tratament „la întâmplare" sau „pe încercate",,nefunda- Metode de testare a sensibilităţii in vitro
mentat pe criterii raţionale (cel puţin criterii de probabilitate). Oferirea criteriilor de;probabili­
Antibiograma face parte din prima categorie de metode menţionate. Reprezintă metoda
tate este o datorie a centrelor naţionale de referinţă care trebuie să realizeze şi să publice peri­
de laborator prin care se apreciază sensibilitatea la antibiotice a germenilor recoltaţi de la
odic studii privind circulaţia tulpinilor microbiene, implicarea acestora în diferitele,entităţi clini­ bolnavii cu infecţii bacteriene, după cultivare pe medii speciale (de exemplu pe agar
ce, sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor izolate etc,m u : ' - m ■ nnmm . •i i . ni ucUm. Muelier-Hinton).
2. Este incorectă prescrierea unui medicament antimicrobian în afara contextului (şi Pentru antibiograme trebuie să folosim culturi pure (reprezentând o singură tulpină bac-
interpretarea corectă a datelor de laborator). Indiferent de specialitate este necesară cu­ teriană), chiar în cazul infecţiilor multibacteriene. Cele mai frecvent utilizate tehnici sunt:
noaşterea şi utilizarea în mod corespunzător a unor noţiuni, elementare de microbiologie. Nu
• Tehnicile calitative
se va (începe antibioticoterapia înainte de recoltarea produsului patologic şi de efectuarea
• antibiograma difuzimetrică comună (cu discuri)
unor examene paraclinice elementare (leucogramă, VSH, radiografie, sumar de urină etc).
Nu trebuie să uităm că în supiciunea unei infecţii avem la îndemână posibilitatea efectuării • antibiograma difuzimetrică comparativă
de preparate între lamă şi lamelă şi frotiuri colorate, a cărof examinare poate dura uneori • antibiograma difuzimetrică standardizată
doar 5 minute, permiţând în scurt timp obţinerea unui rezultat orientativ, uneori foarte • antibiogramele difuzimetrice rapide
important. încă din al doilea an de studiu se obţin primele date referitoare la testarea sensi­ • Tehnicile cantitative
bilităţii la antibiotice (antibiograma), metodă care nu trebuie interpretată mecanic, nu tre­ • metoda diluţiilor în mediu lichid
buie nici subestimată şi nici supraevaluată. , ,. , , , , ;: ;j . • metoda diluţiilor în agar
3. Este incorect să nu cunoaştem şi să nu utilizăm corespunzător noţiunile şi datele • metoda microdiluţiilorîn agar
privind spectrul antimicrobian,'folosirea antibioticului1de elecţie, difuzibilitatea în focar, • metoda „punctelor de ruptură"
mecanismul de acţiune,;reacţiile adverse posibile, , ,; ., (;i> ; ,j> ■: • testul „E“
4. Utilizarea antibioticelor în.scop profilactic trebuie, privită cu rezerve. Este incorect să • metode şi sisteme comerciale, automatizate de testare etc.
nu cunoaştem foarte bine situaţiile în care antlbioticoprofilaxia este utilă şi recomandabilă.
A ntibiogram a difuzim etrică comună
3. Este incorect să nu acumulăm cunoştinţele necesare de microbiologie, farmacologie,
fiziopatologie, semiologie medicală; medicină internă, care contribuie la evitarea erorilor în Din punct de vedere tehnic însămânţăm germenul de testat pe mediul solid (ex. agar
conducerea tratamentului sau/şi greşelile în tehnica de administrare. "• • ■■■’ ' Muelier-Hinton) turnat în plăci Petri. însămânţarea se poate realiza de exemplu prin „inun­
darea" plăcii urinată de aspirarea, aseptic, a excesului de inoculsau cu ajutorul unui tampon
6. Este incorect ca atunci când avem un dubiu cu privire la decizia pe care urmează (există şi alte variante tehnice). După circa 20 minute (timp în care placa Petri se lasă cu
să o luăm să nu ne consultăm cu alţi colegi, pentru a alege întotdeauna cea mai bună capacul întredeschis în vecinătatea becului de gaz, aprins) se aplică microcomprimatele în
variantă posibilă.
98 Diagnosticul de laborator în microbioiogie

care sunt încorporate antibiotice în concentraţie standardizată. Aplicarea microcompri- • există elemente minerale care trebuie adăugate în cazul testării anumitor microor­
matelor se poate face cu ajutorul unei pense, în condiţii aseptice, sau cu ajutorului un apli- ganisme (ex. Mg2+ şi Ca2+, pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa, atunci
cator „automat" (la minim 30 mm distanţă între ele şi minim 15 mm de ntarginea plăcii; vom când este testată sensibilitatea la aminoglicozide);
utiliza 5 antibiotice diferite pentru o placă Petri cu diametrul de 9 cm). Microcompriniatele • se va verifica pH-ul mediului (de obicei cuprins între 7,2 şi 7,4);
trebuie să vină în contact perfect cu mediul, motiv pentru care, cu •ajutorul unei pense le
• există suplimente nutritive care trebuie adăugate în cazul testării Unor microorga­
presăm uşor (după cai). După încă115-20 minute, incubăm plăcile peste noapte în termostat,
nisme pretenţioase;
la 28 sau 35-37°C, în funcţie de temperatura optimă de multiplicare a microorganismului
testat. Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzează în'm ediu; realizând zone de • grosimea mediului trebuie să fie de 4 mm (25 ml de mediu/placă de 9 cm);
( . 1• li? z ; .. ,
inhibiţie în care coloniile microbiene nu se dezvoltă. Cu'cât zona de inhibiţie este mai largă, o inoculul, care se obţine de preferat din 5 colonii izolate (cultură pură)'trebuie să aibă o
cu atât germenul va fi considerat mai sensibil. Dacă în interiorul zonei de inhibiţie (phiar turbiditate corespunzătoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland (circa IO8 unităţi
dacă diametrul înregistrat este foarte mare) se dezvoltă colonii, „mutanţi rezistenţi", ger­ formatoare de colonii/ml) în majoritatea cazurilor;
menul va fi considerat rezistent. 11 ....... " / '’'i "/1" , • timpul de incubare (în majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37°C, nu mai mult de 2-3
Această metodă, cu toate că este folosită pe scară largă în laboratoare, permite de fapt plăci suprapuse), atmosfera de incubare, umiditatea atmosferei de incubare;
numai eliminarea antibioticelor complet inactive şi eventual selecţionarea antibioticelor • concentraţia substanţelor antimicrobiene din microcomprimate şi dimensiunea micro-
foarte active, pentru că tehnica nu este standardizată. ' ,> ■:• i .• comprimatelor (6 mm diametru);
Antibiogram a difuzim etrică com parativă (Stokes, Balş) • alegerea substanţelor antimicrobiene pentru care se face testarea;
• păstrarea plăcilor cu mediu până în momentul utilizării (maxim 7 zile, în pungi de poli­
Se efectuează pentru microorganismul de testat în paralel cu un microorganism de refer­
etilenă, la +4°C);
inţă, din aceeaşi specie (sau o specie asemănătoare). Spre exemplu, pentru cocii grain pozi­
tivi putem alege pentru comparaţie o, tulpină de Staphylococcus spp.,Tulpina de referinţă are • utilizarea tulpinilor de referinţă pentru controlul de calitate; .
o sensibilitate cunoscută la diferitele antibiotice pe care le utilizăm. • interpretarea rezultatelor (se măsoară diametrul zonei de inhibiţie şi se compară rezul­
Prin această metodă se înlătură o parte din factorii de eroare ai metodei precedente, spre tatele cu ceje.din tabelele puse la dispoziţie de producători şi/sau centrele de referinţă).
ex. calitatea mediului, calitatea discurilor de antibiotice, care vor fi identice pentru microor­ Metodele difuzimetrice au dezavantajul că nu permit aprecierea concentraţiilor eficace
ganismul de referinţă şi pentru microorganismul testat. Rezultatele se exprimă cu termenii: ale antibioticului la nivelul focarului infecţios.
„sensibil", „intermediar", „rezistent", în funcţie de diametrul zonelor de inhibiţie a multi­
plicării celor doi germeni, faţă de acdaşhmtibiotic (jumătăţile de cerc se examinează com­ Metoda diluţiilor în mediu lichid
parativ). în cazul în care cunoaşteiiTCMI (concentra|j«'mTnimă inhibitorie) a microorganis­ Oferă informaţii cu privire la CMI ale antibioticelor studiate,, faţă de microorganismul
mului de referinţă, putem face apretseri-mi privire M CM Ipentru microorganismul testat. testat. CM1 = concentraţia minimă inhibitorie, reprezintă cea mai mică concentraţie de agent
Din punct de vedere tehnic, pe o placă de forma tmtri'pătrat („împărţită" în 3 zone egale antimicrobian, exprimată în micrograme/ml, care mai exercită o acţiune bacteriostatică
marcând pe partea externă a plăcii liniile de demarcaţie) se inoculează în treimea medie asupra germenului testat.
microorganismul de referinţă iar în treimile exterioare 2 microorganisme diferite, pentru Din punct de vedere tehnic, pentru fiecare antibiotic avem nevoie de mai multe tuburi cu
care dorim să realizăm testarea. Inoculul trebuie să fie astfel realizat încât să conducă.la bulion Mueller-Hinton în concentraţii descrescânde (diluţii binare) pornind spre ex. de la 32 pig/ml
apariţia după incubate a unor colonii foarte apropiate, dar care să nu fie confluente. Plasăm şi până la 0,125 pg/ml, în total 8 tuburi, plus 2 tuburi martor, fără antibiotic (cantitatea finală
microcompriniatele cu antibiotice pe liniile de demarcaţie dintre culturi. Incubăm peste va fi de 1 ml în fiecare tub). Preparăm un inocul standardizat turbidimetric şi în condiţii
noapte la 35-37°C urmând ca în ziua următoare să citim şi interpretăm rezultatele. . aseptice inoculăm'toatei cele 10 tuburi, cu câte 1 ml de inocuj. Agităm pentru a omogeniza.
Incubăm cele 8 tuburi cu antibiotice şi 1 tub martor timp de 16-20 ore la 35-37°C, iar al doilea
Antibiograma difuzim etrică standardizată (Kirby-Bauer)
tub martor îl menţinem pentru aceeaşi perioadă la temperatura frigiderului. Pentru controlul
Din punct de vedere tehnic se realizează asemănător cu prima metodă prezentată,/dar de calitate utilizăm şi un şir de tuburi pe care le inoculăm cu o tulpină de referinţă cores­
este standardizată, fiind singura metodă difuzimetrică recunoscută pe plan internaţional, punzătoare. în ziua următoare citim şi interpretăm rezultatele. Deoarece am utilizat o canti­
care permite obţinerea unor rezultate reproductibile şi corelabile între laboratoare difeţite. tate de inocul egală cu cantitatea de mediu, concentraţia finală de antibiotic se va înjumătăţi
Elementele necesare standardizării surit:__ ^ , (de ex. în tubul în care diluţia iniţială a fost de 32 pg/ml, diluţia finală va fi 16 pg/ml). în
© mediul (în majoritatea căzuţilor agar Mueller-Hinton, pentru că are o valoare nutritivă tubul martor menţinut la +4°C ar trebui să nu fie prezentă creşterea, în tubul martor menţi­
corespunzătoare şi nu conţine substanţe cu acţiune înmbitoare); nut la 35-37°C creşterea trebuie să fie prezentă. în tuburile inoculate cu tulpina de referinţă
trebuie să avem rezultatul corespunzător datelor pe care le cunoaştem privitor la respectiva
i
1 - 4 Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice 10.1
100 Diagnosticul de laborator în microbiologie

• benzi Etest (a. cu agenţi antimicrobieni cu nucleu (3 lactam, b. cu alţi agenţi antimi-
tulpină. în tuburile cu microorganismul testat, ultima diluţie care a inhibat dezvoltarea crobieni); se păstrează în congelator la -20°C; au o durată de utilizare de 1-2 ani (pentru
microorganismului corespunde CM1. Se consideră (în general, pentru că CMI diferă în prima grupă) şi respectiv de 2-3 ani.
funcţie de specia microbiană) că microorganismele în cazul cărora CMI este <3 pg/ml vor • tampoane sterile;
fi eficient inhibate de către antibioticul respectiv şi in vivo.; ;t, . t-fu-vA /: >-V.
• standard de turbidîtate McFarland de 0,5 şi 1,0;
D eterm inarea CMB (concentraţia minimă bactericidă) • pipete Pasteur sterile;
Pornind ,de la rezultatul obţinut prin metoda dîluţiilpr în mediu,lichid, se vor utiliza ca •. .»foarfece; .
sursă de inocul tuburile în care dezvoltarea microbiană a fost inhibată^ Este necesară o placă • plăci Petri sterile cu diametrul de 90 mm şi respectiv de 150 mm;
Petri cu agar MiieUer-Hiftton care va fi împărţită în sectoare, numărul de sectoare fiind co­ • incubator cu atmosferă obişnuită reglat la 34-35°C; incubarea în atmosferă îmbogăţită
respunzător numărului de tuburi fără creştere microbiană. însămânţăm în condiţii aseptice cu CO 2 este necesară în cazul testării anumitor microorganisme;
din fiecare tub fără creştere microbiană, fiecare în secforitl deplăcă cbrespunzator. Incubăm ■ • sursă de lumină;
pentru 16-18 ore la 35-37°C. CMB va corespunde ultimei-concentraţii de antibiotic care a
• aplicator Etest şi bandă adezivă (opţional).
distrus microorganismele însămânţate (sectoare de placă fără apariţia culturii). Se consideră Tehnica de lucru:
că antibioticul va fi eficient in viyo dacă în serul pacientului se pot atinge concentraţii de
A. Benzile Etest
antibiotic care să depăşească de 4-8 ori CMB. . u. , =<- i u- i ' - ; - , -
Determinarea CMI şi CMB este extrem de ,importantă pentru, .aprecierea, eficacităţii • scoatem plăcile cu mediul de cultură şi benzile Etest din congelator, le lăsăm la tem­
antimicrobiene a unui antibiotic asupra unei tulpini bacteriene. Pentru tratamentulinfecţiilor peratura camerei pentru echilibrare termică timp de 20 minute sau până când nu mai
observăm nici o urmă de umezeală;
severe (de exemplu endocardite, meningite, septicemii etc), precum şi la imunodeprimaţi,
efectuarea acestei metode este indispensabilă. .., • înainte de a deschide folia care include benzile, inspectăm pentru a observa dacă există
perforări; dacă folia respectivă nu este intactă, atunci benzile din interiorul ei nu se mai
Determ inarea CM I p rin testul E (E test) . .•«, pot folosi; dacă nu sunt probleme, pentru a deschide o folie mai intâi tăiem cu o foar­
E test reprezintă o metodă de testare in vitro a sensibilităţii la antibiotice pentru diferite mi- fecă de-a lungul liniei întrerupte apoi între compartimentele ce conţin benzile;
croorgahisme, inclusiv pentru bacteriile pretenţioase şi germenii anaerobi. E test se aseamănă • scoatem benzile din folie cu ajutorul unei pensete şi le punem în plăci Petri sterile; apoi
metodei diluţiei în agar combinând principiile metodei dîfuzimetrice cu cele de diluţie. E: test le putem aplica pe mediul de cultură care conţine inoculul microbiah de testat;
este uşor de utilizat şi spre deosebire de metoda difuzimetrică permite determinarea valorii CMI. • păstrăm restul benzilor în tuburi în care introducem o substanţă desicantă pentru, a le
Principiu: proteja faţă de umezeală; este necesară protecţia şi faţă de căldură şi expunerea direc­
Asemănător metodei dîfuzimetrice, E test necesită un inocul bacterian ajustat ca turbidi- tă la lumină (punem tuburile în congelator, la -20°C).
B. Inoculul bacterian:
tate (standardizat), ce urmează a fi depus pe mediul de cultură potrivit microorganismului stu­
diat (ex. mediul Mueller-Hinton, geloză sânge etc), în plăci, Petri. Benzile Etest conţin un gra­ • cu ajutorul ansei sau a unei pipete, transferăm mai multe colonii dintr-o cultură bacte­
dient de agent antimicrobian se aplică după însămânţate. în funcţie de antibiotic, gradientul riană de 18-24 de ore într-un tub cu soluţie salină sterilă sau bulion; omogenizăm
acoperă un şir continuu-'de concentraţii între 0,002-32 jig/ml; 0,016-256 pg/ml sau 0,064- (există şi varianta să transferăm mai multe colonii în bulion, să incubăm timp de 2-8
1024 pg/ml. După incubare (timp de 16-18 ore la 35-37°C) se formează o zonă eliptică de ore până când obţinem densitatea dorită);
inhibiţie. Valoarea CMI se citeşte acolo unde creşterea bacteriană intersectează banda Etejist. • ajustăm (vizual) densitatea folosind soluţie salină sterilă 0,85% sau bulion, la un stan­
M ateriale şi reactivi necesari: dard de turbiditate echivalent cu 0.5 McFarland; alternativ, suspensia se poate ajusta
la standardul dorit cu ajutorul unui nefelometru (aprecierea vizuală a turbidităţii inocu-
• plăci Petri cu agar Mueller Hinton (păstrate la 2-8°C până în momentul utilizării)^ .
lului nu garantează numărul corect al unităţilor formatoare de colonii).
. * bulion Mueller Hinton (cu 20-25 mg caţioni de calciu şi,Î0-12,5 mg cationi de mag-
neziu/litru; se repartizează câte 5 ml în tuburi sterile cu capac; se păstrează C. Inocularea plăcilor:
®medii de cultură pentru menţinerea în stare viabilă, a tulpinilor bacteriene necesare • introducem tamponului steril în tubul care conţine suspensia bacteriană de testat, rotim
efectuării controlului de calitate; , f de câteva ori, apoi eliminăm excesul de lichid prin presarea tamponului de pereţii inte­
riori ai tubului;
• tulpini martor; ' • •/
a inocul bacterian; • depunem inoculul pe suprafaţa plăcii cu mediul de cultură având grijă să acoperim com­
o soluţie salină sterilă (0,85% NaCl) sau bulion Mufeller Hinton, pentru ajustarea inocu- plet suprafaţa mediului (ex. inoculăm pe 3 direcţii diferite, rotind placa cu câte o treime);
luiui bacterian;
.(

10 2 Diagnosticul de laborator în microbiologie 1 4 Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice

• lăsăm placa timp de circa 10 minute, ca să se usuce, înainteide a aplica benzile Etest. • în cazul în care nu apare nici o zonă de inhibiţie, raportăm valoarea CMI caifîind mai
D. Aplicarea benzilor Etest: mare decât cea mai mare concentraţie a agentului antimicrobian de pe banda Etest;
• luăm cu grijă o bandă fără să atingem sau zgâriem partea pe care. este depus agentul dacă zona de inhibiţie nu intersectează banda (zona de inhibiţie se află sub banda
antimicrobian;-dacă folosim pensa sterilă, apucăm cu grijă de căpătui benzii notat cu Etest), valoarea CMI se raportează ca fiind mai mică decât concentraţia cea mai
E (benzile trebuie să fie complet separate una'de cealaltă’înainte’de a' le aplica pe scăzută a agentului antimicrobian de pe banda Etest;
suprafaţa mediului de cultură inoculat cu tulpina de testat); dacă se.foloseştejaplicato- • în caztil unei valori CMI situată între două marcaje ale gradientului benzii, rezultatul
rul Etest, banda adezivă trebuie să fie în poziţia corectă (la fiecare capăt al aplicatoru- pe care îl notăm va fi valoarea cea mai mare; .i
Iui>; o - , V ; '■ o - ;,,, . • raportăm rezultatul obţinut pentru tulpină studiată după ce verificăm rezultatul obţinut
• aplicăm banda Etest pe suprafaţa mediului de cultură, cu capătul ce conţine concen­ pentru tulpina de referinţă (control de calitate);
traţia cea mai mare aproape de marginea plăcii; • rezultatele C M ! se interpretează conform'criteriilor stabilite de NCCLS (National
• dacă lucrăm cu plăci cu diametrul de 90 mm, aplicăm una sau două benzi; dacă lucrăm Committee for Clinical Laboratory Standards).
cu plăci cu diametrul de 150 mm, putem aplica şase benzi Etest (benzile se pun la dis­
tanţe egale, radial, pornind din centrul plăcii; marginea capătului' benzii noţâtâ cu E Alte metode de testare
trebuie să atingă marginea plăcii); • Testarea sensibilităţii la antibiotice a bacteriilor anaerobe:
• banda trebuie să fie în contact cu suprafaţa agarului; eliminăm eventualele bule de aer o metodele sunt utile în special din punct de vedere al supravegherii epidemiologice,
de sub bandă cu ajutorul undi pense începând de la mărginea bulei' şi tnutând-o în sus dar sunt rezervate pentru laboratoarele de referinţă;
pe gradient până la capătul notat cu E (prezenţa bulelor mici nu va afecta rezultatul
• se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid, tehnici de microdiluţii în
testării); mediu lichid, testul E, teste pentru producerea de p-Iactamază etc.
• banda aplicată' pe suprafaţa agarului nu se mută în altă poziţie (luând contact cu me­ • Testarea sensibilităţii mycobacteriilor:
diul de cultură, agentul antimicrobian de pe pârtea posterioară se eliberează imediat);
» se efectuează respectând prevederile Programului naţional de control al tubercu­
dacă banda a fost aplicată cu partea posterioară în sus atunci se apucă cu grijă, se
lozei (care indică situaţiile în care vor fi efectuate aceste testări);
întoarce şi se pune corect pe suprafaţa mediului; dacă banda â atins suprafaţa mesei de
lucru sau un alt obiect, se poate folosi în continuare atâta timp cât nu!a luat contact cu • se pot utiliza metoda concentraţiilor absolute, metoda proporţiilor, metoda
o substanţă lichidă; f ■ ■ m n i i v-, f rapoartelor de rezistenţă, metode radiometrice etc.
• Testarea sensibilităţii altor bacterii:
E. Incubarea: ••
• timpul şi temperatura de incubare depind de combinaţia microorganism-agent antimi­ » există şi alte bacterii pentru care trebuie respectate condiţii particulare;
crobian ce urmează a fi testate; • spre exemplu pentru testarea sensibilităţii stafilococilor la oxacilină/meticilină se
recomandă ca mediul să conţină 4% NaCl, pentru testarea sensibilităţii la antibio­
• incubarea în atmosferă de CO 2 modifică pH-ului mediului de cultură şi poate afecta
activitatea agenţilor ăntimicrobieni; se foloseşte numai în cazul în care microorga­ tice a streptococilor se recomandă ca mediul să conţină 5% sânge defibrinat de
berbec etc.
nismele supuse testării necesită pentru multiplicare CO2 (Haemophilus spp., Neisseria
gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae etc). • Testarea sensibilităţii fungilor (antifungigrama):
Interpretarea rezultatelor: 1 ® ţine cont de temperatura şi durata de incubare, care diferă faţă de cele pentru bac-
• terii, mediul utilizat fiind mediu! Sabouraud;
• putem citi rezultatul în cazul în care creşterea bacteriană este confluentă sau aproape
confluentă; . . ... . ... •, .... :r. ; » se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid.
• Testarea producerii de P-lactamaze:
• ţinem placa lângă o sursă de lumină (atunci,când mediul este Mueller-Hinton);,citim
valoarea CMI în punctul în care creşterea bacteriană intersectează banda Etest; dacă ®este utilă atunci când se verifică sensibilitatea la antibiotice a microorganismelor
am utilizat agar Mueller Hinton suplimentat cu 5% sânge de oaie, sau gfeloză şocolăt care pot produce p-lactamază (ex. Haemophilus spp., Staphylococcus aureus etc);
Mueller Hinton sau alt mediu opac, vom utiliza pentru citirea rezultatului o sursă de • se pot utiliza teste iodometrice, teste acidimetrice, teste cu cefalosporine cromo-
lumină reflectantă şi o lupă; j gene etc; există şi metode puse la punct pentru testarea sintezei de P-lactamaze cu
o pe geloză-şânge citim zona de inhibiţie a creşterii bacteriene nu zona de inhibiţie a spectru extins (BLSE).
hemolizei;

1
104 Diagnosticul de laborator Tn microbiologie

Exista şi sisteme automate (ex. ATB şi rapid ATB) sau sisteme semiautomate (ex. ATB REACŢII ANTIGEN-ANTICORP UTILIZATE
Expression sau miniAPi), pentru testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice, uti­ ÎN MICROBIOLOGIE
lizând criteriile de interpretare NCCLS.

Metode de testare a sensibilităţii in vivo şi de apreciere a eficienţei terapeutice


Eficienţa.terapeutică poate fi apreciată clinic, paraclinic şi prin teste de. laborator. Există
unele criterii nespecifice de laborator care sunt utile în aprecierea eficienţei terapeutice, pre­
cum leucograma, examenul sedimentului urinar, examenul citologic al LCR, VSH, proteina
Bazele moleculare ale interacţiunii Ag-Ac
C reactivă etc. .... ...;) ■
Dintre metodele, specifice utilizate pentru apreciera eficacităţii terapeutice sau pentru .. . Reacţia dintre.antigenf(Ag) §1 anticorp (Ac) necesită interacţiunea determinantului anti­
evaluarea eventualei nocivităţi a medicamentelor folosite, vom enumera: , genic (epitop) cu situsul de combinare al. anticorpului (paratop).
• determinarea NEI (nivel de eficienţă inhibitorie) pentru ser, LCR sau alte umori; Factorii care condiţionează, interacţiunea Ag-Ac sunt:-
o determinarea NEB (nivel de eficienţă bactericidă) pentru ser, LCR sau alte umori; pu­ - complementaritatea structurală dintre epitop şi paratop (reacţia este specifică); com­
terea bactericidă a serului celor trataţi (NEB) măsoară capacitatea diluţiilor din serul plementaritatea presupune adaptarea conformaţională a celor două grupări, de tipul „cheie
unui bolnav tratat cu antibiotice de a inactiva un inocul conţinând germenul infectant; în broască";
se determină diluţia cea mai înaltă de ser care mai manifestă capacitate bactericidă; . - complementaritatea electrochimică a grupărilor care intră în reacţie este p consecinţă a
• determinarea nivelul de antibiotic realizat în sânge, .LCR sau în alte umori (prin complementarităţii structurale; pentru stabilizarea legăturii intră în acţiune forţe intermole-
metode microbiologice, enzimâtice, HPLC etc). culare, care sunt legături necovâlente, forţe nespecifice cu' valoare mică, spre exemplu
• legături de hidrogen/energie de legare 3-7 kcal/mol;
• forţe electrostatice (coulombiene sau ionice)/energie de legare 5 kcal/mol;
• legături van der Waals/energia de legare 1-2 kcal/moR
•-legături hidrofobe.
Complementaritatea structurală sau forjele intermoleculare nu sunt suficiente fiecare în
Sparte, pentru a forma legături stabile; este necesară îndeplinirea ambelor condiţii. Cu cât
ertergia de legare a reactanţilor este mai mare, cu atât complexele Ag-Ac sunt mai stabile.
Interacţiunea dintre epitop şi, paratop este definita de 2 parametri (afinitatea şi aviditatea
anticorpilor).
• Afinitatea măsoară forţa de legare dintre epitop şi paratop. Afinitatea este rezultanta
forţelor de atracţie şi de respingere care mediază interacţiunea celor doi reactanţi. O
interacţiune cu afinitate înaltă presupune structuri complementare perfecte, în timp ce
complementaritatea imperfectă a grupărilor reactante determină o afinitate scăzută,
deoarece forţele de atracţie sunt active numai pe distanţe foarte mici şi sunt diminuate
de forţele de respingere. Afinitatea anticorpilor se poate măsura prin dializa la echili-
"brii;
• Aviditatea este un parametru dl interacţiunii Ag-Ac care rezultă din multivalenţa Ag.
Cele mai multe Ag. posedă mai mult decât un epitop. De exemplu, bacteriile, poliza-
haridele etc, au pe suprafaţă un număr mare de epitopi repetitivi: Ag. proteice au epi-
topi multipli, dar diferiţi. Antigenele multivalente leagă un număr echivalent de,mo­
lecule de anticorpi. Energia totală de legare a epitopilor multipli ai unui Ag, cu para-
topii specifici este mult superioară în comparaţie cu energia separată a fiecărei inter­
acţiuni dintre epitop şi paratop. Aviditatea caracterizează energia medie de legare a
unui Ag multivalent cu Ac specifici şi măsoară forţa rezultantă a afinităţii dintre epi-
topîi multipli ai unui Ag şi paratopii complementari. Complexele Ag-Ac formate de
106 Diagnosticul de laborator în microbiologie 1 5 Reacţii antigen-anticorp utilizate în microbiologie 10 7

antigenele multivalente sunt stabile, disocierea lor fiind dificilă, deoarece esţe necesară • pot avea loc în mediu lichid (reaeţia Ramon, precipitarea în inel Ascoli etc)
ruperea tuturor legăturilor existente. • reacţii de. aglutinare............
• se pot folosi în diagnosticul bacteriologic (ex. reacţia Huddleson) sau
Reacţii încrucişate
• se pot folosi în diagnosticul serologic (ex, reacţia Wright)
în anumite cazuri pot avea loc reacţii încrucişate; un Ag reacţionează cu un Ac care a • reacţia de fixare a complementului (RFC)
fost sintetizat faţă de un alt Ag (aceste reacţii pot apărea de ex. datorită faptului că anumite ■dai • în diagnosticul.serologic al sifilisului,îepţospirozei etc , . , •r
Ag posedă anumite grupări determinante comune).* :Spre exemplu; serul imun ariti-poliza-
’i » îri diagnosticul serologic al infecţiildrivirale etc *v • . ’ ■:
harid capsular de Streptococcus pneumoniae aglutinează eritrocitele umane de grup A (cu
specificitate' antigenică 'conferita de :N-acetil-găîactozamină); târ serul imun' mti-Escheri- • reacţii cie seroneutralizare ' '' ,Vl l:!u •
/' I' ", : vţi- ■;i f ţ i n ■.•
chia coli aglutinează eritrocitele umane de grup1B'(cu spedificitate'ănfigenică conferită'de ... . • reacţia, A S t0 , (în diagnoşticul serologic al infecţiilor ştreptococice)
galactoză). Nu vom detalia aceste,aspecteîn‘materialul'deifăţă.a!i‘ • : •-n»: m w w » diferite intradermoreacţii cu mecanism imun umoral etc
.«’• .{-Wh'ViC:? .. Y*- . i " • reacţii în care componenţele sunt marcatei,
iStadiile reacţiilor a n t i g e n - a n t i c o r p >s y >r: « , a.:;, trims.
• izotopic (radio immuno assay, RIA) - ,
.1(1'' ui
• Interacţiunea primară se datorează legării efective a Ac de Ag şi depinde în mod direct • enzimatic (enyzme linked immuno assay, ELISA)
de cantitatea şi'afinitatea Ac. Din punct de vedere diagnostic, reacţiile Ag-Ac în care • fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA) '
reactanţii se află în interacţiune primară pot, fi puse în evidenţă 'prin nefeiometrievln
• chemiluminiscent (chemiluminişcent assay, CLA), . . •
cazul tipurilor de reacţii care vor fi discutate în capitolele următoare, interacţiunea pri­
mară nu devine vizibilă (complexele Ag-Ac sunt de dimensiuni mici, solubile şi se pot
desprinde uşor). In vivo aceste interacţiuni sunt spre exemplu necesare şi suficiente în
vederea neutralizării unor exotoxine circulante i(difterică, botulinică etc), pentru
inhibarea activităţii unor bacterii sau virusuri, sau în declanşarea unor reacţii de
hipersensibilitate (ex. în reacţia de hipersensibilitate de tip I).
• Interacţiunile secundare apar la circa 30 de minute: după interacţiunile primare. Datorită
faptului că Ag poate avea mai mulţi epitopi iar Ac are. minim 2 paratopi complexele pri­
mare mici, solubile, interacţionează între ele formând complexe secundare, produsul
final fiind un complex Ag-Ac ca o reţea tridimensională, insolubil, mult mai stâlpii depât
complexele primare. Din punct de vedere diagnostic, reacţiile Ag-Ac în care reactănţii
se află în interacţiune secundară pot fi puse în evidenţă prin tehnici care vor fi enume­
rate în finalul acestui capitol şi discutate în capitolele următoare. In vivo, manifestările
interacţiunilor seciindare sunt dependente de natura reactanţilor şi de condiţiile de
reacţie.' .
• • Interacţiunile terţiare definesc manifestările in vivo ale reacţiilor Ag-Ac,şi depind în
special de anumite variabile care sunt caracteristice gazdei. Interacţiunile terţiare pot
conduce la un rezultat pozitiv (protecţia gazdei) sau negativ (degradare tisulară). 1

Tipuri de reacţii Ag-Ac ] 1


în funcţie de natura antigenului, metodele aplicate pentru vizualizare, scopul urmărit
există mai multe tipuri de reacţii Ag-Ac, după cum urmează: •/
• reacţii de precipitare
• pot avea ioc în gel (imunodifuziaradială simplă Mancini, dubla difuzie Ouchteriony
etc) sau
109
1»;

Reacţii de precipitare în care difuzia în gel este combinată cu migrarea în câmp electric
REACŢIA
» DE PRECIPITARE • Imunoelectroforeza;
• Contraimunoelectroforeza;
f.J' j ! ‘ !iJ (i'l'.'.l! •.'l'b j'i.-iîK lifii J . •« c • Eiectroforeza urmată de imunofixare;
‘.a (i'i Dny.ih-m ih-Aiit w * • Electroimunodifuzia. v '
' l .M U) ii l ?i■ i-'-î/Vtiîţ'î'i of.) iJ e■

Reacţia Ag-Ac de precipitare poate avea loc în mediu lichid sau solid şi constă în unirea , Reacţii de precipitare în mediu lichid
Ag solubile cu Ac specifici, rezultând, complex? antigen-anticorp, care nu devin insolubile
Au la bază unirea Ag cu Ac în mediul lichid, formându-se complexe Ag-Ac, care vor
şi stabile decât în cazul formării unei reţele tridimensionale, conform teoriei reţelei care pre­ precipita atunci când Ag şi Ac se găsesc în anumite proporţii.
supune: un Ag cel puţin trivalent pentru amplasarea Ac, un Ac bivalent şi condiţii Fizice
favorabile precipitării (ex. Ac puţin giicozilâţi, de tip IgG cu 3% glucide, superiori Ac de tip Reacţii de precipitare în amestec
IgM cu 10% glucide). ■: i». nutr.î •fi'-.'irth ou •<.> .*b«-*.ii vuriiib •••
Reacţia de precipitare între Ag şi Ac se poate cuantifica şi este foarte utilă pentru a demon­
Reacţia de precipitare este sensibilă şi specifică în evidenţierea1prezenţei' Ag (pentru stra prezenţa şi respectiv absenţa precipitatului în funcţie de concentraţiile relative de Ag şi Ac.
realizarea reţelei Ag-Ac este necesar ca în reacţie să intre o.anumiţă „cantitate" de Ag şi Ac, Spre exemplu pentru titrarea toxinei difterice (Ramon) se pun în contact, în amestec în tuburi,
care să se găsească într-un anumit raport/prpporţie.jar Ag,care.participă la formarea agre­ cantităţi egale din componenta care trebuie titrată (toxina difterică, Ag) cu cantităţi variabile de
gatelor sunt într-o cantitate proporţional niai mică, în raport cu Ac). în cadrul cursului se dis­ Ac la care titrai este cunoscut. Cantitatea maximă de precipitat se găseşte în tubul unde există
cută diferitele situaţii legate de prezonă (exces‘de Â6)i1exces'relâtiv,de;Ac^| ,z6hâ de echi­ raportul de echivalenţă. Pentru sistemul toxină difterică - anticorpi anti-toxină difterică (ca şi în
valenţă (Ag şi Ac se găsesc „în totalitate" în precipitat), eXces relativ de Agşurespectiv post-, cazul sistemului toxină tetanică - anticorpi anti-toxină tetanică), raportul de echivalenţă se
zonă (exces de Ag). Pentru anumite sisteme Ag-Ac va fi definită şi noţiunea de proporţie „suprapune" peste proporţia optimă, astfel încât se poate observa relativ uşor tubul în care apare
optim ă., cantitatea cea mai importantă de precipitat. Cunoscând titrai anticorpilor, se află imediat titrai
toxinei (1 Lf = / limes floculans = cantitatea de toxină care se combină cu o unitate de antito-
Clasificarea reacţiilor de precipitare xină = 1 UA = 1 unitate antitoxică). Dacă spre exemplu precipitarea maximă apare în tubul în
care titrai anticorpilor este de 10 UA, titrul toxinei este de 10 Lf.
Reacţiile de precipitare se pot clasifica după cum urmează.
în mod asemănător, prin metoda Dean şi Web se poate determ ina titru l anticorpilor
Reacţii de precipitare în mediu lichid anti-toxici, cunoscând titrul toxinei.
• Reacţii de precipitare în amestec, reacţii de floculare; Reacţii de precipitare în inel
• titrarea toxinei difterice (metoda Ramon), determinarea titrului Ac antitoxici etc;
Reacţia de precipitare în inel, constă în punerea în contact a Ag şi Ac astfel încât să nu
• VDRL (Venerai Disease Research Laboratory), USR (Unheated Serum Reagin), se amestece; reacţia care apare la interfaţa dintre Ag şi Ac se concretizează printr-un inel de
RPR (Rapid Plasma Reagin) etc, în diagnosticul serologic al sifilisului. precipitare albicios. Se utilizează pentru identificarea originii petelor de sânge (reacţia
• Reacţii de precipitare în inel Uhlenhut, în medicina legală) şi pentru identificarea provenienţei unor preparate pe bază de
• reacţia Ascoli, determinarea grupului streptococic etc. carne (în industria alimentară).
• Reacţii de precipitare în tub capilar j. ■ Demonstrativ, în cursul lucrărilor practice, reacţia de precipitare în inel (reacţia Ascoli) se
poate utiliza pentru identificarea prezenţei antigenului cărbunos (Ag obţinut de la Bacillus
• determinarea prezenţei proteinei C reactive; ,i J
ahthracis). Istoric, soluţia de antigen se prepara pornind de la organe (de ex. splină) recoltate
• determinarea prezenţei tipului M streptococic (streptococi de grup A) etc. de la un animal care a decedat şi pentru care se suspecta că decesul a fost produs de o infecţie
« Dozajul nefelometric etc j generalizată cu Bacillus anthracis. Fragmentul de organ se mojara în soluţie de clorură de sodiu
sterilă, adăugându-se ulterior câteva picături de acid acetic, apoi se menţinea la temperatura de
Reacţii de precipitare în mediu gelifiat i fierbere timp de 5-10 minute. După decantarea şi alcalinizarea cu NaOH, urma filtrarea şi rezul­
I'
®Imunodifuzia radială simplă (ex. metoda Mancini) ta soluţia antigenică. Din punct de vedere tehnic vom utiliza 3 tuburi, 1 pentru reacţie şi 2 tuburi
o Difuzia dublă . martor. în primul tub martor vom pipeta 0,5 ml ser anticărbunos şi 0,5 ml soluţie salină fizio­
logică iar în al doilea tub martor vom pipeta 0,5 ml ser normal de cal şi 0,5 ml soluţie de anti-
• metoda Elek
• difuzia dublă radială (Ouchterlony)
no Diagnosticul de laborator în microbiologie 16 Reacfii antigen-anticorp: reacţia de precipitare 111
gen. în ceea ce priveşte tubul de reacţie trebuie să pipetăm întâi 0,5 ml din seruî anticărbunos, Imunodifuzia dublă radială (Ouchterlony)
urmând ca soluţia de antigen (în cantitate de 0,5 ml) să fie pipetată foarte lent, eventual prin Imunodifuzia dublă se bazează pe difuzia Ag şi Ac (unul spre celălalt) într-un gel. Deoarece
„scurgere picătură cu picătură", pe peretele interior al tubului, în aşa fel încât cele 2 soluţii să nu mărimea moleculelor de Ag şi Ac este mai mică decât diametrul porilor gelului, iar distanţa par­
se amestece. în cazul reacţiei pozitive (prezenţa Ag cărbunos în soluţia antigenică), după circa cursă de reactant într-un anumit timp este direct proporţională cu gradientul concentraţiei sale
5 minute, la interfaţa dintre cei 2 reactivi apare un „inel" de precipitare. şi invers proporţională cu greutatea sa moleculară, migrarea reactanţilor unul spre celălalt deter­
mină formarea unor linii de precipitare la locul de întâlnire Ag-Ac. în gelul transparent vor
Reacţii de precipitare în mediu geiifiat ; ^ :: ;Vi .; apărea linii opace, numărul lor corespunzând numărului sistemelor Ag-Ac studiate.
Metoda certifică prezenţa sau absenţa proteinei cercetate. Se pot evidenţia alfa-fetopro-
Utilizarea gelozei, în care pot să migreze cei doi reactivi (se va utiliza o anumită con­
teina, proteina C reactivă, beta-2 microglobulina, proteine Bence-Jones tip kappa şi lambda,
centraţie de agar în soluţie de’tampon veronaî, în aşa 'fel încât porii getului şâ permită
produşi de degragare ai fibrinogenului etc. în micologie, prin imunodifuzie se poate identi­
migrarea), va duce la vizualizarea reacţiei Ag-Âc printr-un arc/linie de precipitare.
fica prezenţa exoantigenelor fungice (Histoplasma capsulatum, Blastomyces dennatidis,
Imunodifuzia radială simplă (IDRS Mancini) j,
Coccidioides immitis etc) sau prezenţa Ac faţă de Ag fungice, spre exemplu în diagnosticul
serologic al unei aspergiloze invazive. Această metodă este încă frecvent utilizată pentru
Imunodifuzia radială simplă (Mancini) şe pazează pe ciifuzia spontană şiiradială a Ag din determinarea specificităţii anticorpilor antinucleari sau a altor anticorpi în patologia umană.
proba de cercetat, într-un gel care conţine,o cantitate conştantă de. anticorpi, determinând Sunt necesare lame de microscop pe care se toarnă un gel de agar 1%, lama putând fi folosită
apariţia unui cerc de precipitare al cărui diametru este direct proporţional cu concentraţia de pe parcursul unei zile (dacă acest lucru nu se poate îndeplini, lama trebuie păstrată în camera
antigen din probă. Pentru a obţine un cerc de precipitare de mărime convenabilŞ.: concen­ umedă, la temperatura frigiderului, pentru maxim o săptămână). în gelul de pe lamă se perforează
traţia Ac înglobaţi în gel trebuie să fie aleasă în funcţie de titrul acestora şi de coî^enţraţia 3 grupe de godeuri, câte 7 godeuri în fiecare grup (1. godeu central şi 6 godeuri periferice, fiecare
Ag care urmează a fi testat. Metoda permite determinarea cantitativă a imuppgl^ulinelpr cu diametrul de 3 mm). Dacă spre exemplu dorim să determinăm prezenţa proteinei C reactivă
(IgG, IgM, IgA), fracţiunii C3 a complementului, alfal-anţitripsinei, siderofilinei etc., . (CRJP) în seruri de cercetat, avem nevoie de un ser cu Ac anti-CRP, seruri de cercetat şi un ser de
Sunt necesare plăcuţe (de ex. cu diametrul de 5 cm) în care se toarnă un gel cară include referinţă care conţine CRP. Numerotând godeurile periferice, pipetăm Ac anti-CRP în godeul
Ac faţă de structura a cărei concentraţie dorim să o determinăm. Există un cod al culorilor central şi ser de referinţă cu CRP în godeurile 1 şi 4. în celelalte godeuri pipetăm serurile de cer­
şi spre exemplu, plăcuţele care vor fi utilizate pentru determinarea concentraţiei âe IgG au cetat. Incubăm Ia 37°C, timp de 24 de ore, în cameră umedă (într-o cutie Petri putem pune o
culoare roşie, pentru IgA culoarea este albastră, pentru siderofilină culoarea este portocalie bucată de vată îmbibată în soluţie salină fiziologică, alături de lama respectivă). Liniile de preci­
etc. în gel sunt perforate mici godeuri (3 mm diametru). Sunt necesare seruri de cercetat şi un pitare pot deveni vizibile după 2-4 ore dar sunt mult mai clare după 24 de ore.
ser de referinţă în care se cunoaşte concentraţia diferitelor componente (spre ex.;câte 100 Pentru citire poate fi necesară o lupă şi o sursă de lumină. între godeul central şi
Ul/ml pentru fiecare dintre cele 3 imunoglobuline). înainte de pipetarea serurilor în godeuri se godeurile 1 şi 4 (martori pozitivi) vor apărea linii (arcuri) de precipitare. în cazul în care de
realizează diluarea acestora, diluţia fiind 1/4 pentru IgG, IgA şi siderofilină şi respectiv 1/2 ex. în godeul 2 există CRP, va apărea un arc de precipitare şi între godeul central şi godeul
pentru IgM, complement C3 şi alfal-antitripsină. Diluţia serului de referinţă se face în funcţie nr. 2. Este certificată prezenţa CRP în cazul în care cele 2 linii de precipitare (dintre godeul
de proteina care urmează a fi determinată. Cantitatea de ser introdusă în fiecare godeu este de central şi godeurile 1 şi 2) sunt una în continuarea celeilalte (imagine de „genunchi îndoit").
5 pi (un godeu pentru serul de referinţă şi restul pentru serurile de cercetat). Dubla difuzie Elek
După 10 minute de nienţinere a plăcuţei pe masa de lucru aceasta se incubează la 37°C,1 Această metodă permite depistarea capacităţii toxigene a unei tulpini de Corynebac-
cu stratul de gel poziţionat în sus, timp de 48 ore pentru IgA şi IgM şi respectiv-24 de ore terium diphteriae. în cazul în care tulpina este toxigenă, toxina va difuza în mediu, iar după
pentru celelalte componente. Citirea se realizează cu ajutorul unei rigle gradate, din. plastici, unirea cu Ac anti-toxină, complexele Ag-Ac vor'da naştere unor linii de precipitare.
o riglă specială pentru această analiză (demonstrat în cursul lucrărilor practice). Se va
într-o cutie Petri turnăm mediul Elek şi după ce mediul s-a întărit, decupăm un şanţ pe unul din
măsura iniţial diametrul cercului de precipitare din jurul godeului în care se .află sşrulpe
diametre, în şanţul respectiv pipetăm 0,5 ini,ser antidifteric, ser care conţine Ac anti-toxină difter­
referinţă iar rezultatul obţinut trebuie,să corespundă.aşteptărilor (de ex.,6 mm pentru IgCÎ ică în concentraţie de 1,000 Ul/ml. Ac anti-toxină difterică vor difuza în mediu. După circa 2 ore
care a fost diluat 1/4 şi astfel are concentraţia'de 25 Ul/ml). în cazul că rezultatul este cel însămânţăm perpendicular pe şanţul cu Ac anti-toxină, de fiecare parte a şanţului, o tulpină de
aşteptat, se poate face direct citirea diametrelor cercurilor de precipitare pentru serurilejde Corynebacteriwn diphteriae toxigenă (martor pozitiv), o tulpină de Corynebacterium diphteriae
cercetat; în caz contrar este necesară o „corecţie" (dacă spre exemplu diametrul este 6,5 mm ne-toxigenă (martor negativ) şi tulpini de cercetat, câte un striu (de fiecare parte a şanţului) pentru
în loc de 6 mm, din valoarea obţinută pentru serurile.de cercetat se scad.0,5 mm). După, fiecare tulpină. Incubăm la 37°C pentru 48 ore, dar urmărim zilnic apariţia culturii şi precipitatului
citirea diametrelor, se compară rezultatele cu cele puse la dispoziţie în tabele,.iar cifra obţi­ (liniilor de precipitare). De-a lungul liniilor de însâmânţare apare cultură bacteriană. Din cultura de
nută se înmulţeşte cu diluţia probei (spre ex. dacă obţinem o valoare de 50 Ul/ml pentru IgG, Corynebacterium diphteriae toxigen, toxina (Ag) difuzează în mediu. Unirea dintre Ag şi Ac duce
vom înmulţi cu 4 pentru a obţine rezultatul real).
112 Diagnosticul de laborator în microbiologie

ia formarea unor complexe Ag-Ac care precipită, iar îrr mediu; ^or apărea linii de .precipitare în
unghiurile dintre cultură şi şanţul cu Ac anti-toxină. în cazul în care apar linii de precipitare în REACŢIA
i DE AGLUTINARE
unghiul dintre una dintre tulpinile de cercetat şi şanţul cu Ac anti-toxină, respectiva tulpină este toxi-
genă. Reacţia va fi negativă pentru martorul negativ şi pentru tulpinile de cercetk rie-toxigene.

Reacţii de precipitare în care difuzia în gel este combinată cii migrarea în


câmp electric ■’ 1 In reacţia de aglutinare antigenele sunt de n atu ră corpusculară. Reacţia de aglutinare
Electroforeza proteică în gel . ...ţ. , , constă în reacţia Ac cu Ag (natural sau artificial) de pe suprafaţa unor particule (bacterii,
hematii, latex, cristale de colesterol etc), determinând aglutinarea acestora prin scăderea
Electroforeza proteică în gel este folosită în laboratorul de i'munbehimie pentrit'decelarea forţelor electrostatice de repulsie dintre particule şi formarea unor punţi de legătură.
unor proteine’patologice. Deplasarea proteinelor într-iiri strat de gel care;este supiis acţiunii
unui câmp electric se va realiza diferenţiat, pentru fiecare structură proteică-în' parte;-în funcţie Aglutinarea este mai sensibilă decât precipitarea, Ag fiind o particulă şi nu o moleculă solu­
de greutatea moleculară şi încărcătura electrică !a proteinelor; Pentru vizualizare este necesară bilă. Anticorpii de tip IgM sunt mai aglutinanţi decât Ac de tip IgG (pentru că au mai multe
fixarea, uscarea .şi colorarea liniilor de precipitare care corespund fracţiunilor proteice din serul valenţe). Există şi Ac neagiutinanţi (hicompleţi/blocanţi) sau care aglutinează numai la rece.
normal sau unor eventuale proteine patologice (ex. o componentă monoclohală);^ ’*'>
Câteva tipuri de aglutinare
Im unoelectroforeza • ‘ V.
Există mai multe variante tehnice de aglutinare. Dintre acestea vom prezenta în conti­
Se asociază electroforeza în gel cuimunodifuzia dublă (realizându-,se separarea prin elec- nuare, pe scurt, aglutinarea directă, aglutinarea indirectă, inhibarea aglutinării, aglutinarea
troforeză a proteinelor în mediu gelozat, urmată de o imtinodifuzie dublă utilizând un antişer în coloană şi aglutinarea mediată de Ac anti-imunoglobuline. Ulterior vom discuta reacţiile
corespunzător). Reacţia Ag-Ac se va vizualiza prin apariţia unor arcuri de precipitare. Este o de aglutinare utilizate în bacteriologic şi micologie.
metodă foarte utilă în studierea purităţii unui Ag (sau Ac), însă în mod curent are indicaţii
didactice. Datorită faptului că-în boala pneumococică prin urină, se-elimină cantităţi.destul de A glutinarea directă
importante de Ag K, prezenţa acestuia poate fi evidenţiată de ex. prin imunoelectroforezâ. Aglutinarea directă reprezintă aglutinarea Ag naturale ale unor particule (bacterii, ce­
Contraim unocîectroforeza lule) de către Ac specifici. Se poate utiliza în diagnosticul bacteriologic, de ex. pentru iden­
tificarea enterobacteriiior (Shigella, Salmonella, E. coli etc) pe baza structurii antigenice, în
Contraimunoelectroforeza reprezintă, o dublă difuzie în care deplasarea unul faţade celălalt diagnosticul serologic al unor boli infecţioase (febră tifoidă, bruceloză etc), pentru deter­
a Ag şi Ac este, accelerată de un câmp electric. Pe o lamă de microscop se toarnă un gel de
minarea grupelor sanguine (ABO) etc.
agar 1% şi se perforează 3 grupe de perechi de godeuri, faţă în faţă. Metoda poate fi utilizată
pentru acele structuri antigenice care în câmp electric migrează către anod. Luând în discuţie A glutinarea indirectă sau pasivă
spre exemplu doar una dintre cele 3 grupe de perechi de godeuri,. în godeurile care vor fi pozi­ Este o reacţie în care particule artificiale (globute roşit formolate, particule de latex, cristale
ţionate spre catod (polul negativ) pipetăm Âg iar în godeurile care vor fi poziţionate spre anod de colesterol, coloditi etc) sau naturale sunt „încărcate" in vitro cu Ag sau Ac şi sunt agluti­
(polul pozitiv) pipetăm Ac cunoscuţi, specifici Ag pe care dorim să-l identificăm. Reacţia este nate de către Ac sau Ag corespondente din proba de cercetat. Se utilizează în principal pentru
mai rapidă şi mai sensibilă decât dubla difuzie deoarece migrarea celor doi reactanţi unul către
decelarea factorului reumatoid, determinarea CRP, determinarea grupului streptococic etc.
celălalt este amplificată fie câmpul,electric. Reacţia (apariţia.unei. linii de.precipitare între
godeuri, în cazul în care.în godeul catodic se găseşte Ag presupus) poate.fi citita,după numai Inhibarea aglutinării
30-90 minute în loc de 24 de ore aşa cum se,întâmplă,în dubla difuzie Ouchterlony. Metodafa
Reacţia constă în inhibarea aglutinării particulelor „încărcate" cu Ag, după ce în preala­
fost utilizată din punct de vedere istoric pentru identificarea prezenţei Ag HBs, Se poate uti­
bil Ac reacţionează cu Ag corespondent. Se utilizează de ex. pentru decelarea mioglobiiiei
liza pentru identificarea ântigenelor capstilare îrilichidul cefalorahidian la pacienţi cu menih-
sau în diagnosticul imunologic al sarcinii.
gită acută (Haemophilus’influenzae, Neissena meningitidis, Etreptocbccfs pneumoniae).n jj •;
A glutinarea îri coloană
•. Eiectroimunodifuzia : a * - ...: ..
Metoda permite o mai bună vizualizare a reacţiei. Dispozitivul utilizat are 2 comparti­
Electroimunodifuzia âre la bază electroforeza probelor care conţin proteina-antigen. îhtrfun
mente, partea în care se introduc reactivii (situată superior) şi o coloană situată inferior,
strat de gel, care conţine o cantitate constantă de anticorpi monospecifici (atiti-proteină ahti-
plină cu micropartieule de sticlă. După introducerea hematiilor şi a serului de cercetat şi
gen), rezultând zone de precipitare în'formă de rachetă sau conuri, a căror arie este diirect
„incubare'a" acestora, dispozitivul este centrifugat. în cazul unei reacţii pozitive complexul
proporţională cu .concentraţia antigenului. Metoda are o sensibilitate mai mare decât 1DRS.
Ag-Ac se va putea vizualiza la nivelul coloanei, în timp ce în cazul unei reacţii negative,
hematiile se depun în porţiunea inferioară a coloanei.
Diagnosticul de laborator în microbiologie / Reacfii antigen-anticorp: reaefia de aglutinare 115
114

Aglutinarea mediată de Ac anti-imunoglobuline si lama de câteva ori, uşor, în toate direcţiile, pentru a favoriza contactul dintre cei 2 reactanţi
şi unirea complexelor Ag-Ac mici, solubile, pentru, a forma reţele de complexe Ag-Ac, în
Anticorpii anti-Ig se vor cupla cu particule „încărcate" cu Ac şi vor duce la apariţia unor cazul reacţiei pozitive (corespondenţă între Ac cunoscuţi şi Ag pe care dorim să îl identi­
aglutinate (prin apariţia complexului imun). Se utilizează spre exemplu în decelarea fac­ ficăm) picătura „se limpezeşte" şi apar grunji de aglutinare. Este indicat să citim reacţia pe
torului reumatoid (tehnica Waaler-Rose). fond negru. De cele mai multe ori citirea se face cu ochiul liber însă în cazul unor aglutinate
de dimensiuni foarte mici poate fi necesar să folosim o lupă, un microscop sau un âglu-
Utilizarea reacţiei de aglutinare în microbiologie 1 tinoscop. Pentru identificarea diferitelor microorganisme există scheme care orientează,
etapele de urmat (tabelele şi schemele respective se livrează de către producători împreună
Vom prezenta atât exemple de utilizare a reacţiei de aglutinare în diagnosticul direct cât
cit serurile cu Ac specifici); Lamele pe care se fac reacţiile de aglutinare, după terminarea
şi în diagnosticul indirect (serologic). Reamintim faptul că în cadrul diagnosticului de,labo­
reacţiilor se introduc în amestecul dezinfectant.
rator serologic se. va determina prezenţa (sau se va dovedi absenţa) Ac necunoscuţi în serul
pacientului respectiv, utilizând Ag cunoscutei în diagnosticul serologic, de;regulă, trebuie în cadrai lucrărilor practice vor fi discutate aglutinările pentru identificarea E. coli,
să putem răspunde la minim trei întrebări esenţiale: există anticorpi în serul. pacientului Salmonella spp. până la nivel de specie (conform clasificării Kauffmann-White) şi respec­
investigat? care este titrai anticorpilor? cum evoluează în dinamică (în timp) acest titru? în tiv a grupurilor de Shigella spp. T ot‘prin aglutinare directă se mai pot identifica tulpini de
acest scop vom realiza minim două determinări diferite la un ,internal de ,7-1.0 zile .(pentru Vibrio choleras, Haemophilus influenzae tip b, tulpini de Brucella spp., tulpini de E. coli
majoritatea infecţiilor care pot fi diagnosticate astfel). în acest capitol vom discuta atât entero-patogen, iar îri cazul leptdspirelor şi unor rickettsii apariţia aglutinării trebuie verifi­
reacţii serologice calitative cât-şi reacţii serotogice cantitative. cată cu ajutorul microscopului.
Reacţii de aglutinare indirectă se pot utiliza pentru detectarea în p.p. a streptococilor de grup
Reacţii de aglutinare utilizate în diagnosticul de laborator microbiologic direct A sau B, pneumococilor, meningococilor, E: coli tip capsular K l, H. influenzae tip capsular b,
Tehnica de aglutinare se execută în a patra etapă a diagnosticului de laborator, respectiv în pentru detectarea unor enterotoxine (stafilococice, ciostridiene etc), pentru detectarea unor
etapa de identificare, pe baza caracerelor antigenice. în momentul aplicării acestei reacţii avem fungi (Cryptococcus neofonnans, Candida albicans, Aspergillus spp.) sau a unor virusuri. Tot
o serie de date pornind de la informaţiile clinice, paraclinice, epidemiologice, s-a prelevat un prin tehnica de aglutinare indirectă se pot identifica exotoxineîn filtratul de cultură, streptococii
anumit p.p. care s-a examinat din punct de vedere microscopic şi a fost cultivat. Aşa cum am de grup A-D, E, coli 0:157, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes etc.
menţionat anterior, în vederea identificării este necesar să avem colonii izolate, cultură pură.
2. A glutinarea în tuburi
/ . , .... ... .
1. Aglutinarea pe lam ă Tehnica de aglutinare în tuburi se poate folosi pentru confirmarea unui rezultat pozitiv
Spre exemplu, în cursul identificării unei tulpini enterobacteriene (Shigella spp., la aglutinarea pe lamă sau atunci când rezultatul unei aglutinări pe lamă nu este suficient de
Salmonella spp., E. coli etc), după cultivarea p.p. pe medii selectivo-diferenţiale se obţin clar. Vom avea ia dispoziţie cultura pură de identificat care se va prepara diferenţiat în
colonii izolate şi din porţiunea superioară (bombată) a coloniilor izolate facem treceri pe funcţie de tipul de Ag pe care dorim să-l identificăm. Spre exemplu, ducă încercăm să iden­
medii multitest (ex. TSI, MIU). în ziua următoare, avem deja mai multe elemente pentru tificăm Ag de tip O, iar bacteria ar putea să prezinte şi Ag H sau Ag K (care ar putea inhi­
încadrarea tulpinii izolate într-o specie, dar, folosind spre exemplu cultura bacteriană dez­ ba aglutinarea cu Ag O) cultura se va menţine 1-2 ore la 1.00°C pentru inactivarea Ag de
voltată pe mediul TSI, putem face reacţia de aglutinare. în nici un caz nu se vor utiliza pen­ înveliş, după care se va trece la realizarea aglutinării în tuburi (o procedură asemănătoare
tru identi ficarea pe bază de caractere antigenice tulpini mai „vechi" de 18-24 ore. poate fi necesară şi în cazul tehnicii de aglutinare pe lamă). Vom utiliza un şir de eprubete în
Pentru realizarea reacţiei de aglutinare sunt necesare următoarele: cultura de identificat care vom introduce Ac cunoscuţi, care se vor dilua succesiv, binar, cu soluţie salină fiziolog­
(colonii de tip S, de 18-24 ore), soluţie salină fiziologică, Ac cunoscuţi faţă de Ag pe care ică. în tuburile respective vom adăuga o cantitate echivalentă de suspensie Ag (spre ex., la 0,5
dorim să le identificăm (Ac polivalenţi, Ac monovalenţi de grup, Ac monovalenţi de tip, ml Ac vom adăuga 0,5 ml suspensie Ag). lncubarea se va face diferenţiat, în funcţie de tipul
după caz), lame de microscop curate, pahar Berzelius cu amestec dezinfectant etc. 1 j de Ag pe care dorim să-l identificăm (ex. 20 ore la 52°C pentru identificarea Ag O).
Iniţial, pe o lamă de microscop curată şi degresată punem la una dintre extremităţile Reacţia este pozitivă în cazul apariţiei aglutinatelor (grunjoase - în cazul prezenţei Ag O,
lamei o picătură de soluţie salină fiziologică, în care suspendăm un fragment din colotjia de floconoase - îlT cazul prezenţei Ag H etc). Reacţia de aglutinare în tuburi permite şi verifi­
identificat în aşa fel încât să obţinem o suspensie omogenă, opalescentă. în cazul în cai;b sus­ care litrului la care are loc formarea complexelor Ag-Ac.
pensia rămâne omogenă, putem trece la etapele următoare; în cazul în care picătura „se Reacţii de aglutinare utilizate în diagnosticul serologic
limpezeşte" şi apar grunji, tulpina este ne-tipabilă prin această metodă (apare „aglutinarea
nespecifică"),-ar putea fi vorba de o tulpină care provine dintr-o colonie de tip R. în urmă­ în diagnosticul serologic, în mod obişnuit, reacţiile utilizate permit detectareaprezenţei
toarea etapă, la cealaltă extremitate a lamei, punem o picătură de ser cu Ac cunoscuţi, de ex.: Ac în serul de cercetat dar şi stabilirea litrului. Totuşi există şi câteva exemple de reacţii de
polivalenţi şi realizăm o suspensie omogenă, opalescentă, a coloniei de identificat. înclinăm aglutinare calitative.
Diagnosticul de laboratorân microbiologie
116

REACŢIA
» DE FIXARE A COMPLEIVIENTULUI
1. A glutinarea pe lamă
Reacţiile de aglutinare pe lamă Huddleson (în diagnosticul brucelozei) şi respectiv
Kudicks-Steuer (în diagnosticul tifosului exanţematic) au intrat în istoria'medickţei. Prima
dintre reacţii o utilizăm demonstrativ în cadrul lucrărilor practice, apariţia aglutinatelor fiind
clară iar tehnica de lucru foarte simplă. Sunt necesare următoarele materiale: lame de micro­
scop.curate, Âgbrucel’os inactivat (colorat în violeţii ser de cercetat., pe p lam^ de.microscop , Sistemul complement
depunem o picătură dirhsoluţia de Ag brucelos şi în imediata, vecinătate, a acesteia, o picătură
de,ser de cercetat.,Cu colţul unei,alte lame amestecăm şi.omogenizăm cei. doi reactanţi. Prin Complementul reprezintă un constituent foarte important al apărării naturale şi respectiv
mişcări de înclinare a lamei în toate direcţiile facilităm formarea complexelor Ag-Âc, în cazul o componentă normală a serului. Sistemul complement (C’> cuprinde circa 30 de compo­
în care în serul de pacient sunt prezenţi Ac anti-Brucella spp. Reacţia.este pozitivă în cazul nente celulare saii plasmatiee. Sistemul C’ se poate activa pe trei căi, repectiv calea clasică,
în care se remarcă prezenţa aglutinatelor. Chiar şi în perioada în care această'se utiliza în calea lectinică şi calea alternă. Activarea pe calea clasică este declanşată în primul rând de
diagnostic, o reacţie pozitivă pe lamă trebuia sâ fie confirmată prin aglutinare în tuburi. formarea complexelor imune (Ag-Ac) dar şi de apariţia celulelor apoptotice, anumite
, Tehnica de aglutinare indirectă poate fi utilizată în diagnosticul serologic al infecţiilor.pro­ virusuri sau de proteina C reactivă cuplată cu anumiţi liganzi. Calea lectinică poate fi acti­
vată de microorganisme care prezintă în structură grupuri manoză-terminale. Calea alternă
duse de Helicobacter pylori, Treponema pallidum (hemaglutinare pâsivăTetc.
poate fi activată de bacterii, fungi, virusuri sau de celule tumorale etc.
2. A glutinarea în tuburi Sistemul C prezintă numeroase activităţi biologice fiind implicat în inflamaţie (componen­
tele C3a, C4a, C2b, C5a, complexul C5b7, C3e), în apărarea anti-infecţioasă (opsonizare, faci­
Tehnica de aglutinare în tuburi se poate, folosi în diagnosticul serologic al bfuceiozei
litarea fagocitozei, liza microorganismului implicat), în metabolismul complexelor imune,
(reacţia Wright), diagnosticul serologic ai infecţiilor produse de Cryptococcus neoformans,
clearance-ul celulelor apoptotice sau în reglarea răspunsului imun. Cu toate că în mod
diagnosticul serologic al. febrei tifoide etc. Denumirea.de reacţie Widal pentru diagnosticul
obişnuit are un rol benefic, sistemul C’ poate avea şi efecte dăunătoare.
serologic al febrei tifoide a Intrat în istoria, medicine!.
Luând în discuţie diagnosticul serologic al febrelor enterice, inclusiv febra tifoidă, sunt Reacţia de fixare a complementului (RFC)
necesare'următoarele: seruri recoltate (în dinamică) de la pacienţii la care se suspicionează
acest diagnostic, tampon fosfat salin, baie de apă cu temperatură reglabilă, Ag cunoscute (Ag Face parte dintre reacţiile al căror rezultat nu poate fi vizualizat fără un artificiu tehnic,
O şi Ab H). Se va lucra cu minim, două rânduri de eprubete, un rând pentru detectarea în acest caz utilizarea unui sistem hemolitic indicator. Motivul pentru care este necesar acest
prezenţei, şi litrului Ac anti-O, al doilea pentru detectarea prezenţei şi titrului Ac anti-H (pen­ sistem indicator se datorează faptului că Ag este fie sub formă macromoleculară fie este
tru persoanele în convalescenţă sau în cazul suspicionării stării de purtător vom încerca Să reprezentat de corpi microbieni de dimensiuni foarte mici, iar complexul Ag-Ac format nu
identificăm în serul de cercetat Ac şi titrul Ac ânti-Vi, de ex. prin hemaglutinare pasivă). '' ’ devine vizibil cu ochiul liber. RFC a fost imaginată încă din anul 1901 de către Jules Bordet
şi s-a perfecţionat destul de mult de-a lungul timpului. Această reacţie este utilizată în peste
Serul de cercetat, pentru fiecare rând de tuburi, va fi diluat cu tampon fosfat salin, în
100 de sisteme Ag-Ac, prin tehnici clasice sau tehnici care au suferit modificări, inclusiv
diluţii binare. Dacă amestecul.de ser de cercetat şi diluant va fi în cantitate de 0,5 ml, vom
introducerea micrometodeior RFC.
adăuga o cantitate simiîârifde Ag, câte 0,5 ml Âg O în primul rând de tuburi şi respectiv câte
0,5 nil Ag H în al doilea rând de tuburi. Vom proceda în aşa fel încât să obţinem în primul Reacţia de fixare a complementului se poate folosi atât pentru identificarea Ag cât şi în
diagnosticul serologic. Pentru că nu urmează să discutăm pe larg prima variantă, vom enu­
tub. o diluţie de 1/20, în a) doilea,tub 1/40 etc.,Un tub va.cqnţiiie doar un amestec de. tanf
mera doar câteva dintre exemple, RFC permiţând identificarea unor Ag rickettsiene,
pon fosfat sai,in şi soluţie.Âg (tub martor). D upă,ce omogenizăm conţinutul tuburilor, vorh
chlamydiene, virale etc. în diagnosticul serologic, cea mai cunoscută metodă rămâne încă
incuba tuburile cu Ag O timp de 20 ore, la 52°C,,iar tuburile cu Ag H. v.or fi incubate timp
RFC Bordet-Wasserman, utilizată în diagnosticul serologic ai sifilisului.
de 2 ore la 52°C urmat de 10 minute la temperatura camerei. ’' , 1 J
i:*v , . ; .* i . 1 t y <v ;T i ;y , >Ş1 Subliniem faptul că RFC este o metodă laborioasă, în care nu se admit erori tehnice, dar
Citirea se,va realiza după incubare, comparând rezultatul din fiecare tub cu martorul pen­
fiind executată corect este foarte exactă, are o mare sensibilitate şi specificitate. Este de aseme­
tru Ag. Pentru evidenţierea reacţiei voiţi,agita uşor tuburile. Aglutinarea H,diferă,/de
nea una dintre metodele cu un mare grad de reproductibilitate.
aglutinarea O. Aglutinatul O este mai dens, mai grunjos, în timp ce aglutinatul H este ihai
floconos şi uşor de disociat prin agitare. Ultimul tub care mai prezintă aglutinare vizibilă Principiu
permite.stabilirea, litrului reacţiei. în, capitolul 31, vom relua acest tip de diagnostic şi ,vom
RFC se bazează pe proprietatea sistemului C’ de a se fixa pe complexul imun Ag-Ac. în
discuta modalităţile de, interpretape. , , ; ,, . .„it , .
prima fază a reacţiei se introduce serul de cercetat iar dacă acest ser conţine Ac specifici faţă
Diagnosticul de laborator în microbiologie I 8 Reacfii antigen-aniicorp: reacfia de fixare a complementului 119
118

de Ag cunoscut se va forma W boniplex Ag-Ac,:urmat de fixarea C ’, care se va activa pe * în RFC finală se va proceda astfel
calea clasică şi nu va mai fi „disponibil" pentru a se fixa pe sistemul hemolitic indicator » se diluează conform indicaţiilor din protocolul de lucru reactivii utilizaţi (serul
(hematii + Ac-antihematie). în cazul în care serul de cercetat nu conţine Ac specifici faţă de hemolitic, serurile de cercetat, Ag, serurile de referinţă, C’)
Ag cunoscut, nu va avea loc formarea unui complex Ag-Ac în prima etapă a RFC. După ®se repartizează în godeuri le corespunzătoare serurile de cercetat, Ag şi C’
introducerea în reacţie a sistemului hemolitic indicator, hematiile şi Ac-antihematie se vor e pe o placă separată se prepară martorii (martor pentru sistemul hemolitic, martor pen­
cupla, vor forma un complex imun, iar C ’ „liber" se va fixa pe acesta. După fixare va urma tru C ’, martor pentru Ag, 2 martori pentru serul de referinţă, martor sigur negativ)
activarea C ’ şi respectiv liza hematiilor, hemoliza putând fi examinaţii cu .ophiulljbeiv « plăcile se introduc până a doua zi la 4°C
• a două zi, plăcile se menţin la 37°C timp de 30 minute
i M aterial^ şi reactivi necesari ,, : ■ , . w ) 'Aen j,-.
• se adaugă în toate godeuri le sistem hemdlitic
• serul de cercetai recoltat de la pacientul suspect sau o pereche:de seruri, obţinute „în
• plăcile se menţin la 37°C timp de 30 minute
dinamică"; '■ ' ‘ ■' v i, . r r ! 1 -
■si /; ; . . - i • •' : ni ” •d < « i ‘ • se pun plăcile la 4°C, până la sedimentarea hematiilor
• seruri de referinţă (martor pozitiv şi negativ); _ ( ...... ®există anumite diferenţe între tehnicile cantitative şi cele calitative, dar principiile
« Ag,cunoscut (suspensie. coipusculară şavi.şpluţie coloidală, după.caz); sunt aceleaşi ' ■,
e sistemul C’ obţinut din ser proaspăt sau conservat recoltat d e ja cobai; . ,i u a • • în RFC Bordet-Wasserman, metodă calitativă, reacţia se realizează în eprubete, 2
• sistemul hemolitic indicator format din -1 " ........' ‘ ' !/- pentru reacţia propriuzisă (una cu ser diluat 1/8, eelaltă cu ser diluat 1/16, 2 pentru
martori sigur pozitiv şi sigur negativ şi câte una pentru fiecare din ceilalţi martori,
» hematii de berbec, soluţie 4%, valabil timp de o săptămână la4°C
respectiv martor pentru serul de cercetat, martor pentru Ag, martor pentru C ’, mar­
• ser hemolitic anti-hematii de berbec (obţinut prin injectări repetate de hematii'de tor pentru serul hemolitic)
oaie la iepurele de laborator, spălate cu soluţie salină fiziologică) titrat şi conservat
îa 4°c ' r .. : In terp retare
» baie de apă cu temperatură reglabilă Iniţial se verifică rezultatele apărute pentru martori (fie că este vorba de o metodă cantita­
• plăci cu godeuri, tuburi de hemoliză, pipete1diferitb etc. tivă sau calitativă); spre ex. în cazul metodei calitative, în tubul martor pentru serul de cercetat
/ trebuie să fie hemoliză, la fel ca şi în tuburile martor pentru Ag, C şi ser sigur negativ. în
Tehnica de lucru1 tuburile martor sigur pozitiv şi martor pentru sistemul hemolitic, nu trebuie să fie hemoliză.
Aşa cum am menţionat, tehnica de lucru este laborioasă şi nu va fi prezentată în totali­ în tuburile cu serul de cercetat, dacă apare hemoliza, înseamnă că nu există Ac, iar tes­
tate, în cele ce urmează. , tul este negativ (lichidul din tub va avea un aspect roşu, limpede).
• serul de cercetat se va menţine 30 minute la 56°C, în baia de apă, pentru inactivarea Testul este pozitiv atunci când în tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliză, hemati­
ile se depun formând un „buton" în partea inferioară a tubului (în serul de cercetat există
C’ propriu;
Ac). Pentru a stabili diagnosticul final, este necesar ca RFC-BW să fie confirmată prin
o principial, RFC are loc în 2 etape; reacţii specifice (vezi capitolul 45).
• în prima etapă se pun în reacţie C \ serul de cercetat şi Ag cunoscut; sunt 2 posi­
bilităţi: a. în serul de cercetat există Ac specifici, rezultând un complex Ag-Acjpe Control de calitate
care se va fixa C ’ b. în serul de cercetat nu există Ac specifici, nu se fonneîiză ■ţ
. Cu privire la controlul de calitate am menţionat utilizarea martorilor, pentru fiecare
complex Ag-Ac, C ’ rămâne liber » reacţie.
• în a doua etapă se introduce în reacţie sistemul hemolitic indicator Chemată t Ac jmţi- ifn RFC utilizată în diagnosticul serologic, Ag cunoscut va fi ales în funcţie de suspiciu-
hernatie); există 2 posibilităţi: a. C ’ nu este liber) nu are loc hemoliza, b. C’ se fixează nea;sde diagnostic. RFC cantitativă se poate utiliza pentru diagnosticul serologic al infecţii­
pe sistemul hemolitic, lizează hematiile şi observăm apariţia hemolizei"’ . lor produse de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia spp., Rickettsia spp., Treponema pal­
• toţi reactivii utilizaţi trebuie standardizaţi, respectiv se vor realiza , j lidum, Leptospira spp., Borrelia spp., Brucella spp,, diferite virusuri etc.
o omogenizarea suspensiei de hematii cu eventuală etalonarc prin spectrofotorhetiie în-scopul creşterii sensibilităţii şi specificităţii se aleg proprietăţile Ag cunoscut, o anu­
o titrarea serului hemolitic • ! mită temperatură „de incubare" (de ex. 4°C în loc de 37°C în RFC Kolmer) etc. Ac fixatori
de C ’ apar precoce în cursul bolii astfel încât identificarea prezenţei lor poate semnifica o
®titrarea C ’ în prezenţa Ag
infecţie acută sau recentă
• titrarea bidimensională a Ag şi a serului de referinţă
/
( (

19 Reacţii antigen-anticorp: reacţia de neutralizare (seroneutralizare) 121

REACŢIA DE NEUTRALIZARE (SERONEUTRALIZARE) Materiale şi reactivi necesari


• ser de cercetat (sau seruri „pereche", recoltate la interval de 2 săptămâni);
• SLO liofilizată (standardizată de către producător);
• sânge defibrinat de iepure/berbec;
• soluţie salină izotonă, soluţie de rivanol 0,3%; v
La fel ca şi RFC, în reacţia de seroneutralizare (RSN) este necesar un artificiu tehnic pen­ • eprubete, pipete gradate foarte curate;
tru a permite vizualizarea rezultatelor. în cazul RSN, Ag are o anumită proprietate biologica | H > baie de apă, centrifugă etc.
(toxică, enzimatică) care poate fi blocată prin cuplarea cu Ac specific. Neutralizarea efectu­
Tehnica de lucru
lui biologic respectiv se poate realiza doar în cazul în care determinantul pentru toxicitate sau
pentru activitatea enzimatică respectivă este acelaşi cii determinantul antigenic (epitop). Trebuie urmate toate indicaţiile din protocolul de lucru, respectiv
Reacţiile de seroneutralizare ar putea fi utilizate în mai multe împrejurări, spre exemplu în: , • se omogenizează suspensia de hematii;
• diagnosticul microbiologic direct , .ţ . ■ ,, • se îndepărtează inhitorii SLO din serul de cercetat (utilizăm soluţie de rivanol şi sus­
pensie de cărbune activ, realizăm o diluţie de 1/10 a serului care se va menţine 30
• identificarea Clostridium perfringeus prin metoda plăcilor semineutralizate (vezi
minute la 56°C);
cap. 44)
• se realizează diluţiile de ser şi se repartizează în tuburile de reacţie (ser în diluţii suc­
• testarea toxigenezei unei tulpini de Corynebacterium diphteriae (test de seroprotecţie,
cesive) împreună cu SLO (în cantitate constantă, câte 0,5 ml/tub); combinarea serului
vezi cap. 11) de cercetat cu SLO reprezintă pritiiâ etapă a reacţiei;
• toxinotipia în cazul suspicionării unei toxi-infecţii alimentare cu Clostridium bot-
• se agită tuburile pentru omogenizare şi se menţin timp de 15 minute Ia 37°C;
ulinum (vezi cap. 11 şi 45)
• urmează a doua etapă a reacţiei ASLO;, respectiv adăugarea suspensie de hematii (5%),
• diagnosticul serologic câte 0,5 ml în fiecare tub;
• reacţia ASLO (vezi şi cap. 25) • se agită pentru omogenizare şi se incubează timp de 45 minute la 37°C;
• prevenirea unor boli infecţioase prevenibile prin vaccinare şi evaluarea eficacităţii vac- • se centrifughează tuburile timp de 1 minut (1.500 rotaţii/minut) şi se menţin până a
cinale ' doua zi la 4°C (temperatura frigiderului). ’
• vaccinarea cu anatoxine (DTP, DT, ATPA, ADPA; vezi şi cap. 22)
Interpretare
e titrarea prezenţei Ac anti-toxine (difterică, tetanică etc)
® testarea prin IDR (intra-dermo-reacţie) a susceptibilităţii faţă de o anumită boală Pornind de la o diluţie iniţială a serului de 1/10, după adăugarea tuturor reactivilor titrul
(numărul de unităţi ASLO) va fi 12,50 în tubul următor, 100,125,166,250,333 etc în tuburile
infecţioasă care are la bază drept mecanism patogenic efectul unei exotoxine
următoare. Titrul reacţiei ASLO este dat de cea mai mare diluţie de ser la care lipseşte complet
• tratamentul/profi 1axia unor boli infecţioase prin utilizarea de imunoglobuline specifice hemoliza. Pentru zona noastiă geografică se acceptă ca normal un titru de 200 (maxim 250)
omologe sau utilizarea unor seruri hiperimune heterologe. unităţi ASLO. Există teste serologice şi pentru evidenţierea prezenţei şi litrului anticorpilor faţă
de alte structuri antigenice (de exemplu streptodornază, hiaiuronidază, streptokinază).
Reacţia ASLO < ‘ !
Control de calitate
Această reacţie poate fi utilizată în diagnosticul retrospectiv a! unei infecţii streptococi-
Ultimele două tuburi sunt reprezentate de tubul martor pentru hematii, în care se verifică rezis­
ce sau pentru confirmarea etiologiei unei boli poststreptococice (împreună c u , criteriile
tenţa hematiilor şi respectiv tubul martor pentru SLO în care se pun SLO şi suspensia de hematii.
minore şi majore de diagnostic). Reacţia ASLO determină titrul Ac anti Streptolizină O
(SLO). : .. • - ; /' J ‘ Există şi posibilitatea de a realiza o micrometodă ASLO în plăci de material plastic cu
godeuri,.însă' metoda clasică rămâne metoda de referinţă.
Principiu j

Titrarea Ac anti-SLO se bazează pe faptul că SLO are efect hemolitic asupra hematiilor Utilizarea RSN în profilaxia şi tratamentul unor boli infecţioase
de iepure sau de berbec. în cazul în care în serul de cercetat există Ac anti-SLO, acţiunea Vaccinarea în scopul obţinerii unei protecţii prin seroneutralizare
hemolitică a S L O este neutralizată. Combinând diluţii din serul de cercetat cu o cantitate Vaccinul DTP,include o suspensie de germeni (Bordetella pertussis) în faza.I, combinată
constantă de S L O vom putea determina titrul ASLO. 1 . cu anatoxina difterică şi tetanică. Primovaccinarea se începe vârsta de 2 luni a nou-născutului,
122 Diagnosticul de laborator în microbiologie

administrându-se 3 doze la interval de 2 luni (la 2, 4, 6 luni). Pentru menţinerea imunităţii se


practică revaccinarea I ia 6 luni de la primo-vaccinare, iar revaccinarea a Il-a se practică la
REACŢII ÎN CARE COMPONENTELE SUNT MARCATE
36 de luni de viaţă a copilului respectiv. Datorită posibilelor reacţii adverse (faţă de com­

.V»
ponenta pertussis) se recomandă eliminarea acesteia la nou-născuţii cu probleme ale sis­
temului nervos, la cei predispuşi la boală şi la cei care au avut o reacţie adversă semnifica­
tivă la o administrare anterioară a DTP-ului. Se studiază posibilitatea utilizării pe scară largă
a unui vaccin acelular în care să fie inclusă toxina pertussis inactivată. ''
Reamintim că, în funcţie de natura antigenului, metodele aplicate pentru vizualizare,

ÎVS
Evaluarea eficacităţii vaccinurilor scopul urmărit există mai multe tipuri de reacţii Ag-Ac, şi anume:
• Se recomandă testarea stării de imunitate indusă prin vaccinare, conform normativelor 1. reacţii de precipitare;
elaborate de autorităţile de sănătate publică; metodele au la bază titrarea Ac anti-toxi- 2. reacţii de aglutinare;
nă (difterică, tetanică etc) în seruri prelevate de la copii vaccinaţi, prin diferite tehnici. 3. reacţia de fixare a complementului (RFC);
Spre exemplu se consideră că un copiî este protejat (prezintă rezistenţă/specifică în
4. reacţii de seroneutralizare.
cazul unei infecţii difterice) dacă titrul Ac-anti toxină difterică1este mai mare de 0,03
Dacă în cazul primelor 2 tipuri de reacţii vizualizarea se poate face direct (cu ochiul
UAI/ml v '
liber, cu ajutorul unei lupe etc) în cazul RFC şi RSN este necesară utilizarea unor „sisteme
• Se pot face teste de susceptibilitate, in vivo, pentru a verifica dacă persoana investi­ indicator*1. în continuare vom discuta despre reacţiile Ag-Ac în care pentru interpretare este
gată este sau nu protejată faţă de o eventuală infecţie. în acest scbp.se practică IDR. în necesară marcarea reactanţilor, ceea ce se poate face:
istoria medicinei au intrat IDR Dick, care permite testarea susceptibilităţii faţă de scar­
• izotopic (radio immuno assay, RIA);
latina (toxina este elaborată de către streptococul de grup A lizogenizat) şi respectiv
IDR Schick, care permite testarea susceptibilităţii faţă de difterie (toxina este elaborată • enzimatic (enyzme linked immuno assay, ELISA);
de către bacilul difterie lizogenizat). • fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA);
gam bele IDR se realizează similar din punct de vedere tehnic • chemiluminiscent (chemiluminiscent assay, CLA) etc.
• spre ex. în cazul IDR Schick se injectează în treimea medie a antebraţului, strict
( intradermic o cantitate de 0,1 ml toxină difterică diluată corespunzător. în cazul în Radioimunoanaliza (RIA)
care în sângele persoanei testate se găseşte o cantitate de Ac anti-toxină mai mare Posibilitatea utilizării izotopilor radioactivi în medicină a condus la multe descoperiri
de 0,03 UAI / ml, toxina inoculată va fi neutralizată şi nu va apărea nici o modifi­ importante în domeniu. Introducerea RIA, pentru determinarea cantitativă a prezenţei unui
care la locul inoculării (lipsa eritemului semnifică faptul că persoana testată nu este mare număr de substanţe prezente în cantităţi foarte mici în lichidele biologice, a constituit
susceptibilă să facă difterie, în cazul în care se infectează cu un bacii difterie toxi- un real succes. RIA a fost şi încă mai este utilizată în multe dintre specialităţile medicale.
gen). în cazul în care persoana respectivă nu prezintă Ac anti-toxină difterică, Ag
Pentru marcarea Ag se pot utiliza 3H,, l25I, 14C etc. Se introduc în reacţie o cantitate
inoculat va conduce la apariţia unui eritem ia locul de inoculare
cunoscută de Ag marcat radioactiv, Ag nemarcat pe care dorim să îl dozăm şi Ac cunoscuţi
• UAI = unitate anti-toxică internaţională ■ ■ , cu specificitate faţă de Ag. Se va realiza o competiţie pentru cuplarea cu Ac între Ag mar­
cat şi Ag nemarcat radioactiv. După respectarea timpilor din protocolul de lucru se măsoară
Terapia sau profilaxia specifică (imunoterapie pasivă) radioactivitatea complexului Ag-Ac şi aplicând formule de calcul corespunzătoare se poate
• Administrarea de imunoglobuline specifice omologe, obţinute de la persoane imii- afla cantitatea de Ag nemarcat.
nizate (natural sau artificial) faţă de o anumită maladie infecţioasă, de ex. în imunote- RIA este o tehnică obiectivă, cu foarte mare sensibilitate, permite cuantificarea unor can­
rapia infecţiei cu Clostridium tetani (tetanos) se pot administra intramuscular 3-6.QOO tităţi foarte mici de Ag sau de haptene dar, datorită problemelor legislative, costului apara­
UAI ' f turii şi reactivilor, riscurilor implicate, este înlocuită din ce în ce mai mult cu tehnici de tip
• Administrarea de seruri imune heterologe, obţinute prin hiperimunizarea căilor, în trata­ ELISA.
mentul tetanosului, difteriei, botulismului etc. /
Terapia bolilor în care mecanismul patogenic implică exotoxine trebuie instituită cât mai
Analiza imunoenzimatică (ELISA, EIA)
rapid, deoarece exotoxinele pot fi neutralizate numai atunci când se găsesc în circulaţie. Marcarea enzimatică a fost introdusă pentru prima oară în histochimie, în 1966, după 5
ani devenind un marker şi în cazul reacţiilor Ag-Ac. Prezenţa complexelor Ag-Ac va putea
( ('
Reacţii antigen-anticorp: reacţii în care componentele sunt marcate ] 25
12 4 Diagnosticul de laborator în microbiologie

în anumite situaţii, rezultatele obţinute prin ELISA trebuie confirmate prin metode mai
fi vizualizată şi cuantificată deoarece unul dintre reactivi este conjugat cu o enzimă, iar după specifice.
adăugarea în mediul de reacţie a unui substrat cromogen specific enzimei marker, densitatea
în continuare vom prezenta succint etapele ELISA în cazul determinării prezenţei de Ac
optică a mediului de reacţie se va modifica iar valoarea densităţii optice se poate înregistra.
anti-mycobacterieni în ser., ,Nu există încă o, standardizare a diagnosticului serologic în
Reacţiile imunoenzimatice pot avea lor în sistem omogen sau heterogeii (activitatea tuberculoză (vezi cap. 42) dar aşa cum urmează să discutăm, pentru a pune diagnosticul unei
markerului enzimatic nu este influenţată de către reacţia Ag-Ac). în continuare nu vom dis­ infecţii cu M. tuberculosis, toate datele care pot fi obţinute sunt importante şi tlfebuie anali­
cuta decât despre al doilea „tip“ de reacţii, care sunt mai frecvent utilizate în microbiologie. zate în context. £,u' 5 l,H‘ 1 ", ,
Tehnicile ELISA pot fi dtilfcate, atât pentru identificarea Ag cât şi pentru identificarea
şi/sau titrarea Ac. în general, reacţiile imunoenzimatice se realizează în următoarea succe­ •|
i, Principiu ■ ..... i, ....
siune: Anticorpii prezenţi în serul de analizat se leagă specific de Aţj imobilizate pe microplă-
• primul reactiv (Ag sau Ac, în funcţie de ceea dorim să determinăm) este „fixat" pe uh ci Koh-I-Nor Hardmuth. Complexul imun forhiat, reacţionează prin fragmentul Fc al imu-
suport solid (foarte frecvent reprezentat de godeurile unor plăci de plastic,1dar pot fi şi noglobulinelor (în special IgG) cu conjugatul Proteină A stafilococică - peroxidaza din
bile, tuburi etc); de regulă această fixare se fealizeazăde Către companiile1producătoare; hrean (SpA-HRPO) care este pus în evidenţa cu orto-fenilen-diamină HC1 (OPD). Reacţia
este cuantificată fotometric. ’ u
• adăugăm al doilea reactiv, cel necunoscut (Ac sau Ag);' ’ >■■■■■ ’*•", j'1-1’,'T-'
Uli-i: I îi:: :■! •
• în cazul în care există complemeritaritate structurală şi electrochirhică între 'cei doi M ateriale şi reactivi necesari ( V, '
reactivi, are loc cuplarea şi formarea complexului Ag-Ac; pentru eliminarea reactivilor .• Plăci sensibilizate (IC) 1 ■ « > ■ - > ft;
care nu au intrat îh complex are loc o primă Spălare; ' ' ' - : M!
• Tampon 1 (TFSTCH) este format din tampon fosfat salin pH 7,2, 0,15M, Tween 20
• reactivul adăugat în următoarea etapă variază în funcţie de tipul de tehnică ELISA (în 0,05% caseinâ;Hammersten 0,5% şi mertiolat de sodiu 0,l% . Se păstrează la + 4°C.
finalul acestui subcapitol vom prezenta pentru exemplificare una dintre Variantele . Este utilizat pentru rehidratare şi diluări. "■ ;
tehnice); de ex. se poate adăuga un reactiv care se poate cupla cu Ac, iar acest reactiv este • Tampon 2 (TFST) de 10 ori concentrat are aceeaşi compoziţie ca Tamponul 1 cu
la rândul lui cuplat cu enzima (conjugat enzimatic); în continuare are loc o nouă spălare; excepţia caseinei Hammersten. este utilizat pentru spălări.
• pentru vizualizarea reacţiei, adăugăm un substrat cromogen pe care ,enzima poate • Tampon citrat (3) pH 5,0, pentru dizolvarea OPD
acţiona şi conduce la apariţiţt unei culori care se poate vedea şi cu ochiul liber, dar se • Ortofenilen diamină (pastile de 9mg, cântărite de producător)
citeşte cu ajutorului unui spectrofotometru; ■ > ;<U • Ser de cercetat 1
• valorile înregistrate pentru „probă" se compară cu valorile înregistrate pentru martorul , • Ser martor pozitiv (M+)
pozitiv şi martorul negativ, se aplică formula .indicată, de către producător, iar inter­ • Ser martor negativ (M-);
pretarea se face aşa cum este indicat în protocolul tehnic care însoţeşte trusa ELISA. • Soluţie concentrată de conjugat SpA-HRPO;
Enzimele utilizate mai frecvent sunt fosfataza alcalină şi peroxidaza. în cazul primei enzime, • Perhidrol (30% H20 2).
substratul cromogen va fi p-nitro-fenil-fosfatul, iar în cazul peroxidazei, substratul cromogen va
fi o-fenilen-diamina în soluţie de apă oxigenată. Tehnica de lucru
Prin tehnicile de tip’ELISA se obţine o specificitate bună sau foarte bună, iar sensibili? • în godeurile plăcii sensibilizate (Institutul Cantacuzino) se introduc 100 pi Tampon 1
tatea este comparabilă cu cea obţinută în cazul RIA. Tehnica este obiectivă, a devenit auto? şi se incubează 60 minute la 37°C.
matizată, iar prin extinderea ofertei şi creşterea numărului celor care o utilizează preţurile • Placa se goleşte de conţinut (automat sau prin răsturnare şi scuturare pe un strat de hâr­
sunt competitive. ' -0 . ',.0 . «fii: tie de filtru).
Există mai multe modalităţi de clasificare pentru aceste tehnici* spre exemplu: ,-j î« j • Probele de ser de analizat şi serurile martor (M+ şi M-) se diluează 1/25 în Tampon 1
• în funcţie de scopul urtn&rit,'se poate determina prezenţa Ag îh diferite'produse pato­ (25 pi ser + 0.6 m l Tampon 1). Serurile se repartizează câte 100 pl în 3 godeuri para­
logice sau prezenţa Ac în ser, LCR, alte umori; j- lele, notându-se în caietul de lucru poziţia serurilor.
• în funcţie de tipul şi ordinea reactivilor introduşi în reacţie tehnicile pot fi necomţieti- • Incubăm placa la 37°C timp de 60 min, în atmosfera umedă.
tive sau de competiţie (directesau indirecte);,,., , ,, ... .. . • Placa se spală de 3 ori cu Tampon 2 şi de 2 ori cu apă distilată, pentru înlăturarea
• în funcţie ele complexitatea tehnicii, putem discuta despre variantele clasice (aşa cum spumei. Pentru această operaţie, întâi se diluează Tamponul 2 concentrat prin ameste­
•a fost descris mai sus şi respectiv aşa cum urmează să fie prezentat în exemplul con­ carea unui volum Tampon 2 cu 9 volume apă distilată.
cret) şi respectiv despre variantele simple/rapide. ■ ■ •••’«
Diagnosticul de laborator în microbiologie 20 Reacfi i antigen-anticorp: reacţii în care componentele sunt marcate 12 7
126

• Conjugatul SpA - HRPO se diluează 1/500 în Tampon 1 (30 pi conjugat + 15 ml Tampon intrat în complexul Ag-Ac), aşteptăm să se: usuce şi examinăm cu microscopul cu fluo-
1) şi se repartizează câte 100 pl/godeu rescenţă. Putem, identifica astfel Ag aparţinând speciilor Legionella pneumophila,
• Se incubează 60 min la 37°C în cameră umedă. ' Boreletella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia trachomatis, Treponema pal­
• Se înlătură din godeuri conjugatul şi se spală ca mai sus de 3 ori cu Tampon 2 şi de 2
lidum, Cryptococcus neoformans, Hiştoplasma capsulatum, Pneumocystis jiroveci etc.
Metoda este rapidă şi aplicabilă pentru frotiuri din p.p. sau din cultură dar şi în anatomia
ori cu apă distilată. ! ^ ‘ i " ■ V ■- ! l,: ■
patologică sau în histochimie:' Pentru fiecare Âg de cercetat trebuie preparat serul care
• Se prepară soluţia de OPD prin adăugarea a 15 ml Tampon 3 şi 8 pi perhidrol, repar- conţine Ac specifici, marcaţi fluorescent. ' /
tizându-se câte 100 pl/godeu.
, ,IF indirectă presupune realizarea unui, frotiuj pornind de la Âg cunoscut. Froţiul se aco­
• Se incubează la temperatura camerei, ferit de lumină directă, până în'momentul peră, cu .ser de cercetat şi. dujiă o ihctibaţieide ŞO minute la 37°C spălăm cu tampon fosfat
apariţiei în godeul corespunzător serului M+ a unei. culori galbene intense iar core­ salin şi cu apă distilată p fti^ ,ta^ p $ rtârea, re^ Y % ţ,ca re . nu au. intrat în reacţia Ag-Âc. Pe
spunzător serului M- lipsa apariţiei culorii. Aceasta se realizează în circa 10-30 min. frotiu se pune un ser cu Ac anti-Ig (le om, marcaţi'fluorescent şi se incubează timp de 30
• Analiza se face cu ajutorul unui fotometru ( X = 450 nm) fără blocare cu acid,,' minute la 37°C, se spală, se aşteaptă uscarea frotiului; urmând examinarea, la microscopul
cu fluorescenţii în situaţia în care în serul'de cercetat există Ac specifici Ag cunoscut,'are
Interpretare .... i loc formarea complexului Ag-Âc, iar în etapa următoare, Ac ănti-Ig de om se cuplează pe
• Rezultatele se exprimă în Unităţi Imuno Enzimatice (UIE) după relaţia: (OD X - OD complex şi în mod indirect, prin fluorescenţă, identificăm5(şi în unele variante tehnice putem
M-/OD M+ - OD M -) x 100 titra) Ac. Metoda poate fi utilizată îh diagnosticul serologic: al infecţiilor produse de
• în cure OD X reprezintă densitatea optică a probei de analizat, OD M- este densitatea optică a serului mar­ Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, Leptospira spp., Borrelia burgdorferi,
tor negativ, iar OD M+ densitatea optică a serului martor pozitiv. Treponema pallidum, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, Pneumocystis jiroveci etc.
• Valorile de pînă la 10 UIE sunt considerate nesemnificative, deşi pot indica un început
de sinteză de anticorpi, repetarea determinării după 1-2 luni, putând indica o creştere
a titrului.
• Indiferent de valoarea obţinută rezultatele se vor-interpreta în contextul clinic, epi­
demiologie şi paraclinic, ţinând cont de rezultatele examenului microbiologic direct.

Imunofiuorescenţa (F!A, IF) ,


Imunofluorescenţa poate fi utilizată atât în diagnosticul microbiologic direct (pe p.p.
recoltat de la bolnav sau pe cultura pură) cât şi în diagnosticul serologic. Unul dintre reac­
tivi (Ag, Ac sau Ac anti-Ac) este marcat fluorescent. Posibilitatea cuplării stabile: a Ac Cu
fluorocromi, fără alterarea specificităţii Ac, a fost evidenţiată încă din anul. 1942.
Fluorocromii sunt compuşi organici care, după „iradiere11 cu radiaţii ultraviolete absorb
radiaţia excitantă, intră în stare de excitaţie iar atunci când revin în „starea normală" pierd
energia acumulată emiţând radiaţii luminoase (vezi şi cap. 8). Dintre fluorocromi am putea
aminti auramina O, rhodamina B, acridin-oranj R sau tripaflavina. Lumina vizibilă emişă
depinde de fluorocromul utilizat (spre exemplu culoarea este galbenă pentru auramina O,
galben-portocalie pentru combinaţia de auramină O - rhodamină B etc). •!, -- .
Tehnicile IF pot fi de tip direct sau de tip indirect,
în cazul IF directă, Ag este necunoscut şi se poate afla într-o cultură, etalat pe frothj ca
atare sau „parazitând" anumite celule (ex. se poate utiliza o probă recoltată prin biopsie).
Produsul care urmează a fi analizat este incubat în prezenţa Ac marcaţi fluorescent,
cunoscuţi. Spre ex. în cazul frotiuiui „colorat" fluorescent, după realizarea frotiului- acope­
rim lama cu serul care conţine Ac marcaţi fluorescent, incubăm timp de 30 minute la 37°C,
spălăm cu tampon fosfat salin şi apoi cu apă distilată (pentru îndepărtarea Ac care nu au
('

Testarea imunităţii de tip celular

TESTAREA IMUNITĂŢII DE TIP CELULAR „ cere de iimfocite T Citotoxice in vitro prin culturi stimulate cu antigene tumorale şi IL-2
etc);
• studii privind reactivitatea celulelor implicate în răspunsul imun de tip celular
apreciată prin incorporarea de timidină tritiată de către iimfocifoie stirfiulăte cu
■ţ • ■ l’.i'l iii : ‘iil i - f P l! lili ■ ! S .■' Jfi V Ai; •■:V ".! ' . ■M; ■•y'-.'l' diverşi mitogeni, lectine care se leagă de membrana celulară (fitohemaglutiriihă,
Există q serie de. metode, utile pentru, evalparea răspunsului imun, de tip celular. (RIC).
concavaiină A etc), substanţe care acţionează direct fără a necesita existenţa unor
Evaluarea RIC este necesară atât în situaţia unor pacienţi ia, care se suspicioneazi prezenţă
componente membranare, diferite antigene (PPD, candidină etc), citokine (IL-2),
unei stări de imuno-deficienţg, cât şi în anumite boli transmisibile care se pot însoţi de modi­
' celule allogenice etc;
ficări fizidpatologice a RIC. Datorită faptului că dn momentul de faţă au: fost ţ«ise la punct
vâriante tefâţ5ei.ttice isâie pot influenţă în mod’'Wvbmblî’ rieceâăr să • studiul secreţiei de citokine, modalitate indirectă de apreciere a funcţiei celulelor
avem la'dispoziţie mb'dâlităţi’de1identificare a deficienţelor, imtirfe,1 v' implicate în răspunsul imun de tip celular etc.
" iii V' . ■ :■ ii: ' • .J'i*-' • ■i'iii '/■/ '}■:'■• p ;’!:U 'iiifilfs 'Will
In vederea stabilirii unui astfel de diagnostic,,cel mai frecvent pomtm.de la o suspiciunş care i • Teste imunobidiogice, prin tehnica intradermoreacţiei (IDR), folosind antigene care
poate fi clinică, iar asocierea unei infecţii cu agenţi.etioiogici consideraţi „oportunişti"' poate să ,. stimulează răspunsul imun ele tip celular („întârziat”); în literatura internaţională este
reprezinte semnalul pentru declanşarea, diferitelor investigaţii. Spre exemplu, infecţiile cu recomandată o „baterie”,de antigene, patru-cinci dintre antigenele menţionate în con­
Pneumocystis jiroveci sau Cryptococcus neofprmans pot „ţrăda“ o, afectare a limfociţelor T, tinuare;
infecţiile,repetate, purulente, cu Staphylococcus, aureus, Pseudomonas cepacia, Serratia • Candidină (antigen extras din Candida albicans, un extract apos realizat în diluţie
marcescens, Aspergillus spp. ăf,putea ft datorate unor suferinţe ale celulelor fagocitare etc. I/iO; antigenul este numit şi „Dermatophyton 0 “);
Având în vedere cele de. mai,sus, investigarea pacientului la care se suspicionează o • Coccidioidinâ (antigen extras din Coccidioides immitis) care însă poate interfera cu
imuno-deficienţă ar trebui să fie realizată prin următoarele activităţi: testele seroiogice realizate pentru histopiasmoză;
• Aplicarea anamnezei pe parcursul căreia,ar trebui să aflăm date privind medicaaţia primi­ . • Histoplasmină (antigen extras din Histoplasma capsulation) care produce şi o
tă de respectivul pacient, momentul debutului suferinţei respective, antecedentele heredo- ; creştere a titrului anticorpilor fixatori de complement;, ..."
colaterale, date privind vaccinările efectuate (vezi şi capitolul 22), date privind agenţii o Antigenul,extras din virusul urlinn;
etiologici izolaţi şi identificaţi ulterior etc. Adeseori anamneza are o importanţă crucială,
® Fitohemaglutinină (mai rar folosită in vivo);
• Examenul clinic, pornind de ia cunoaşterea înălţimii şi greutăţii pacientului investigat
• Lizat din cultură de Staphylococcus aureus;
comparând-cu valorile considerate normale pentru vârsta respectivă, prezenţa unor
Lemne clinice sugestive (la nivelul feţei, dentiţiei şi evoluţiei acesteia, ia nivelul tegu­ • O combinaţie între streptokinază şi streptodornază;
mentului şi anexelor acestuia, la nivelul scheletului, organelor interne care pot fi exa­ • Toxoid tetanic, cu concentraţia de 10 limes floculans/m! (diluat);
minate clinic etc); • Toxoid difteric, cu concentraţia de 30 limes floculans/ml (nediiuat); pentru uitime-
• Examene de laborator (numărul elementelor figurate: hematii, granulocite, trombocite; ijil;.' le 2 antigene pot apărea reacţii de hipersensibilitate de tip umoral ceea ce poate
formula teucocitară, aspectul pe frotiul realizat din sângele periferic, VSH etc): l *' , crea probleme importante în ceea ce priveşte evaluarea răspunsului imun de tip
• studiul mai aprofundat limfociţelor şi subpopulaţiiior limfocitare CD3+, CD4+, celular;
CD8+ etc (număr, procent) prin metode clasice şi moderne (ex. flow-citometrie); i • Trîcofitină (extras din Trichophyton spp.);
• studiul funcţiei subpopulaţiiior limfocitare (prin metode clasice şi modeme); ! » Tuberculină (derivai proteic purificat, PPD, extras din cultura de Mycobacterium
• determinarea numărului de celule formatoare de anticorpi faţă de antigeifo tirao- tuberculosis);
dependente (plaje hemoiitice); r în cele ce urmează vom discuta despre IDR cu PPD.
• studiul funcţiei celulelor fagocitare (aderare, inhibiţia aderării, inhibiţia migrării ma- Principiul metodei
crofageior sau leucocitelbr, deficienţe.la nivelul granuiaţiilor, deficienţe îri mieloper- Tuberculiha- reprezintă un amestec relativ bine standardizat de antigene proteice myco-
oxidază, deficienţe în NADPH oxidază, eliberarea radicalilor de oxigen activi de către bacteriene, utilizat în mod curent pentru decelarea infecţiei tuberculoase (TB), individual
celulelor fagocitare nestimulate şi/sau stimulate cu. zimosan, lectine etc); sau popuţaţioiiai. Acest extract se poate utiliza în cadrul unei „baterii” de teste IDR pentru
• evaluarea activităţii citotoxice a celulelor NK şi K (citotoxicitatea naturală imedi­ evaluarea reactivităţii din punct de vedere al RIC. După ce o persoană data se infectează cu
ată celular, citotoxicitatea mediată celular anticorp-dependentă/ADCC, citotoxi­ mycobacterii, urinează sensibilizarea şi proliferarea anumitor populaţii de iimfocite T (LT).
citatea' specifică faţă de celule tumorale sau normaie/prin eliberare de 5!Cr, indu- Injectarea intradermică a luberculinei stimulează LT şi declanşează o serie de evenimente
ce conduc la un apariţia unui RiC şi a unor manifestări de hipersensibilitate de tip IV.
13 0 Diagnosticul de laborator în microbiologie 21 Testarea imunitâfii de tip celular 13 1

Reacţiile implică vasodilataţie, edem şi infiltrat cu Iimfocite, bazofile, macrofage,neutro- ® eliberăm tegumentul şi fixăm seringa presând-o pe antebraţul subiectului, având-grijă
file. LT antigen-specifice proliferează şi eliberează limfokine care mediază acumularea să nu se acopere diviziunile seringii pentru a putea urmării cantitatea injectată;
locală a diferitelor alte celule. Răspunsul maxim se constituie ia circa,48 ore după injectare. • injectăm strict 0,10 mi; dacă injectarea s-a făcut strict intradermic apare o bulă uşor
Aria induraţiei,(infiltratului ,celular),reflectă hipersensibilitatea d e; tip întârziat. Eritemul denivelată, cu margini relativ abrupte, cu aspect de coajă de portocală şi diametru ,de
reprezintă o reacţie inflamatori? acută, cauzată de vasodilaţaţia capilară,iar apariţia eritemu- 5-8 mm; în lipsa apariţiei acestei bule (în cazul injectării hipodermice sau când,se
lui nu va fi interpretată drept o reacţie pozitivă, Limfocitele sensibilizate, ating un nivel adec­ pierde soluţie între seringă şi acul incorect montat), este recomandat să se reia manevra
vat pentru a conduce la apariţia unui răspuns interpretabil .dţjpâ'j2-4 săptămâni, de la infecţia cu mai multă atenţie, repetând injectarea la o distanţă de 3-5 cm sau la antebraţul opus.
iniţială cu M. tuberculosis. Sensibilitatea poate persista mai mulţi ani, dar reactivitatea scade ' La persoanele infectate anterior (sensibilizate), la locul injectării apare o reacţie con­
de regulă o dată cu vârsta. ,, , , ,, , ' ... .;,, ,r Vţ’.,,.,,.,-. ţ,', stând din eritem-edem-indiiraţie începând după circa 6 ore şi atingând un nivel maxim după
M ateriale şi reactivi necesari ,,r ,, i;. ( , y - circa 36-60 ore, care se retrage în următoare câteva zile.'Pe locul reacţiei poate persista o
Pornind de la tuberculina preparată de Koch (Old-tuberculin, 1891), în 1901 a fost rea­ perioadă îndelungată o zonă de hiperpigmentaţie.
lizat produsul New tuberculin, iar ulterior, derivatul proteic purificat (PPD-S,, preparat de Citirea rezultatului
Seibert în anull941), adoptat ca Standard Internaţional pentru PPD. Metoda de obţinere a Citirea rezultatului se face de regulă după 72 ore, asigurând o bună iluminare a zonei
fost reprezentată de precipitarea proteinelor din filtratul mediului de cultură concentrat la examinate (este de preferat lumina naturală). Recomandăm o primă citire la 24 ore (pentru
cald, cu soluţie 50% sulfat de amoniu. Unitatea internaţională pentru PPD este definită drept a surprinde o eventuală hipersensibilitate de tip umoral faţă de antigenul inoculat care are
activitatea biologică conţinută în 0,000028 mg de PPD-S (0,00002 mg PPD + 0,000008 mg
structură proteică), o a doua citire la 48 ore şi citirea finală la 72 de ore..,
săruri). PPD-RT 23 reprezintă lotul de tuberculin# purificată în anul 1958 în Danemarca şi
: Identificăm existenţa unei eventuale arii intens eritemato-violacee care circumscrie zona
asigură omogenitatea produsului antigenic folosit in studii epidem iologie în lumea întrea­
gă. Din produsul realizat iniţial se prepară diluţiile necesare (etalbnate) la care se adaugă în care am făcut inocularea. în cazul existenţei unei astfel de reacţii, apreciem tactil (prin
mişcări repetate, atingând zona respectivă) cu pulpa policelui sau inelarului limitele zonei
Tween 80 în scopul reducerii absorbţie! pe peretele de sticlă al fiolei; îh mod uzual se utili­
de infiltraţie dermică (percepută ca fiind reliefată) corespunzând din punct de. vedere
zează 2 Ul/doză, echivalentul a 5 UI PPD-S. în raport cu PPD-RT23, în România se utili­
histopatologic inflamaţiei (edem, Iimfocite, macrofage, PMN) şi care reprezintă reacţia ne-
zează PPD IC-65 produsă de către 1NCDMI „Cantacuzino”,
specifică şi specifică.faţă de antigenul injectat.
Tehnica de lucru
Măsurăm „diametrul maxim" al zonei de infiltraţie. Notăm şi semicantitativ intensitatea
în ţara noastră se utilizează tehnica injectării intradermice (Mantoux). infiltraţiei dermice („tip Palmer"), semnificaţia fiind următoarea;
• controlăm produsul biologic pe care urmează să îi utilizăm din punct de vedere al • tip I, induraţie fermă sau prezenţa unei flictene;
perioadei de eficacitate şi conservării în condiţiile prevăzute de către producător;
• tip II, induraţie elastică;
• utilizăm numai seringi cu volumul,de maxim 1 ml şi.cu diviziuni clar marcate, cel
• tip 111, infiltraţie depresibilă;
puţin pentru fiecare 1/10 ml precum şi ace pentru injecţie intradermică, de unică între­
buinţare; • tip IV. fără infiltraţie aparentă.
• agităm energic fiola pentru u omogeniza concentraţia produsului biologic, ştiut fiind Citirea reacţiei tuberculinice reprezintă o evaluare subiectivă, existând posibilitatea unor
că în timpul unei conservări mai îndelungate tuberculina tinde să se absoarbă pe pereţii importante variaţii inter- şi intraindividuale din partea persoanelor care efectuează lectura.
de sticlă ai fiolei; ' , Dubla citire „în orb" fără cunoaşterea rezultatului celeilalte lecturi, poate reduce variaţiile
“grosiere”, cu condiţia ca ambele persoane care „citesc” rezultatul să aibă experienţă cu
• aspirăm în seringă o cantitate suficientă de soluţie pentru a putea elimina integral orice această tehnică. ..
bulă de aer apărută între piston şi orificiul acului;
Interpretarea rezultatului testului tuberculinic (IDR cu PPD)
O poziţionăm acul astfel încât bizoul să fie aliniat diviziunilor seringii; .... , &
în funcţie de analizele statistice efectuate, există câteva recomandări cu privire la inter­
• antiseptizăm cu alcool (minim 3 minute) o arie situată pe faţa anterioară a antebraţu­
pretarea IDR cu PPD.
lui stâng, la unirea treimii medii cu cea superioară; , ;f
Centrul de control şi prevenire a bolilor Atlanta-Georgia (CDC) a modificat relativ
• cuprindem zona respectivă a antebraţului în palmă, întinzând pielea cât mai uniform
recent clasificarea reactivităţii la testul cutanat efectuat cu 5 UI PPD după cum urmează:
între extremitatea inferioară a eminentei tenare şi hipotenare pe de p parte şi cele patru
degete strâns lipite, pe de altă parte; : 1. Reacţia este considerată a fi pozitivă dacă diametrul induraţiei este >5 mm în urmă­
toarele cazuri;
• pătrundem cu acul aproape tangent la supmL i antebraţului, cu bizoul în sus, până
acesta este situat în derm; • persoane care au avut un contact recent cu un caz de TB;
132 Diagnosticul de laborator în micrdbiologie

« persoane Cu semne'radiologice deTB ; ■ r.'V-i-v'.bL-o


o persoane infectate cu HIV. BIOPREPARATE
2. Reacţia' este considerată a fi pozitivă dacă diametrul induraţiei e s t e ţ i 0 mm în cazul
persoahWlbr:căre nu infra in categoriile rtienţioriatO ifmi'sus dar hu ‘alţi’factori de risc, spre
r ?. -i •' -‘ l •>i ' f 'i îf .v i.V '■ ! ! • ■:> -,V r . i ; " ! , n i ’! j.V, > -»* ..f ’ţ ' .. : • . H
exemplu: ‘"A • " , .• ■
V» persoane născute în ţăt'i încare prevaienţaTB.este'crescută'(dinAsia, ’ÂMca, America Produsele biologice de uz uman sunt preparate obţinute pe scară mai mică (de ex. Ia
Lătină, Europă de Est etc); 1 • nivelul unui laborator ul care sunt asigurate normele de asigurare a calităţii stabilite la nivel
truc „■'•u' riv\i!.,r - i,:;' ;:'vJv.+ Sffer-vj • ufr; iu!;
. «persoane care folosesc droguri, inoculate pe cale injectabila; internaţional) sau pe scară mai largă, În instituţii specializate. Aceste produse sunt obţinute
i:.«;pei;soane fără adăpojţt saujcare locuiesc în ,itzile sau în instituţii cpţecţionale; din diferite microorganisme (ex. bacterii, virusuri), din macroorganisme sau prin intermediul
unor tehnici de inginerie genetică. Produsele imuncbiologice (biopreparate) se pot clasifica
• persoane care prezintă afecţiuni care cresc riscul, apariţiei TB .(silicoză; diabet zaharat,
după mai multe criterii.
boli hematologice şi ale sistemului reticuloendotelial, malnutp|ie) sau sunptratate cu
Spre exemplu, în funcţie de scopul urm ărit, putem descrie o serie de reactivi utilizaţi în
medicamente imunosupreşjţve. >••>> ?s ;,-wy p ^ v v iiî',r ;
diagnostic sau diferite produse utilizate în profilaxia sau tratamentul bolilor infecţioase.
. 3. Reacţia este considerată a fi pozitivă dacă diametral induraţiei este â 15 mm în cazul Dintre reactivii de diagnostic:
altor,situaţii decât .cele; menţionate‘mai .sus, . j, . . S - j r A , - . i-:,?iiVr!
• unii se pot utiliza'»? vitro (ex’, serurile imune utilizate în identificarea microorganis­
NB. Persoanele infectate cu alte tipuri de mycobăcterii pot prezenta reacţii pozitive după
melor pe baza caracterelor aritigenice ale acestora, prin reacţii antigen-anticorp; vezi
IDR cu PPD, însă de regulă diametrul induraţiei;este <l,0.mm, excepţiile (diametra>,10, mm) capitolele 15-20);
putând apare în special,iadebutul infecţiei.;
• în timp ce alţi reactivi sunt utilizaţi in vivo (ex..PPD sau alte produse inoculate intra-
în ţara noastră se consideră drept pozitive reacţiile atunci când diametrul este > 9 mm.
dermic pentru evidenţierea răspunsului imun de tip celular sau umoral; vezi capitolele
Această definiţie convenţionalăse bazează pe.rezultatele unor testări efectuate pe eşantioane
19 şi 21). . .
semnificative statistici la :care‘analiza epidemiologică .a distribuţiei valorilor a arătat că
plasarea limitei între valorile de 9-10 mm separă cel mai bine cele 2 categorii ;(neiafectaţi şi Dintre produsele utilizate în profilaxia şi/sau tratamentul bolilor infecţioase putem aminti:
infectaţi);asigurând cei mai scăzut procent de rezultate,falş;pozitive,şi.respectiv fals nega­ • serurile hiperimune,
tive. Clasificarea indivizilor di.ntr-o populaţiei în negativi şi pozitivi la testul tuberculinic • vaccinurile şi
serveşte la măsurarea extinderii infecţiei TB.În acea populaţie (prevalenţa infecţiei) oferind • imunomodulatorii.
un plus de informaţie prin analiza separată pe grupe de vârstă. Dacă se repetă determinarea
Produsele inumologice s-ar mai putea clasifica după starea fizică, biologică, num ărul
prevalenţei infecţiei pe vârste ia intervale definite de timp, dinamica prevalenţei infecţiei în
com ponentelor incluse dar există şi alte criterii pentru clasificare.
fiecare cohortă permite determinarea riscului anual de infecţie, indicator fiabil al evoluţiei
endemici tuberculoase. Dintre produsele biologice de uz uman vom discuta în special despre seruri, vaccinuri şi
imtinomodulatori. în final vom enumera o serie de produse realizate de către Institutul
, în ceea ce priveşte investigarea reactivităţii din punctul de vedere al RIC pentru un anu­
mit subiect, Ia,care s-a utilizat o,„baterie" de antigene,; dapăjSpre .exemplu rezultatul,este Naţional de Cercetare - Dezvoltare pentru Microbiologie şi Imunologie (INCDMI)
„negativ" pentru fiecare dintre cele 4-5 antigene folosite se poate presupune faptul că.su­ “Cantacuzino".
biectul respectiv, eşte anergic.;În,ceea,ce,priveşte RIC şi se,recomandă efectuarea unor inves­ Serurile imune
tigaţii suplimentare. • i - :iA Α Serurile imune utilizabile în scop terapeutic pot fi omologe sau heteroioge. în momen­
• ,i Jţ .■
(i U-! i 1 Ufill ; tul actual, ce! mai frecvent sunt folosite serurile imune heteroioge obţinute prin imunizarea
(hiperinumizared) unor animale perfect'sănătoase, utilizate numai în acest scop (cel mai
" j‘: : liifjfr ;' u t r y s : j.n.iy/.» iu ■v '„x•.î.- ;;!n ... \u ■ . ; ; f -ii ;
frecvent sunt utilizaţi cai). în vederea hiperimunizării putem utiliza spre exemplu anumite
CRl'I ir.i Mi '•! Vi' ir'fK
toxine sau anatoxinfe,- , ■' , ,;l : . . ••«•:< <•>.
. :;NV i;ii‘;
Imunoterapia reprezintă un mijloc terapeutic eficace, în anumite situaţii fiind indispensa­
bilă. Imunoterapia este de obicei pasivă (administrarea de anticorpi gata formaţi) bazându-se!
; f-' .-V i ! J.i, . ;
pe utilizarea de: . -
• imunoglobuline standard
• obţinute din placentă sau din sângele donatorilor (concentrate de Ac);
I
ît
«

134 Diagnosticul de laborator în microbiologie 2 2 Biopreparate 135

• de regulii folosite în scop profilactic , ; /j administra la 12 luni, simultan cu DTP în timp ce ultima doză de DTP se va administra la
• pot fi utilizate în tratamentul asociat al unor infecţii severe (ex. sepsis) copilul cu vârsta cuprinsă între 30 şi 35 de luni.

• imunoglobuline specifice (hiperimune) Sugarul în vârstă de 9-12 luni va primi vaccinul pentru prevenirea rujeolei, iar copilul în
vârstă de 7 ani (la intrarea în clasa 1) va primi simultan o nouă doză de vaccin rujeolos şi
• obţinute de la persoane imunizate (natural sau artificial) cu un anumit Ag bivaccinui DT. : , - > . . .
• pot fi utilizate în tratamentul tetanqsului, rabiej, varicelei,:formelor;severe de
Pentru reducerea incidenţei hepatitei cu virusul B (şi în consecinţă şi a hepatitei cu viru-
herpes zoster, infecţiilor cu virusul citomegalic, infecţiei cu virusul: sinciţial
• sul delta), în clasa a 111-a copiii nevaccinaţi primesc trei doze de HepB, prima dintre ele
. ■ respirator etc /. ■. ,v > v ' / :!>! . ■' ■ A n -'', • uv. 'U-u' v-rnV . simultan cu o nouă doză de VPO, iar elevii şcolilor Sanitare postliceale şi respectiv studenţii
• seruri-imune hetfcfbloge-i*' • . facultăţilor cu profil medical, primesc 3 doze de HepB în primul an de studiu. Am introdus
• obţinute de la animale imunizate (hiperiniunizate) artificial această politică de vaccinare îrt România prin ordin al ministrului sănătăţii în anul 1999,
• sunt utilizate în tratamentul unor boli în care rolul esenţial aparţine unei exo- strategia fiind ulterior inclusă în acte normative de nivel superior. '
‘ toxine (difterie, tetanos, botulism, gangrenă gazoasă etcj. Prevenirea difteriei şi tetanosului se realizează prin vaccinarea copiilor în clasa a VIII-a
(Ia vârsta de 14 ani) cu rapeluri ulterioare la fiecare 10 ani sau de câte ori este necesar în
Spre exemplu, principala resursă terapeutică în difterie este reprezentată de adminis­
funcţie de recomandările tehnice naţionale şi internaţionale. Cu privire la revaccinarea cu
trarea de ser imun anti-difteric, în dozele corespunzătoare calculate fie pe kilogram-corp fie
vaccinul BCG, aceasta se va realiza în colaborare cu programul naţional de prevenire şi con­
în funcţie de anumite aspecte clinice. Este necesar un diagnostic foarte rapid (dar tratamen­
trol al tuberculozei.
tul începe chiar şi în lipsa diagnosticului de certitudine, în cazul suspiciunii clinice) şi
administrarea de antitoxină difterică. Doza în terapia difteriei depinde de sediul infecţiei (ex. Im unom oduiatorii
20-40.000 UAI pe cale i.vV în cazul localizării faringiene, în primele 24 de ore de la debut în privinţa obţinerii substanţelor cu efect imunomodulator s-a pornit de la observaţia că
şi respectiv 40-80.000 UAI pe cale i,v. în cazul localizării laringiene; în cazul difteriei unele infecţii (bacteriene) stimulează în mod nespecific organismul gazdă şi conducând lâ
maligne şi respectiv atunci când de la debut au trecut 48 de ore). apariţia unei „rezistenţe” faţă de alţi agenţi infecţioşi sau chiar şi faţă de apariţia unor metas­
taze neoplazice. Ulterior s-a demonstrat că structuri aparţinând şi altor organisme (fungi,
Vaccinurile
alge) sau diferiţi compuşi chimici prezintă proprietăţi asemănătoare.
Vaccinurile sunt produse biologice administrate în special în scbp preventiv.
Pe baza datelor acumulate au fost puse la punct conceptele de bază privind imunomo-
Prin Ordonanţa Guvernului nr. 53 din 30 ianuarie 2000 (redactată şi propusă pentru apro­ dularea şi substanţele imunomodulatoare. Astfel, se consideră că: a. terapia nespecifică este
bare de către autorul acestui manual) a fost instituită obligativitatea raportării bolilor şi a utilă menţinerii homeostaziei; b. agenţii utilizaţi, imunomoduiatorii, menţin funcţiile imune
efectuării vaccinărilor. Acest act normativ a devenit Legea nr. 649 din 20 noiembrie 2001, în limite normale (activându-le atunci când scad sub pragul inferior al valorilor normale sau
după aprobarea Parlamentului României. Am considerat necesară sublinierea poziţiei inhibându-le atunci când depăşesc pragul superior); c. un imunomodulator trebuie să aibă o
medicilor de familie (indiferent dacă lucrează în sistemul public sau privat) în raport cu sis­ serie de calităţi (să nu fie antigenic, să nu conducă la apariţia fenomenului de hipersensibi­
temul de raportare şi programul naţional de imunizări precum şi instituirea unui registru unic litate, să nu genereze reacţii adverse, să poată fi administrat.concomitent cu alt antigen
de vaccinări şi respectiv a carnetului de vaccinări (au existat iniţiative în realizarea utilizarea folosit în scop terapeutic, să fie cât mai uşor de produs iar preţul de cost să fie rezonabil).
carnetului de vaccinări şf înainte de anul 2000 în câteva judeţe ale ţării şi, respectiv în
Prim ii im unom oduiatori de origine bacteriană au inclus suspensii ale tulpinii vaccinale
municipiul Bucureşti). Ordonanţa Guvernului nr. 53/2000 şi respectiv aprobarea acesteia obţinute din Mycobacterium tuberculosis, respectiv tulpina BCG. Au mai fost utilizate şi
prin Legea nr. 649/2001 reprezintă o referinţă din punct de vedere legislativ pentni sisleiftul suspensii obţinute din Coryiiebcicterium parvum. Imunomoduiatorii au fost puşi la dispoziţia
de sănătate publică din România. , , ;j- , sistemului medical atât sub formă de preparate monomicrobiene cât şi sub formă de
In ceea ce priveşte schemele de vaccinare recomandate pentru.copii, adolescenţi şi ţineri, preparate polimicrobiene. Dintre preparatele polimicrobiene amintim cele cunoscute sub
vom prezenta câteva .exemple. ' V.,.,. m tiv» mu,- numele de: Omnadin, Bronhodin, Aerodin, Polidinul, Broncho-vaxom, ICB-10 etc.
în maternitate, la nou născuţii în vârstă de 0-7 zile se vor administra vaccinul BCG.şii Spre exemplu, Broncho-vaxomul este o suspensie alcătuită din specii bacteriene distruse
prima doză de vaccin pentru prevenirea hepatitei cu virusul B (HepB), dozele ulterioare de prin diferite tehnici (Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneu­
HepB fiind administrate la 2 şi respectiv 6 luni. , j moniae, Staphylococcus aureus, Neisseria catarhalis etc). Acest produs este recomandat în
Simultan cu HepB, conform recomandărilor naţionale şi internaţionale, la vârsta de 2 şi 6 prevenirea şi terapia unor infecţii ale căilor respiratorii inferioare şi superioare. Aerodinul
luni se vor administra doze vaccinale pentru prevenirea infecţiei cu virusul polio (VPO) şi conţine un amestec de 10 specii bacteriene (Streptococcuspyogenes, Streptococcus faecalis,
respectiv prevenirea difteriei —tetanosului—tusei convulsive (DTP) în timp ce la vârsta de Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas
4 luni se vor administra simultan DTP şi VPO. Următoarea doză de vaccin VPO se va aeruginosa, Neisseria catarrhalis, Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Proteus
Biopreparate 13 7
136 Diagnosticul de laborator în microbiologie

0X19), distruse prin căldură, parţial lizate, concentraţia fiind ^de circa 11 miliarde ger- - antigene pentru intradermoreacţie (PPT iC 65 de 2UT şi 10UT);
meni/ml. Aerodinul este condiţionat sub formă de suspensie nazală pentru aerosoli şi disti­ 2. Reactivi biologici pentru diagnostic in vitro
laţii, Este recomandat pentru prevenirea infecţiilor nespecifice .ale căilor respiratorii dar şi - antigene pentru diagnostic (Ag brucelos pentru diagnostic serologic, Ag cardiolipiitic
pentru pregătirea preoperatorie în intervenţiile chirurgicale,ORL. Fplidinul are în .compo­ pentru VDRL, Ag Coxiella burnetii pentru RFC, Ag Chlamydia pşitacii pentru RFC, Ag
nenţa sa 13 tulpini bacteriene distruse prin căldură (o fiolă conţine circa 48 de milioane ger- gripal, Ag Leptospira patoc, Ag Mycoplasma pneumoniae pentru RFC, Ag Pertussis, Ag
meni/ml). Polidinul este încă utilizat în prevenirea sau terapia infecţiile acute ale căilor res­ Salmonella grupele A, B, D, Ag. Salmonella H. Ag Salmonella Vi, SLO activată şi liofilizată
piratorii superioare sau a infecţiilor genitale. , : ^ . etc);
. Ulterior, s-a arătatşcă .şi;diferite extracte,‘bacteriene (în, special localizate la nivel,pari­ - seruri pentru diagnostic in vitro (hemoîizină anti-oaie, seruri aglutinante anti EPEC
etal) pot fi utilizate ca imunoniodulatorLAstfel, a fost obţinut Canţasţjrnul produs de către, mono şi polivalente, ser aglutinam anti-Shigella shtga, ser anti-Proteus 0X19, 0X 2 şi
INCDMI „Cantac.uzino", pornind.de la o tulpină foarte, virulentă de pseudomonas aerugi­ OXK, ser anti-Yersinia pseudotuberculossis, ser mti-Yersitiia enterocolitica, ser ântidifteric
nosa. Acest produs normalizează,funcţiile fagocîtare ,şi. secretarii,ale ipacrofagelor.funcţiij pentru testul ELEK, ser aglutinam imti-Haemophilus influenzae polivalent sau anticapsular
le citotoxiee ale celulelor NK şi T citotoxice (CD8+), cooperările interceiulare, activitatea de tip a-f, ser fluorescent antirabic, ser aglutinam anti-holeric grup 01, seruri anti -Salmo­
limfocitelor T helper (CD4+) şi limfocitelor’B (CD19+). , .V nella diferite grupuri şi tipuri, ser anti-EHEC etc).
în categoria imunomodulatorilor intră,şi diferite produse,pentru car.e îp momentul, defaţă - reactivi pentru diagnostic imunochimic (ser uman de referinţă 1C, ser de referinţă
sunt cunoscute, structurile .moleculare, precum: tuftsina, timopoietinele, tiniozinelejeuco- pentru proteina C reactivă, ser de referinţă pentru aî-fetoproteină umană, ser
trofina, interferonul, interleukinele, factorii de necroză ai tumorilor, factorii decreŞtefe,a monospecific anti-IgA umană etc);
macrofagelor şi/sau granulocitelor (MG-CSF).
- enzime (enzimă distrugătoare de receptori, penicilinază liofilizată în două concen­
Pornind de la diferitele molecule naturale identificate ca fiind utile, studii aprofundate traţii);
au permis obţinerea unor produse sintetice sau identificarea! efectelor imunbmodiilafbare
- medii pentru culturi celulare (soluţii Hancks, soluţie EDTA, mediu IC 65 cu tam­
pentru unele substanţe care fuseseră produse iniţial cu un alt scop. Spre ekemplu, îevămi-
pon Hancks etc):
solul (Decarisj este un medicament antiparazitâr, Substanţa activă din acest medicament are
efecte imiinoniodulatoare deoarece influenţează mecanismele de apărare a gazdelor aflate în - medii de cultură pentru diagnostic bacteriologic (peste IOC) de produse diferite);
hipofuncţie imună (ex. din cauza vârstei înaintate sau a unor boii) modulând în special RIC. - suplimente pentru medii de cultură (supliment Tinsdale, supliment tip HYL, supli­
Efectul iliuinomodulator se realizează consecutiv restaurării funcţiilor macrofagelor, limfo­ ment tip Fildeş, amestec reducător pentru itnaerobioză etc).
citelor t ! granulocitelor PMN etc, exprimat printr-o mai bună secreţie de limfoktne sau sin­ 3. Animale de laborator (şoareci non-consangvini, şoareci consangvini, şobolani, ham-
teza diferitelor substanţe cu structură proteică prin activarea fagocitozei, activarea mobi­ steri, cobai, iepuri etc);
lităţii celulelor fagbcitare etc. 4. Produse din sânge de animate (sânge defibrinat de berbec, sânge defibrinat de iepure,
Este important cu imunomodulatorii să fie utilizaţi în mod corespunzător şi să se ţină sânge Jaeat de cal, ser normai de bou, ser normal de cal, ser normai de iepure etc).
seama atât de beneficiile care pot fi obţinute cât şi de limitele existente. Modul de adminis­
trare este destul de variat, în funcţie de substanţa activă şi efectul dorit. Imunomodulatorii
pot fi inoculaţi intratumoral, peritumorai, la distanţă de o tumoră'solidă aşa cum poî fi
administraţi şi sistemic prin injecţii intramusculafe, subcutanate, intfadermice,'iar îi* unele j
cazuri chiar pe cale digestivă: ’ ' , : j
Produse realizate de INCDM I „Caiitacuzino"
în anul 2004,, INCDMI „Cantacuzi.no",• conform,tradiţiei de aproape un veac,a realizat,
numeroase.produse strict necesare,sistemului-.ste sănţitate din România. Dintre,acestea voiţi,I
aminti o mai mică parte, după cum urmează: , . j.
1. Produse medicamentoase imtinologice de uz uman . , i
- vaccinuri (BCG liofilizat, DTP, DT, dT, gripal, dizenterie viu oral, rabic, rujeolos etc);
- seruri terapeutice (anticărbunos, ântidifteric, antirabic.’antitetahicîn două variante eţc);
- imunomodulatori (Aerodin în două variante, Bronhodin, Cantastim, Imunbstimulâtor
cu Căndidină, Orostim etc); . ' ' 1 ’
23 Introducere în diagnosticul.de laborator microbiologic 139
PARTEA SPECIALĂ urmat în „ateliere de lucru", întâlnirile cu factori de decizie ai Organizaţiei Mondiale a Să­
nătăţii, Conferinţa internaţională „Health Issues of Joint Interest to Romania and the
INTRODUCERE ÎN DIAGNOSTICUL DE European Union" organizată în octombrie 2000, iniţiativa organizării unei reţele de supra­
veghere a bolilor transmisibile în ţările din Europa Centrală şi de Est (întâlnire plenară pe
LABORATOR MICROBIOLOGIC care am organizat-o în decembrie 2000, în Bucureşti) au condus la elaborarea unui program
de reformă în domeniul .supravegherii bolilor transmisibile eu sprijin european (PHARE)
care a fost aprobat de asemenea în anul 2000. .r
•v Chiar dacă reprezintă o măsură pentru prevenirea.unor maladii virale (şi nu bacteriene ,sau
fungice) vom mai aminti dintre iţiăsuri luate în ultimii ani îmbunătăţirea programului de vac­
îti prima parte1a manualului am prezentat date privind bazele diagnosticului în1microbio­ cinare împotriva infecţiilor cu virusul hepatitei B, în anul 1999. Vaccinarea npu-născuţilpr
logic, studiul microbiologic dirbct şi respectiv evaluarea răspunsului gazdei faţă de infecţie.
avea deja o „vechime" de 4 ani. dar în 1999 prin politica dusă în domeniul sănătăţii publice
Având la bază aceste cunoştinţe, în capitolele următoare vom discuta pe rând diagnosticul a fost inclusă şi vaccinarea copiilor din clasa a lll-a, vaccinarea tuturor elevilor din anul I de
de laborator al infecţiilor produse de principalele microorganisme studiate. la şcolile sanitare postliceaie şi respectiv a studenţilor din anul I din facultăţile de medicină
Pentru fiecare dintre capitolele 24-52 vom utiliza schema ele diagnostic prezentată în şi stomatologie. Această politică va duce ca în numai câţiva ani, un mare număr de generaţii
capitolul 5, schemă pe structura căreia am discutat de altfel şi diferitele aspecte din partea de copii să fie vaccinate faţă de o infecţie care devenise endemică la nivelul anilor ‘90.
generală. Utilizarea în mod repetat a unei scheme clare permite o mai bună fixare a cu­
Fiecare din aspectele menţionate are o strânsă legătură atât cu microbiologia cât şi cu
noştinţelor. Microbiologic este, după părerea noastră, o ştiinţă cu foarte mare aplicabilitate
sănătatea publică şi merită a fi cunoscute de către medicii şi viitorii medici din sistemul sani­
practică. Elementele de bază ale microbiologici sunt necesare şi utile pentru.toţi cei impli­ tar românesc.
caţi în sistemul sanitar; cunoaşterea acestor elemente de bază ar putea preveni o serie de
anomalii şi erori care uneori sunt dezastruoase (aşa cutn s-a întâmplat de ex. înţr-o materni­ In bolile inlecţioase (transmisibile), diagnosticul are o importanţă considerabilă,
deoarece de stabilirea corectă şi precoce a diagnosticului depind atât vindecarea bolnavului,
tate în care o serie de nou-născuţi au decedat datorită unor infecţii de spital).
cât şi succesul măsurilor preventive care trebuie iniţiate cât mai rapid posibil. Spre exem­
Dacă,în urmă cu circa 30 de ani a început să se considere la nivel internaţional (în mod plu, ignorarea primului caz al unei boit .inlecţioase grave (ex. holeră) poate avea consecinţe
eronat) <^ă problemele legate de bolile inlecţioase sunt din ce în ce mai puţin importante,
epidemiologice foarte importante. Cu toate că în primii de studiu este abordată în mod spe­
eroare care a creat şi crează încă mari probleme în sănătatea publică, în ultimii 5-6 ani (în
cial partea microbiologică (bacteriologică, virusologică, parazitologică, mieolpgică) a diag­
special jîncepând cit anul 1998) s-a înţeles că bolilor transmisibile trebuie să li se reacorde
nosticului, este strici necesar să menţionăm că examenul clinic îşi păstrează şi astăzi o
importanţa cuvenită. Astfel, inclusiv la nivel european, au fost elaborate numeroase acte
deosebită valoare. în scopul diagnosticării bolilor inlecţioase au fost puse ia punct nu­
normative în acest domeniu iar fondurile alocate au sporit substanţial, încercând să se ame­
meroase tehnici de laborator, metode paraclinice, precise .şi obiective, dar utilitatea lor este
lioreze situaţia creată datorită erorilor anterioare. maximă atunci când rezultatele sunt interpretate în contextul clinic şi epidemiologie.
Şi în ţara noastră, preocuparea faţă de sănătatea publică în general şi faţă de microbio-
în diagnosticul bolilor transmisibile trebuie respectate o serie de reguli, după cum urmează.
logia în sănătatea publică în mod particular a crescut după anul 1997. Activitatea desfăşurată
în domeniul reformei pentru sănătatea publică în România este, din acest punct de vedere, I. Obţinerea datelor (clinice, paraclinice şi de laborator) este urgentă. Anamneză trebuie
destul de aproape de reforma care are loc restul Europei. Diferitele proiecte .şi programe realizată cu rigurozitate.- Aprecierea stal tisului imunologic poate fi esenţială. Nici un element
iniţiate în special în perioada 1997-2000 îşi găsesc şi astăzi concretizarea în aplicarea unor obţinut prin examenul obiectiv nu trebuie neglijat. 2. Datele obţinute trebuie privite ea un tot
măsuri cu mare importanţă ia nivel naţional: reabilitarea centrelor de referinţă pentru micro­ unitar; nu pot fi absolutizate nici posibilităţile clinice şi nici cele ale laboratorului. 3. Este
biologic, reforma sistemului de supraveghere a tuberculozei, adaptarea la standarde inter­ indispensabil să se stabilească un diagnostic etiologic în toate maladiile inlecţioase, având în
naţionale a sistemului de diagnostic, prevenire şi control pentru bolile cu transmitere sexu­ vedere importanţa tratamentului antimicrobiun; 4. Folosirea corectă a laboratorului consti­
ală, menţinerea la un nivel corespunzător a imunizărilor pentru a preveni bolile prevenibiie tuie o uită regulă importantă. Este necesar ca fiecare medic clinician să ştie ce analiză să
prin vaccinare, includerea României în sistemul de pregătire în scopul supravegherii bolilor ceară, ce produse tie recoltează de la bolnav, când şi cum să le recolteze, cum să le expe­
dieze către laborator. Pentru obţinerea unor date corecte prin examenele de laborator, clini­
transmisibile la nivel european ele.
cianul va respecta câteva reguli: produsele se recoltează înainte de administrarea tratamen­
Din anul 1999 România face parte (ca membru fondator) din Reţeaua de supraveghere a tului antimicrobiun; se trimite laboratorului o cantitate suficientă de produs pentru exami­
bolilor transmisibile în Balcani. în anul 2000, a fost organizată una dintre cele mai impor­ nat; produsul patologic trimis trebuie să lie reprezentativ pentru boala respectivă (de exem­
tante întâlniri cu.scopul armonizării supravegherii bolilor inlecţioase în Europa (Consensus
plu, spută şi nu salivă în infecţiile respiratorii inferioare); produsul examinat nu trebuie con­
Meeting on Surveillance of Infectious Diseases, Grottaferrata, Italia, 7 aprile 2000).
taminat cu alţi germeni în cursul recoltării sau al transportului (recoltare aseptică);- expe-
Prezentarea pe care autorul prezentului volum a făcut-o cu acest prilej, discuţiile care au
Introducere în diagnosticul de laborator microbiologic 141
140 Diagnosticul de laborator în microbiologie

dierea către laborator se face în condiţiile de conservare cerute pentru fiecare tip de produs Un prim grup important este Cel care include cocii cu importanţă medicală, gram pozi­
patologic în parte; se solicită examinarea imediată a produselor transmise către laborator. 5. tivi (stafilococi, streptococi, pneumococi etc) şi respectiv gram negativi (meningococi şi
gonococi etc).
Trebuie să existe o colaborare strânsă şi continuă între elinician şi specialistul de laborator.
Este necesară o informare clinică a omului de laborator de către clinician pentru orientarea Dintre bacteriile gram negative care au dimensiuni pe baza cărora nu pot fi încadrate
studiilor în 'laborator şi peîrtrti alegerea Celor -mar bune!metode'de identificare-a' agentului drept coci sau bacili se află parvobacteriile, cocob’acilii gram negativi (Haemophilus influen­
etiologic. în acelaşi timp; laboratorul trebuie să informeze clinicianul-pe parcurs în legătură zae, Bordetella pertussis, Brucella spp. etc).
cu datele obţinute. ,4 1,1 / r ‘ -n' 1J,; ' ■ ■ --T' ■ JBacilii gram pozitivi care vor fi discutaţi se pot grupa în bacili nesporulaţi (Corymbac-
în cadrul-examenelor de laborator, iun ide prioritar este ocupat de diagnosticul micro- * lerium diphteriae, Listeria spp. etc) şi respectiv bacili gram pozitivi sporulaţi (Bacillus
biologic (bacteriologic, mitologic şi/saU imunologic), care va fi prezentat în continuare anthfacis, Clostridium spp. etc). '
(vezi 'şi capitolul 5). Fpârte pe/scurt'volţi, discuta câtevâ1date.' referitoare la alte examene >pa- ' Baci!ii gram negativi studiaţi aparţin fie familiei emerobacteriilor (E. coli, Salmonella
raclinice, utile în diagnosticul bolilor infecţioase." . spp., Shigella spp., Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Yersinia spp. &tc) fie sunt incluşi
Diagnosticul citologie constă în punerea .în evidenţă a unor aspecte celulare cahicteris-J în genuri separate precum' Vibrio cholerae din genul Vibrio sau Pseudomonas aeruginosa
din genul Pseudomonas.
tice, utilizând iln produs1prelevat de Iii Bolnav. Spre exemplu, citodiagnosticui revărsatelor
pleurale şi al LCR poate aduce date preţioase'pentru elucidarea etiologici unei pleurezii şi Microorganismele din genul Mycobacterium se-pot colora (cu dificultate) prin metoda
respectiv a unei meningite. Diagnosticul histologic implică biopsii (recoltate prin tehnicii' Gram, dar în mod caracteristic se colorează prin metoda Ziehl-Neelsen. Specia principală
chirurgicală) sau puncţii-biopsii ale diferitelor organe (ficat, rinichi, plămân, ganglioni lim­ studiată este reprezentată de M. tuberculosis.
fatici, fragmente vasculare,'mucoasă digestivă sau respiratorie) care permit punerea în evi­ O serie de bacterii spiralate (ex. Treponema pallidum, Leptospira spp.. Borrelia spp.) nu
denţă a unor modificări structurale caracteristice, determinate de acţiunea agentului rnicro- se colorează.prin metoda Gram datorită structurii particulare a peretelui, Pot fi studiate
bian. Dintre metodele de laborator nespecifice sunt utile în diagnosticul bolilor infecţioase microscopic fie în preparate proaspete (utilizând tehnici microscopice speciale) fie utilizând
hemograma, leueograma (cu modificări caracteristice în unele boli),-viteza'de sedimentare coloraţii particulare (ex. impregnarea urgentică).
a hematiilor, testele de disproteinemie, diferite teste enzimatice, determinarea prezenţei pro­ Până în urină cu o, perioadă de limp microorganismele aparţinând genurilor Rickettsia.
teinei G reactivă (beta-globulină care apare în ser în afecţiuni inflamatorii, neoplazii şi în Chlamydia şi Mycoplasma erau incluse în categoria virusurilor. Totuşi proprietăţile lor fun­
procese necrotice). alte teste de inflamăţie (reactanţi de faza acută) etc. damentale fac să le studiem astăzi între bacterii.
Referitor la alte metode paraclinice vom aminti examenul radiologie care poate furniza' în obiectul de studiu sunt încadraţi şi fungii (ciupercile) care au o serie de caracteristici
date de valoare pentru bolile infecţioase cu participare pulmonară (pneumonii virale, febră Q, aparte. Noţiunile legate'de diagnosticul mitologic sunt prezentate mai pe larg în tratatele de
tuse convulsivă, pneumonie pneumococică etc). în diagnosticul bolilor infecţioase se mai pot specialitate, . 1
folosi rectosigmoidoscopia, elcctrocncefalografia, electrocardiograful, diferite determinări
biochimice, examene oftalmologice, scintigrafia, ecografia, tomografia computerizată, tehni­
ca de rezonanţă magnetică nucleară.

Diagnosticul tie laborator microbiologic (ex. bacteriologic)


Diagnosticul de laborator în microbiologie poate fi un diagnostic bacteriologic (direct),iun
diagnostic imunologic (indirect) sau o combinaţie a celor două variante menţionate. Schema
generală a diagnosticului de laborator microbiologic a fost discutată în capitolul 5 .şi va fi aplica­
tă concret în capitolele care urmează. Pentru fiecare microprganism/diagnostic în parte, din,lista
p.p. posibil de utilizat, vom alege pentru prezentare câte unul singur,- considerat reprezentativ.

Principalei microorganisme pentru care se va studia


diagnosticul microbiologic j
Bacteriile studiate pol fi grupate după mai multe criterii, dar o variantă utilă este cea în
care avem în vedere structura peretelui bacterian şi respectiv afinitatea acestuia faţă de dife­
riţi coloranţi.
( ;
Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Staphylococcus 143
#|J DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
&*$* ÎN INFECŢIILE PRODUSE DE MICROORGANISME .,:i 2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două
_________DIN GENUL STAPHYLOCOCCUS frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu
albastru de meliten (AM) şi respectiv Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic
' ;■. 1! ,;r, ; . .[!>:■, t'.:,) ■ , m twftififij» i;i-1>-■. >â;,: cu imersie şi se notează prezenţa celulelor de la nivel tegumentar (eventual modificate faţă
<i . . , i 1 ,■ 'i:1' ■: ..-fu «I. ■.-( . -1iţ, r'i! i.'iii'/'u ; ;, .VI;,i.» j j ; : / ;f! j.s :: K : ■iii de normal), prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) şi prezenţa cocilor
gram-pozitiyi, cu diametrul de 0,5-1,5. j.tnt, dispuşi în lanţuri scurte, perechi, izolaţi sau în
grămezi..neregulate. Cocii,se pot situa intra sau extraleucocitar. Se are în vedere locul de
unde a fost recoltat, p.p. (puroiul poate fi .necontaminat, dacă se recoltează de ex.,prin
i};11>■ «,» v i •1.M-* ■■■ •• O l'. V j VJ Vvn»AiV.|,Lv,;,i\nA>t
Stafilococii sunt coci gram-pozitivi aerobi, facultativ anaprabi, intobili, ineşporiţlaţi, puncţie-aspirare dintr-o colecţie purulentă profundă şi este foarte probabil contaminat cu
catalazo-pozitivi. Genul Stctphylocdccuţ cuprinde mai multe grupe de microorganisme de floră de asociaţie dacă a fost recoltat dintr-o leziune superficială).
interes medicai (unele dintre aceste grupuri incluzând mai ffiulţe specii). Cele mai,cunoscute 3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să
specii sunt reprezentate de: Sfapfiyiqcwcus-aureuiş; S'. efifarmidisj tS. saprcipliyţicusl S. se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi capi­
aureus reprezintă.specia cei mai frec vent implicată’în clinică. Există şi alte s’p^qii nepato­ tolele 9 şi 10). Stafilococii se dezvoltă în general pe medii de cultură obişnuite în 18-24 ore,
gene sau condiţionat patogene. în funcţie de capacitatea de a elabora coagulazâ, toţi stafilo­ la 35-37°C. Coloniile au aspect de tip S, diametrul cuprins între 1-3 mm şi sunt pigmentate
cocii coagulazo-pozitivi sunt grupaţi-ca S. aureus.;" ■ ’!'> •, *"*’ ••••..••.vnws t1;'1,.:; în funcţie de specia izolată (ex. pigment auriu). Pe mediul geloză-sânge, în jurul coloniilor
Stafilococii pot deveni patogeni şi se pot manifeştâcaatarefie prin multiplicare'şi jnvaZiv- poate apărea o zonă de bemol iză clară. Stafilococii se pot multiplica pe medii hipercloru-
itate, fie prin multiplicare şi toxinogeneză (fiind posibilă şi combinarea acestor mecanisme). rate, tolerând o concentraţie de 7-10% NaCi (ex. mediul Chapman).
Determinanţii patogenităţii la stafilococ includ produsele toxice şi eiizimatice; $)ăureiis’este 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
implicat ca agent etiologic într-o mare varietate de infecţii supumtive (cu puroi),'începând caractere:
cu infecţiile superficiale ale tegumentelor şi mucoaselor şi continuând cu panariţii, ftiruri- e Caractere morfolincloriale: Suni coci gram-pozitivi, eu diametrul de circa 0,5-1,5 g,
cule, abcese profunde, infecţii ale diferitelor organe interne cu sau fiM generalizăreit ito dispuşi în lanţuri scurte, perechi, izolaţi sau în grămezi neregulate
fecţiei. Pe de alta parte, ar fi de menţionat toxinozele (datorate în special toxinelor!elabo­
* Caractere de cultură: Produc colonii de tip S, pigmentate auriu; pe mediile cu sâiîge
rate), şi anume toxiinfecţiile alimentare, necroliza toxică a epidermului, isindroniul detşoe
pot produce hemoiiză.
toxţb etc. Toxiinfecţiile alimentare sunt provocate de exotoxinele prefofmate, existenteîn
aliiiiente în care s-au multiplicat stafilococi enterotoxigeni., Stafilococii coagulazo-negâtivi * Caractere biochimice: Stafilococii au un meiabolism glucidic atât respirator cât fî fer-
(SCN) sunt implicaţi în infecţii apărute după manevre medico-chirurgieale care,penetrează mentativ. Fermentează glucoza, manitolui, xiloza, lactoza, zaharoza etc. cu prodtemr®
bariera cutaneo-mucoasă (cateterisme, Împlânte, protezări intravasculare etc). Ar.inai.fi de de acid. Capacitatea de acidifiere a mediului conţinând manită este utilizată ca tes*«Hs
amintit infecţiile tractului urinar şi genital cu S. saprophyticus (la femeile tinere). O infecţie diferenţiere între S. aureus (manito-pozitiv) şi SCN (manilo-negativ). Stafitassdii
gravă produsă de SCN este enterocolita postantibiotice a nou născutului (mai ales a pre­ aurii sunt catalazo-pozitivi (vezi 12.5.B). Se poate face şi testul fosfatazei. ExisiiS sis­
maturului, la care administrarea necontrolată a antibioticelor poate produce disbacteriemii teme multitest care se pot procura comercial (API, Micro Scan, Minitek etc).
cu consecinţe grave). Pentru a discuta diagnosticul de laborator în infecţiile produse dp * Caractere antigen ice: Se pot utiliza teste comerciale care includ fibrinogen şi IgGo®s
stafilococi vom aleg?-drept reprezentative infecţiile purulente ale tegum entelor şi mu-, cuplează coagulaza legată şi proteina A (tehnici de aglutinare indirectă).
coaselor şi ne vom referi numai ia Staphylococcus aureus. ! * Caractere de patogenîtate: Trebuie efectuat testul coagulazei (vezi capitolul 12,p»® -
Diagnosticul de laborator este ndmai bacteriologic, direct, cu urm ătoarele etajje.| tul 12.7); pentru identificarea exotoxinelor se poate utiliza o tehnică de tip ELlSAsaw
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o .serie aglutinarea pasivă inversată (vezi şi capitolul i 1).
de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât * Sensibilitatea ia bacteriofagi: Susceptibilitatea la acţiunea iitică a bacteriofagiloralfetiit
mai rapid şi corect din punct de vedere ai tehnicilor Utilizate, respectând toate normele de sistematizată pentru tulpinile de S. aureus şi se poate testa la nivelul centrelor deuisffe-
asepsie şi antisepsie etc). în funcţie de maladia provocată se pot recolta următoarele prbduse rinţă. '-
patologice: secreţii purulente (clin foliculite, abcese, celulite, fistule, infecţii ale plăgilor şi « Alte caraclere/teste utilizate în identificare: Se pot utiliza (în centre de referinţă) lisate
arsurilor), lichide (de puncţie sinusală, otică, mastoidiană, articulară, peritoneală, pleurală, care se bazează pe proprietăţi f'enotipice moleculare (studiul acizilor graşi celutoaţ.afl
perieardică), exsudat nazal sau exsudat. faringian, sânge, LCR, spută, urină, secreţie vagi- unor enzime sau ai unor polipeptide-totale) sau genotipiee (fragmente de restricţie site
nală, tampoane vaginale. lichid de vomă, materii fecale, alimente, prelevate de pe suprafaţa materialului genetic, hibridarea moleculară, ribottpia). S-au dezvoltat tehnici a p tto
catetereior şi'ti inserţiilor iv. ale acestora. în continuare vom discuta cazul în care p.p. este utilizând truse de identificare şi instrumente automatizate pentru evidenţierea unarafe-
reprezentat de puroi (vezi şi capitolul 6).
144 Diagnosticul de laborator în microbiologie

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
mente ale peretelui celular (proteina A, coagulaza legată), a enzimelor elaborate în ali­
ÎN INFECŢIILE PRODUSE DE MICROORGANISIVIE
ment sau lichidul tie hemdcultură xftestui pentru termonuclează) şi a toxinelor (entero-
toxine, TSST1, exfoliatine). Există metode care utilizează marker! moleculari pentru DIN GENUL STREPTOCOCCUS
evidenţierea prezenţei MRSA (stafilococ rezistent la meticilină) şi pentru diferenţierea
intraspecifică la 5'. u u t e u s şi SCN. :i V a -■■■
5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chîriliotefâpibeîriAedefeă sta-
bilirii tratamentului) este obligatorie şi se realizează de 'obicei'prin metode difuziitietricfe;
în cazul unor infecţii grave trebuie să fie însoţită de alte determinări (vezi capitolul 14).
Streptococii sunt rnni ş-feriri pi-mn-poziiud. care formează perechi sau lanţuri în cursul
■ •' l '* ' ■• r "«•;’î'rî 'iii Ar U.y '■-;: diviziunii celulare. Sunt larg răspândiţi în natură. Unii fac parte din flora umană normală;
, j *• r.:- •. ;r. •" alţii sunt asociaţi cu afecţiuni umane importante datorate partial infecţiei streotococice şi
parţial răspunsului iimtn al gazdei. Nu s-a elaborat un sistem perfect pentru clasificarea
tuturor streptococilor. Dintre speciile cu importanţă medicală ar fi de amintit S. pyogenes
(grup A), S. agalactiae (grup B), S. viridans (care aparţine florei normale), j>. pneumoniae
T p netimbcocul) etc. Enterococii aparţineau grupului D, însă în momentul actual fac parte
dintr-un gen separat, genul Enterococcus. Streptococii sunt imobili, nesporulaţi şi pot avea
sau nu capsulă. în acest capitol,vom discuta diagnosticul de laborator ai infecţiilor produse
de Streptococcus pyogenes,
Cei mai mulţi dintre streproeeefi care conţin antigenul de grup A sunt streptococi piogeni.
Streptococii piogeni sunt hefa-hemolitici fnroduc în mod caracteristic zone largi de hemo-
liză clară în jurul unor colonii de dimensiuni mici). De regulă streptococii piogeni sunt sen­
sibili la bacitracină. *
Streptococii sunt potenţial implicaţi într-o mare varietate de boli. în principal strepto­
cocii piogeni pot deveni patogeni datorită multiplicării şi capacităţii de invazivitate.
Proprietăţile hiningico ale microorganismelor infectante, natura răspunsului gazdei şi poar­
ta de intrare a infecţiei au o mare influenţă asupra tabloului clinic. Infecţiile streptococice ar
putea fi grupate astfel:
• Boli invazive, în care putem include faringita, angina streptocoeică, erizipelul, diferite
“infecţii în sfeFa ORL, pneumonia, impetigo streptococic, celulita, fasceita necrozantă,
febra puerperală, endocardita infecţioasă, sepsisul streptococic etc.
• Boli produse de streptococi lizogenizaţi, în care putem include scarlatina şi sindromul
de şoc toxic streptococic.
• Bolile poststreptococice care includ reumatismul articular acut (RAA) şi glomerulo-
. nefrita acută poststreptococica (ONA). Diferiţi autori iau în considerare şi alte entîtăţT
clinice.
Pentru a discuta diagnosticul de laborator în infecţiile produse de streptococii piogeni
vom alege faringita streptocoeică. în vederea confirmării unei boli poststreptococice vom
discuta reacţia ASLQ (vezi si capitolul 19).
Diagnosticul de lab o rato r bacteriologic, direct, în faringita streptocoeică.
/ u R ecoltarea si transpnn.nl pi-nHnsnlui patologic, secreţia purulentă de la nivelul
farttigelui, trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât mai aproape de debutul
bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere
(

146 Diagnosticul de laborator în microbiologie .JlS Diagnosticul de laborator în infecjiile produse de Steptococcus 14 7
i" \ i y ' *i *' i.ii v's-'. ,/b? . i-■./Vii-1: ri'Qirî'Cifj'* ' L . :'V. '
•r.t - ............
al tehnicilor utilizate, respectând, toate normele de asepsie şi antisepsie, recoltarea se face • Streptococii piogeni sunt rezistenţi la trimetopriin-sulfametoxazol.
preferabil dimineaţa înainte ca pacientul să mănânce şi % ă să se fi spălşt pe dinţi, fără să fi • Caractere antigenice:
utilizat gargarisme cu diferite soluţii, iar dacă aceste condiţii nu au fost respectate, recoltarea
• Se pol utiliza teste comerciale pentru detectarea rapidă a polizahariduiui specific
se va face după minim 4 ore etc vezi şi capitolul 6). Produsul recoltat trebuie prelucrat cât
de grup A al streptococilor piogeni în p.p., după extracţie chimică sau enzimaticâ
mai repede posibil, însă în nici un caz nu trebuie să treacă mai mult d & 3 o v e \te la recoltare
(ex. cu p ro n az ăh je taicije utilizate pot fi aglutinarea indirectă (latexaglutinare),
până la cultivare (preferabil 1-2 ore). în cazul în care se estimeazădgpăşireadîcestui interval coaaluiinarea sd a E LiSA.,^ ^ =*—____
de timp trebuie folosit un m ^ i" h»Transport^.», mediul Stmniiwy/i şi capitolul 9). Chiar şi
•" “ Prin reacţii ele aglutinare (latexaglutinare,.coaglutinare) pe lamă, sau precipitare se
în această situaţie, nu ar trebui să treacă mai mult de 24 de ore până la prelucrarea p.p.
!v pot determina antigenele streptococice de; gi-up (Lancefieid) sau de lip.
/ î . Examinarea microscopică a produsului patologic iricliKle realizarea a două frotiiirj din
proaus&r^tttbtegidTTOdTîîrşrtranspdrtat' cores^ se vor colora cti albastru de
•J - pyogenes este împărţit în serotipuri pe baza antigenelor proteice M.(peste 80)
prin reacţia de precipitare în tuburi capilare şi T (28 serotipuri) prin reactiTcTe
metilen (AM) şi respeeliv'Gram. Frotiurile se examinează lâ microscopul optic cu imersie şi
■'■( ' aglutinare pe lamă. Aceste testări se fac în centre de referinţă.
se notează prezenţa celulelor de la nivel farmgian, prezenţa celulelpr inflamatorii (ex.ieu-
cocite, piocite) şi prevenţii cnrijor gram-pozitiyi aşezaţi separat, în perechî sâu în lanţuri, dar • Alte teste utilizate în identificare: Se pot utiliza sondele nucleotidice pentru detectarea
şTâ^l'tof. tipuri de microorganisme. Examenul microscopic al p.p. are doar uiţ rol orientativ. directă a streptococilor (le grup A în exsudatul faringian. • :

f 3.jCultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşg fel încât să Slreptococii piogeni îşi menţin sensibilitatea cunoscută la penicilină fan fost identifi-
sejîlSată obţFnecoloniilzolatc şi respectiv o cultură pură, care,se va identifica (vezi şi capi­ caheTn ultima perioadă tulpini “tolerante”, care sunt inhibate dar nu distruse de către peni-
tolele 9 şi 10). Streptococii piogeni sunt germeni pretenţioşi caceuţu se dezvoltă pe medii cilină)..Egiiixii pacienţii alergici ia .beta-lactamine se poate alege pentru tratament eritromi-
cină, dar au fost identificate tulpini rezistent&ja acest medicament antimicrobian şThracesT
de cultură obişnuite. Mediul cel mai frecvent folosit este stear-sângo? pe care cultura apare
caz anţibiograma devine necesară. în general antibiograma se realizează în scop epidemio­
în 18-48 ore, la 35-37°C. în cazul în care nu remarcăm apariţia de'colorm ^^ictedstice după
logie.
24 de ore, reincubăm placa Petri pentru încă o zi. Coloniile au asp ecp d etip S cuiliametrul
de 0,5-1 mm, înconjurate de o zonă de B-liemoliză (zonă clarW e Jie m d iză , cu un
diametru mult mai mare decât diametrul coloniei), în cursul însămânţării, pe cel puţin una
Diagnosticul de laborator serologic
dintre laţurile „poligonului" descris trebuie să realizăm şi o înţepare a mediului în aşa fel Diagnosticul imunologic al infecţiilor produse de streptococii p-heinolitici din grupul A
încât inoculul să ajungă mai în profunzime, Această.-rrianevră (există şi alte variante ţehniţe) ar putea consta din investigarea fie a răspunsului imun umoral (prezenţa şi litrul anticorpi­
este necesară pentru a permite activitatea hemolizinei O (această streptoiizină este inactivată lor, în cadrul diagnosticului seroiogic), fie a răspunsului imun de tip celular. în continuare
în prezenţa oxigenului). Speciile care produc material capsular, din acid hialuronic, adese­ nu vom discuta decât diagnosticul serologic, care are importanţă practică.
ori dau naştere unor colonii mucoide (de tip M). Se pot folosi pentru cultivare şi medii selec- Diagnosticul serologic este util pentru certificarea etiologiei bolilor poststreptococice
tiv^Xde ex. agar-sânge plus irimetoprim-sulfanietoxazol). (RAA, GNA), identificarea unei eventuale stări de hipersensibilitate, diagnosticul retro­
6 1U Identificarea
1 microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor spectiv al unei infecţii streptococice, evaluarea evoluţiei clinice şi eficacităţii tratamentului.
caractere: Diagnosticul serologic se realizează de obicei prin reacţia ASLO, care identifică titruri ale
• Caractere morfotinctoriale:.Sunt coci gram-pozilivi. sferici sau ovoidali. cu diametrul anticorpilor anti-streptolizină O (vezi şi capitolul 19). Testarea se face în dinamică, pe seruri
cleTcirca )pm. Se divid într-un pian perpendicular pe axa lor lungă şi se pot dispune îţi recoltate la interval de 7-10 zile. Pentru zona noastră geografică se acceptă ca normal un
lanţuri. Lungimea lanţurilor variază şi este condiţionată de factorii de mediu. litiu de 200 (maxim 250) unităţi ASLO. Este strict necesară realizarea controlului intern şi ‘7
extern de calitate. .
• Caractere de cultură: Produc colonii d*rtlp*S>cu diametrul de 0,5-1 mm, înconjurate
de o zonă de P-hemoliză sau colonii oeT ijfM ., , ‘ Există teste seroiogice pentru determinarea prezenţei şi litrului anticorpilor faţă de altd^
structuri antigenice (streptodomază. hialuronidază, streptokinază). Titrai anticorpilor anti-
• Caractere biochimice: , " , • ' /
strcptociornază este Crescut la pacienţii cu infecţii tegumentare şi trebuie investigat dacă se
<TSti-p.pinr.ncii piogeni produc hemoliză de tip behu_ suspicionează prezenţa unei glomerulonefrite acute. Se pot determina şi anticorpii anticar-
• Prin testul PYR este identificată sinteza pirolidonil-amidazei (actualmente există şi bohidrat (hemaglutinare pasivă) sau anti-MAP (prin latex aglutinare).
•teste comerciale, rapide, pentru testul PYR).
• Multiplicarea streptococilor de grup A este inhibată de bacitracină (antibiotic oro-
dus de Bacillus liclwnijbrniis). Se apreciază că dintre tulpinile de Streptococcus
pyogenes, mai puţin dc \% sunt rezistente la bacitracină (vezi capitolul 12),

J
26 Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Steptococcus pneumoniae 149

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN INFECŢIILE


nietilen, capsula poate apărea ca un halotf în jurul pneumococilor. Utilizând anticorpi anti-
PRODUSE STREPTO COCCUSPNEUMONIAE capsulari, se poate realiza o identificare rapidă inclusiv direct, pe produsul patologic (de exem-
ă), prin reacţia de imsflnre -arcmvsirteffvea-eapitoliil 12. punctul 12.14).-

11

vii
ţ ţ | t ]' i"| Ş , >

i V l i - i t l i , ■! ' i

Streptococcus pneumoniae se prezintă sub formă de coci^eram-pozitivi./alungiţi, kinceo-


laţi, dispuşi în general în diplo pe axul longitudinaf, încapsulaţi, liesporuiapT imobili.
.1 a ultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să
i obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (veziişi capi­
tolele 9 şi 10), Pneumococii sunt germeni pretenţioşi, oare nu se dezvoltă pd medii simple,
sunt aerobi, facultativ anaerobi. Pe geloză-sânge formează colonii de tip S sau de tip M,
înconjurate de o zonă de rx-hamoliyJM^a-fel-ea-.9frep/ncnr.,ctt,y viridans). Multiplicarea este
favorizată în,atmosferă de 5% CO 2 la o temperatură de 35-37°C. în mediile de cultură
lichide tulbură omogen mediul.
Pneumococii sunt aerobi, facultativ anaerpbi;. Pfeigeloză-sânge determină a-hemoliză la fel
Produsul patologic ,se poate inocula şi la animale de laborator sensibile, respectiv la
ca Streptococcus viridans. Creşterea lor este favorizată în: atmosferă d ^ J % W )2 la o tem­
peratură de 37°p. Streptococcus pneumoniae poate: deveni patogen p rin .^ frp iic a re şi in- şoareci albi. ,,,
vazivitate, conducând la apariţia unor variate infecţii ale tractului respirator superior, şi infe- •
rior, ale urechii medii, ale sinusurilor, dar şi alte infecţii produse, prin diseminare hemato-
genă (ex. meningită, Cndocardită, care pot fi foarte grave). Pneumonia pneumococică se • Caractere morfotinctoriaie: Sunt coci gram-pozitivi, alungiţi, lanceolaţi, dispuşi în
însoţeşte de prezenţa edeimilui alveolar şi a Unui exSudat fibrinosî* urmat de apariţia de genera! in diplo, încapsulaţi (cu o capsulă comună), nesporulaţi.
hematii şi Îeucocite. V j :' : ' ■ \ :' j , "H !"1' .;d :,:- • Caractere de cultură: Pe geloză-sânge formează colonii d ^ lip S sau M, înconjurate de
.. Datorita faptului că poate face parte din flora midrobianâ. normală, există o serie de pro­ b Zonă de a-hem oliză (la fel ca Streptococcus viridans).
bleme în ceea ce priveşte interpretarea semnificaţiei prezenţei pneumococilor în produse • Caractere biochimice:
patologice care pot fi contaminate cu această floră (ex. sputa'recoltată prin expectoraţîe).
* Giucoza reprezintă principala sursă de energie pentru pneumococi (aceştia ela­
Una dintre marile probleme terapeutice decurgând din dezvoltarea rezistenţei la antibio­
borează enzime zaharolitice, proteoiitice şi lipolitice).
tice o reprezintă apariţia pneumococilor rezistenţi la penicilină şi alte,medicamente antibac-
terierie___ " ' — 1 ~ ~ ^ • F erm entarea innlinci reprezintă un caracter biochimic important, util în dife­
renţierea pneumococilor de £ viricknsjex.istă tulpini de S. viridans care fermen­
Pentru a discuta diagnosticul de laborator în infecţiile produse de pneumococi vom alege
tează inulina). Se utilizează un mediu în care există inulină şi un indicator de pH.
drept entitate reprezentativă pneumonia pneumococică. Diagnosticul pneumoniei pn'eumo-
în cazul reacţiei pozitive are loc o modificare de pH şi respectiv modificarea culorii
cocice este adeseori clinic şi radiologie.
mediului.
Diagnosticul de labortţţor microbiologic este numai bacteriologic (direct) » Pneumococii elaborează enzime autolitice. Autoliza esleJndusă şt accelerată de
/ ^ / Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie bilă, săruri, biliare, acizi biliari: testul este util în identificarea pneumococilor (tes­
tul bilolizei, Neufeld; vezi capitolul 12, punctul 12.3).
cte-fCguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi.primit antibiotice, cât
mai rapid şi corect din. punct de vedere ai tehnicilor utilizate, respectând toate normele de • Sunt sensibili ia optochin (etil-hidrocupreină), sensibilitatea la această substanţă
asepsie şi antisepsie etc). în funcţie de maladia provocată se pot recolta-următoare le produse TTnFfflertîsenTCTTEr^ă fn identificare şi diferenţierea de Streptococcus viridans
patologice: spută, aspirat bronşic sau traheal, exsudat faringian, secreţii otice sau conjiincti- (vezi capitolul 12, punctul 12.13).
vaie, lichid pleural, lichid pericardic, LCR, puroi, sânge, material necroptic, Ţn pheurponia • Caractere antigenice;. _ .
pneumococică agentul etiologic poale fi izolat şi prin hemocultură. în continuare vom dis­ # Cel majjmpprtant determinant antigenic şi patogenic este capsula polizaharidică
cuta cazul în care p.p.,estetreprezadM^aŞguţă_(,vezi şi capitolul 6).'. "j , (jmtigenuljiy, ce protejează pneumococul faţă de fagocitoză şi permite invazivi-
i^ZdEXaminareă•microscopică a, produsului patologic include realizarea a, minimi două tateaŢStracţura polizaharidului capsular este specifică fiecărui serotip în parte.
«otâuj din 1produsul patologic recoltat şi-transportat-corespunzător, care se;vor colora cu Până în prezent au fost identificate peste 85 de serotipuri capsulare diferite, a căror
albastru de meiilen fAM) şi respectiv Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic.cu structură a fost determinată pentru majoritatea serotipurilor. Au fost produse seruri
imereieşi se notează prezenţa celulelor de la nivel alveolar (ex. macrofage alveolare), prezenţa specifice anticapsulare polivalente şi monovalente, utile în identificarea pneumo-
celulelor inflamatorii (ex. Îeucocite) şi prezenţa cocilor gram-pozitivi, alungiţi, lanceolaţi, cociibr cu ajutorul reacţiei de umflare a capsulei (vezi capitolul 12, punctul 12. i 4).
dispuşi în general în diplo, încapsulaţi (cu o capsulă comună), nesporulaţi, Examinarea micro­ în acelaşi scop se poate utiliza şi reacţia de aglutinare.
scopică trebuie să demonstreze calitatea produsului patologic şi să realizeze o identificare
prezumtivă a microorganismului implicat (vezi şi capitolul 52). în coloraţia cu albastru de
150 Diagnosticul de laborator în microbiologie
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
• Datorită faptului cîbprin urină se-elimină cantităţi destul de importante de-Ag K,
prezenţa acestuia, poate fi evidenţiată prin reacţii de latexaglutinare sau mai bine
J € ÎN INFECŢIILE PRODUSE DE MICROORGANISME
DIN GENUL N EISSERIA
prin iinunoelectrof'oreză.' ,..v ;■ r,: t . •
• Caractere,de patogenitate:-Setpoate-utiliza.inocularea la şoarecele alb,(vezi capitolul
... 11,). ■:) ii . i c , '••.•••) „■ ', i » q ii ic.'iL'o o v ilu . . '■iiii.,.;! Îiîîo io u .a f u jf u >'■
. :•• Alte teste1utile în identificare: Se pot utiliza sonde nucleotidice;jjehtni*identificarea Familia Neisseriilkclcie include mai multe genuri, spre exemplu Neisseria, Moraxella,
'.'ARNr. ut :A) Uv/w not lid-;'! >(.• Âcinetobacter, Kmgella. în genul Neisseria, speciile importante pentru patologia umană
5. Ântibibgrâifiiî \^'nsibiiiUiţii ’ia' antibi6tice‘‘^i chimidterapice îii'vederea sta­ sunt Neisseria meningitidis (meUiitgococul) şi Neisseria gonorrhoeae (gonococuî), dar Se
bilirii' tratamentului)1este5obligatorie şl' se idilizează de obicei prin metode !difuzimetrice pe pot aminti şi N. lactamica, N. sicca, N, subflava etc. în acest capitol vom discuta numai
medii suplimentate cu sânge defibrinat de oaie. Pentru verificarea sensibilităţii/rezistenţei la diagnosticul de laborator în infecţiile produse de meningococ şi gonococ.
penicilină se utilizează ’microcdmprimate cu oxacilină (1 pcg).‘în cazul unor linfeţţii grave Neisseriile se prezintă sub formă de coci gram-negativi, dispuşi în diplo, reniformi, imo­
antibiograma trebuie să fie însoţită de alte determinări (vezi capitolul-14). 1 : • bili, înconjuraţi de o structură capsulară comună: în funcţie de structura capsulei există mai
•M !'. . f i i . M ....................................tv .-ii i r - iiii'/ t i f multe serogrupuri. Ambele microorganisme sunt oxidazo pozitive şi au nevoie în vederea
izolării de medii de cultură îmbogăţite, necesităţile nutritive fiind mai mari în cazul gono-
[ţi:..--; •; . ■! \ i ,. I :■ .'.'I" - -'.ito !' i Ui i tr iV 'J i ; i '
cocului. Principial se pot multiplica pe mediul Mueller-Hinton (amintit şi la antibiograma
-ligii,. Iii ItrtS:»; difuzimetrică) după ce izolarea din p.p. a fost realizată pe alte medii îmbogăţite, Mul­
tiplicarea are loc la o temperatură de incubare de 35-37°C şi în condiţiile unei atmosfere de
3-10% CO?. Coloniile-apar în 24-48 de ore, mai rapid în cazul meningococului.

Neisseriameningitidis
IJt T1 V ; - s j.î -vf ' t:. Neisseria meningitidis poate face parte din flora microbiană de la nivel oral, nazal sau
faringian. Colonizarea poate persista săptămâni sau luni de zile. Meningococul este un
microorganism condiţionat patogen care poate fi implicat în infecţii respiratorii, dar este
'■ / semnificativ de reţinut faptul'că prin invazivitate poate conduce la apariţia unei bacteriemii
în cursul căreia complicaţia principală este meningita meningococică. Meningococul repre­
zintă una din primele trei cauze de meningită infecţioasă la adulţi (alături de Haemophilus
influenzae şi Streptococcus pneumoniae).

Diagnosticul meningitei meningocociee


Diagnosticul meningitei meningocociee porneşte de la elementele clinice, eventual într-un
anume context epidemiologie; clin punct de vedere al stabilirii etioiogiei este un diagnostic
bacteriologic (direct).

Diagnosticul de laborator
11 în m eningita meningococică diagnosticul este urgent (risc de evoluţie cu sechele şi/şau
deces), de importanţă-maximă fiind recoltarea şi transportul rapid al LCR către laborator.
Este de preferat realizarea unei cultivări „la patul bolnavului", chiar dacă pentru concen­
trarea germenilor ar putea fi necesară centrifugarea LCR. Analiza citologică şi biochimică
a LCR este utila în stabilirea etioiogiei.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând re­
gulile cunoscute (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibi­
otice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate
(

152 Diagnosticul de laborator în microbiologie 27 Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Neisseria 153

normele de asepsie ţi antisepsie etc). Aşa cum am menţionat, recoltarea LCR prin puncţie 0,05 pg de Ag/ml). De notat posibilitatea unei reactivităţi încrucişate faţă de Ag
(după verificarea presiunii din artera centrală a retinei prin examinarea fundului de ochi) tre­ grupului B, respectiv Ag Ki de la E. coli.
buie tăcută pe cât posibil la patul bolnavului, având la dispoziţie tot ce este necesar pentru
• Tehnici similare se pot utiliza pentru identificarea tulpinilor de meningococ izolate
pregătirea frotiurilor, cultivarea pe diferite medii de cultură, repartizarea unei cantităţi de
în cultură.
LCR pentru examenul citologic şi biochimic (vezi şi capitolul 6). LCR poate fi purulent. în
cazul în care p.p. urmează a fi transportat către laborator, transportul trebuie realizat fără • Caractere utilizate în tiparea tulpinilor izolate: Există diferite tehnici .(imunologice,
întârziere (la o temperatură apropiată ’de, 37°C). Meningococul ar, putea fi izolat şi prin electroforetice, de biologie moleculară) care sunt practicate numai în centre de refe-
hemocultură, cultivarea secreţiilor nazale sau faringiene.etc., ...... m , / rinţâ. Utilizarea PCR are o sensibilitate şi specificitate de circa 91%; foarte utilă la
pacienţii pentru care s-a iniţiat dejaantibioticoterapia.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a,minim două
frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora.cu 5. Antibiograrna (testarea sensibilităţii tulpinilor izolate în vederea stabilirii tratamen­
albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram..Dacă LCR. este, franc purulent,frotiurile se pot tului) este recom andată şi se realizează de obicei prin metode difufcimetrice. în cazul unor
executa direct din p.p;, în caz,contrar realizării.iniţial.,centrifugarea LCR. Froţiurije se exa; infecţii grave antibiograma trebuie să fie însoţită de alte determinări (vezi capitolul 14).
minează la microscopul optic cu imersie ş i se notează .prezenţa celulelor inflamatorii (ex.
Îeucocite) şi prezenţa cocilor gram-negativi, dispuşi în diplo, reniformi, (mobili, înconju­ Neisseria gonorrhoeae
raţi de o structură capsulară comună, situaţi intra sau extraleucocitar. , Infecţiile gonococice continuă să reprezinte o problemă importantă de sănătate publică.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se După pătrunderea în organismul receptiv, Î 11funcţie de calea de transmitere, gonococu!
poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură; care se va identifica (vezi şi capitolele 9 se ataşează de mucoase (genito-urinarâ, oculară, rectală, faringiană etc) şi produce local o
şi 10). Meningococii sunt germeni pretenţioşi, care nu se dezvoltă pe medii simple, sunt aerobi, supuraţie acută. La bărbaţi apare uretrita gonococică. La femei, gonoreea se localizează
facultativ anaerobi. Se pot utiliza medii selective (ex. medii în care se include vancomicină, endocervical, dar se poate extinde, la nivelul uretrei, vaginului, glandelor Bartholin,
colistin, trimetoprim şi nistatin) sau neselective (ex. Mueller-Hinton, geloză-sânge sau geloză- trompelor uterine, Dacă mama are gonoree şi nou-născutul se naşte pe cale naturală, poate
chocolat) pe care formează colonii de tip S sau de tip M. Este necesară o atmosferă de 3-5% apărea oftalmia gonococică. Rareori gonococu! poate disemina pe cale sanguină (bac-
CO2, la o temperatură de 37°C. teriemie), cu apariţia unor leziuni dermice, artrite, tenosinovite gonococice etc.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere': Diagnosticul de laborator în gonoree
1 ■■. , ...... ,
• Caractere morfotinctoriale: Sunt coci gram-negativi, dispuşi în diplo, reniformi, imobili, Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic (direct).
înconjuraţi de o structură capsulară comună, nesporulaţi. 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regu­
• Caractere de cultură: Coloniile de meningococ sunt de tip S, cu dimensiuni de circa 1- lile cunoscute (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibio­
2 mm. Tulpinile încapsulate (ex. grupele A, C) pot conduce la apariţia unor colonii de tice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate
tip M. normele de asepsie şi antisepsie etc). La bărbat se prelevează secreţia u retrală (eventual
o Caractere biochimice: „picătura matinală"), iar la femeie recoltarea trebuie efectuată pe masă ginecologică de la
nivelul colului uterin şi glandelor Bartholin (vezi şi capitolul 6). Secreţiile au de obicei un
'• Metabolizează diferiţi carbohidraţi, activitate care poate fi utilă în identificare. Spre
aspect purulent. Este de preferat cultivarea imediat, pe medii de cultură potrivite şi în
exemplu meningococul metabolizează atât glucoza cât şi maltoza.
atm osferă de CO 2. în cazul în care p.p. urmează a fi transportat către laborator, transportul
• Produc citocrom-oxidază, un test cheie în identificare (vezi şi capitolul 12) trebuie realizat fără întârziere (la o temperatură apropiată de 37°C). Chiar şi în cazul uti­
• Există , o serie de sisteme comerciale pentru identificare .exoenzimatică a lizării mediilor de transport (ex. mediul Amies plus cărbune activat), acesta nu ar trebui să
Neisseriilor (ex. API, Quad Ferm+, RIM, Miniteketc). , , ..... ... dureze mai mult de 6 ore. Gonococul ar putea fi izolat şi prin hemocultură, cultivarea
• Caractere antigenice: în funcţie de structura lipooiigozaharidului există 12 serotipuri. secreţiilor conjunetivale, faringiene, cultivarea urinei etc. în cazul în care nu există nici o
Cel mai important determinant antigenic este capsula polizaharidică. Structura capsu­ secreţie, se poate utiliza Urina care trebuie centrifugată şi însămânţată im ediat pe medii de
lară permite subdivizarea speciei în 13 serogrupuri. Dintre acestea mai importante siint cultură.
grupele: A, B, C, Y şi W -135. 1/ . 2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a ,minim două
• Prezenţa meningococului poate fi detectată direct în produsul patologic prin latex frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu
aglutinare, coagiutinare sau contraimunoelectroforeză utilizând seruri polivalente albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic
anti-A, C, Y , W-135 şi respectiv seruri monovalente anti-B (se pot detecta 0,02- cu imersie şi se notează prezenţa celulelor, a celulelor inflamatorii (ex. îeucocite) şi
154 Diagnosticul de laborator în microbiologie Li Diagnosticul de laborator în infeefiile produse de Neisseria
155

prezenţa cocilor p kam-negsitivi, dispuşi în di'plo, rertiformi, imobili, înconjuraţi cîe o struc­ • Metodele biologiei moleculare au atât o specificitate cât şi o sensibilitate foarte bună;
tură capsulară comună, situaţi intra sau extraleucoeitar. se pot utiliza fie pornind de la culturi fie de la p.p.
3. Cultivarea pe mediii de cultură a produsului patologic se realizează în-aşa fel încât să * Sondele nucieotidice
se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi capi­
• PCR
tolele, 9: şi 1,0). Goiipcpcii- sţint germeni .foarte pretenţioşi,,care nu se, dezvoltă pe,rneclii .sim­
ple, sunt aerobi, facultativ anaerobi,.;Se, pQtsutiliza mediii selective (ex,v) medii, în, care se • IţCR (Ligase Chain Reaction); această metodă se poate utiliza pornind de la urină
includ®: y.ancomicina,,;coliştin,,,trim,etQprim §i ţiistatin) sau neselective (eţi imeţăul GC, , sau,,de la,secreţii yaginaieşŞHU'e un.singur.dezavantaj.'COSţui ridicat», , ;
geloz#sânge sau geloză-chocolaţcu, diferite suplimente iputritjve; se, tec,ontandă; utilizarea (>''> 5. Antibiogrnma (testarea .sensibilităţii tulpinilor izolate în vederea stabilirii tratamen­
pulberii de, hemoglobina şi nu a sângelui proaspăt), Eşţe preferată cultivarea „în dublu", pe tului) este recomandată:şij’se:reâlizează de obicei prin metode difuzimetrice (mediul utilizat
medii selective şi nesejectivefln câzuj 'în care p.p. esţe reprezentat ele secreţie de ia nivelul este GC suplimentat nutritiv clar fără pulbere de hemoglobină). Au fost identificate tulpini
rectului sau .de secreţie, iaringiană se vor, folosi .nunţiii medii selectiveiEste necesară o rezistente la penicilină (fie datorită unui plâsmid care codifică o fS-iactamază de tipul TEM,
atmosferă de 3-10% COa, la o temperatură de 35-37°C. Coloniile apar în 24-48 de ore. fie datorită unor imitaţii cromozomiale). Este'necesară testarea producerii de (3-lactămază
Gonococul produce colonii de tip S, cu dimensiuni de 0,5-1 mm s.au.cplqnij de .tip,Mi(,nepig­ (de ex»< folosind discuri cu nitrocefin). Determinarea;CMI se poate realiza prin metode cla­
mentate, transparente sau opace. Este de remarcat faptul că în aceeaşi placă pot apărea până sice .sau Pu ajutorul’testului E'(vezicapiloluN4).'-; >•'' ■
la cinci tipuri de .colonii (TI-Ţ5). Pitica eşte eliminată în cazul în care nu se dezvoltă colonii,
după 72 de ore, i ,, ; ,, .
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe bazamai,multor
caractere: ■ ■■ . .■ • : p ;.:
• Caractere morfotinctoriale: Surit coci gram-negativi, dispuşi în dipio, reniformi, i'mo-
. bili, eventual înconjuraţi de o structură capsulară comună, nesporuîaţi. Se poate utiliza
şi „coloraţia"fluorescentă; <• ^ ■1 , ; f . - ; -ri <
• Caractere de cultură: Coloniile de gonococ sunt de tip S sau M (vezi punctul 3).
/ .
• Caractere biochimice: ...... ...; ,v.j •
4 Metabolizează diferiţi carbohidraţi, activitate care poate fi utilă în identificare.
Gonococul metaboiizează glucoza dar nu şi maitoza,
• Produc citocrom-oxidază, un test cheie în identificare (vezi şi capitolul 12).
• Testul catalanei (superoxol) este intens pozitiv.
• Există o serie de sisteme comerciale pentru identificare exoenziinatică a Neisse-
riilor (ex. API, Quad Ferm+, RIM. Minitek, Gonochek II etc).
• • Utilizând galeria, API NH (manuală) putem identifica,specii ,de,jyeişşţiaa, Haemq-
philux şi Branheiimllq caiurrhali$,\n numai 4 ore.
• Caractereantigenice: ■/ ■ .*
• în funcţie de structura lipooligozahariduiui există 6 serotipuri.'Gonococii po't
exprima simultan mai multe structuri antigenic diferite, ceea ce trează probleme
tehnice. Aceste testări se realizează în centre de referinţă. 1: ■‘ "■■if
• Prezenţa gonococutui poate fi detectată direct în produsul patologie prin
coaglutinare (suspensie de S. aureus tip Cowan i stabilizată şi sensibilizată cu Ac
monoclonali antiproteină I din membrana externă a gonocodlor) sau printr-o
tehnică imunoenzimatică (cu Ac policlonali). j
• Se pot .utiliza Ac monoclonal! cunoscuţi, pentru identificare gonococttlui prin
tehnica inuinoiluorescenţei directe. 'I
Diagnosticul de laborator în infecfiiie produse de enferobacterii 157
0 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
2 O # ÎN INFECŢIILE PRODUSE DE ENTEROBACTERII Infecţiile enterobacteriene sunt destul de variate. Pot fi localizate la nivel digestiv (dizen­
terie şi sindroame asemănătoare dizenteriei, sindroame asemănătoare holerei, toxi-infecţii ali­
mentare etc), la nivelul tractului urinar, la nivelul aparatului respirator sau la nivelul sis­
temului nervos. Infecţiile enterobacteriene pot avea şi alte localizări sau poţ fi generalizate
, > ' ■' '•V-! V ••• i Vl (de ex. în febra tifoidă, febrele paratifoide, pestă).
•• .V .1 ;>'!»î'J*v ' MfjfO 0£>*l£: ' ?l J-r > i? în majoritatea infecţiilor produse de enterobacterii diagnosticul este bacteriologic, direct,
Familia Enterobactiriacecte Cuprinde tin impbftant nuM tide geriiiri'de microorganisme în febra tifoidă diagnosticul poate fi atât bacteriologic cât şi imunologie (serologic). Datorită
semnificative din punct de vedere medical(28) şiţriumeroase speqii (peste >IQQ,, îrfcazul în faptdlui că în multe dintre aceste infecţii produsul patologic este reprezentat de către mate­
care-nu luăm în considerare clasificarea genului Salmonellatn pesţe 200Q d e specîi). Dintre riile fecale, în continuare vom discuta examenul bacteriologic al materiilor fecale.
genurile incluse în această vastă familie, ,vom-aminti următoareie:. Escherichia, Shigella,
.Salmonella, Yersinia, Klebsiellai,Proteus, 0robacter,>Edwarsiellti,*Enterobacter, Morgane- C0PR0CULTURA
Hai Providencia şi Serratia. în capitolele, următoare, vom discuta numai, despre diagnosticul
în multe dintre infecţiile produse de enterobacterii, care se manifestă prin sindrom diareic,
în , infecţiile produse de microorganismele -i aparţinând , primelor ,6,; genuri; enumerate.
utilizăm coproculturu. în cele ce urmează vom discuta coproculturaîn general, nu numai din
Enterobacteriile sunt bacii! gram negativi care, nu,se. pot diferenţia-prin;microscopie,optică,
punctul de vedere al unei infecţii enterobacteriene.
mobili cu cili peritrichi (ex. Salmonella spp., Proteus spp.),."sau imobili (ex. Shigella,
Yersinia, Klebsiella), nesporulaţi; unele specii prezintă capsulă (ex. Klebsiella pneumoniae). Boala diareică acută
Sunt germeni nepretenţioşi care se pot multiplica pe medii simple, aerobi facultativ anae-
Boala diareică acută (BDA) a fost şi rămâne o entitate patologică foarte răspândită la nivel
robi, utilizează fermentaţiv glucoza cu sau fără producere de gaz, sunt oxidazo-negativi, mondial. Spre exemplu, în ţara noastră în ultimii ani, numărul de cazuri de boli diareice acute
catalazo-pozitivi, reduc nitraţii. Formează colonii de tip S, R (în cazul culturilor ,,vechi“) a fost de 85.055 în anul 2000, 81.268 în anul 2001 şi respectiv 97.317 în anul 2002, cu o
sau M (pentru speciile capsulate), pot fermenta lactoza (ex. Escherichia coli, Klebsiella) sau incidenţă de 446,5 °/nooo în 2002. în aceeaşi perioadă de timp, în fiecare an au decedat
sunt lactozo negativi (ex. Salmonella, Shigella, Yersinia). Pentru izolarea speciilor de ente-
datorită BDA circa 100 de pacienţi.
robacterii putem folosi medii selective, diferenţiale şi selectivo-diferenţiale. Există medii cu
selectivitate mai redusă care inhibă majoritatea bacteriilor gram pozitive şi permite dez- Sindromul diareic include eliminarea a peste 3 scaune în 24 de ore iar scaunele au con­
voltareâ tuturor enterobacteriilor (ex. mediul Mac Conkey cu săruri biliare în concentraţie sistenţa diminuată (până ia emiterea unor scaune apoase, cu pierderea a până la 20-30 litri/zi
mică; se poate adăuga şi cristal violet), medii cu selectivitate medie care inhibă multipli­ în holeră). Materiile fecale pot avea aspect patologic (apos, mucos, purulent, sanguinolent
carea Enterobacteriilor lactozo-pozitive (ex. mediul ADCL cu dezoxicolat, cltrat şi lactoză, etc), culoare modificată, miros, particular etc. De regulă sindromul diareic asociază şi alte
mediul Shigella-Salmonella cil săruri biliare şi verde briliant sau mediul XLD cu xifSză, Uzi­ semne şi simptome digestive (dureri abdominale, teesine, greaţă, vărsături etc) sau generale
nă şi dezoxicolat, preferat în multe dintre ţările Uniunii Europene) şi medii cu selectivitate (febră, stare generală alterată etc). Foarte important şi obligatoriu de reţinut este că BDA
înaltă (ex. mediul Wilson-Bîair cu verde briliant în concentraţie crescută). duce la pierderi de apă şi electroliţi iar intervenţia cea mai importantă care trebuie avută în
vedere este reechilibrarea hidroelectroliţicâ.
Caracterele biochimice sunt esenţiale pentru identificarea enterobacteriilor. După exami­
narea caracterelor de cultură, (pe mediile selectivo-diferenţiale se poate identifica şi comporta­ Agenţi etiologici
mentul în ceea ce priveşte fermentarea iactozei), prin repicarea coloniilor suspecte pe medii
potrivite (TS1, M1U/M1LF, Simmons etc), în zilia următoare se pot examina diferite carac­ Boala diareică acută poate fi de etiologie infecţioasâ şi neinfecţioasă. în continuare vom
tere biochimice (fermentarea zaharurilor, evidenţierea unui anumit metabolit, metabolizarea discuta pe scurt etiologia infecţioasă în general, nu numai cea bacteriană sau fungică. Este
unui anumit substrat, utilizarea căratului ca unică sursă de carbon, identificarea unor enzi- de menţionat că marea majoritate a BDA infecţioase au etiologie virală.
me etc) sau alte caractere fenotipice (ex. niotilitatea). în momentul de faţă există baterii de
Etiologia bacteriană include
teste şi sisteme comerciale care permit examinarea unei, game extinse de caractere biochi­
mice (ex. galeriile API). Dorim să menţionăm.că pentru fiecare test fenotipic există o serie • Salmonella spp.
de variaţii care sunt prezentate procentual în tabele special dedicate. .. j , • Shigella spp.
Un alt aspect foarte util pentru identificare este reprezentat de studierea caracterelor anti- • Escherichia coli (EPEC/enteropatogen, ETEC/enterotoxigen, EHEC/enterohemoragic,
genice folosind seruri cunoscute (preparatg pe animale de laborator), cu ajutorul diferitelor EIEC/enteroinvaziv, EAEC/enteroagregant, DAEC/aderent difuz)
reacţii Ag-Ac (vezi şi capitolele 15-20). Toate enterobacteriile deţin Ag O. Enterobacteriile • Klebsiella spp.
mobile deţin Ag H. Enterobacteriile capsulate deţin Ag K. Salmonella typhi prezintă şi Ag • aite enterobacterii (Yersinia enterocolilica, Citrobacter spp., Proteus spp. etc)
Vi, Yeninia pestis prezintă Ag FI etc; • Vibrio cholerde şi alţi vibrioni
Diagnosticul de laborator în microbiologie Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de enterobacterii
158

! • alţi bacili gram negativi -(Aerâinohad:spp4 Alâdligenes sppj Pseudoiiiolias spp. &tc) include acţiunea unei toxine este contraindicată administrarea de antibiotice sau chimiote-
• Bacillus cereus rapice antibaqteriene.
• Campylobacter jejuni ■ Indicaţiile coproculturii în bacteriologie
• Clostridiumpeifringenx, Clostridium difficile '' " ’ -ii ■-ii • "•
• Clostridium bvtuliniirn • atunci când este suspicionută o infecţie cu Shigella spp., Vibrio cholerae, E. coli (tipu­
: • Staphylococcus aureus etc.i-; ■!.. tir rile patogene), Campylobacter spp., Yersinia enterocolitica sau Salmoiîella spp. în
specia! la pacienţi cu vârste extreme sau imunodepresie'
Etiologia fungică include ‘
" • după circa .1 săptămână de la debutul febrei tifoide etc
• Candida albicans, (la pacienţi, cu S I p A ) , e t C t i i . - . » • •< v'lmm-;- ,o Si. :
• atunci când BDA prezintă riscul extinderii la nivelul unei colectivităţi (creşe, grădiniţe,
Etiologia parazitară include tabere, unităţi 'de alimentaţie publică, staţii de distribuţie a apei potabile etc)
■.!?> ' ■■■,.'ii lb ! .
/ » .atunci când BDA apare la pacienţi care ati fost trataţi cu antibiotice iar sindromul
• Giardia lamblia
'• Entamoeba'hystoUtica Entamoeba call' 1 ’ 1 1 ■ 1” '.’- diareic persistă şi după întreruperea anţibipticoterapiei. ,
• Tricliinella spiralis ’ • **' ' - v ;••• ' :: ■ i' • atunci când sindromul diareic persistă mai mult de o săptămână sau are loc o recădere
• Cryptosporidium parvum • în scopul verificării stării de sănătate a persoanelor care lucrează în unităţi de alimentaţie
• Strongvloides stercoralis etc. publică (conform normativelor stabilite de către ministerul sănătăţii)
‘ < .-i.
• în scop de cercetare etc.
Etiologia virală include
• rotavirusurije !i Recoltarea şi transportul materiilor fecale
• virusurile Norwalk şi asemănătoare virusurilor Norwalk ;'
Se. vor respecta recomandările menţionate în capitolul 6, în special faptul că recoltarea
:• calicivirusurile i . -i ■< ■■ . .. <■!' t p.p. trebuie să se realizeze înainte de administrarea de medicamente antimicrobiene. Se pot
• astrovirusurile . 1 ■; recolta şi examina:
• coronavirusurile . .
• scaunul emis spontan care reprezintă p.p. utilizat cel mai frecvent. Defecaţia are loc
• enterovirusurile ,, ........
într-un recipient de carton sau îiur-un container din material plastic de unică între­
• adenovirusurile etc.
[ ................................... ' buinţare (care poate fi apoi decontaminat şi eliminat fără probleme). în acelaşi timp
Gruparea agenţilor etiologici în funcţie de mecanismul patogenic efectuăm şi examinarea macro,scopică a p.p. din punctul de vedere al mirosului, culorii
sau aspectului. Utilizăm pentru prelevare linguriţa recoîtorului alegând porţiuni care
Atât din punct de vedere diagnostic cât şi, pentru tratament poate fi importantă elucidarea
permit cu o mai mare şansă izolarea agentului patogen'(fragmente mucopurulente,
tipului de mecanism im plicat Astfel, BDA ar putea fi produse prin: : , ;. ,
porţiuni cu sânge, flocoane riziforme etc) sau porţiuni diferite dintr-un scaun în care nu
• mecanism neinflamator, atunci când din punct de vedere microscopic în preparatul se remarcă aspectele menţionate anterior. Prelevăm o cantitate de aproximativ 1 gram
între lamă şi lamelă nu se evidenţiază leucocite (ex. BDA produse de Vibrio cholerae, pe care o suspensionăm în mediul de transport (minim 2 ml în cazul scaunelor apoase).
ETEC, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Giardia îdmbliâ, 'fotaViru-
• tamponul rectal este recomandat în cazul unei infecţii cronice cu Shigella spp., atunci
suri, virusuri Norwalk, Ciyptpsporidium parvum etc), .. ; '
când suspicionâni portajul de Shigella spp. sau Salmonella spp. Tamponul steril se
• mecanism inflamatori atunci când din punct de vederemicroscopic în preparatul între introduce cu blândeţe şi se prelevează secreţiile de la nivelul mucoasei rectale, prin
lamă şi lamelă' se- evidenţiază leucocite' polirriorlbnucleare (ex. BDA produşe db : rotire, pentru a recolta material din criptele rectale. Apoi introducem, tamponul în;
Shigella spp., EIEC, Salmonella enteritidis, Vibrio parahaemolyticum, Entqţnoeba ,. mediul de transport. Pentru a putea închide recoltorul, tăiem în mod corespunzător tija s
hystoliticci etc) ■v ,! tamponului.
• mecanism de „penetrare", atunci când dur punct de vedere microscopic-în'preparatul • sonda Nelaton-.se poate utiliza atunci când, urmărim recoltarea p.p. d e,la nivelul
între lamă şi lamelă se evidenţiază leucocite mononucleare (ex. BDA sau Vsindrom colonului sigmoid. Introducem cu blândeţe sonda până la nivelul dorii (circa 10-12 cm
'diareic produs de Salmonella typlti-, YirsiniirenterocoUt'lca etc). . 1d ■la copil şi respecti v circa 15-20 cm la adult), adaptăm la celălalt capăt al sondei o serin­
După cum se poate remarcă, simplă recoltare a produsului patologic urinată de realizarea gă şi aspirăm p.p. de la nivel sigmoidian. Introducem p.p. în mediul de transport.
uiiui preparat nativ (vezi capitolul 7) şi examinarea microscopică a acestuia pot da informaţii în cazul în care p.p. nu poate II prelucrat imediat sau în maxim 1 oră, utilizăm un mediu
importante cu privire la etiologia probabilă precum şi atitudinea terapeutică de urmat. Este de transport, transportul la rece (+4°C) sau transportul în mediu de transport menţinut la.
evident că într-o BDA pentru care agenţii etiologici suiit virali sau mecanismul patogenic
■I

160 Diagnosticul‘de laborator în microbiologie


28 Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de enterobacterii 161

4°C. Cel mai frecvent utilizăm, mediul Cary-Blair (vezi capitolul 9). Acest mediu asigură ■-jp' 3-5 colonii în cazul îti care pacientul este adult. în căzui în care nu există colonii Iactozo-
supravieţuirea enterobacteriilor patogene timp de 24-48 de ore, inhibând în acelaşi timp negative, pentru identificare vom repica (fără să atingem mediul de cultură) 10 colonii la
multiplicarea florei de asociaţie. Atunci când este suspicionată infecţia cu V. cholerae, apa copil şi respectiv 10 colonii la adult (dacă se consideră că identificarea este necesară, de ex.
peptonată alcalină serveşte în acelaşi timp drept mediii de transport şi m ediu'de 1îmbogăţire. în izbucniri epidemice de BDA).
Aşadar, după apariţia coloniilor izolate pe mediile selectivo-diferenţiale trecem ia iden­
Exam inarea m ateriilor fecale tificarea speciilor implicate patogenic pe baza caracterelor morfo-tinctoriaJe, de cultură
Materiile fecale sunt examinate macroscopic şi microscopic. Din punct de vedere micro­ (vezi capitolul 11), biochimice (vezi capitolele 11 şi 12), antigenice (vezi capitolele 11-20,
scopic, de fiecare dată se vor realizapreparaţe native,(între lamă şi. lamelă). Materiile fecale în special capitolul 17), de patogenitate, pe baza sensibilităţii la bacteriofagi şi eventual pe
sunt suspensionate într-o picătură de lugo! sau de albastru de m e t i l e n i a r preparatul se baza unor caractere moleculare. Pentru interpretare vom utiliza diferitele tabele disponibile
va examina iniţial cu obiectivul I0x, apoi cu obiectivul 40x. Spre exemplu.'evidenţierea a în tratatele de specialitate sau recomandările producătorilor în cazul utilizării unor sisteme
peste 40 PMN/câinp, însoţite de măcrolage şi hematii, conduce la suspicionaVea unei dizen­ comerciale de diagnostic. Pentru tulpinile considerate a fi implicate patogenic vom realiza
terii bacteriene. Frotiurile colorate pot fi utile în suspicionarea diagnosticului de enteroco- •î studiul sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice, de regulă prin metode difuzimetrice
lităcu Campylobacter spp. sau hi coliiCi pseudbmembranoaiîe; post antibioticoterapiC. (antibiograma difuzimetrică ,standardizată, comparativă, E test).
. ............. *■• : ■) ■' f Alte aspecte particulare urmează a fi prezentate în capitolele următoare.
Cultivarea m ateriilor fecale . ■.... i . jv Iu--- •ui--»:’
■■
‘Hi-.-' . .?•i> . • 7." .. • • •{( .. • ; .•«
în mod obişnuit, pentru cultivare vom-utiliza13-medii diferite,Respectiv o epriibetă cu
bulion selenit acid de sodiu şi 2 plăci Petri, una cu mediu cu selectivitate scăzută (exr Mac
Conkey) şi alta cu mediu cu selectivitate medie (ex. ADCL sau XLD). Aceste medii selec­
tive sunt în acelaşi timp şi medii diferenţiale. m '
Alegem fragmente caracteristice clin p.p. (mucus, puroi etc) şi însămânţăm,2-3 anse în
mediul cu bulion selenit (mediu de îmbogăţire în special pentru Salmonella spp.). Realizăm:
o suspensie omogenă în mediul lichid. Prelevăm o ansă (sau o picătură) din suspensie şi o
depunem pe mediul MacConkey. Modul de însămnnţare diferă de cel prezentat în capitolul
10. întindem p.p. în striuri paralele pe o jumătate de placă, până aproape de marginile plăcii
fără să/le atingem. Fără să sterilizăm ansa, atingem ultimile 3-4 striuri şi dispersăm p.p. în
alte striuri paralele, perpendiculare pe primele, pe jumătate din mediul.disponibil, până
aproape de marginile plăcii, fără să le atingem. Atingând din nou ultimele 3-4 striuri, dis­
persăm p.p. în mod similar pe mediul încă neînsămânţat. Incubăm timp de 18-24 de ore la
35-37°C.
în ziua următoare examinăm plăcile însămânţate precedent în vederea selectării colonii­
lor suspecte. Apoi, pornind de la tubul cu bulion selenit însămânţăm aşa cum am menţionat
mai sus o placă cu MacConkey ,şi o placă cu ADCL (sau XLD);.incubăm aceste plăci timp
de 18-24 de ore la 35-37°C. , ,
Pe mediul MacConkey coloniile lactozo-pozitive au dimensiuni de 1-3 mm, sunt roşii,
pot prezenta un halou opalescent, de regulă sunt de tip S dar pot fi şi de tip M. Coloniile lâc-
tozo-negative au dimensiuni de 1-2 mm, nu sunt colorate, sunt transparente, de regulă sunt i
de tip S. '• fain,: !j ■
Pe mediul ADCL majoritatea bacteriilorîactozo-pozitîve sunt inhibate; pot apărea tai/div
colonii de dimensiuni mai mici, roşii, de tip S. Coloniile iactozo-negative au dimensiuni de 1-
2 mm, nu sunt colorate, sunt seini transparente, de tip S; dacă produc H2S centrul coloniei
. -l
este de culoare neagră. .y* . .. ■■: ■ ">■ ' • ' ■
De regulă urmărim apariţia coloniilor Iactozo-negative, iar pentru etapele de identificare
vom repica (fără a atinge mediul de cultură) 3 colonii în cazul în care pacientul este cppil şi
Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Escherichia coli \(,3
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
9 • ÎN INFECŢIILE PRODUSE DE ESCHERICHIACOLI recolta şi lichid de vărsătură sau un anumit aliment incriminat. Materiile fecale se examinează
macroscopic şi se trimit către laborator aşa cum am menţionat în capitolul precedent. în con­
tinuare vom discuta diagnosticul unei infecţii produsă de EHEC (ex. 0157.H7) dar, subliniem
'■ i ■■ .. it •! faptul că în practica medicală, pornind de la p.p. reprezentat de materiile fecale, putem izola
orice microorganism implicat etiologic în BDA, după caz; Materiile fecale pot avea aspect
: ;:-rn '.ij'liJ hemoragie iar la examinarea microscopică a p.p. putem observa prezenţa unor lambouri de
mucoasă epitelială. Transportul se va realiza aşa cum am menţionat în capitolul nr. 28.
După ce o serie de date sugerau asemănarea din punct de vedere molecular între speci­
, 2. Examinarea microscopică â produsului patologic include realizarea preparatului nativ,
ile genurilor Escherichia şi Salmonella, cunoştinţele actuale pledează pentru o grupare a
între lamă şi lamelă; remarcăm prezenţa hematiilor şi leucocitelor PMN.
speciilor din genurile Escherichia şi Shigella. Cu toate acestea, Vom prezenta în continuare
separat diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganismele aparţinând 3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să
genurilor „clasice". Genul Escherichia cuprinde germeni comensali care se găsesc ubicvitar se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi capi­
(în apă, pe sol, etcf iar la nivelul intestinului'uman au rol în sinteza unor vitamine'‘(sim­ tolul nr. 28). în vederea izolării EHEC, pe lângă mediile menţionate în capitolul precedent
bioză). Sunt bacili gram negativi'mobili sau imobili, aerobi facultativ ânaerobi, lâctbzo poizt- se recomandă utilizarea mediului MacConkey cu D-sorbitol, deoarece spre deosebire de
tivi. Specia tip este reprezentată de Escherichia coli. 4 , [ : ’ l : ; ; :: majoritatea tulpinilor de E. coli EHEC nu fermentează' sorbitolul (sau îl fermentează tardiv),
în acest sens, coloniile suspecte, repicate (fără a atinge mediul) în vederea identificării vor
Cu toate că majoritatea tulpinilor de E. coli sunt saprofite sau condiţionat patogene (fiind
fi necolorate, cu dimensiuni de 1-3 mhi; de regulă de tip S (coloniile sorbitol-pozitive vor
implicate în infecţii oportuniste cu localizări în afara tractului digestiv, spre ex. peritonite,
avea o culoare roz). '
colecistite, infecţii ale plăgilor, endomelrite, pneumonii etc) există şi anumite tulpini dotate
cu caractere patogenice particulare. Dintre aceste tipuri de E. coli (patotipuri) se disting trei 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
grupări mai importante: caractere:
• tipuri patogene implicate în boli diareice acute (BDA) • Caractere morfolinctoriale: Sunt bacili gram-negativi.
• E. coli enteroagregativ (EAggEC) implicat în apariţia unei BDA apoase, persisten­ • Caractere de cultură:
tă, cu mucus, în special la sugari • Produc colonii de tip S cu caracterele menţionate mai sus.
• jE, coli enterohemoragic (EHEC), spre exemplu serotipul 0157:H7, care elabore- • Caractere biochimice şi de mobilitate (pentru EHEC se vor examina la nivelul centrur,
/ ază două citotoxine şi este implicat în apariţia unei BDA apoasă, care poate deveni lui de referinţă, neceşitând măsuri suplimentare de siguranţă):
! severă şi se poate însoţi de o complicaţie gravă, sindromul hemolitic uremie • Fermentează glucoza (cu producere de gaz), sunt lactozo-pozitivi, nu fermentează
• E. coli enteroinvaziv (E1EC) care elaborează una sau mai multe enteroxine pro­ (sau. fermentează tardiv) sorbitolul, nu produc H2S
ducând un sindrom dizenteriform • Pot produce îndoi, sunt urează-pozitivi, mobili (dar există şi tulpini imobile) etc.
• E. coli enteropatogen (EPEC) care determină diaree la copilul mic, uneori de gra­ • Se pot folosi mediile multi-test convenţionale (TSI, MlU/MiLF) sau galeriile
vitate maximă (ex. diaree malignă la nou născut) multi-test API 10 S, API 20-E, API Rapid 20 E sau alte variante
• E. coli enterotoxigen (ETEC) cure elaborează două enterotoxine (termolabilă şi ter- • Alte teste ce pot fi studiate în scopul identificării germenilor:
mostabilă) şi produce un sindrom holeriform
• Testarea caracterelor antigenice: Ag somatice pot fi identificate prin reacţii de
• E. coli aderent difuz (DAEC) care produce diaree apoasă, persistentă, la copii în aglutinare sau latex aglutinare (se pot utiliza şi seruri monovalente anti 0157 şi
vârstă de 1-5 ani respectiv anti H7); toxinele pot fi identificate prin tehnici de tip ELISA, latex
• tipuri (grupuri) patogene implicate în infecţii ale tractului urinar (ITU) aglutinare, latex aglutinare pasivă inversată (VET-RPLA), sau prin seroneu-
• tipul patogen implicat în infecţia meningeală la nou născut. tralizarea efectului citotoxic pe celule Vero
Indiferent de localizarea infecţiei, diagnosticul de laborator microbiologic este bacterio­ ' • Testarea caracterelor de patogenitate: EHEC produce enterocolită hemoragică
logic, direct. j letală la purcel; se poate studia efectul citopatic pe celule Vero'
• Teste de biologie moleculară (PCR, detectarea genelor de patogenitate pornind de
Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu localizare digestivă la p.p. sau de la coloniile izolate pe MacConkey cu D-sorbitol).
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regu­ 5. Antibiograma este recomandată de regulă numai pentru supravegherea apariţiei fenome­
lile cunoscute. Produsul patologic este reprezentat de obicei de scaunul diareic dar am putea nului de rezistenţă la antibiotice şi chimioterapice; se realizează prin metode difuzimetrice.
,164 Diagnosticul de laborator în microbiologie
Diagnosticul de laborator în infecfiile produse de Escherichia coli 165

UROCULTURA : (ţlln-
uretrale sau ale colului vezical, compresiune uretraiă în timpul sarcinii, corpi străini, calculi
Tractul urinar este în mod normal necontaminat, în schimb uretra distală poate prezenta urinari, cateterizare urinară etc), refluxul vezico-ureteral, alţi factori funcţionali.
o floră microbiană foarte variată, fiind contam inată cu.microorganisme provenind din,zona Microorganismele mai frecvent implicate în producerea unei infecţii a tractului urinar sunt în
genitală sau de la nivelul colonului. Dintre aceste microorganisme,putem, jzola,de, la nivelul ordine descrescătoare E. coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae,
uretrei distale stafilococi coagulnzo-negativi, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Proteus ' vulgaris,
difteromorfi, enterococi, streptococi, neis,serii saprofite, Mycoplasma spp^Ureplqsma spp. Citrobacter freundii, Citrobacter diversus, Enterococcus Jaecalis, stafilococii coagulază-nega-
sau Fusobacterium spp. La acelaşi nivel ai; pufea fi identificate şi tu|pini(.dţCcindida spp., tiyi. Adenovirusurile pot determina cistite hemoragice' la copii. Mai rar, în ordine descrescătoare
i-ll i - A o n o ! n o n iss a ra m nAtrsifriV/i îi n u A r /S K î,-1 Iri n iu p n - etiolbj|ia ITU poate fi reprezentată de Staphylococcus aureus, Acin’etobacter calcoaceticus',
streptococi (3-hemolitici din grupele A, B, C sau G, Morganella morgani, Provklencia rettgeri,
explică mdtivdî pentr P. stuartil, Serratia liquefaciens; Serratia marcettcens, Candida albicans, Salmonella spp.,
. [. ■ vt-iîlo.'-.i. i . ' i s u t - o .r;;iti> 15;.,, Corynebucterium urealyticum. Cu privire ia E. coli, cel mai frecvent microorganism implicat în
tativă.
.;i ITU, există anumite grupuri uropatogene, spre ex. O l, 02; 07 etc. în mod cert, există diferenţe
Cu toate ,că indiferent' de grija cu cţire vom ,recolta p.p.iţurinaj. acesta^a fi contaminat,
p'rin aprecierea.cantitativă ă.numărului,de,unităţi formatoare,de ,colpnii„ţn,urina'proaspijţ în ceea ce priveşte etiologia ITU. pe grupe de vârstă, în funcţie de sex sau ia pacienţii spitalizaţi
recoltată, „din mijlocul jetului",: pptenpăprecizăm dacăpacientLil.are.sau,nu infecţie urjnarăi în comparaţie cu pacienţii pentru care se solicită urocultura în ambulatoriu.
Mai multe studii.au,arătat,că aţunci când se, demppstrează prezenţa,a,105,bacterii/mj, aceas­ Recoltarea şi transportul produsului patologic
ta indică o infecţie a tractului urinar (ITU) în aproximativ 80% dintre cazuri întinrp ,ce,p
valoare de 104 bacterii/ml indică ITU în mai puţin de 30% dintre c a z i i t i . j : £ în ITU se pot recolta urină, sânge (ex. în pielonefrita acută) sau chiar şi LCR. în contin­
uare vom discuta despre recoltarea şi transportul urinei,
Datorită acestor rezultate, în practica medicală se consideră că ne aflăm în situaţia unei
ITU atunci când numărul de bacterii/ml• urină /•este > 105/ml. •; ; în afară de recomandările generale menţionate anterior, trebuie să subliniem unele
».ll'», t-<•J■ • • •
aspecte-particulare ' H
Cu toate acestea, dorim să subliniem că interpretarea rezultatului ,nu trebuie realizată
mecanic şi decizia finală în ceea ce priveşte identificarea bacteriei, efectuarea testării sensi­ • în cazul în care nu se poate recolta prima urină de dimineaţă, trebuie aşteptat pentru
recoltare 3-4 ore după micţiune
bilităţii la antibiotice şi respectiv redăctdrea buletinului de analiză ar trebui să fie luată având
în vedere aspectul macroscopic 'al urinii (ex. purulent); rezultatul exameriului microscopic • Recoltarea se realizează după spălarea cu apă şi săpun a organelor genitale şi a peri-
al sedimentului urinar (ex. prfeenţa de‘PlvîNjimumăful de unităţi'forinâtbare de colonii/ml neului; există recomandări specifice pentru sexul feminin şi masculin şi respectiv pen­
urină şi elemente clinice (ex. disurie. micţiuni mai frecvente, febră), cualte cuvinte Colabo­ tru copilul mic
rarea între clinică şi laborator este esenţială. Spre exemplu, în cazul unor elemente suges­ • Este preferabil ca recoltarea să aibă ioc într-un spaţiu corespunzător în apropiere.de
tive, chiar dacă numărul de bacterii este de 104/ml, putem lua decizia-să.repetăm urocultura, laborator, iar personalul medical trebuie să explice şi eventual să asiste recoltarea
iar izolarea aceleiaşi bacterii poate indica prezenţa ITU.,Pe.de altă parte, izolarea a.peste IO4 • Este contraindicată recoltarea urinei la domiciliu (pot exista erori de recoltare iar pre­
unităţi formatoare/ml în cazul stafilococilor sau (evurilor .este luată în considerare, iar lungirea timpului de transport va conduce la multiplicarea bacteriilor, aşa cum am
prezenţa în urină a Listeria monocytogenes la femeile însărcinate sau prezenţa în urina a menţionat mai sus); după recoltare, în cazul în care urina nu este prelucrată imediat
Salmonella typhi sunt semnificative indiferent’<ie număr ui UFd/ml. , (sau în cel mult 30 de minute după recoltare), p.p. trebuie menţinut la temperatura
Pentru a sublinia încă!o dată importanţa etapei ;de recoltare şi transport â urinei..amintim fapj- frigiderului iar transportul trebuie realizat ia +4°C
tul că urina reprezintă un foarte'bun mediu de cultură penti;u majoritatea bacteriilor care pot con­ • De regulă se recoltează urina „din mijlocul jetului"; după spălarea organelor genitale şi a
tamina p.p., iar o probă de urină care are iniţial (în momentul recoltării) f O3 bacterii/ml, după 2 perineului, prin micţiune se elimină circă 100 ml urină (îndepărtând astfel o parte a ger­
ore la temperatura camerei va conţine K)5 bacterii/ml. ' -..ru, . . i .• .••!:•[} 1 | menilor de Ia nivelul,uretrei distale) şi abia apoi se recoltează 20-50 ml (preferabil 50 ml)
Clasificarea ITU se poate, face după, mai multe criterii., ITU joase includ cistita;dar după urină în recipientul steril, după care micţiunea continuă
unui autori şi uretrita, prostatita şi epidjdiniita. ITU înalţe includ pielonefrita aquţă, necrpfea • Există şi alte tehnici de recoltare, neinvazive sau invazive (puncţie şi aspiraţie supra-
papilară (complicaţie a pielonefritei acute sau care poate apărea în absenţa infecţiei), abcesul pubianâ, cateterizare uretraiă, cu riscurile respective),
renal sau pielonefrita.cronică'ţdiîpă unii autori)'. Invazia tractului urinar poate avea Ioc pe cale
E xam inarea macroscopică şi microscopică a urinei
ascendentă, limfatică său heinatogenă.1 * 1' ‘ .
•. • , • i; ‘ ■•.i Cjî‘*■}..(^1{*t • Ţjtî ‘ /"
Există o serie de factori care favorizează apariţia 1ŢU, dintre care amintim: obstrucţiile Realizăm iniţial examenul macroscopic; p.p. poate fi tulbure, opalescent, poate prezenta un
care duc la stază urinară (adenom sau carciiiom de prostată, tumori.'de vecinătate,‘stricturi anumit miros etc. în vederea examenului microscopic al urinei omogenizăm urina prin „răs-
(

166 Diagnosticul de laborator în microbiologie Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Escherichia coli 167

turnare", de 2-3 ori. Punem o picătură de urină pe lamă, acoperim cu o lamelă şiexaminămcu • Izolarea a trei bacterii diferite, chiar şi în cazul în care concentraţiile pentru fiecare în
microscopul cu imersie (sau microscopul cu contrast de fază)., în:cazul în care identificăm parte depăşesc 10-Vml de urină, impune repetarea analizei; extrem de probabil este
prezenţa a cel puţin unei bacterii. pe fţecafe cârnp,,în fiecarp, dintre,5 ^âmpuri, succesive, putem vorba de o contaminare sau de un p.p. recoltat cu mai mult timp în urmă şi menţinut
cu o bună aproximaţie să, considerăm că aveni o bacteriurie.de, 10? bacterii/ml. Alternativ se ■la temperatura camerei şi nu la frigider
poateuţiliza preparatul'colorat.Gram.i Este, necesşrsăapreciem.concomitenţ,§i. prezenţa piuriei • Izolarea unei bacterii cu o concentraţie de !04/ml de urină conduce !a recomandarea
i
(peste 10 leucocjte/mtţi3' de prină^Â u fost .imaginate ,q serie de alte teste pentru aprecierea repetării analizei (există şi unele excepţii, în care rezultatul este considerat pozitiv,
pi^«uşi,',bt«te4un^L spre exetp^ju.ftMtul spre ex. pentru levuri în concentraţie de peste 104/ml de urină, stafiiococii coaguiazo-
razei leucocitarej teste,bioIuminiseenteptc' .Piuria,şi bacteriuria trebuie inţerpţetaţe'încontex­ negativi în concentraţie de peste 5 x l0 4/ml de urină etc)
tul clinic., i i ; . ■.. ,..\k u .şr. ;■v« :Ş> rrj+i: ni!; '0'i!ilornrr!..,ţ i , ■ i::ăt •. • Lipsa multiplicării bacteriene sau dezvoltarea de UFC în concentraţie de 103/ml de
;.,i Examenul sedimentului urinar .permite vizualizarea de celule epiteliale (malpighiene, urină reprezintă o urocuîtură negativă
vezicule, uretrale etc), celule sanguine (leucoeite, hematii),.cilindrii urinari (hialini, leucoci- • Dorim să subliniem din nou că rezultatul microbiologic trebuie să fie analizat în con­
tari,;eritrocitari,'-.epi tel i aii,' granulaţi etc:), cristale urinare, levuriufeventuaLînrnuguriteVcu textul clinic şi corelat cu rezultatul microscopiei iar în cazul anumitor bacterii (ex.
blastoconidii),.Trichomonas•vaginalis etc; examenul sedimentului urinar este fqarte util şi Salmonella typhij rezultatul este pozitiv indiferent de concentraţia UFC/ml de urină.
trebuie realizat de fiecare dată., •i mmr, '• 'l ,:e în jisw » ' . >>•
în cazul unei uroculturi pozitive, bacteria izolată se identifică (pe baza caracterelor morfo-
Cultivarea urinei tinctoriale, de cultură, biochimice, alte caractere) şi se testează sensibilitatea la antibiotice şi
chimioţerapice, de regulă prin metoda difuzimetrică (vezi capitolul 14).
în mod obişnuit, .pentru cultivare putem utiliza 3-4 medii diferite,.Din motive:deEco­
nomie am putea însămânţa o jumătate de piacă cu mediu MacConkey,(fără cristal violet),,o Există o serie de încercări pentru optimizarea diagnosticului ITU, inclusiv abordarea
jumătate de placă cu geloză-sânge şi câte un sector de placă cu mediu agar telurit şi respec­ unor tehnici miniaturizate. Dintre acestea vom aminti metoda imaginată în Institutul de boli
tiv agarcu eozină şi albastru de metilen (EMB) în cazul în care examenul ,microscopic al infecţioase „Matei Ba!ş“ (prof. Florin Cărunţii), metoda „Uriline“ etc. Spre exemplu ultima
urinei este pozitiv. Dacă examenul microscopic este negativ, însămânţăm doar o jumătate dintre metode utilizează o lamă de plastic acoperită pe ambele părţi cu mediu de cultură,
protejată într-un tub de plastic.
de placă Petri cu mediii MacConkey. ‘ ..
O variantă de însămânţam pentru mediile MacConkey şi geloză-sânge este utilizarea unei Principiu
anse calibrate d e : 1' ţii cu ajutorul, căreia prelevăm urină prin atingerea suprafeţei p.p, după Mediul CLED de pe prima parte a lamei (Cysteine - Lactose - Electrolyte Deficient agar)
omogenizare. însămânţăm iniţial un striu pe centrul jumătăţii‘de placă după care întindem are culoare verde şi permite numărarea coloniilor bacteriene (indirect a numărului de
p.p. în striuri paralele, perpendiculare pe primul striu. în final fără sterilizăm ansa întindem UFC/mi urină) şi identificarea prezumtivă. Concentraţia scăzută de electroliţi inhibă invazia
p.p în striuri paralele în unghi de. 45 faţă de striurile precedente: După o incubarc de 18-24 Proteus spp. Mediul MacConkey fură cristal violet de pe a doua parte a lamei are culoare
ore la 35-37°C,'înmulţind cu 1000 numărul de UFC dezvoltate, putem' aprecia care este roz; inhibă majoritatea bacteriilor gram pozitive.
numărul de bacterii/ml de urină. !•••
Tehnica de lucru
Frecvent este utilizată înşămânţarea urinei după diluare (ex. 1/100) cu ajutorai pipetei gra- (
date. însămânţăm de ex. pe o placă cu mediu MacConkey 0,1 ml de urină diluată 1/100, Deştirubăm capacul şi extragem iama iară să atingem, suprafaţa agarului. Imersăm lama în
incubăm în' condiţiile cunoscute şi după apariţia coloniilor calculăm numărul de bacterii/ml prin proba (je urină recoltată (dacă urina nu este suficientă cahţitativ, repartizăm p.p. pe cele 2 părţi
înmulţirea numărului de UFC x inversul diluţie x inversul volumului însămânţat. '1 j ale Jaijjgi cu ajutorai unei pipete Pasteur). îndepărtăm excesul de urină pe o hârtie de filtru
curatăl$rptmem la ioc în dispozitiv lama însămânţată. Injjubăni în poziţie dreaptă, timp de 18-
Interpretarea rezultatelor uţoculturii.cantitative .,.. 24 o rela 35-37°C. A doua zi citim rezultatele, comparând numărul de colonii apărute pe me­
diul CLED cu modelul producătorului.
• Izolarea unei bacterii cu o concentraţie de peste lO-Vnil de^urină confirmă ITU la băr­
bat sau la femeie (cu simptome caracteristice); în cazul că pacienta este asimtomaticâ, In terp retare
certificarea. ITU este dată de izolarea aceleaşi bacterii în a doua probă de urină,, ,f în cazul în care numărul de UFC/mi este mai mare de IO5 realizăm teste suplimentare
• Izolarea a două bacterii diferite,'fiecare cu o concentraţie de peste 105/tnl de1urină, pentru identificare şi respectiv antibiograma. Alte elemente privind interpretarea au fost
impune repetarea recoltării şi însămânţării; în cazul în care rezultatul este similar şi prezentate anterior.
pentru a doua probă de urină este posibilă ITU mixtă (îri caz1contrar este o foarte
Control de calitate
probabilă contaminare) • ! : -■
• Pregătim o suspensie baeteriană în soluţie salină fiziologică sterilă cu 105-I06 bacterii
pe mi din fiecare dintre tulpinile de referinţă
(
168 Diagnosticul de laborator în microbiologie
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
• Staphylococcus aureus ATCC 25923 » ÎN INFECŢIILE PRODUSE MICROORGANISME
• Escherichia coli ATCC 25922 DIN GENUL SH IGELLA
• Proteus mirabilis ATCC 12453 ...
o Inoculăm suspensiile astfel pregătite pe suprafaţa mediilor de cultură; ţJriline, iar după
18-24 ore incubare,citim şi interpretăm rezultatele ..., ,-a *
• Staphylococcus aureus: apar colonii, doar.pe mediul CLED.Fermenţarea;lactozei este
indicată de.prezenţa culorii ■galbene în jurul coloniilor dezvoltate. . .
• Escherichia coli: apar colonii galbene pe CLED şi colonii roz pe MacConkey. ■Genul Shigella ar trebui să facă parte conform studiilor de biologie moleculară dintr-un
• Proteus mirabilis: apar colonii translucide iar culoarea CLED este albastră; pe Mac gen care include şi Escherichia spp., genul Escherichict-Shigella. Actualmente este accep­
tată tratarea separată a celor două genuri înrudite. Ffe bâza structurii antigenice au fost dife­
Conkey apar colonii incolore. , . .. .
renţiate patru subgrupe (A-D) respectiv Shigella clysenteriae (13 setotipuri), S.'flexneri (6
... '[ ■. .■y' . -v i: *S* 1,. h ■i > :i ?tK'' .-H ' ' serotipuri care se pot subdiviza în sub-serotipuri), S. boydii (18 serotipuri) şi S. sorinei (1
serotip cu 2 faze sau variante, respectiv R şi S). ■ • .
, Genul Shigella include bacili gram negativi, imobili, cu dimensiuni de 0,5-0,8pm/2-3 pm,
nesporulaţi, necapsulaţi, aerobi facultativ anaerobi, glucozo pozitivi fără producere de gaz
oxidazo negativi, lactozo negativi. Subgrupele se pot diferenţia de ex. pe baza fermentării
manitei (subgrupui A este mani to negativ). Cresc pe medii simple şi produc colonii de tip S
în 24 de ore.
Microorganismele din genul Shigella sunt patogene prin multiplicare şi invazivitate. în
cazul serotipului 1 din subgrupui A (Sh. sluga) este implicată şi toxigeneza. Exotoxina shiga
afectează atât intestinul cât şi sistemul nervos central (putând; conduce, la apariţia unor
fenomene de meningism sau chiar pierderea stării de conştienţă, până la comă). Faţă de ani­
*iS malele de experienţă are efect letal.
Infecţiile cu Shigella spp. sunt de regulă limitate la nivelul tractului intestinal. Dizenteria
poate apărea după ingestia a numai 10-100 de bacterii, care se localizează, se multiplică şi
invadează epiteliul intestinal (pot apărea abcese la nivelul peretelui intestinului gros, la
nivelul ileonului terminal, abcese care evoluează spre ulceraţie, necroză, hemoragie). După
o perioadă de incubaţie de circa 2-5 zile, în cazul unei dizenterii tipice apar brusc febră, dia­
ree apoasă, dureri abdominale intense. Ulterior se elimină scaune foarte numeroase (20-
40/zi), nefecaloide, cu mucus, puroi şi sânge, însoţite de colici intestinale şi tenesme rectale.
Starea generală se înrăutăţeşte (mai grav în cazul unei infecţii produse de Sh. shiga). în lipsa
tratamentului corespunzător (în special în lipsa reechilibrării hidro-electrolitîce) evoluţia
poate fi fatală. în afară de dizenterie, Shigella spp. poate produce şi toxiinfecţii alimentare
de tip infecţios.
Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic (direct) şi trebuie făcut
de urgenţă datorită implicaţiilor posibile ale unei dizenterii.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând re­
gulile cunoscute (vezi capitolul 6), în s'pecial recoltarea cât mai rapid după'debutufbolii şi
înainte de iniţierea antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat de m aterii fecale; dar
s-ar putea recolta, şi lichid de vărsătură. La începutul bolii este mai uşor să. izolăm bacteria
patogenă, deoarece iniţia! .se elimină circa 103- IO9 bacterii/gram de materii fecale. Din
punct de vedere macroscopic materiile fecale pot fi în cantitate mică, conţinând mucus,
puroi şi sânge (uneori sângele nu este vizibil macroscopic). Recomandăm recoltarea şi cui-
170 Diagnosticul de laboratoei ... microbiologie Diagnosticul de laborator în infecfiile produse de Shigella 171

tivarea în special a fragmentelor care conţin iiiucus, puroi şi sânge:. Transportul trebuie să din respectiva tulpină, pe care o menţinem-timp de 30-60 minute la o temperatură
fie realizat rapid,'-dar eăle'-'pttsferabilli•‘ftisamânjtti«ârla' patul bolnavului. iDacă această reco­ de 100°C şi ulterior repetăm reacţia de aglutinare
mandare nu poate fi urmată, recomandăm folosirea unui mediu de transport, mediul bacte­ • Testarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza în studii epidemiolo-
riostatic Cary-Biair. O altă variantă de recoltare posibilă (de ex. în cazuri atipice, sau.pentru gice sau în scop de cercetare, fiind rezervată laboratoarelor de referinţă; schemele de
controlul stării de „purtător") este reprezentată de utilizarea sondei Nelaton introdusă în lizotipie au fost utilizate în special pentru S.flexneri 2a şi S. sonnei
colonul sigmoid (10-12 cm la copil sau 1.5-20 cm la adult) aspirând p.p. cu ajutorul unei
* Alte caractere/teste utilizate în identificare ia nivelul centrelor de referinţă:
seringi. Materiile fecale se vor suspensiona în,soluţie cloruro-sodică sau în mediul Cary-
Blair. Există şi posibilitatea de a recolta p.p. prin rectosigmoidoscopie. • teste biochimice suplimentare (biotipie)
2. ExaminareaMicroscopică a produsului patologicincludeyrealizafea‘!unui preparat '■ ■ • bacteriocinotipie (ex. pentru S, sonnei)
pjrbaspftt' în,tre. l&rnSV*""iameia ‘.^’n u; fi^duH’''dm'_'âcesţ tip' cîe proidusiii' patologic, în • rezistotipie (tipare prin patern-ul rezistenţei Ia antibiotice), utilă în scop epidemio­
cazul în care suspectăm o infecţie ca'SHigellajpp.). Preparatul se examinează'la|micro­ logie
scopul optic cu obiectivul 4Qx. Evidenţierea a numeroase PMN vine în sprijinul stabilirii ; ’ • testul Sereny (producerea cheratocoiijunctivitei la cobai); repicăm colonia suspec­
mecanismului bolii diareice, iar un procent de peşţe 75'°/o PMN însoţit de prezenţă hematii­ tă pe gelozu înclinată iar.după 8 ore, introducem o ansă de cultură sub pleoapa ţinui
lor este sugestiv pentru dizenteria bacteriană. Anumiţi autori recomandă utilizarea imuho- cobai; după 12-24 ore în cazul unei reacţii pozitive apare congestie conjunctivaiă,
fluorescenţei directe; examenul este costisitor în special datorită1existenţei numeroaselor secreţie purulentă şi opacifiere a corneei cu accentuarea acestor fenomene şi evo­
serotipuri. ; ' ” 1 luţie spre cheratoconjunctivită (testul poate fi pozitiv şi în cazul unor tulpini de
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa;fel încât să Escherichia coli) ' ■
se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifică (vezi şi capi­ f tehnici ale biologiei moleculare (stabilirea profilului plasmidic, ribotipia, sondele
tolele 9 şi 10). Se vor utiliza mediile de cultură recomandate, prezentate în capitolul 281 ADN etc).
Shigella se dezvoltă pe mediile slab şi moderat selective şi nu se multiplică pe mediile înalt 5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii ia antibiotice şi chimioterapice) se realizează
selective. în cazul apariţiei unor colonii lactozo negative, repicăm 3-5 colonii izolate pe prin metoda difuzimetrică standardizată, în special în scopul supravegherii apariţiei unor
mediile multitest (TS1, M ili' M1LF) sau procedăm conform protocolului d e’lucrii pentru tulpini rezistente la» medicamentele antimicrobiene dar şi pentru stabilirea tratamentului
galeriile tip API. 1 !" " ’ ’• 'A 'Ji' ’ antimicrobial! corespunzător.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere: ' .' ’
• Caractere morfotinetoriale: Sunt bacili gram-negativi cu cu dimensiuni de 0,5-0,8 pm/
2-3 pm;
• Caractere de cultură: . .... ,,
• produc colonii de tip S, lactozo negative, semitransparente, cu diametrul de 1-2 mm
pe MacConkey sau ADCL (S. sonnei poate produce colonii care devin roz deoa­
rece poate fermenta tardiv, lactoza) şi roşii pe XLD
• Caractere biochimici şi de mobilitate: ■ 1 - a:
• se pot investiga analizând rezultatele obţinute pe mediile multitest sau pe galeriile
API; caracterele biochimice sunt utile şi în diferenţierea subgrupelor genului !
• microorganismele clin genul Shigella sunt,giucozo pozitive, fără producere de gaz,
lactozo negative, nu produc H2S, imobile, urează negative, indol negative- 7
• pot fi necesare, teste biochimice suplimentare .j
• Caractere anţigenice: • 7
• se utilizează seruri imune polivalente pentru subgrup sau seruri imune'specifice ide
tip, prin reacţii de aglutinare pe iarnă, conform unor scheme stabilite ■
• în cazul. în care o tulpină izolată are un comportament biochimic sugestiv'dar
reacţia de aglutinare este negativă, trebuie să realizăm o suspensie (destul de densă)
(

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR IN 3 1 Diagnosticul de laborator în infecţii produse de Salmonella 173


INFECŢIILE PRODUSE DE MICROORGANISME DIN
GENUL SALM ONELLA — putea recolta şi lichid de vărsătură, un anumit aliment incriminat etc. Materiile fecale se
examinează macroscopic şi se trimit către laborator aşa cum am menţionat în capitolul 28.
■i Itîv \i!hw'lnil iu* vii 2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea preparatului nativ,
ii):'!' ii' *■"’ între lamă şi lamelă; putem remarca prezenţa granuiocitelor mononucleare.
■ V i! v’iijîf* j/!i!! , i : ■; •■;jiî!î-iti an-v « 3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să
Există mai multe clasificări pentru microorganismele care.aparţin genului,Salmonella. se poată obţine colonii izolate şi respecti v o cultură pură, care urmează a fi identificată (vezi.
Una dintre clasificările acceptate;(Ewing)grupează genul.în.3 .specii.şj.anumţ S., typhi (pato­ capitolele 9-10 şi 28). Pentru izolarea şi identificarea agentului patogen p.p. este însămânţat
genă doar pentru om), S. cholerae suis (patogenă ia porc, ocazional şi ia om) .şpA enterica pe un mediu lichid de îmbogăţire (bulion selenit) şi pe două medii gelozate selectivo-dife-
(produce boli diareice la ora şi la animal, cu aproximativ 2000 de serotipuri^Este încă bine renţiale (MacConkey şi ADCL/XLD). După o incubafe de 18-24 ore la 35-37°C, pe mediile
cunoscută schema de identificăm sm-ol6gică' (Kaufmann-White)' cares'ubîihparte genul solide pot apărea colonii bacteriene âuspecte (lâctozb-hegative) din'care obţinem cultura
Salmonellaîn grupe care includ foarte multei „speCii“'iSpre'ex. gruipul Ai'($ paratyphi A), pură în scopul identificării şi stabilirii sensibilităţii la antibiotice. Pentru a creşte şansa de­
grupul B (51 paratyphi B;S. C ] , t y p h i , S. pistării agentului cauzal, cultura de 18-24 ore în bulion selenit va fi trecută pe mediile solide
enter'iiidis) e tc .s ' ' ' ■■■■■',■' >! '• ” , '• (pe MacConkey şi ADCL/XLD),
■' 1,, /.)>•< jj j,(î / î 5 ‘ ■*’f. i ,>•',} J j j i ' . t ! ! ,i ?;îU ,î|
Genul Salmonella include bacili gram.negativi, cu dimensiuni de 2-4 pm/0,4-0,6 pin, mobili 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic izolat în cultură pură.se va realiza
cu cili peritrichi (cu excepţia S. galinantm putlorum), necapsulaţi, nesporulaţi, glucozo-fer- pe baza mai multor caractere:
mentativi (cu producere de gaz cu excepţia S. typhi), 1111 fermentează lactozâ, produc KfeS • Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativi,
(există şi excepţii) şi utilizează citratu! ca unică sursă de carbon.. • Caractere de cultură:
Infecţiile produse de microorganismele care aparţin genului Sălihdneilăsepoiîmpat# în • Produc colonii de tip S, lactozo-negative, cu diametrul de 1-3 mm (necolorate şi
salmdneloze minore (enterocolite, toxiinfecţii alimentare) şi" saltnondoze''mi^OT<5'';(febrii semitransparente pe MacConkey; necolorate dar cu centrul negru pe ADCL; roşii,
tifoidă, febre entefale). semitransparente, cu centrul negru pe XLD). în cazul în care a fost folosit şi me­
Enterocolita (gastroenterita, toxiinfecţia alimentară de tip infecţios) apare după ingestia diul Wilson Blair (foarte selectiv, care nu include iactoză) coloniile sunt negre, cu
a 105-10^ Salmoneie. Febra tifoidă (febra enterală) poate apărea după ingerarea a circa 103 margini neregulate şi halou metalic.
salmonele. Febra tifoidă este o boală gravă care în lipsa tratamentului poate conduce la • Caractere biochimice şi de mobilitate:
deces. S. typhi trece prin şi printre celulele epiteliale de ia nivelul ansei ileocecale, se mul­
• Fermentează glucoza (cu producere de gaz), sunt lactozo-negativi, produc FUS,
tiplică activ în submucoasă şi este fagocitată de macrofage unde supravieţuieşte şi continuă
(exisă şi excepţii) şi utilizează citratu! ca unică sursă de carbon.
să se multiplice. Microorganismele trec apoi, în ganglionii mezenterici, în canalul toracic şi
conduc la apariţia unei prime bacteriemii umitată de invadarea altor organe şi formaţiuni lim­ • Nu produc indol, sunt tirează-pozitivi, mobili, produc lizindecarboxilază şi ornitin-
fatice. Multiplicarea importantă, în special lâ nivelul organelor cu sistem reticulo-endotelial decarboxiiază etc.
bine reprezentat (ficat, splină), este urmată de o a doua bacteriemie masivă şi de eliminarea • Pentru punerea în evidenţă a caracterelor biochimice se pot folosi mediile multi­
prin bilă şi/sau urină. La sfârşitul primei săptămâni de boală, S. typlii se elimină din foliculii test convenţionale (TSI, MIU, MILF) sau galeriile multi-test (API 10 S, API 20 E,
intestinali şi prin bilă în materiile fecale, excreţia prelungindu-se mult timp în conva-, API Rapid 20 E sau alte variante).
lescenţă. Pot apărea angiocolită, colecistită; bolnavul poate deveni purtător (ex. la nivelul • Caractere antigenice:
veziculei biliare) după vindecare. • se utilizează seruri imune specifice, în scheme care folosesc iniţial Ac anti-0 şi
în cazul afecţiunilor strict digestive, diagnosticul de laborator microbiologic este bacte­ ulterior, în funcţie de rezultatul obţinut, Ac anti-H, prin reacţii de aglutinare pe
riologic, direct. în cazul afecţiunilor sistemice, diagnosticul poate fi bacteriologic şi/sau lamă conform schemei Kauffmann-White (există tabele şi scheme care trebuie
serologic. ' / respectate);
Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu localizare digestivă , • în cazul în care o tulpină izolată are un comportament biochimic sugestiv dar
Diagnosticul bacteriologic (direct) cuprinde etapele cunoscute. / reacţia de aglutinare este negativă, trebuie să realizăm o suspensie (destul de densă)
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând're­ din respectiva tulpină, pe care o menţinem timp de 30-60 minute la o temperatură
gulile cunoscute.’Produsul patologic este reprezentat de obicei-de materiile fecale dar'am de 100°C şi ulterior repetăm reacţia de aglutinare. >