Universidad Nacional de San Luis

Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia

Esterilización

Tagua, Débora Belén

Licenciatura en Química

2017
OBJETIVOS

 Adquirir
conocimientos sobre los diferentes métodos de esterilización.
 Realizar un perfil de temperatura para una esterilización discontinua, en autoclave
acondicionado especialmente para tal fin.
 Realizar el cálculo del tiempo de mantenimiento, con los datos obtenidos anteriormente
y para las condiciones dadas.

INTRODUCCION

La esterilización es un proceso por el cual se elimina toda forma de vida de un medio o de un

ambiente. Desde el punto de vista industrial, esto se alcanza en muy raras ocasiones. La
esterilización busca minimizar los efectos adversos de los microorganismos contaminantes, que:

- Consumirían nutrientes, bajando el rendimiento.

- Podrían formar productos inhibitorios de la fermentación, o que compliquen el proceso de
separación de productos.
- Podrían formar compuestos que descomponen el producto.

En la industria, algunos procesos transcurren sin esterilización previa, otros se operan semi-
asépticamente, esterilizando solo los componentes del medio más susceptibles de contaminarse,
para algunos casos se utiliza la fermentación protegida (antibióticos, SO2). Sin embargo la mayoría
de los procesos se lleva a cabo asépticamente y en este caso se necesita esterilizar:

- Medios de fermentación
- Equipos y accesorios.
- Aire.
- Ambiente (industria farmacéutica).

Los procesos de esterilización se llevan a cabo mediante:

- Agentes físicos.
- Agentes químicos.
Esterilización de Medios de Cultivo

El proceso más difundido es por calor húmedo; que posee mayor eficiencia que el calor seco debido
a que las formas esporuladas contienen un tenor de agua muy bajo. La esterilización por calor
húmedo puede hacerse con vapor indirecto o con vapor directo:

Vapor directo: se inyecta vapor en el medio de cultivo.

Vapor indirecto:

- a presión atmosférica: pasteurización, tindalización.

- a presión superior a la atmosférica.

Consideraciones básicas sobre la cinética de esterilización

Los microorganismos difieren mucho en su resistencia térmica, siendo los que no esporulan, por lo
general, menos resistentes. La resistencia térmica se modifica con el pH, sólidos en suspensión,
viscosidad, etc.

La destrucción de los microorganismos por el calor puede asimilarse a una reacción química de
primer orden.
N: número de esporas
𝑑𝑁
− =𝑘𝑁 (1) presentes
𝑑
k: constante de velocidad.
: tiempo de calentamiento
2,303 𝑁𝑖
k= = log (2) Nf: número final de esporas
 𝑁𝑓
Ni: número inicial de
esporas.
Diseño de operaciones de esterilización

A) Curvas de supervivencia: Generalmente se trabaja con Bacillus stearotermophilus, de gran

resistencia, ampliamente usado como bacteria de prueba en la industria de la alimentación. Para
realizar las curvas de supervivencia, a muestras con un determinado Ni, se las somete a
calentamiento a temperatura constante, durante distintos tiempos, midiendo luego de cada
experiencia, el Nf. Si se grafica se obtiene:
 ln Nf / Ni

105 °C

120 °C

Figura 1. Representación gráfica de la ecuación (2).

De las pendientes de las rectas se puede calcular k y luego representar:

𝐸𝑎
log 𝑘 = log 𝐴 − 2,3 𝑅𝑇 (3)

log k

1/T

Figura 2. Representación gráfica de la ecuación (3)

De la pendiente de la recta resultante se puede calcular Ea. El valor de la energía aparente de activación
de destrucción de las esporas bacterianas (las más resistentes), se sitúa entre 50 y 85 Kcal/mol, estos
valores son mucho más altos que los de la energía necesaria para producir la desactivación de las
vitaminas y factores de crecimiento. Por ejemplo, para vitamina A es de 14 Kcal/mol. Debido a esto
son menos afectados por el calentamiento que las esporas. Un aumento en la temperatura causa
mucho mayor aumento en k esporas que en k vitaminas T1 > T2.

Log k

Ea = 14 Kcal/mol
Esporas

Ea = 50-85 Kcal/mol

Vitaminas

1/T1 1/T2 1/T

Figura 3. Representación gráfica de la ecuación (3) aplicada para vitaminas y esporas.

Una esterilización a temperatura elevada, con menor tiempo de exposición, destruye menos
nutrientes que una menor temperatura durante mayor tiempo. Por encima de 105 ºC la temperatura
es letal para los esporos y al aumentar el tamaño de los equipos, se tarda de 105 ºC a la temperatura
de esterilización mayor tiempo que en equipos más pequeños. Lo mismo ocurre durante el
enfriamiento; debido a esto hay mayor exposición a temperaturas letales. Basados en la cinética de
primer orden para destrucción de esporas, se puede estimar la contribución de los ciclos de
calentamiento y enfriamiento al ciclo total. Esto es importante debido a que el sobrecalentamiento
del medio de cultivo, contribuye a la degradación de nutrientes y a la producción de compuestos
tóxicos.
B) Cálculo de calor de esterilización. (Cultivo en batch)

Si se realiza un gráfico de temperatura del reactor vs. tiempo, calentando hasta 120 ºC y luego
enfriando:

t °C

Calentamiento
Enfriamiento


Figura 4. Grafico que representa el aumento de temperatura del reactor en función del tiempo.

Con los valores de temperatura y con los gráficos de log k vs. 1/T, se hallan los valores de k, con los
que se grafica k vs. .

k prom. enfriam.

k prom. calent.


Figura 5. Grafica de los valores de k (ecuación 3) en función del tiempo de calentamiento.
Lo realizado tiene por objeto calcular el número de microorganismos muertos durante el
calentamiento y el enfriamiento, lo que resulta indispensable para calcular el tiempo de
mantenimiento a 120 ºC.

Para aplicar la ecuación 2 en el cálculo de Nf ' (microorganismos que quedan vivos luego de los ciclos
de calentamiento y enfriamiento), se necesita calcular una k promedio total de calentamiento más
enfriamiento:

t = c + e (4)

 
𝑘𝑝𝑟𝑜𝑚,𝑡 = 𝑘𝑝𝑟𝑜𝑚,𝑐 𝑐 + 𝑘𝑝𝑟𝑜𝑚,𝑒 𝑒 (5)
𝑡 𝑡

k ∫ d k ∫ d
kpc =  kpe = (6)
2 −1 1 −2

1 𝑁
𝑘𝑝𝑡 =  𝑙𝑛 𝑁 𝑖 (7)
𝑡 𝑓′

Para calcular kpc y kpe se emplea algún método de integración gráfica (Fig. 4)

Una vez calculada kpt se puede obtener de la ecuación 2 el valor de Nf ', luego de los ciclos de
calentamiento y enfriamiento. Conocido el Nf 'se calcula el tiempo de mantenimiento a 120 ºC
(temperatura de esterilización), necesario para alcanzar el Np requerido.

1 Nf′
m = ln (8)
k120 Np

Np se fija en un valor menor que 1 y mayor que cero, por ejemplo 10-3 y significa la probabilidad de
que algún microorganismo sobreviva en n esterilizaciones (n= 10, 100, 1000,10000, etc.), o bien de
que un batch quede contaminado en n batch esterilizados.
 t °C
120 °C
105 °C T °C letal mínima


c m e

Figura 6. Gráfico de la variación de la temperatura en función de la temperatura de calentamiento.

Sistemas de esterilización

Discontinuo: -serpentín

-camisa

-vapor directo

Continuo: -tubo de retención.

 Comparando gráficamente los dos sistemas:

t °C continuo

140 °C
discontinuo

120 °C

105 °C

Figura 7. Grafica de la variación de la temperatura en función del tiempo de calentamiento para los diferentes
sistemas de esterilización.

Cambio de escala en esterilización

Para hacer el cambio de escala debe mantenerse:

-Similitud de esterilización.

-Similitud de calidad de nutrientes.

Si definimos el grado de esterilización como:

𝑁 𝐶𝑉
 = 𝑐𝑟𝑖𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑠𝑒ñ𝑜 = 𝑙𝑛 𝑁 𝑖 = 𝑘 (𝑓 − 𝑖 ) = 𝑙𝑛 𝑃
(9)
𝑓

C: concentración de esporas.

V: volumen de medio

P: concentración final de esporas.

Para mantener similitud de esterilización:

𝐶𝑒 𝑉1 𝐶𝑒 𝑉2
1 = ln 𝑃
2 = 𝑙𝑛 𝑃
(10)

𝑉
2 − 1 = 𝑙𝑛 𝑉2 (11)
1

𝑉
2 = 1 + 2,3 log 𝑉2 (12)
1

Para mantener similitud de calidad de nutrientes: se usa un esquema adaptado por Frim, para la
industria de la alimentación. Si se grafica ln  vs. 1/T para distintas escalas se tiene:

ln  3 1
4 2

C4
C3
C2
T cte . C1
cte.
P

1 /T

Figura 8. Representación gráfica de la variación de los tiempos de calentamientos en función de la

temperatura para distintas escalas.

Las rectas de líneas completas representan similitud de tratamientos térmicos para destrucción de
microorganismos y las rectas de línea punteada representan líneas de concentraciones crecientes:
C1 > C2 > C3  C4. Si nos hallamos en el punto P y se quiere pasar de una escala a otra, conviene
hacerlo por las rectas de concentración constante (similitud de calidad de nutrientes), aumentando
la temperatura y disminuyendo el tiempo de exposición. Esto se logra en los procesos continuos.
PARTE EXPERIMENTAL

Calculo del tiempo de mantenimiento (m) en sistema discontinuo (Batch)

 Materiales

- Autoclave.

- Erlenmeyer con medio de cultivo.

- Termocupla.

- Sensor de temperatura.

- Tester.

 Procedimiento
1- Colocar la termocupla en el medio de cultivo contenido en el Erlenmeyer. Depositar el
mismo en el autoclave. Conectar la termocupla al tester.
2- Llevar las condiciones de esterilización a 121 ºC, 1 atmósfera, e inmediatamente enfriar.
3- Calcular el tiempo de mantenimiento considerando que la probabilidad de que quede algún
contaminante sea de 1:1000. Suponer una contaminación inicial de 106 microorganismos por
ml (utilizar una gráfica de log k vs. 1/T para Bacillus stearotermophylus y el método propuesto
en la introducción).

Con los datos obtenidos mediante la aplicación del procedimiento se puede construir la siguiente
tabla.
T(ºC) T(K) 1/T tiempo calentamiento tiempo K log K
(min) (seg)
90 363 0,00275482 0 0 3,03864E-05 -4,517321025
95 368 0,00271739 1 60 0,000108618 -3,964096555
100 373 0,00268097 2 120 0,000375229 -3,425703839
103 376 0,00265957 3 180 0,000777067 -3,109541309
107 380 0,00263158 4 240 0,002014853 -2,695756663
111 384 0,00260417 5 300 0,005121621 -2,290592531
115 388 0,00257732 6 360 0,012770788 -1,893782299
118 391 0,00255754 7 420 0,025032104 -1,60150264
121 394 0,00253807 8 480 0,048565298 -1,313673939
122 395 0,00253165 9 540 0,060436233 -1,218702613
121 394 0,00253807 10 600 0,048565298 -1,313673939
119 392 0,00255102 11 660 0,031255739 -1,505070235
117 390 0,0025641 12 720 0,020024903 -1,698429569
115 388 0,00257732 13 780 0,012770788 -1,893782299
113 386 0,00259067 14 840 0,008106634 -2,091159409
111 384 0,00260417 15 900 0,005121621 -2,290592531
109 382 0,0026178 16 960 0,003220224 -2,492113958
107 380 0,00263158 17 1020 0,002014853 -2,695756663
106 379 0,00263852 18 1080 0,001590802 -2,79838399
104 377 0,00265252 19 1140 0,000987934 -3,005271968
103 376 0,00265957 20 1200 0,000777067 -3,109541309
102 375 0,00266667 21 1260 0,000610426 -3,214366752
102 375 0,00266667 22 1320 0,000610426 -3,214366752
101 374 0,0026738 23 1380 0,000478903 -3,31975276
101 374 0,0026738 24 1440 0,000478903 -3,31975276
100 373 0,00268097 25 1500 0,000375229 -3,425703839
100 373 0,00268097 26 1560 0,000375229 -3,425703839
100 373 0,00268097 27 1620 0,000375229 -3,425703839
100 373 0,00268097 28 1680 0,000375229 -3,425703839
100 373 0,00268097 29 1740 0,000375229 -3,425703839
99 372 0,00268817 30 1800 0,000293613 -3,532224549
99 372 0,00268817 31 1860 0,000293613 -3,532224549
98 371 0,00269542 32 1920 0,000229446 -3,639319493
98 371 0,00269542 33 1980 0,000229446 -3,639319493
97 370 0,0027027 34 2040 0,000179063 -3,74699333
97 370 0,0027027 35 2100 0,000179063 -3,74699333
96 369 0,00271003 36 2160 0,000139556 -3,855250764
96 369 0,00271003 37 2220 0,000139556 -3,855250764
95 368 0,00271739 38 2280 0,000108618 -3,964096555
95 368 0,00271739 39 2340 0,000108618 -3,964096555
94 367 0,0027248 40 2400 8,44237E-05 -4,07353551
94 367 0,0027248 41 2460 8,44237E-05 -4,07353551
93 366 0,00273224 42 2520 6,55281E-05 -4,183572492
93 366 0,00273224 43 2580 6,55281E-05 -4,183572492
92 365 0,00273973 44 2640 5,07911E-05 -4,294212417
92 365 0,00273973 45 2700 5,07911E-05 -4,294212417
91 364 0,00274725 46 2760 3,93133E-05 -4,405460253
90 363 0,00275482 47 2820 3,03864E-05 -4,517321025

Tabla 1. Datos obtenidos durante la aplicación del proceso de esterilización.

 1/T
0
0.0025 0.00255 0.0026 0.00265 0.0027 0.00275 0.0028
-0.5

-1

-1.5

-2
log K

-2.5

-3

-3.5

-4

-4.5

-5

Figura 8. Grafico obtenido de la aplicación de la ecuación de Arrhenius (ecuación 3)

400

395

390

385
Temperatura

380

375

370

365

360
0 500 1000 1500 2000 2500 3000


Figura 9. Grafica de la