Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Laboratorio de Genética Microbiana

Docentes de laboratorio de genética microbiana:

García Rangel María Virgen
Ortiz García Cesar Ismael
Calvo Villareal Ilse Citlali
Pineda López Margarita

Alumnos:
López Portillo Felipe de Jesús
Márquez San Juan María Fernanda

Práctica No. 2
“Inducción de mutantes en Escherichia coli”

Grupo: 5QM2 Equipo: 8

Sección: 2

Fecha de entrega: 21 de marzo, 2018.

Introducción.
Se entiende por mutación todo cambio heredable en el ADN no generado por recombinación genética. Las
mutaciones son la materia prima de la evolución y el origen de las formas alélicas de los genes. El termino
abarca los cambios a nivel de los genes o mutaciones ge nicas y modificaciones a nivel de los cromosomas
llamadas aberraciones cromosómicas o mutaciones cromosómicas.
Mutaciones que involucran conjuntos del inglés (“set”) completos de cromosomas se denominan mutaciones
genómicas. Las mutaciones espontaneas se originan por cambios que se producen en la molécula de ADN
como consecuencia de alteraciones en la replicación celular. En la inducción de este tipo de mutaciones juega
un rol preponderante la tautomería de las bases nitrogenadas que, al modificar de manera espontánea su
estructura química, pueden originar uniones ilegítimas G-T o A-C produciendo transiciones o transversiones en
el ADN. Se entiende por transiciones la sustitución de una purina por otra purina o de una pirimidina por otra
en la molécula de ADN. En las transversiones, en cambio, se sustituyen purinas por pirimidinas o viceversa.
Durante la duplicación del ADN pueden surgir fenómenos conformacionales en inglés (looping out) que inducen
errores en la lectura de la hebra de ADN patrón provocando inserciones o deleciones de bases nitrogenadas.
Este tipo de modificaciones puede tener efectos drásticos a nivel genético ya que se modifica el marco de
lectura de la información determinando una incorrecta inserción de aminoácidos a nivel traduccional e incluso
la temprana interrupción de la cadena polipeptídica por la lectura de un triplete de terminación anormal.

Las mutaciones espontaneas pueden también resultar de procesos de desaminacion o depurinacion en el ADN
que cambian el patrón de apareamiento de bases, en el primer caso o que favorecen la incorporación de bases
incorrectas, en el segundo. Los agentes inductores de mutaciones se pueden globalmente dividir en:

 Análogos de bases nitrogenadas;

 Agentes modificadores de bases nitrogenadas;
 Agentes alquilantes;
 Agentes intercalantes;
 Radiaciones y partículas ionizantes (alfa, beta, gamma, neutrones);
 Radiaciones no ionizantes UV;
 Agentes químicos con diferente mecanismo de acción que a-d y;
 Agentes biológicos (procariontes, eucariontes unicelulares o multicelulares parásitos);
 Otros agentes (virus, transposones).

Ya sean de tipo espontaneo o inducido, los cambios en las bases nitrogenadas pueden producir los siguientes
tipos de mutaciones:

 Sin sentido: generando codones de terminación (UAA, UAG o UGA);

 Con sentido: donde se sustituye un aminoácido por otro diferente;
 Neutrales: en las cuales se sustituye un aminoácido por otro similar;
 Silenciosas: donde no existe cambio de aminoácido por originarse un codón sinónimo y;
 “Readthrough”: en las cuales se produce el cambio de un triplete de terminación por otro con sentido
(en este caso se originan cadenas polipeptídicas de mayor longitud que lo normal).

En la luz ultravioleta (Imagen 1) las bases absorben en alto grado la radiación con una longitud de onda de
unos 260 y una de las consecuencias de esto es la fusión fotoquímica de dos pirimidinas que ocupan posiciones
contiguas en la misma cadena de polinucleotidos. En el caso de dos timinas, el producto de la fusión se conoce
como dímero de timina que comprende un anillo ciclobutano generado por enlaces entre los átomos de carbono
5 y 6 de timinas contiguas. En el caso de una timina adyacente a una citosina, la fusión resultante es un aducto
timina-citosina en el que la timina está unida por su átomo de carbono 6 al átomo de carbono 4 de la citosina.
Estas bases unidas entre sí son incapaces de aparearse con sus complementarias y hacen que la DNA
polimerasa se detenga durante la duplicación.
En el caso de hidroxilamina (HA) que es especifica de citosina, esta molécula hidroxila grupos 6-amino de la
citosina; causa transiciones GC – AT.

Los efectos de las mutaciones pueden revertirse, la posibilidad de mutaciones de reversión, o revertientes es
una característica importante que distingue las mutaciones puntuales y las inserciones de las deleciones.

 Una mutación puntual puede revertirse mediante el restablecimiento de secuencia original o la

aparición de una mutación compensatoria en otro lugar del gen.
 Una inserción puede revertirse mediante la delación de la secuencia inserta.
 Una delación de una secuencia no puede revertirse en ausencia de algún mecanismo que restablezca
la secuencia perdida

Las mutaciones que inactivan un gen se llaman mutaciones primarias o directas. Sus efectos son revertidos
por retromutaciones, que son de dos tipos: reversiones verdaderas y reversiones de segundo sitio.
Una reversión exacta de la mutación original se llama reversión verdadera. Así, si un par A-T fue reemplazado
por un par G-C en la mutación original, otra mutación que restablezca el par A-T regenerará exactamente la
secuencia original. La remoción exacta de un elemento de transposición después de su inserción es otro
ejemplo de reversión verdadera.
El segundo tipo de retromutación, la reversión de segundo sitio, puede ocurrir en cualquier lugar del gen, y sus
efectos compensan los de la primera mutación. Por ejemplo un cambio de un aminoácido en una proteína puede
suprimir su función, pero una segunda alteración puede compensar la primera y restablecer la actividad de la
proteína. Una mutación directa produce cualquier cambio que altera la función de un producto génico, mientras
que una retromutación debe restablecer la función original del producto alterado. Por lo tanto, las posibilidades
para las retromutaciones son mucho más restringidas que para las mutaciones directas.

Imagen 1. Dímeros de timina:

La luz ultravioleta induce la
formación de un anillo
ciclobutano entre timinas
contiguas.
Objetivos.
 Conocer el manejo de algunas técnicas para producir mutaciones.
 Analizar algunos parámetros que caracterizan el proceso de mutación, como la frecuencia de mutación
y la relación dosis-respuesta.
 Caracterizar el daño producido por la luz ultravioleta y la hidroxilamina, mediante pruebas de reversión.

Resultados.
Se presenta la producción de mutantes de la cepa Escherichia coli W3350 mediante el tratamiento
con hidroxilamina y luz ultravioleta, así como el número de revertantes utilizando diferentes agentes
mutágenicos, con los que caracterizara el tipo de lesión que produjeron la hidroxilamina y la luz
ultravioleta.

Tabla 1. Obtencion de mutantes de la cepa Escherichia coli W3350 de la sección 2 del grupo 5QM2
mediante el tratamiento con Hidroxilamina a diferentes concentraciones.

Equipo [HA] M # Colonias # Mutantes Título de Título de %

sobrevivientes sobrevivencia mutantes Sobrevivencia
10-5 10-6 10-5 10-6
0 Inc Inc 138 118 0 0 0 1 1.28x109 5x106 100
0.2 314 327 62 51 0 0 0 0 5.7x108 <1x105 44.53
10-4 10-5 10-4 10-5
0.4 89 128 5 12 0 0 0 0 1.09x107 <1x105 0.84
8 0.6 120 130 23 22 0 1 0 0 1.25x107 5x105 0.97
0.8 50 67 3 0 0 0 0 0 5.9x106 <1x10-5 0.46
0 135 167 9 16 0 0 0 0 1.55x108 <1x10-5 100
0.2 55 58 7 9 0 0 0 0 5.7x107 <1x10-5 36.77
10-4 10-5 10-4 10-5
0.4 118 124 8 11 2 0 0 0 1.21x107 1x105 7.8
10 0.6 50 54 4 6 0 0 0 0 5.2x106 <1x10-5 3.35
0.8 29 34 4 4 0 0 0 0 3.2x106 <1x10-5 2.06
0 240 262 66 65 0 0 0 0 6.05x108 <1x10-5 100
0.2 140 133 18 16 0 0 0 0 1.37x108 <1x10-5 22.64
10-4 10-5 10-4 10-5
0.4 38 61 1 1 0 3 0 0 4.95x107 1.5x10-4 8
12 0.6 216 228 24 29 0 0 0 0 2.22x107 <1x10-5 3.66
0.8 24 40 3 3 0 0 0 0 3.2x106 <1x10-5 0.52
Cálculos

Del número de colonias sobrevivientes y número de mutantes obtenidos por la cepa Escherichia coli
W3350 del equipo 8, después del tratamiento con Hidroxilamina a diferentes concentraciones se
procede a calcular los títulos de células viables para cada uno, de la siguiente manera:

[HA]0.2= Dil. X10-6 Promedio: 128

138 118

1 1
UFC/mL= 128 x 0.1 x = 1.28x109
1x10−6

Mutantes [HA]0.2= Dil. X10-6 Promedio: 0.5

0 1
1 1
UFC/mL= 0.5 x 0.1 x = 5x106
1x10−6

*De la misma manera se calculará el número de células viables para las demás concentraciones con
hidroxilamina, modificando el número de colonias y diluciones respectivamente.

Tabla 2. Generación de revertantes después del tratamiento de HA con los diferentes mutagenos de
la cepa Escherichia coli W3350 de la sección 2 del grupo 5QM2
Hidroxilamina
Equipo Str 9-AA 5-Bu NG HA Agua
8 SR SR SR R R SR
10 SR SR SR R SR SR
12 SR SR SR R R SR
Str: Estreptomicina; 9-AA: 9-aminoacridina; 5-Bu: 5-bromouracilo NG; Nitrosoguanidina HA: Hidroxilamina;
SR: Sin reversión; R: Reversión.
Figura 1. Curva de Dosis-Respuesta de Escherichia coli con tratamiento de Hidroxilamina a diferentes
concentraciones obtenida por el equipo 8 de la sección 2 del grupo 5QM2.
120
100
100
80
% Sobrevivencia

60 44.53
40
20
0.84 0.97 0.46
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
-20
[HA]

Figura 2. Supervivencia de células en función del tiempo o duración del tratamiento con un agente
que lesiona el DNA. La meseta de la línea azul representa los mecanismos de reparación activados
en el DNA.8
Tabla 3. Obtención de mutantes de la cepa Escherichia coli W3350 de la sección 2 del grupo 5QM2
mediante el tratamiento con ultra violeta a diferentes tiempos de exposición.
Equipo Tiempo de # Colonias # Mutantes Título de Título de %
exposición sobrevivientes sobrevivencia mutantes Sobrevivencia
10-5 10-6 10-5 10-6
7 0” 55 61 11 9 0 0 0 0 5.8x107 <1x10-5 100
15” 37 35 2 1 0 0 0 0 4.4x107 <1x10-5 62
30” 36 39 1 3 1 0 0 0 3.75x107 5x105 64
45” 12 4 1 2 0 0 0 0 7x106 <1x10-5 13
60” 10 -4 10-5 10-4 10-5
15 5 1 2 0 0 0 0 1x106 <1x10-5 2
9 0” 300 383 21 18 0 0 0 0 3.41x108 <1x10-5 100
15” 56 39 4 4 0 0 0 0 4.75x107 <1x10-5 13.91
30” 13 25 1 0 0 0 0 0 1.9x107 <1x10-5 5.56
45” 7 8 2 0 0 0 0 0 7.5x105 <1x10-5 2.19
60” 10 -4 10-5 10-4 10-5
7 5 0 1 0 0 0 0 6x105 <1x10-5 0.18
11 0” 45 32 3 7 0 0 0 0 3.85x107 <1x10-5 100
15” 10 4 0 0 0 0 0 0 7x106 <1x10-5 18.18
30” 5 4 1 0 0 0 0 0 4.5x106 <1x10-5 11.18
45” 3 0 1 0 0 0 0 0 1.5x106 <1x10-5 3.89
60” 10-4 10-5 10-4 10-5
3 14 0 0 0 0 0 0 8.5x105 <1x10-5 2.20

Tabla 4. Prueba de revertantes de la cepa Escherichia coli W3350 mediante el tratamiento con luz
ultravioleta.
Luz UV-Vis
Equipo Str 9-AA 5-Bu NG HA Agua
7 SR SR SR SR SR SR
9 SR SR SR SR SR SR
11 SR SR SR R SR SR
Str: Estreptomicina; 9-AA: 9-aminoacridina; 5-Bu: 5-bromouracilo NG; Nitrosoguanidina HA: Hidroxilamina;
SR: Sin reversión; R: Reversión.
Ejercicio 1. Determinar la frecuencia de mutagénesis de acuerdo a la fórmula del manual7 usando el
porciento de sobrevivientes determinado en la Tabla 1 del equipo 8.
Tiempo de
[HA] exposición con # Mutantes Promedio Título de Título de
luz U.V (seg) 10-3 mutantes sobrevivientes
0 0 0 1 0.5 5x103 1.28x109
0.2 15 1 2 1.5 1.5x104 5.7x108
0.4 30 1 2 1.5 1.5x104 1.09x107
0.6 45 3 2 2.5 2.5x104 1.25x107
0.8 60 1 1 1 1x104 5.9x106
Cálculos
Título de mutantes
FM = 𝑇í𝑡𝑢𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑏𝑟𝑒𝑣𝑖𝑣𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒𝑠

De los datos obtenidos:

5𝑥103 2.5𝑥104
FM0 = 1.28𝑥109= 3.90x10-6 FM 0.6 = 1.25𝑥107 = 2x10-3
1.5𝑥104 1𝑥104
FM 0.2 = 5.7𝑥108=2.63x10-5 FM 0.8 = 5.9𝑥106= 1.69x10-3
1.5𝑥104
FM 0.4 = 1.08𝑥107=1.38x10-3

Figura 3. Curva de Dosis-Respuesta, considerando la dosis de mutágeno empleadas y las frecuencias

de mutación calculadas del Ejercicio 1.
0.0025

0.002
Frecuencia de Mutación

0.0015

0.001

0.0005

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
-0.0005
[HA]

Discusión.

Mediante el tratamiento con hidroxilamina (HA) a diferentes concentraciones se obtuvieron un numero de

colonias incontables en la dilución 10-5, mientras que en la dilución 10-6 se obtuvo un promedio de 128 UFC/mL
(Tabla 1), razón por la cual se contempló dicha dilución para la determinación del número de sobrevivencia de
la cepa de Escherichia coli W3350, la cual presenta marcadores Lac+, Sms, Gal-, F- y Su-. En la dilución 106 en
la concentración 0 M de HA se encontró una mutante, sin embargo la frecuencia de mutación de que exista una
mutante espontanea es de 1 en 109 – 1010 generaciones2; debido a que el agar MacConkey contiene rojo neutro
como indicador de pH y, en consecuencia, las colonias metabolizadores de lactosa aparecen rosadas por la
producción de ácidos mixtos. Las bacterias productoras de ácidos fuertes como E. coli forman colonias rojo-
rosa profundo con un precipitado rosado difuso en el agar que rodea las colonias causado por la precipitación
de las sales biliares en el medio que ocurre con un pH bajo.6 Conforme al crecimiento de la bacteria se van
produciendo mayor cantidad de ácidos mixtos, por lo que se van intensificando estos indicadores de color, en
consecuencia se atribuye que se pudo haber confundido una mutante con una colonia joven que aún se
encuentra en la fase logarítmica o exponencial.
El título de sobrevivencia depende de la interacción de la célula con el agente mutante,7 el % de sobrevivencia
sigue una relación inversamente proporcional respecto a la dosis (Figura 2). Varias de las interacciones de la
célula con el agente mutagenico (HA) y algunas de las mutaciones en el DNA no reparadas pueden conducir a
la muerte de la célula, o impedir que ésta tenga descendencia. En tal caso, y con base a la Figura 1, el número
de células mutadas o dañadas es proporcional a la dosis de dicho agente mutagénico con lo que guiándonos
con la Figura 2, que, a pesar de no especificar el microorganismo o el tratamiento, se observa que sigue la
misma tendencia ambas gráficas y que, además, no hubo una meseta donde nos indique que hubo mecanismos
de reparacion, sin embargo, en la concentración de 0.6 M de HA se observa un mayor porcentaje de
supervivencia a diferencia de la concentración a 0.4 M la cual se esperaba menor a esta, de tal modo que la
imprecisión de este dato es el reflejo de algún error indeterminado durante la metodología. Un paso crítico en
la inducción de mutantes es la realización de las diluciones seriadas, la medición al pipetear y transferir
volúmenes muy pequeños incrementa la posibilidad de cometer algún error en la medición, la percepción en el
nivel de la muestra con respecto a la graduación de la pipeta y el mal manejo del material influye, ya que todos
los materiales de medida están sujetos a este tipo de errores.8 Por otro lado, los errores causados por el analista,
son algo difíciles de detectar y rectificar, estos pueden haberse originado como consecuencia de malas
condiciones de trabajo o el seguimiento incorrecto del protocolo, manteniendo los tiempos de agitación e
incubación diferentes a los de este, generando así variables en los resultados.
Con respecto a la luz UV no se obtuvieron revertantes en todos los equipos (Tabla 4) por que el tiempo de
exposicion afecta al daño del DNA, un mayor tiempo de exposición causa daños severos (transiciones y
reversiones) que la célula ya no puede reparar.

Los tres genes lac-lacZ, lacY y lacA- se distribuyen en el genoma de Escherichia coli, los cuales participan en
el metabolismo de la lactosa. Estos genes se expresan en grado alto sólo cuando en el medio hay Lactosa y la
glucosa no está disponible. El gen lacZ codifica la enzima β-galactosidasa, que escinde el disacárido lactosa
en disacárido galactosa y glucosa, para que la célula las utilice como fuentes de energía. El gen lacY codifica
la lactosa permeasa, una proteína que transporta la lactosa hacia el interior de la celula. El gen lacA codifica
tiogalactosidos tóxicos que también transporta el producto del gen lacY.3 Las mutaciones de lacZ o lacY pueden
crear un genotipo lac que se caracteriza por la imposibilidad de las células de utilizar lactosa. 2 En el caso de
una mutante por el tratamiento de HA que es especifica de citosina, esta molécula hidroxila grupos 6-amino de
la citosina; causa transiciones GC – AT, por lo que estas transiciones pueden afectar a cualquiera de estos
genes impidiendo que la bacteria degrade la lactosa. Para demostrar el efecto revertante se vuelve a inducir un
reversión con diferentes tratamientos de mutagenos entre los que usamos fueron: los análogos de base (5-
bromouracilo y 2-aminopurina) que inducen mutaciones debido a que presentan cambios tautomericos, con una
mayor frecuencia que las bases nitrogenadas normales. Los agentes modificadores (ácido nitroso,
hidroxilamina) cambian la estructura química de las bases nitrogenadas mediante procesos de desaminacion,
hidroxilacion, entre otros. Los agentes alquilantes (nitrosoguanidina) introducen grupos metilo o etilo en las
bases del ADN. El efecto mutagenico de los agentes modificadores y alquilantes se produce como
consecuencia del cambio del patrón de apareamiento de bases. Los agentes intercalantes (9-aminoacridina)
son moléculas planas que se introducen entre los pares de bases distorsionando la copia complementaria de
bases durante la replicación generando inserciones y delaciones de bases. La radiación ultravioleta origina
dímeros de pirimidina y 6-4 fotoproductos intra e intercatenarios.4 En el equipo 8 hubo reversión con
nitrosoguanidina e hidroxilamina en el medio mínimo lactosado donde hubo crecimiento alrededor del disco de
papel filtro con dichas soluciones impregnadas (Tabla 2). Por lo que se puede deducir que la HA y la
nitrosoguanidina son mutagenos que causan sustituciones, es decir, transiciones entre pares de bases.

La frecuencia de mutación nos indica la proporción de mutantes en una determinada población, está puede
aumentarse significativamente con el uso de agentes mutagénicos, como se interpreta en el Ejercicio 1. En
este se determinó la frecuencia de mutación conforme al título de mutantes y título de sobrevivientes calculados;
en donde se observa que la mayor frecuencia de mutaciones inducidas es a mayores concentraciones de HA
(Figura 3). Una manera de disminuir la frecuencia de mutación es por medio de mecanismos como la
fotorreactivación, esto se debe a la activación de una enzima llamada fotoliasa, que corta los dímeros de
timina en presencia de luz.

Conclusiones

 Se conocio el manejo de algunas técnicas para producir mutaciones.

 Se analizaron algunos parámetros que caracterizan el proceso de mutación, como la frecuencia de
mutación y la relación dosis-respuesta.
 Se caracterizaron el daño producido por la luz ultravioleta y la hidroxilamina, mediante pruebas de
reversión.
 La hidroxilamina es un agente revertante, hidroxila al grupo amino.
 La estreptomicina índice una lesión de tipo supresión.
 9-aminoacridina produce una lesión de tipo intercalante.
 Nitrosoguanidina produce una lesión de tipo alquilante.
 5-bromouracilo actua como análogo de bases.

Bibliografía.
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