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PRACTICA Nº 5
DETERMINACIONES ESPECTROFOTOMETRICAS EN ALIMENTOS.
Carotenoides totales y nitritos.

I. INTRODUCCIÓN: En espectrofotometría se usa como fuente luminosa la

luz blanca natural o artificial (espectro continuo entre el rojo y el ultra
violeta). Las mediciones se realizan por medio de un espectrofotómetro.
La ventaja principal de los métodos espectrofotométricos consiste en que
se pueda determinar con mayor exactitud y de una manera simple, trazas
de sustancias en cuyo caso los procedimientos gravimétricos y
volumétricos darían errores relativamente mayores puesto que las
cantidades absolutas de las sustancias que se van a determinar son
demasiado pequeñas. Por lo tanto, el método espectrofotométrico es
especialmente adecuado para la determinación de micro y semimicro
cantidades de componentes.
En caso contrario se prefieren los procedimientos gravimétricos y
volumétricos, por cuanto son más exactos. Se debe tener muy presente
que aún en los casos más favorables, la espectrofotometría común no da
una exactitud mayor del 1%, aproximadamente.

II. PIGMENTOS NATURALES: CAROTENOIDES TOTALES.

A. Fundamento:
El método se fundamenta en la medición de la absorbancia de un
extracto de los carotenoides presentes en el alimento y luego mediante
1%
el uso de una curva de calibración o la aplicación E1cm se calcula el

contenido de carotenoides en la muestra.

B. Reactivos:
1. Éter de petróleo
2. Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)
3. Solución concentrada de beta-caroteno en alcohol isopropilico/

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cloroformo (25:75) (80mg/ ml).
4. Solución diluida de beta-caroteno (10 ml de solución concentrada +
éter de petróleo en cantidad suficiente para 100 ml)
4. Acetona.
NOTA: RECUERDE QUE DURANTE LA PRACTICA SE TRABAJA
CON SOLVENTES VOLATILES MUY INFLAMABLES Y QUE POR LO
TANTO NO DEBE FUMAR, NI ENCENDER MECHEROS, ETC.
C. PROCEDIMIENTO:
1. Curva patrón:
Tomar 5 tubos de ensayo y enumerar del 1 al 5. Colocar en cada
uno de ellos las cantidades de reactivos que se especifican a
continuación:
Tubo Nº 1 2 3 4 5
ml de solución diluida de
0 2 4 6 8
beta- caroteno
ml de solvente puro
10 8 6 4 2
(éter de petróleo)

Agitar con cuidado los tubos y determinar la absorbancia de cada

solución a la longitud de onda máxima.
Construir la curva de calibración trazando un grafico de la
absorbancia correspondiente contra la concentración de beta-
caroteno contenida en cada una de las soluciones patrón.
2. Determinación del contenido de carotenoides totales en el
alimento:
1. Pesar aproximadamente 1g de muestra fresca de zanahoria
previamente pelada y cortada en trozos pequeños.
2. Homogenizar en una licuadora con 60 ml de acetona por unos
3 minutos.
3. Decantar y agregar más acetona para realizar una extracción.
Repetir el proceso hasta extraer completamente los pigmentos.

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4. Filtrar y lavar el residuo que queda en el papel de filtro con
unos 20-30 ml de acetona.
5. Concentrar en campana con un baño de María (o en plancha
eléctrica) hasta pequeño volumen.
6. Agregar 60 ml de éter de petróleo.
7. A la solución etérea que contiene los carotenoides agregar
una pequeña cantidad de Na2SO4 anhidro. Dejar la solución
con el agente desecante unos 15 minutos, agitar
ocasionalmente.
8. Transferir cuantitativamente la solución etérea a un matraz
aforado de 100 ml y llevar a volumen con éter de petróleo.
9. Tomar con una pipeta 2 ml de esta solución ( o un volumen
que pueda medirse la intensidad de color) y transferir a un
tubo.
10. Agregar 8 ml de éter de petróleo y medir la absorbancia a la
longitud de onda de máxima absorción encontrada
previamente.
D. Cálculos:
1. Determinar por medio de la curva estándar la cantidad de
carotenoides totales presentes en la muestra. Expresarlos
como mg de beta-carotenos/100 g de muestra.
2. Calcular la cantidad de carotenoides totales expresados como
1%
beta-caroteno utilizando la constante E1cm

3. Comparar ambos resultados.

I. COMPUESTOS NO COLOREADOS: NITRITOS

A. Fundamento:
Cuando se hacen reaccionar soluciones de ácido sulfanílico y alfa-
naftilamina en ácido acético diluido con ácido nitroso, se produce una
coloración roja. El ácido sulfanilico se transforma en el diazo
compuesto correspondiente que se copula con la alfa-naftilamina-

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pazobenceno-p-sulfonico, azocolorante rojo.
B. Reactivos:
1. Reactivo de Greiss (modificado)
Disolver 0,5 g de ácido sulfanilico en 150 ml de ácido acético al 15
% (V/V).
Hervir 0,1 g de alfa-naftilamina o 0,125 g de clorhidrato en 20 ml de
agua hasta disolver; agregar, en caliente, a 150 ml de ácido acético
al 15 % (V/V).
Mezclar las dos soluciones. Filtrar si es necesario y guardar en
frasco ambar.
2. Solución estándar de nitrito de sodio (1 mg / ml)
3. Solución de ferrocianuro de potasio (10 %)
4. Acetato de zinc dihidratado (22 %)
5. Solución de Bórax decahidratado
C. Procedimiento:
1. Curva patrón.
1. Diluir volúmenes adecuados de la solución estándar de nitrito
en matraces aforados de 50 ml.
2. Añadir 2 ml de reactivo de Greiss.
3. Dejar desarrollar color por 15-20 minutos.
4. Leer a 520 nm y llevar a un grafico los valores de Absorbancia
vs. concentración de cada una de las soluciones patrones.
Concentración de los estándares: 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 y 0,5
ppm.
2. Determinación de nitritos en carnes curadas.
1. Pesar 5 g de carme finamente homogenizada en un vidrio de
reloj.
2. Pasarlos a un vaso precipitado de 250 ml con 150 ml de agua
aproximadamente.
3. Añadir 5 ml de bórax.
4. Colocar en baño de Maria durante 45 minutos. Agitar

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ocasionalmente
5. Transferir cuantitativamente a un balón aforado de 250 ml
6. Añadir 2,5 ml de solución de ferrocianuro y 2,5 ml de acetato
de zinc, mezclar.
7. Enfriar a temperatura ambiente, llevar a volumen con agua y
mezclar cuidadosamente.
8. Filtrar
9. Medir una alícuota de 25 ml (o un volumen que permita medir
la intensidad de color desarrollado) en un matraz aforado de
50 ml y llevar a volumen.
10. Mezclar y dejar desarrollar color por 15-20 minutos
11. Leer a 520 nm la absorbancia (A) de la solución contra un
blanco preparado añadiendo 2 ml de reactivo de Greiss a 50
ml de agua.
NOTA: EL AGUA A USAR EN ESTAS DETERMINACIONES DEBE
ESTAR LIBRE DE NITRITOS.
3. Cálculos:
Calcular el contenido de nitritos presentes en la muestra por medio
de la curva estándar. Reportar como ppm.
Comparar el resultado obtenido con valores reportados en libros de
análisis o Norma Venezolana COVENIN.

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