LAPORAN BIOKIMIA (KI-3061)

PRAKTIKUM V
UJI AKTIVITAS SUKSINAT DEHIDROGENASE

Tanggal Praktikum: 22 April 2016

Disusun oleh :
Joshua Andrian K
10414026
Kelompok 1

Asisten:
Hanny Septiani
10412024

PROGRAM STUDI MIKROBIOLOGI

SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2016
I. TUJUAN PERCOBAAN

Tujuan dari percobaan kali ini adalah sebagai berikut :

1. Menentukan aktivitas kecepatan enzim suksinat dehidrogenase

2. Menentukan pengaruh malonat, suksinat, dan Na-azida terhadap aktivitas enzim

suksinat dehidrogenase (pada Tabung 2,4,5,6, dan 7).

II. TEORI DASAR

Enzim merupakan protein yang mampu mengkatalis reaksi-reaksi biologis

dengan mempengaruhi laju reaksi saaat kesetimbangan telah dicapai, namun enzim
tidak mengganggu kesetimbangan totdal dari reaksi yang terjadi. Pada dasarnya enzim
mampu menemukan jalur lain yang membutuhkan energi lebih sedikit untuk
pembentukan keadaan transisi maupun pembentukan produk, sehingga reaksi akan
berjalan lebih cepat dibanding reaksi tanpa pengkatalis enzim.

Salah satu jenis enzim adalah enzim dehidrogenase yang mampu mengkatalis
suatu reaksi yang melibatkan electron. Prosesnya adalah reaksi transfer elektron,
termasuk ion hidrogen, dari substrat menuju senyawa akseptor seperti NAD +, NADP,
dan FAD+. Salah satu contoh dari enzim dehidrogenase adalah enzim suksinat
dehydrogenase yang terdapat dalam mitokondria suatu sel. Enzim ini akan
membentuk ikatan yang sulit terputus dengan akseptor elektronnya yakni berupa
protein Flavin yakni FAD+. Enzim ini berperan dalam pengubahan substrat suksinat
menjadi fumarat dalam siklus Kreb atau siklus TCA saat proses respirasi aerobik.
Selain itu, enzim ini merupakan penyusun utama Kompleks II pada proses Sistem
Transfer Elektron pada respirasi aerobik di mitokondria. Kompleks II ini akan
mengubah ubiquinon menjadi ubiqionol dengan menambahkan elektron padanya.

Dalam kerjanya, enzim dapat diganggu oleh suatu senyawa lain sehingga
kerjanya bisa terhambat bahkan dapat mengakibatkan kerusakan struktur yang
dikenal sebagai inhibitor enzim. Inhibitor ini mekanisme kerjanya beragam. Jika
didasarkan pada kestabilannya, dibagi menjadi dua yakni inhibitor reversible dan
irreversible. Perbedaan yang mendasar dari keduanya adalah kestabilan inhibitor
menempel pada sisis aktif enzim. Untuk inhibitor reversible mampu terlepas dari sisi
aktif enzim, sedangkan inhibitor irreversible tidak mampu terlepas. Kelompok
 inhibitor lainnya dikelompokkan berdasarkan pengaruhnya terhadap reaksi enzim
yang terdiri dari inhibitor kompetitif, non-kompetitif, dan un-kompetitif. Inhibitor
kompetitif akan menempel pada sisi aktif enzim sehingga substrat tidak bisa
menempel dan reaksinya tidak terjadi. Sedangkan inhibitor non-kompetitif akan
menempel pada enzim ataupun kompleks enzim sehingga mengubah struktur enzim,
namun substrat masih punya kemungkinan untuk menempel pada sisi aktifnya dan
reaksinya terjadi. Untuk inhibitor un-kompetitif menempel pada kompleks enzim dan
tidak dapat menempel pada enzim bebas yang menyebabkan kompleks enzim
menjadi tidak aktif.

III. DATA PENGAMATAN

Buffer Suspensi Absorbansi pada t (menit)

Azida DCIP Malonat Suksinat
Tabung Uji Mitokondria
(ml) (ml) (ml) (ml) 5’ 10’ 15’ 20’
(ml) (ml)
1 4 0.5 - - 0.5 0.0 Blanko Blanko Blanko Blanko
2 3.5 0.5 0.5 - 0.5 0.0 0.357 0.341 0.331 0.328
3 3.4 0.5 - - 0.5 0.6 Blanko Blanko Blanko Blanko
4 2.9 0.5 0.5 - 0.5 0.6 0.218 0.214 0.211 0.21
5 2.7 0.5 0.5 0.2 0.5 0.6 0.211 0.209 0.207 0.206
6 3.4 - 0.5 - 0.5 0.6 0.204 0.211 0.2 0.2
7 3.4 0.5 0.5 - - 0.6 0.237 0.231 0.229 0.226

IV. PENGOLAHAN DATA

∆Absorbansi

Tabung ∆1 (t5- ∆2 (t10- ∆3 (t15-

t10) t15) t20)
T2 0,016 0,026 0,029
T4 0,004 0,007 0,008
T5 0,002 0,004 0,005
T6 -0,007 0,004 0,004
T7 0,006 0,008 0,011
 T2
0.36
0.36
0.35 f(x) = - 0.01x + 0.36
0.35 R² = 0.92
Absorbansi

0.34
0.34
0.33
0.33
0.32
0.32
0.31
5 10 15 20
waktu (menit)

T4
0.22
0.22
0.22 f(x) = - 0x + 0.22
0.21 R² = 0.94
Absorbansi

0.21
0.21
0.21
0.21
0.2
5 10 15 20

waktu (menit)
 T5
0.21
0.21
0.21 f(x) = - 0x + 0.21
0.21 R² = 0.98
Absorbansi

0.21
0.21
0.21
0.21
0.2
0.2
5 10 15 20
waktu (menit)

T6
0.21
0.21
0.21
0.21 f(x) = - 0x + 0.21
Absorbansi

0.2 R² = 0.33
0.2
0.2
0.2
0.2
0.19
5 10 15 20
waktu (menit)
 T7
0.24
0.24
0.23 f(x) = - 0x + 0.24
R² = 0.95
0.23
Absorbansi

0.23
0.23
0.23
0.22
0.22
0.22
5 10 15 20
Waktu (menit)

Tabung Laju Awal (∆A/menit) Keterangan

2 -0.0097 Tanda negatif tidak menyatakan
4 -0.0027 nilai, namun menyatakan bahwa
5 -0.0017 terjadinya penurunan konsentrasi
6 -0.0023 bukan kenaikan konsentrasi.
7 -0.0035

V. PEMBAHASAN
Enzim dehidroghenase enzim yang mengkatalisis reaksi transfer hidrogen dari
suatu substrat kepada senyawa akseptor seperti NAD+, NADP atau flavoprotein.
Suksinat dehidrogenase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi pengubahan suksinat
menjadi fumarat dalam siklus asam sitrat pada respirasi aerobik (Frais,1972). Selain
berperan pada siklus asam sitrat dan fosforilasi oksidatif, sebagai senyawa supresor
tumor dan penghambat pembentukan ROS pada molekul FAD (Styrer,2000).
Pada percobaan ini dilakukan uji aktivitas ezim suksinat dehidrogenase. Enzim
ini berada pada organel sel yakni mitokondria yang merupakan organel untuk repirasi
sel. Enzim ini dapat diisolasi dari makhluk hidup yang memiliki mitokondria. Secara
umum, untuk kebutuhan praktikum ini, enzim diisolasi dengan cara mengisolasi
mitokondria pada sel tumbuhan yakni bunga kol. Isolasi mitokondria bertujuan untuk
mengekstrak suspensi enzim suksinat dehidrogenase yang akan diuji. Selain mudah
untuk didapatkan, bunga kol mengandung mitokondria relatif lebih banyak dibanding
lainnya sehingga diharapkan enzim yang didapat juga lebih banyak. Langkah pertama
yang dilakukan adalah menggerus 20 gram kembang kol diatas mortar dingin dengan
40 mL mannitol grinding buffer. Buffer ini berfungsi untuk menjaga agar kondisi
mitokondria tetap terjaga dan tujuan penggerusan adalah untuk melisiskan sel. Lalu ke
dalam larutan ditambah 5 gram pasir dingin untuk membantu memecah dinding sel.
Kemudian suspensi diperas melewati kain dan di sentrifugasi selama 5 menit 1000g
pada suhu 4oC. Dekantasi supernatant hasil sentrifugasi ke dalam tabung yang bersih
dan dingin. Lalu di sentrifugasi kembali selama 3 menit 10000g. Enzim ini didapat
berupa suspense dari pellet hasil isolasi yang disimpan pada suhu 0-4 0C dalam buffer
uji mannitol yang mengandung 0.3 M mannitol, 0.006 M KH2PO4, 0.014 M K2HPO4,
0.01 M KCl, 0.005 M MgCl2, dengan pH 7.2 yang berguna untuk menjaga kualitas
mitokondria sekaligus enzim yang dikandungnya agar tidak rusak (Fessenden,1992).
Prinsip dari percobaan ini adalah mengamati perubahan suksinat menjadi
fumarat dengan mengukur absorbansi senyawa penerima electron buatan yang
tereduksi menjadi senyawa tak berwarna. Semakin rendah absorbansi yang didapat,
maka aktivitas enzim suksinat dehydrogenase semakin tinggi. Senyawa penerima
electron buatan yang digunakan adalah 2,6-diklorofenolindolfenol atau dikenal
dengan nama DCIP yang memiliki warna biru ketika teroksidasi. Ketika DCIP
tereduksi dengan cara menangkap elektron bebas, maka menjadi senyawa tak
berwarna. Elektron ini berasal dari FADH2 yang teroksidasi menghasilkan electron
bebas yang seharusnya ditangkap oleh oksigen sebagai akseptor electron terakhir.
Agar electron dapat ditangkap oleh DCIP dan tidak ditangkap oleh oksigen, maka
ditambahkan natrium azida atau kalium sianida yang mampu menghalangi transfer
elektron pada mitokondria.
Dalam mengamati aktivitas enzim siksinat dehidrogenase ini, dibuat berbagai
perlakuan dengan memvariasikan konsentrasi enzim yang ditambahkan, keberadaan
substrat berupa suksinat, serta keberadaan inhibitor kompetitif berupa malonat.
Malonat ini merupakan senyawa yang memiliki struktur mirip dengan struktur
suksinat. Sehingga dapat dikatakan bahwa malonat merupakan senyawa analog dari
suksinat. Malonat ini dapat menginhibisi aktivitas enzim karena mampu mengikat sisi
aktif dari enzim sehingga substrat tidak dapat menempel dan reaksi yang
sesungguhnya tidak dapat berlangsung. Karena itu lah, malonat ini digolongkan
sebagai inhibitor kompetitif dari enzim suksinat dehidrogenase.
Dari percobaan yang dilakukan, didapat data yang dapat dilihat pada bagian
Data Pengamatan dan Pengolahan Data di atas. Tabung 1 dan 3 digunakan sebagai
blanko. Untuk tabung 1 digunakan sebagai blanko tabung 2, sementara untuk tabung 3
digunakan untuk blanko tabung 4,5,6,dan 7. Untuk data tabung 2 seharusnya didapat
laju awal reaksi yang bernilai negatif yang seharusnya menunjukkan tidak terjadi
penurunan konsentrasi DCIP atau DCIP tidak tereduksi karena tidak dilakukan
penambahan enzim pada Tabung 2. Namun laju untuk tabung dua bernilai negatif dan
terjadi penurunan absorbansi DCIP pada waktu 5’, 10’, 15’ dan 20 menit. Hal ini
mungkin terjadi dikarenakan terdapat kontaminasi suatu zat yang dapat menyebabkan
DCIP tereduksi. Untuk Tabung 4 yang berisi buffer uji, Na-azida, suksinat, suspensi
mitokondria dan DCIP seharusnya terjadi penurunan absorbansi dan laju awal reaksi.
Laju awal reaksi menunjukkan hasil negatif yang menyatakan terjadinya penurunan
konsentrasi DCIP berwarna biru menjadi senyawa tak berwarna karena tereduksi. Hal
ini sesuai dengan hipotesis. Untuk tabung 5 yang komposisinya serupa dengan
tabung 4, namun ditambah malonat sebagai inhibitor yang seharusnya terjadi
penurunan absorbansi DCIP dan penurunan laju awal reaksi namun lebih kecil
penurunannya dibandingkan tabung 4. Hasil menunjukkan bahwa pada tabung 5
terjadi penurunan laju awal reaksi namun nilai laju awal reaksi tabung 4 lebih besar.
Hal ini sesuai dengan hipotesis karena malonat berperan sebagai inhibitor kompetitif
suksinat yang akan menghambat kerja enzim suksinat dehidrogenase. pada Tabung 6
lebih tinggi dibanding Tabung 4 yang menunjukkan data yang berbanding lurus
dengan jumlah enzim yang ditambahkan. Dapat disimpulkan bahwa semakin tinggi
konsentrasi enzim yang ditambahkan, maka laju awal reaksi enzim akan semakin
cepat pula. Untuk tabung 6 komposisinya berisi buffer uji, suspensi mitokondria,
suksinat dan DCIP seharusnya terjadi penurunan absorbansi dan laju awal reaksi,
seharusnya tidak adanya azida juga mampu mempengaruhi laju awal reaksi enzim
karena penangkapan electron oleh oksigen tidak terhambat dan menyebabkan laju
tereduksinya DCIP berlangsung lebih lambat masih terdapat kemungkinan DCIP
tereduksi oleh electron lainnya karena enzim masih aktif dan tidak terinhibisi oleh
inhibitor kompetitif sehingga penurunan absorbansi dapat bersifat fluktuatif. Hal ini
terbukti terjadi kenaikkan absorbansi pada t5 – t10. Namun laju awal tetap bernilai
negatif, namun lebih kecil dari laju awal reaksi tabung 4. Untuk tabung 7
 komposisinya berisi buffer uji, Na-azida, suspensi mitokondria dan DCIP seharusnya
tidak terjadi penurunan absorbansi dan laju awal reaksi karena substrat tidak
diberikan. Hasil yang didapat adalah terjadi perubahan absorbansi yang cenderung
turun dan membuktikan adanya aktivitas reaksi. Hal ini tidak sesuai dengan hipotesis
karena seharusnya tidak ada perunahan absorbansi karena tidak ada suksinat sebagai
substrat. Hal ini terjadi karena faktor suspensi mitokondria yang telah mengandung
FADH2 sehingga bisa mereduksi DCIP (Styrer, 2000).
Berfasarkan data yang didapatkan tidak dapat ditentukan apakah grafik
kecepatan enzim terhadap konsentrasi enzim sesuai dan konsisten dengan persamaan
Michaelis-Menten karena konsentrasi substrat yang digunakan sama yaitu sebesar 0,5
mL. Semakin tinggi konsentrasi enzim yang ditambahkan maka aktivitas enzim akan
semakin tinggi jika dilihat dari laju reaksi awal. Keberadaan malonat sebagai inhibitor
kompetitif enzim suksinat dehydrogenase akan menurunkan aktivitas enzim dalam
mengkalatis reaksi pengubahan suksinat menjadi fumarat. Ketidakhadiran suksinat
sebagai substrat enzim suksinat dehidrogenase dan natrium azida sebagai penghambat
penangkapan electron oleh oksigen, akan menurunkan aktivitas enzim jika ditinjau
dari laju reaksi awal.

VI. KESIMPULAN
Dari percobaan yang telah dilakukan, dapat disimpulkan

1. Pengukuran kecepatan awal aktivitas enzim sebesar -0.0097A/t untuk tabung 2,

-0.0027A/t untuk tabung 4, -0.0017A/t untuk tabung 5, -0.0023A/t untuk tabung 6
dan -0.0035A/t untuk tabung 7.
2. Semakin tinggi konsentrasi enzim yang ditambahkan maka aktivitas enzim akan
semakin tinggi jika dilihat dari laju reaksi awal.
3. Keberadaan malonat sebagai inhibitor kompetitif enzim suksinat dehydrogenase
akan menurunkan aktivitas enzim dalam mengkalatis reaksi pengubahan suksinat
menjadi fumarat.
4. Ketidakhadiran suksinat sebagai substrat enzim suksinat dehydrogenase dan
natrium azida sebagai penghambat penangkapan electron oleh oksigen, akan
menurunkan aktivitas enzim jika ditinjau dari laju reaksi awal.
VII. DAFTAR PUSTAKA

Frais, F. 1972. Practical Biochemistry on Introductory Course. London : Buffer Worths

Fessenden. 1992 . Kimia Organik edisi 3. Jakarta : Erlangga

Nelson, D. L. dan Cox, M. M. 2004. Lehninger Principles of Biochemistry, fourth edition.

Inggris : W. H. Freeman. Halaman 75-115.

Styrer,2000. Biochemistry. New York : W.H Freeman and Company