INSTITUTO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD

“Dr. Nestor Morales Villazón”

I.N.L.A.S.A.

PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS
DE LA RED NACIONAL
DE TOXOPLASMOSIS

Niveles I, II y III

AUTORES:
Dr. Sergio MOLLINEDO
Dr. José SANTALLA
Tec. Sup. Pamela DURAN

1
 CONTENIDO

I. ESTRUCTURA Y REGLAMENTO DE LA RED NACIONAL

DE LABORATORIOS DE DIAGNOSTICO DE LA TOXOPLASMOSIS

DEFINICIÓN

ESTRUCTURA

LABORATORIO NIVEL I:

LABORATORIO NIVEL II

LABORATORIO NIVEL III

II. PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS PATRON (POPs)

OBTENCIÓN DE MUESTRA
Obtención de sangre por punción venosa
Obtención de sangre por punción capilar
Uso de anticoagulantes

REGISTRO DE MUESTRAS

CRITERIOS DE RECHAZOS DE MUESTRAS

CENTRIFUGACIÓN DE MUESTRAS

TRANSPORTE DE MUESTRAS

CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA (suero o plasma)

DESINFECCIÓN DE MATERIAL CONTAMINADO

ENTREGA DE INFORME DE RESULTADOS

CONDUCTA ANTE UN DIAGNÓSTICO BIOLÓGICO DE

TOXOPLASMOSIS

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III. PROCEDIEMIENTOS TECNICOS

AGLUTINACIÓN DIRECTA

HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA (HAI)

Fundamentos

ENZIMOINMUNOENSAYO CLÁSICO DE TOXOPLASMOSIS (Ig. G)

Principios y fundamentos
Material, reactivos y equipos
Calibración y control
Procesamiento
Lectura e interpretación
Limitaciones del método
Reporte y liberación de resultados

ENZIMOINMUNOENSAYO CLÁSICO DE TOXOPLASMOSIS (Ig. M)

Principios y fundamentos
Material, reactivos y equipos
Calibración y control
Procesamiento
Lectura e interpretación
Limitaciones del método
Reporte y liberación de resultados

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
Pricipios y fundamento
Material, reactivos y equipos
Control
Procesamiento
Lectura e interpretación
Fuentes de error
Reporte y liberación de resultados

IV. BIBLIOGRAFÍA

GLOSARIO

ANEXOS

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 I. ESTRUCTURA Y REGLAMENTO DE LA RED
NACIONAL DE LABORATORIOS DE DIAGNOSTICO
DE TOXOPLASMOSIS:

DEFINICIÒN:

La Red Nacional de Laboratorios de Diagnostico de la Toxoplasmosis es el

conjunto de laboratorios que efectúan diagnostico de laboratorio de la esta
patología, estableciendo en todos los servicios Departamentales de Salud
del País, que ejecutan técnicas y procedimientos normalizados dirigidos a
apoyar el diagnostico y control de la Toxoplasmosis en todos los niveles de
atención en salud.

ESTRUCTURA:

La estructura orgánica de la Red de Laboratorios de diagnóstico de la

Toxoplasmosis para su funcionamiento esta organizada en los siguientes
niveles:

 Laboratorio Nacional de Referencia establecido en el Instituto

Nacional de Laboratorios de Salud INLASA, mediante
resolución Ministerial Nº 175/2003.
 Laboratorios Departamentales ubicados en cada capital de
Departamento
 Laboratorios Municipales
 Laboratorios de Centros de Salud y Puestos de Recolección de
Muestra

Estos se encuentran clasificados en niveles de acuerdo a la complejidad,

equipamiento, material y disponibilidad de recursos humanos.

 Laboratorios de Nivel
 Laboratorios de Nivel II
 Laboratorios de Nivel III

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LABORATORIOS DE NIVEL I.

Son aquellos servicios que realizan pruebas básicas serológicas de

tamizaje epidemiológico, cuentan con un equipo mínimo, ambientes,
material; su actividad esta en función a la disponibilidad de recursos
humanos.

EFECTUAN:

1. Funciones Técnicas:
 Toma, envió y desecho de muestras
 Registro de la muestra
 Obtención del suero o plasma
 Técnica de Aglutinación Directa (AD)
 Técnica de Hemoaglutinación Indirecta (HAI)
 Información a la comunidad
 Envió de muestras a nivel superior de la red.

2. Funciones administrativas:
 Envió de informes al Laboratorio Departamental.
 Envió de sueros problema para confirmación diagnostica a
nivel superior de la Red.
 Envió de sueros para el control de calidad
 Solicitud y requerimientos

DEPENDENCIA Y OBLIGACIONES:

Administrativamente dependen del Servicio Departamental de Salud

SEDES donde estén establecidos. Técnicamente dependen del Laboratorio
Departamental y de la Red Nacional, en ambos sistemas deben trabajar
en estrecha coordinación, para cumplir sus funciones en forma óptima.

OBLIGACIONES:

 Brindar atención permanente al paciente de su área.

 Cumplir las disposiciones técnicas que rigen los Laboratorios
de Nivel I tanto para las medidas de Bioseguridad,
procedimientos técnicos y administrativos garantizando la
buena calidad de ejecución de estos.
 Cumplir con el envió de sueros problema para confirmar el
diagnóstico
 Cumplir con el envió de sueros positivos y negativos para el
control de calidad

5
  Enviar oportunamente la solicitud de requerimientos para el
cumplimiento de sus funciones
 Participar en las actividades de reciclaje, capacitación e
información determinadas por el Laboratorio departamental o
la Red nacional

PERSONAL:

El laboratorio debe contar con personal calificado, dependiente de cada

DILOS o SEDES.

MATERIAL Y REACTIVOS NECESARIO PARA SU FUNCIONAMIENTO

 Kit Diagnostico Aglutinación Directa

 Kit Diagnostico Hemoaglutinación Indirecta
 Tubos de hemólisis
 Hipoclorito de Sodio al 0,5% (lavandina)
 Guardapolvo
 Guantes

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LABORATORIOS DE NIVEL II

Son aquellos servicios que cuentan con capacidad instalada, ambientes y

áreas especificas para realizar pruebas de detección de títulos de
anticuerpos específicos y así detectar la etapa en la que se encuentra la
enfermedad.

EFECTUAN:
1. Funciones Técnicas:
 Técnica de Enzimo inmuno ensayo Toxoplasmosis para
detección de Ig. M
 Técnica de Enzimo inmuno ensayo Toxoplasmosis para
detección de Ig. G
 Hemoaglutinación semi cuantitativa

2. Funciones Administrativas:
 Capacitación
 Supervisión Directa e Indirecta
 Evaluación
 Coordinación con e Laboratorio Nacional de Referencia
 Envió de Información al Laboratorio Nacional de Referencia.
 Envió de sueros problema para confirmación diagnostica a
nivel superior de la Red.
 Envío de sueros para el control de calidad
 Programar los requerimientos e insumos en su región.

DEPENDENCIA Y OBLIGACIONES:

Los laboratorios del Nivel II administrativamente dependen del Servicio

Departamental de Salud SEDES donde estén establecidos. Técnicamente
dependen del Laboratorio Nacional de referencia, en ambos sistemas
deben trabajar en estrecha coordinación, para cumplir sus funciones en
forma óptima.

OBLIGACIONES:

 Cumplir las disposiciones del presente reglamente tanto en el

ámbito técnico como administrativo.
 Ejecutar las técnicas y procedimientos del laboratorio de
acuerdo a las normas de aplicación establecidas por el
Laboratorio de Referencia Nacional de Toxoplasmosis.
 Cumplir con las regulaciones propias de su nivel respecto al
control de calidad.

7
  Confirmar el diagnóstico y titulación de los sueros problemas
enviados por laboratorios periféricos.
 Cumplir con el envió de sueros positivos y negativos para el
control de calidad al Nivel III

PERSONAL:

Debe contar con personal calificado, profesionales bioquímicos o Técnicos

en Laboratorio Clínico dependientes de la SEDES.

MATERIAL Y EQUIPOS:

Debe contar con el equipo necesario para ejecutar las pruebas ya

mencionadas.

Equipo:
 Lector de ELISA
 Incubadora

Material:
 Kit Diagnostico Enzimo inmunoensayo toxoplasmosis Ig. M
 Kit Diagnostico Enzimoinmunoensayo toxoplasmosis Ig. G
 Kit Diagnostico Hemaglutinación Inrecta Semicuantitativo
 Tubos de hemolisis
 Tips
 Micropipetas
 Hipoclorito de Sodio al 0,5% (lavandina)
 Guardapolvo
 Guantes

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LABORATORIOS DE NIVEL III:

Constituido por el Laboratorio de Nacional de Referencia que emite

normas técnicas y administrativas, realiza técnicas de mayor complejidad.
Cumple las funciones de Dirección de la Red Nacional de Laboratorios de
Diagnostico de Toxoplasmosis, ejecutando funciones de normalización
técnica y administrativa, además de investigación básica y epidemiología.

FUNCIONES:

Es el laboratorio que tiene la capacidad de realizar la funciones técnicas

siguientes:

1. Funciones Técnicas:
 Inmunofluorescencia Indirecta
 ISAGA Ig. M
 PCR
 INMUNOBLOT

2. Funciones Administrativas:

 Organización y Dirección de la Red

 Capacitación
 Supervisión
 Evaluación
 Programación de actividades
 Programación de insumos y materiales
 Recolección de información
 Análisis de datos
 Envió de resultados de pruebas complejas a los laboratorios
departamentales.

DEPENDENCIA Y OBLIGACIONES:

Depende directamente del Instituto Nacional de Laboratorios de Salud y

efectúa actividades coordinando en forma estrecha con las SEDES a nivel
nacional.

OBLIGACIONES:

 Implementar y ejecutar las técnicas y procedimientos, de

mayor complejidad en forma óptima.
 Elaborar de normas técnicas
 Elaborar normas administrativas

9
  Ejecutar sistemas de control de calidad interno y externo.
 Supervisar directa e indirecta de Laboratorios dependientes de
la red.
 Diseñar programas de capacitación
 Diseñar sistemas de Evaluación Nacional
 Elaborar informes escritos de control de calidad nacionales y
departamentales.
 Programar actividades nacionales e internacionales

PERSONAL:

Debe contar con personal especializado, profesionales Médicos,

Bioquímicos, Biólogos y Técnicos superiores en Laboratorio Clínico
dependientes del MSyD.

MATERIAL Y EQUIPOS:

Debe contar con el equipo necesario para ejecutar las pruebas ya

mencionadas.

Equipo:
 Microscopio de inmunofluorescencia.
 Campana de flujo laminar
 Centrifugadoras
 Estufas de cultivo
 Heladeras
 Aparato de hibridación
 Balanza de precisión
 Vortex
 Agitador magnético
 Container de Nitrógeno líquido
 Campana de extracción
 Cámara Húmeda

Material:
 Guantes
 Secador de cabello
 Portaobjetos especiales IFI
 Cubreobjetos 24 x 48mm
 Jarras Koplin
 Vasos de precipitado

10
  Frasco gotero
 Papel filtro
 Micropipetas
 Tips
 Tubos de hemólisis
 Gradillas


Reactivos:
 Solución Buffer fosfato salina Ph 7,2 (PBS)
 Antígeno Toxoplasma gondii
 Anti gamma globulina Humana marcada con
isotiocianato de fluorescenina o conjugado.
 Azul de Evans
 Solución de montaje.
 Kit ISAGA
 Kit PCR

11
 II. PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS PATRON
(POPs)

OBTENCIÓN DE MUESTRA

La sangre puede considerarse como el liquido biológico en el que se

pueden realizar un numero mayor de análisis cuantitativos. Antes de
realizar cualquier análisis debe asegurarse la adecuada calidad de la
muestra.

El profesional responsable debe instruir detalladamente utilizando un

lenguaje claro y adecuado al paciente sobre los cuidados que debe seguir
antes de la obtención de muestra.

Para la adecuada obtención de un volumen de sangre destinado a realizar

la prueba serológica de Toxoplasmosis, se utilizaran:
 punción venosa (en adultos)
 punción capilar (pacientes pediátricos, con
quemaduras severas, obesos, con tendencias
tromboticas, geriátricos, etc).

Las muestras deben ser obtenidas con medidas de bioseguridad

adecuadas: uso de mandil de protección, guantes, barbijo, .......

Debe existir estricta relación de identidad entre el etiquetado de la

muestra, el formulario de solicitud del medico que además debe llevar
datos del diagnostico presuntivo y orientadores de la patología que sufre el
paciente.

Luego de la toma de muestra, el material utilizado debe ser desechado en

recipientes adecuados y con un rotulo de material peligroso.

OBTENCIÓN DE SANGRE POR PUNCIÓN VENOSA

 SITIO DE PUNCIÓN: vena cefálica o mediana cubital, femoral,

yugular, venas del dorso de la mano.

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  ANTISÉPTICO: Alcohol al 70%
 TORNIQUETE: Aplicar por el lapso de un minuto y liberarlo
después de la punción.
 AGUJAS Y JERINGAS DESECHABLES: Estériles, de volumen
entre 3 a 5 ml. Con agujas Nº 21 a 23G , en niños se recomienda
aguja mariposa Nº 21 a 23G.

Una vez extraída la sangre debe colocarse desde la jeringa, sacando

previamente la aguja para evitar hemólisis y formación de espuma, a un
tubo limpio y seco rotulado con el nombre del paciente. Los tubos pueden
tener o no anticoagulante, luego se deben tapar y enviar al laboratorio lo
mas antes posible (dentro de 45 minutos como máximo).

OBTENCIÓN DE SANGRE POR PUNCIÓN CAPILAR

 SITIO DE PUNCIÓN: Existen diversas alternativas:

- Dedo anular en su superficie palmar en el ultimo segmento
(yema del dedo).
- Lóbulo de la oreja.
- Superficie plantar media o lateral del talón.
- Dedo grande del pie en su superficie plantar en el último
segmento (yema del dedo).

 PROCEDIMIENTOS PARA CALENTAR LA ZONA DE PUNCIÓN:

Cubrir el sitio con una toalla húmeda o bien utilizar una bolsa de
agua, a una temperatura no superior de 42ºC por un mínimo de
tres minutos
 ANTISÉPTICO: Alcohol al 70%
 ENVASES: Capilares con o sin heparina.
 RECOLECCIÓN: Eliminar las dos primeras gotas con algodón
seco, recoger la sangre por capilaridad presionando suavemente
alrededor del sitio de punción. Sellar los capilares en un extremo
con plastilina.

Nota: por este tipo de punción no siempre se obtiene una muestra

significativa.

13
Recomendaciones:
En el informe indicar el tipo de punción realizada.
No se debe usar agujas para jeringa.

USO DE ANTICOAGULANTES

Se puede realizar la técnica con suero o plasma, por lo que se puede o no

utilizar anticoagulante.

REGISTRO DE MUESTRAS

Debe existir un libro de registros en los que se inscriba los datos del
paciente como:
 Nombre completo
 Edad
 Sexo
 Procedencia
 Antecedentes clínicos de la enfermedad:
 Antecedentes gineco obstétricos (Menarca, gesta, para, abortos,
FUM)
 Tipo de prueba a realizarse

CRITERIOS DE RECHAZO DE MUESTRAS

Bajo las siguientes condiciones las muestras no deben ser aceptadas para
su análisis:
 Identificación inadecuada o falta de identificación
 Muestras hemolizadas
 Transporte inadecuado (ejemplo: tapones mojados, tubos rotos,
no refrigerados, muestras no conservadas)
 Ordenes de examen que no contengan todos los datos: nombre,
edad, sexo, procedencia y antecedentes clínicos de la
enfermedad, en casos de mujeres embarazadas tiempo de
gestación y antecedentes gineco obstétricos.

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CENTRIFUGACIÓN DE MUESTRAS

 No centrifugar las muestras de sangre hasta que coagulen

adecuadamente.
 Nunca desprender el coagulo adherido con aplicador o similar, ya
que es una potencial fuente de hemólisis.
 Centrifugar las muestra lo mas rápidamente posible.

TRANSPORTE DE MUESTRA

 Tiempo: Se debe hacer llegar la muestra al Laboratorio tan

pronto como sea posible, máximo dentro de los 45 minutos, evitar
temperatura ambiente de 30ºC o mas.
 Identificar las muestras infecciosas: hepatitis (+), VIH (+) con
etiqueta especial de tal manera que las diferencie de las otras.
 Las muestras deben ser transportada en forma de suero o plasma
y no así como sangre entera.

CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA (SUERO O PLASMA)

 Si la muestra será procesada dentro de la primera semana de

haber sido obtenida, se conservará a una temperatura de 2 a
8ºC.
 Si la muestra se procesará pasada la primera semana de haber
sido obtenida se conservará a una temperatura de –10ºC.
 Es importante evitar ciclos de descongelamiento repetidos.

DESINFECCIÓN DE MATERIAL CONTAMINADO

Se realizará la desinfección del material empleado y superficies

(mesones) con una solución de hipoclorito de sodio al 0,5% (una
parte de lavandina que contiene hipoclorito de sodio al 5% y 9 partes
de agua ) o 1% (1 parte de lavandina que contiene hipoclorito de
sodio al 5% y 4 partes de agua).

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ENTREGA DE INFORME DE RESULTADOS

Se debe establecer un protocolo (ver ejemplo en anexos) general de

entrega de resultados:
 Fecha de entrega
 Lugar y vía de despacho (personal, correo ordinario, fax, etc)
 Establecer un libro de registro de la fecha de despacho, vía,
identificación de la persona que lo retira.

CONDUCTA ANTE UN DIAGNÓSTICO BIOLÓGICO DE

TOXOPLASMOSIS:

Las situaciones clínicas en las cuales se realiza la exploración de la

respuesta humoral específica (serodiagnóstico) de Toxoplasmosis se
pueden resumir en cuatro situaciones tipo:
 En la mujer embarazada en su control pre natal
 En producto de la gestación
 En inmunocompetentes
 En inmunodeprimidos

a) Embarazada en su control pre natal: La Ley Nº 2426 del Seguro

Universal Materno Infantil (SUMI), implementa servicios
complementarios de diagnóstico de una serie de enfermedades
parasitarias, una de ellas es la Toxoplasmosis, este examen
complementario es incluido como parte de un plan de prevención de
la infección congénita y no del diagnóstico de la enfermedad en la
embarazada.
El objetivo es el de identificar lo más antes posible a las mujeres en
riesgo (mujeres seronegativas), y en caso de detectar la positivodad
de las reacciones serológicas, contribuir a excluir una infección
reciente.
Los métodos diagnósticos difieren del nivel de la red donde se
realicen diferentes pruebas:

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 - Nivel I: HAI, AD
- Nivel II: HAI, ELISA
- Nivel III: HAI; ELISA; ELISA inverso, ISAGA, PCR,
INMUNOBLOT

Serología no reactiva (negativa): El objetivo esta puesto en el

descubrimiento de pacientes embarazadas sero negativas, en las
cuales se tendrá que evitar su primo infección y el riesgo probable de
transmisión al feto, estas embarazadas entran a un plan preventivo
de información (profilaxis de la enfermedad) y al seguimiento
serológico cada 8 a 12 semanas (repetición de la serología) hasta la
finalización del embarazo; estas acciones también se realizan en
otras gestaciones mientras la paciente sea susceptible a la infección.

Serología reactiva (positiva): Cuando la prueba de una paciente es

sero positiva para Ig. G, es necesario dilucidar el estadio clínico de la
infección, mediante la investigación de la presencia de Ig. M (o
también Ig. A), además de la repetición de la prueba a las 3
semanas; de no existir cambios en la tasa de Ig. G y de ser negativa
la Ig. M (Ig. A) , se concluye que la paciente esta en estadio crónico
de la enfermedad y no existe posibilidad de transmisión de la
enfermedad al feto, por lo que nuevos exámenes son innecesarios.

Seroconversión positiva: Si en estos exámenes aparece una sero

conversión (la serología previamente negativa de la paciente se
vuelve positiva), el laboratorio deberá determinar la presencia de
Inmunoglobulina M se deberá recomendar el inicio del tratamiento y
la confirmación de los resultados remitiendo a la paciente a un nivel
superior en la red de laboratorios.

17
b) En el producto de la gestación: Si el diagnóstico de infección
materna se confirma lo más importante es precisar si existe o no
infección fetal; el riesgo de contaminación fetal cuando la madre a
tenido una seroconversión en su embarazo varia de 5 a 80%
dependiendo de la fecha de contaminación, por lo tanto toda primo
infección de la embarazada debe hacernos proponer un diagnóstico
antenatal y si no se realiza este, deberá realizarse un abanico de
pruebas al nacimiento del niño, seguido de un control periódico
serológico que permita confirmar o desestimar el diagnóstico de
infección congénita.
Para este efecto el Nivel I tendrá que remitir el paciente a un nivel de
mayor complejidad para que se realicen un abanico de pruebas que
permitan emitir un diagnóstico mediante:

Diagnóstico antenantal:
 amniocentesis
 Cordonocentesis

Diagnóstico posnatal:
 sangre del niño para buscar IgM o IgA anti-Toxoplasma,
por medio de ELISA, western blot o ELIFA.

c) Diagnóstico en Inmunocompetentes: Las adenopatias cervicales, a

veces asociadas con fiebres fugaces en niños pueden hacernos
pemnsar en una primo infección por Toxoplasma; la serología
permite confirmar el diagnóstico.
La Corioretinitis toxoplasmica puede ser observada por una
reactivación endógena de una infección congénita (niño o adulto
joven), siendo raro observarla como primo infección, también en
este tipo clínico se puede realizar pruebas con el humor acuoso.

18
 d) En el Inmunodeprimido: En este tipo de pacientes conviene
identificar sobre todo a los sujetos en riesgo de reactivar una
Toxoplasmosis anteriormente adquirida, una quimioprofilaxis
específica es recomendada cuando existe una inmunodepresión
importante.
Se recomienda la utilización de técnicas serológicas las más
sensibles.

DISPOSICIONES REGLAMENTARIAS
1) Todo Examen deberá precisar el umbral de positividad del reactivo

2) El examen inicial o los posteriores de seguimiento, comprenden la

utilización de por lo menos dos técnicas diferentes.

3) El estudio sistemático de la Ig G e IgM es obligatorio; en el Nivel I la

detección de Inmunoglobulina G debe ser obligatoria.

4) Un examen de control debe estar previsto cuando se encuentren tasas

límites o de sospecha de infección reciente.

5) Al final de cada examen el laboratorio debe aportar una conclusión al

médico solicitante sobre la presencia o ausencia de anticuerpos anti-
toxoplasma, la ancianidad probable en caso de positividad

6) El laboratorio deberá eventualmente proponer al médico solicitante las

modalidades de seguimiento serológico.

7) En caso de un resultado que sea límite (se aproxime al umbral), una nueva
muestra de control se aconseja a los 21 días (3 semanas).

8) En caso de sospecha de infección reciente (presencia de Ig M), un

seguimiento serológico es recomendado, utilizando técnicas complementarias
que permitan estimar la fecha de contagio particularmente en la mujer
embarazada.

19
 III. PROCEDIEMIENTOS TECNICOS

Durante una infección por Toxoplasma no existen síntomas específicos de

esta infección por lo tanto la sospecha clínica requiere siempre la
confirmación por el laboratorio. El laboratorio juega, entonces, un papel
crucial para determinar la etiología en esta infección parasitaria. La
estrategia diagnóstica puede basarse en técnicas serológicas que midan
anticuerpos específicos o técnicas cualitativas y semi cuantitativas que
establezcan perfiles inmunológicos comparados. Estos perfiles
inmunológicos comparados permiten distinguir entre anticuerpos
maternos y fetales o una neoproducción. Cuando se sospecha un déficit
inmunitario o una producción débil de anticuerpos, como en los casos de
inmunosupresión o infección fetal se puede emprender la detección directa
del parásito tanto en ratón como en cultivo celular o evidenciar su
presencia por la amplificación de un segmento del ADN del parásito.

El diagnóstico se puede basar en pruebas serológicas que evidencian la

presencia de inmunoglobulinas específicas IgG, IgM, IgA o IgE. Es
importante conocer la cinética de aparición de los anticuerpos y el tiempo
de duración de cada isotipo de inmunoglobulinas para realizar la
interpretación de las pruebas serológicas en el inicio de la infección. Las
infecciones clínicamente importantes pertenecen (salvo en el caso de los
inmunosuprimidos) a infecciones recientes. La cinética va a depender de la
técnica de detección de anticuerpos que se utilice y los métodos de
fabricación del antígeno. El patrón que se menciona a continuación se
refiere a lo que se halla por Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) o las
técnicas inmunoenzimáticas (ELISA) o en la Aglutinación directa (AD) en el
caso de la IgG. La IgG aparece 1 a 3 semanas después de adquirida la
infección y alcanza su máximo nivel 3 a 6 meses después para luego
descender y quedar a bajos niveles por el resto de la vida. La elevación de
IgG específicas para Toxoplasma en muestras tomadas con un intervalo de
cuatro semanas puede ser utilizada como criterio diagnóstico pero tiene el
inconveniente de que retarda el diagnóstico. La detección de IgM fue
propuesta como marcador de infección activa. La técnica de
Inmunofluorescencia Indirecta (IFI-IgM) no tiene una buena sensibilidad
ya que la detección puede ser bloqueada por la presencia de IgG en altos
niveles o factor reumatoideo, sólo entre 10-25 % de las toxoplasmosis
agudas son positivas por esta técnica.

La mayor utilidad del test específico para IgM es para determinar si una
mujer embarazada no se ha infectado recientemente. Una prueba negativa

20
para IgM en una mujer embarazada descarta virtualmente una infección
reciente.

La utilización del PCR en el diagnóstico de la toxoplasmosis aporta un

progreso indiscutible en aquellos casos donde los exámenes clínicos y
serológicos son inoperantes, así como una mayor rapidez para realizar el
diagnóstico, dando resultados disponibles en 24 horas.

21
AGLUTINACIÓN DIRECTA

Principio:
Es una técnica simple que posibilita la detección cualitativa de
anticuerpos en suero o plasma.

Los anticuerpos tanto IgG como IgM se detectan mediante una reacción
inmunológica de aglutinación, utilizando el reactivo látex que posee anti
IgG y anti IgM absorbidas sobre las partículas de látex.

Mezclando de forma directa la muestra con el reactivo látex la presencia

de anticuerpos tanto IgG como IgM, dan lugar a la aglutinación de las
partículas de látex que se visualiza macroscópicamente.

La cantidad de anticuerpos aglutinada con antígeno creciente es lineal al

principio y en un momento alcanza un pico (punto de equivalencia).
Frente a un exceso de antígeno la cantidad de anticuerpo aglutinado por lo
general disminuye dado que ya no se forman los enlaces cruzados
adecuados para la formación de grandes complejos.

22
 HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA

Fundamento:

El reactivo consiste en una suspensión de hematíes estabilizados,

sensibilizados con antígeno purificado obtenido a partir Toxoplasma
gondii cultivado en exudado peritoneal de ratón.
Estos hematíes reaccionan con los anticuerpos específicos presentes en el
suero del paciente, formando una malla homogénea en la policubeta (caso
positivo).

Si los anticuerpos específicos están ausentes, los hematíes sedimentan

formando un botón nítido en la poli cubeta (caso negativo).

El equipo para realizar Hemoaglutinacion indirecta (HAI), proporciona el

material para la rápida determinación de anticuerpos anti-Toxoplasma
gondii.

La Aglutinación emplea un antígeno que consiste en trofozoitos enteros

formalinizados o fijados con acetona. La muestra de suero debe ser
previamente tratada para eliminar las IgM. La lectura de los resultados da
títulos muy altos. La Hemaglutinación indirecta emplea como soporte del
antígeno hematíes tratados con glutaraldehído. El antígeno empleado es
diferente según la marca productora (de membrana o citoplásmicos). Esto
hace que sea poco reproductible y no debe emplearse para el diagnóstico
de infección congénita ni para los casos de infección aguda. Esto es debido
a que los anticuerpos que detecta se desarrollan más lentamente. ELISA
IgG es la metodología más empleada. Los resultados obtenidos con ella se
correlacionan bien con los del resto de las pruebas. Otra posibilidad
disponible es la medida de la AVIDEZ de los anticuerpos IgG. Se basa en la
medida de la afinidad (avidez) de los anticuerpos por su antígeno. Durante
la fase inicial de su producción poseen una afinidad baja y a medida que
transcurre el tiempo esta aumenta progresivamente. La sexta semana de la
infección es el punto de inflexión en el cambio de la avidez. Con esta
prueba se puede discriminar muy bien la infección reciente de la antigua,
quizás mejor que con la determinación de IgM. ELISA IgM es el método
más frecuente para la detección de este tipo de anticuerpos. Su positividad

23
define la infección aguda aunque en ocasiones, cuando su concentración
es baja, esto no es cierto. La versión ELISA con captura de cadena pesada
es más sensible y específica ya que no tiene interferencias con el F.R. De
igual diseño que el anterior es la prueba de ISAGA-IgM empleando como
antígeno toxoplasmas enteros. Es muy sensible.

Técnica Biocientífica S.A. HI. :

o Diluir el suero 1/32 empleando solución diluyente.
o Colocar 25 ul de esta dilución en uno de los orificios de la
placa de microtitulación en V.
o Adicionar 25 ul de antígeno Toxoplasmosis HI, previamente
agitado.
o Agitar muy bien la placa y dejar en reposo durante 2 horas a
temperatura ambiente y en lugar libre de vibraciones.

Interpretación de resultados :
La reacción es considerada reactiva cuando forma una malla o red de
bordes irregulares con 50 a 100% de aglutinación.
La reacción es considerada negativa cuando los hematíes se depositan en
el fondo de la placa formando un botón de eritrocitos no aglutinados.

Limitaciones del método :

La utilidad de este ensayo es el screening de anticuerpos anti Toxoplasma
gondii en muestras de sangre.
Los valores obtenidos con este ensayo deben ser tomados como una ayuda
en el diagnóstico y deben ser evaluados por el médico considerando,
además, la historia clínica del paciente, los hallazgos físicos y
sintomatológicos y otros procedimientos diagnósticos.

24
 ENZIMOINMUNOENSAYO CLÁSICO DE TOXOPLASMOSIS (IgG)

I. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS

Estudios serológicos indican que la inyección por Toxoplasma gondii, agente

causante de la toxoplasmosis, esta ampliamente presente entre la población.
En adultos la infección suele cursar de forma asintomática a pesar de los
casos descritos sintomáticos así como de evolución fatal. En niños, la
enfermedad puede afectar el sistema nervioso central y las vísceras. También
puede ocurrir la infección congénita causando malformaciones que pueden
terminar con la muerte.

Quit : SeraQuest, Estandarizado 02-02-03.

La Paz, Enero de 2003

Los resultados son de ayuda en la valoración del estado inmunológico del

paciente. El equipo Sera Quest Toxoplasma IgG esta indicado para la
detección de anticuerpos del tipo IgG frente a Toxoplasma gondii. Los
resultados se obtienen después de una hora y media de incubación. Los
resultados son objetivos y expresados en valor de índice o unidades
internacionales (IU/ml) referenciadas a la preparación del tercer Standard
internacional de 1994 del suero anti-toxoplasma de la OMS.

Las muestras diluidas se incuban en pocillos recubiertos de antígeno. Los

anticuerpos anti-toxoplasma, si están presentes, se fijan a los pocillos. Los
componentes que no han reaccionado se eliminan mediante lavado,
añadiendo e incubando a continuación el conjugado (anticuerpos anti-IgG
humana marcados con un enzima). Si la muestra contiene anticuerpos anti-
toxoplasma, el conjugado se fijará en los pocillos. El conjugado residual se
elimina mediante lavado, añadiendo e incubando a continuación el
substrato. En presencia de la enzima, el substrato se transforma en un
producto final de color amarillo el cual se lee fotométricamente.

II. MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS

a. Material:
- Cuaderno de Registro

25
 - Guantes desechables
- Placas de tiras microelisa recubiertas con Ag de T. gondii
- Precintos para placas
- Micropipeta automática graduable de 4 a 200ul
- Micropipeta multicanal automática
- Tips
- Tubos de ensayo
- Cronómetro
- Papel absorbente
- Recipientes de desechos, biológicamente peligrosos, para los
materiales potencialmente contaminados.

b. Reactivos
- Agua destilada o desionizada
- Conjugado: Liofilizado de antigammaglobulinas G marcadas con
HRP.
- Control Negativo: Suero humano, no reactivo a anti-toxoplasma IgG.
- Calibrador 1: Suero humano. Fuertemente reactivo para anticuerpos
anti-toxoplasma IgG.
- Calibrador 2: Suero humano. Moderedamente reactivo anti-
toxoplasma IgG.
- Tampón fosfato concentrado
- Solución TMB (tetrametilbencidina en ácido cítrico)
- Solución de peróxido de urea
- Ácido sulfúrico 1 mol/l para análisis

c. Equipo
- Lector de microplacas (espectrofotómetro para microplacas con filtro
de 405nm)
- Incubador (seco o humedecido) o baño maría a 37 2°C.

III. CALIBRACIÓN Y CONTROL

a. Calibración:
Alternativamente, los resultados pueden calcularse a partir de una
curva de calibración a tres puntos: calibrador 1 (punto alto), calibrador
2 (punto medio) y blanco de reactivos (cero), usando un gráfico punto a
punto.

26
 b. Control:
 Los calibradores y controles deben incluirse en cada prueba.
 El valor de absorbancia del calibrador 1 debe ser al menos de 0.4
cuando se lee frente al blanco.
 El valor de absorbancia del blanco debe ser menor de 0.35.
 El control negativo debe presentar un valor inferior de 27 IU/ml y
un índice menor de 0.9.
 El control positivo debe presentar un valor de índice dentro del
rango indicado en el vial.

Si no se cumple uno de estos criterios, se deberá repetir la prueba.

IV. PROCEDIMIENTO

a. Preparación de reactivos:
Atemperar todos los reactivos y muestras antes de usar. Devolverlas
pronto al frigorífico después de usar.

1. Preparar la dilución 1:50 de las muestras, calibradores y controles.

Por ejemplo: añadir 4 microlitros de muestra a 200 microlitros de
diluyente en un pocillo o tubo y mezclar bien.
2. Colocar el número requerido de pocillos en el soporte de la
microplaca.
3. Introducir 100 microlitros de cada calibrador, control y muestra
diluidos a los pocillos correspondientes.
4. Incubar los pocillos a temperatura ambiente (20 a 25ºC) durante 30
minutos (+/- 5 minutos).
5. Lavar los pocillos 4 veces, vaciándolos a continuación.
6. Añadir 2 gotas (100 microlitros) de conjugado en cada pocillo.
7. Incubar los pocillos a temperatura ambiente durante 30 minutos
(+/- 5 minutos).
8. Lavar los pocillos 4 veces, vaciándolos a continuación.
9. Añadir dos gotas (100 microlitros) de substrato en cada pocillo.
10. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos (+/- 5
minutos).
11. Añadir dos gotas (100 microlitros) de solución de parada en cada
pocillo.

27
 12. Leer y anotar la absorbancia del contenido de cada pocillo a 405
nm frente a blanco. Las lecturas deben realizarse dentro de las 2
horas después de que la reacción se detuvo.

V. LECTURA E INTERPRETACIÓN

a. Lectura:
- Hacer blanco al aire sin la placa y leer la absorbancia de la solución
de cada pocillo a 450  5 nm (longitud de onda única).

b. Cálculos:
Punto Final: (calibrador 2) : Determinar el valor del índice o IU/ml para
cada muestra (o control) usando la fórmula siguiente:

Índice calibrador o IU/ml x Absorbancia muestra = Índice o IU/ml

Absorbancia calibrador muestra

SI se realiza el calibrador por duplicado, utilizar la media de los valores

obtenidos para realizar el cálculo.

c. Interpretación:
El Toxoplasma gondii es un parásito ubicuo en el humano y los
animales. La mayoría de las infecciones en el humano pasan
inadvertidas, aunque, en algunos casos, la enfermedad pueda tener un
carácter benigno o más grave y de larga duración. No obstante si una
mujer embarazada está infectada, el parásito Toxoplasma puede pasar
por la placenta e infectar al feto. Estas infecciones congénitas pueden
tener consecuencias muy serias, en algunos casos, incluso el aborto o
el mortinato.

NO existe comercialmente ninguna vacuna contra la infección, pero la

infección natural suele conferir una inmunidad de por vida.

Se determina el estado inmune controlando la presencia de

anticuerpos anti-toxoplasma IgG. Antiguamente el diagnóstico de una
Toxoplasmosis aguda de basaba exclusivamente en la detección de
anticuerpos anti-toxoplasma IgM, debido a que la IgM suele

28
 permanecer en algunos pacientes por el lapso de un año o más, es
mejor realizar dos controles con 21 días de diferencia. El aumento de la
tasa de Inmunogobulinas es indicativa de una infección reciente.

Las pruebas IgG de ELISA están reconocidas como herramientas

serológicas en el control de Toxoplasma y se basan en:
 Un resultado reactivo refleja una infección anterior o actual por T.
gondii.
 Un resultado no reactivo indica que probablemente no exista
protección contra una infección por T. gondii, vale decir una gestante
en riesgo (seronegativa); sin embargo debe tenerse en cuenta de que
el resultado de la prueba será no reactivo durante el periodo de
incubación y durante las primeras fases de la infección.

Los anticuerpos IgG durante la fase aguda del toxoplasma aumentan

gradualmente hasta alcanzar sus niveles máximos entre los dos a cinco
meses de presentarse los síntomas.

El diagnóstico de toxoplasmosis aguda (sero conversión positiva) debe

estar dado en combinación con la detección de IgM específica y el
aumento de la tasa de IgG.

VI. LIMITACIONES DEL METODO

- Esta destinado solo a la detección de anticuerpos IgG frente al
Toxoplasma gondii.
- Las sustancias interferentes que podrían afectar la interpretación
son insignificantes.
- Se recomienda volver a analizar las muestras que resulten
reactivas después del primer análisis.

VII. REPORTE Y LIBERACIÓN DE RESULTADOS

IU/ml Valor del índice Interpretación

< 27 < 0.9 Negativo
> 27< 33 > 0.9 < 1.1 Equívoco
> 33 > 1.1 Positivo

29
 Cuando se obtienen valores equívocos, se debe obtener otra muestra
dos o tres semanas después y valorarla de nuevo en paralelo con la
muestra inicial.

Si la segunda muestra resulta nuevamente equívoca, se considera al

paciente negativo para una infección primaria o reciente y equívoco en
cuanto al estado inmunológico. Si la segunda muestra es positiva,
puede considerarse el paciente

Quit Human IgG : Estandarizado 03-04-03

I PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS

La prueba Human Elisa Toxo IgG esta basada en la clásica técnica ELISA.
Los micropocillos ELISA son recubiertos con antígenos de Toxoplasma
preparados con parásitos sonicados Toxoplasma gondii (taquizoitos). En la
primera etapa la incubación , los anticuerpos anti TOXO , contenidos en la
prueba o el control se fijan específicamente a los antígenos inmovilizados. Al
final de la incubación los componentes excesivos son eliminados por lavado.
En la segunda etapa de incubación se añade un conjugado anti IgG
(anticuerpos anti-IgG-humana marcados con peroxidasa) que se fijan
específicamente a los anticuerpos IgG. Se forman inmunocomplejos típicos.
Después de eliminar el conjugado excesivo por lavado y añadir TMB /
substrato (etapa 3) , se forma un color azul que se transforma a amarillo
después de parar la reacción. La intensidad de este color es directamente
proporcional a la cantidad de anticuerpos anti- TOXO IgG en la muestra.

II MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS

a. Material:
- Cuaderno de Registro
- Guantes desechables
- Placas de tiras microelisa recubiertas con Ag de T. gondii
- Precintos para placas
- Micropipeta automática graduable de 4 a 200ul
- Micropipeta multicanal automática
- Tips

30
 - Tubos de ensayo
- Cronómetro
- Papel absorbente
- Recipientes de desechos, biológicamente peligrosos, para los
materiales potencialmente contaminados.

b. Reactivos
- Agua destilada o desionizada
- Conjugado: Anti-IgG-humano, marcado con peroxidasa (conejo).
- Control Negativo: Suero humano, no reactivo a anti-toxoplasma IgG.
- Control Cut off
- Control positivo IgG alto, medio y bajo.
- Buffer de dilución IgG.
- Reactivo substrato A y B. Solución TMB (tetrametilbencidina en
ácido cítrico)
- Solución de lavado.
- Ácido sulfúrico 1 mol/l para análisis

c. Equipo
- Lector de microplacas (espectrofotómetro para microplacas con filtro
de 450nm)

III PROCEDIMIENTO.-

1. Diluir el suero del paciente 1+100 con buffer de dilución. Mezclar

vigorosamente.
2. Colocar 100 ul de las muestras diluidas, además de colocar los
controles negativo y positivos directamente.
3. Incubar por 30 min. Entre 17 a 25 ºC.
4. Lavar 4 veces con la solución de lavado.
5. Colocar el conjugado 100 ul.
6. Incubar por 30 min. Entre 17 a 25 ºC.
7. Lavar 5 veces con la solución de lavado.
8. Colocar el substrato 100 ul.
9. Incubar por 15 min. Entre 17 a 25 ºC.
10. Añadir 100 ul de solución stop.
11. Leer a 450 nm de absorbancia dentro de 30 min.

31
 ENZIMOINMUNOENSAYO TOXOPLASMOSIS (IgM)

I. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS

El diagnóstico de toxoplasmosis es frecuentemente asistido por

métodos serológicos. La demostración de anticuerpos IgM
antitoxoplasma es generalmente indicativo de una infección activa o
reciente o, en caso de recién nacidos, de infección congénita.

Quit : SeraQuest . Estandarizado 04-02-03

La Paz, Enero de 2003.

El equipo SeraQuest Toxoplasma IgM se ha diseñado para la detección

de anticuerpos IgM anti-toxoplasma. Los resultados de la prueba se
obtienen después de una hora y media de incubación. Los resultados
son objetivos y expresados como valor de índice permitiendo
uniformidad de los resultados.

II. MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS

a. Material:
- Cuaderno de Registro
- Guantes desechables
- Placas de tiras microelisa recubiertas con IgM anti-
humana (oveja)
- Precintos para placas
- Micropipeta automática graduable de 5 a 200ul
- Micropipeta multicanal automática
- Tips
- Tubos de ensayo
- Cronómetro
- Papel absorbente
- Recipientes de desechos, biológicamente peligrosos, para
los materiales potencialmente contaminados.

32
 b. Reactivos
- Agua destilada o desionizada
- Antígeno/conjugado: Antígeno toxoplasma y anti-toxoplasma (de
oveja) marcado con HRP liofilizado.
- Control Negativo: Suero humano, no reactivo a anti-toxoplasma
IgM.
- Control positivo: Suero Humano reactivo a anti-toxoplasma IgM
- Control fuertemente positivo: Suero bovino conteniendo
anti.toxoplasma IgM (monoclonal humano)
- Tampón fosfato concentrado
- Solución TMB (tetrametilbencidina en ácido cítrico)
- Solución de peróxido de urea
- Ácido sulfúrico 1 mol/l para análisis

c. Equipo
- Lector de microplacas (espectrofotómetro para filtro de 405nm)
- Incubador (seco o humedecido) o baño maría a 37 2°C.

III. CALIBRACIÓN Y CONTROL

a. Calibración:

Alternativamente, los resultados pueden calcularse a partir de una

curva de calibración a tres puntos: calibrador 1 (punto alto), calibrador
2 (punto medio) y blanco de reactivos (cero), usando un gráfico punto a
punto.
b. Control:
 Los calibradores y controles deben incluirse en cada prueba.
 El valor de absorbancia del calibrador 1 debe ser al menos de 0.4
cuando se lee frente al blanco.
 El valor de absorbancia del blanco debe ser menor de 0.35.
 El control negativo debe presentar un valor inferior de 27 IU/ml y
un índice menor de 0.9.
 El control positivo debe presentar un valor de índice dentro del
rango indicado en el vial.

Si no se cumple uno de estos criterios, se deberá repetir la prueba.

33
IV. PROCEDIMIENTO
a. Preparación de reactivos:

Atemperar todos los reactivos y muestras antes de usar. Devolverlas

pronto al frigorífico después de usar.

1. Preparar la dilución 1:25 de las muestras, calibradores y controles.

Por ejemplo: añadir 8 microlitros de muestra a 200 microlitros de
diluyente en un pocillo o tubo y mezclar bien.
2. Colocar el número apropiado de pocillos en el soporte de la
microplaca.
3. Introducir 100 microlitros de cada calibrador, control y muestra
diluidos a los pocillos correspondientes.
4. Incubar los pocillos a temperatura ambiente (20 a 25ºC) durante 30
minutos (+/- 5 minutos).
5. Lavar los pocillos 4 veces, vaciándolos a continuación.
6. Añadir 2 gotas (100 microlitros) de conjugado en cada pocillo.
7. Incubar los pocillos a temperatura ambiente durante 30 minutos
(+/-5 minutos).
8. Lavar los pocillos 4 veces, vaciándolos a continuación.
9. Añadir dos gotas (100 microlitros) de substrato en cada pocillo.
10. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos (+/-5
minutos).
11. Añadir dos gotas (100 microlitros) de solución de parada en cada
pocillo.
12. Leer y anotar la absorbancia del contenido de cada pocillo a 405
nm frente a blanco. Las lecturas deben realizarse dentro de las 2
horas después de que la reacción se detuvo.

V. LECTURA E INTERPRETACIÓN

a. Lectura:
- Hacer blanco al aire sin la placa y leer la absorbancia de la solución
de cada pocillo a 450 5 nm (longitud de onda única).

b. Cálculos:

34
 Punto Final: (calibrador 1 o calibrador 2) : Determinar el valor del índice
o IU/ml para cada muestra (o control) usando la fórmula siguiente:

Índice calibrador o IU/ml x Absorbancia muestra = Índice o IU/ml

Absorbancia calibrador muestra

SI se realiza el calibrador por duplicado, utilizar la media de los valores

obtenidos para realizar el cálculo.

c. Interpretación:

El Toxoplasma gondii es un parásito ubicuo en el humano y los

animales. La mayoría de las infecciones en el humano pasan
inadvertidas, aunque, en algunos casos, la enfermedad pueda tener un
carácter benigno o más grave y de larga duración. No obstante si una
mujer embarazada está infectada, el parásito Toxoplasma puede pasar
por la placenta e infectar al feto. Estas infecciones congénitas pueden
tener consecuencias muy serias, en algunos casos, incluso el
nacimiento de un niño muerto.

Una infección aguda por el toxoplasma es en general una enfermedad

más bien benigna, frecuentemente sub-clínica. Una enfermedad
sintomática se presenta normalmente mediante linfoadenopatía, fiebre
o fatiga. Los anticuerpos IgM pueden aparecer ya en los primeros 5
días después de la infección, alcanzando su máxima concentración en
las primeras semanas y pueden persistir durante meses (o años)
después de la infección. Un resultado es reactivo indica una infección
reciente o aguda por toxoplasma. Un resultado no reactivo excluye
probablemente una infección aguda o reciente por toxoplasma.

En caso de una infección congénita la sensibilidad de la prueba es

menor debido a las cantidades de IgM producidas.
Resultados no reactivos en este caso no excluyen una infección
congénita.

VI. LIMITACIONES DEL MÉTODO

35
 - Esta destinado solo a la detección de anticuerpos IgM frente al
Toxoplasma gondii.
- Existen algunas sustancias interferentes que podrían afectar la
interpretación de los resultados.
- Se recomienda volver a analizar las muestras que resulten
reactivas después de 21 días (3 semanas).

REPORTE Y LIBERACIÓN DE RESULTADOS

Valor del índice Interpretación

< 0.9 Negativo
> 0.9 < 1.1 Equívoco
> 1.1 Positivo

36
 INMUNOFLUORESCENCIA TOXOPLASMOSIS

La Paz, Enero de 2003.

I. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS

El método de inmunofluorescencia se basa en la capacidad que tienen las

proteínas de unirse a fluorocromos sin alterar sus propiedades
inmunológicas; esto permite observar al microscopio de fluorescencia la
formación de complejos antígeno anticuerpo, si es que en una segunda
etapa este complejo se une a un inmuno-reactivo ligado a un
fluorocromo.

El antígeno figurado fijado a la placa de vidrio o portaobjetos y

generalmente se obtienen de los parásitos recuperados del ascitis de
ratones inoculados.

La reacción de inmunofluorescencia Indirecta correctamente

estandarizada es una de las pruebas inmunodiagnósticas más sensibles y
específicas que puede ser utilizada como prueba patrón para estudiar la
sensibilidad y especificidad de otras técnicas.

II. MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS

a. Material:
- Cuaderno de registro
- Guantes
- Secador de cabello
- Portaobjetos especiales IFI
- Cubreobjetos 24 x 48mm
- Jarras Koplin
- Vasos de precipitado
- Frasco gotero
- Papel filtro
- Micropipetas
- Tips

37
 - Tubos de hemólisis
- Gradillas

b. Reactivos:
- Solución Buffer fosfato salina Ph 7,2 (PBS)
- Antígeno fijado a portaobjetos
- Antigammaglobulina Humana marcada con isotiocianato
de fluoresceina o conjugado.
- Azul de Evans
- Solución de montaje.

c. Equipos:
- Microscopio de inmunofluorescencia.
- Estufa de cultivo
- Heladera
- Cámara Húmeda

III. CONTROL

Los testigos deberán presentar las siguientes características:

Testigo negativo: Al microscopio de fluorescencia, los parásitos
deberán presentar una coloración pardo-rojiza y no presentar
fluorescencia.
Testigo positivo: Al microscopio de fluorescencia los parásitos se
presentan teñidos con el fluorocromo, en este caso presentaran color
verde fluorescente. La fluorescencia es particularmente intensa en la
membrana del parásito.

IV. PROCEDIMIENTO
- Sacar los portaobjetos con los antígenos de la heladera y dejar que
sequen en papel filtro.
- Diluir los sueros control positivo y negativo en PBS a 1:32.
- Diluir los sueros problema a partir de 1:16
- Colocar una gota de cada una de las soluciones en las divisiones de
la placa incluyendo los controles positivos y negativo.
- Incubar los portaobjetos en cámara húmeda a 37°C por 30 minutos

38
 - Lavar los portaobjetos tres veces con PBS, cada vez por 5 minutos.
- Secar los portaobjetos con corriente de aire frío .
- Diluir el conjugado de acuerdo a su título en azul de Evans.
- Colocar una gota del conjugado diluido en cada una de las
divisiones del portaobjeto.
- Incubar los porta objetos en cámara húmeda a 37°C por 30
minutos.
- Lavar los portaobjetos tres veces con PBS, cada vez por 5 minutos.
- Secar los portaobjetos con corriente de aire frío .
- Colocar los cubreobjetos con el líquido de montaje.

V. LECTURA E INTERPRETACIÓN
a. Lectura:
- Leer en microscopio de inmunofluorescencia.
- Hacer la lectura de los testigos antes que los sueros problemas.
- La fluorescencia es particularmente intensa en la membrana del
parásito.
- La dilución diagnóstica para esta prueba corresponde a 1:32 por lo
que cualquier título igual o superior se considera como positivo.

b. Interpretación:
- La IFI como cualquier otra prueba de diagnóstico serológico, no
puede ser concebida como un método de diagnóstico definitivo,
por lo tanto todo resultado debe ser interpretado como una
probabilidad mayor o menor de acierto en relación al caso
estudiado dentro de una población normal o parasitada.
- Los individuos parasitados por T. gondii infectados después del
nacimiento suelen dar resultados positivos para IFI antes que en
la HAI, esto porque el antígeno utilizado en la IFI es de superficie.
En los recién nacidos infectados dentro del útero la reacción
positiva puede demorarse un tiempo en aparecer , sin embargo
también hará su aparición antes que la HAI.
- Los infectados en más del 95% de los casos suelen dar títulos de
1:16 o mayores, a pesar de esto la línea de corte se ha fijado a
una dilución 1:32 porque a diluciones menores suelen presentarse
reacciones cruzadas con otras parasitosis.

39
 - Las personas presumiblemente no parasitadas, en el 95% de los
casos no superan la dilución de 1:8, este título tiende a aumentar
en personas de bajo nivel socio-económico, en las que el título
puede alcanzar a 1:16 pero en ningún caso es mayor.
- Un suero reactivo a título 1:8 no podrá ser considerado como
negativo si es que se sospecha una toxoplasmosis de transmisión
congénita ya que en esta caso se deberá repetir la prueba a los 30
días

VI. LIMITACIONES DEL MÉTODO

La inexperiencia del personal que realiza el diagnóstico puede llevar a la
lectura de falsos positivos en el caso de sueros con factor reumatoideo
positivo ya que estos dan una fluorescencia mono o bipolar en los
parásitos, esto es particularmente evidente cuando el conjugado
utilizado es anti IgM o es un conjugado polivalente (GMA).
Suelen presentarse reacciones cruzadas con otras parasitosis.

VII. FUENTES DE ERROR

Unas de las principales causas de error de la IFI es que el conjugado
fluorescente no este correctamente titulado ya que puede dar lugar a
los falsos positivos y falsos negativos.
Los lavados durante la realización de la técnica son de mucha
importancia ya que así se eliminan las sustancias no ligadas y se evita
la inmunofluorescencia inespecífica.

VIII. REPORTE Y LIBERACIÓN DE RESULTADOS

a. Reporte:
- NO REACTIVO cuando el parásito presenta color café- rojizo sin
fluorescencia.
- REACTIVO cuando se presenta con una fluorescencia verde
intensa, debe indicarse la dilución hasta la que alcanza el título
del suero
b. Liberación de Resultados: ver anexos

40
 BIBLIOGRAFÍA

1.- Ambroise, T.; Pelloux, H.; Toxoplasmosis congenita, avances en el

diagnóstico serológico y molecular; Memorias Segundo congreso
internacional de Toxoplasmosis, Santa Fé de Bogota 1998; 19-23.
2.- Francis Derouin; Philippe Thulliez; Stéphane Romand; Bertrand
Lecolier; La Toxoplasmose chez l’homme, Diagnpstic, prevention et
traitement; Supplement au LABORAMA Nº 35. BIORAD.
3.-Jorge Enrique Gómez Marín,. Jhon Carlos Castaño; María Teresa
Montoya Londoño; Nelsy Loango; Consuelo López; María Cristina
Sarmiento; Lyda Pinzón; Fernando Alvarado Toxoplasmosis congénita en
Colombia: Análisis clínico y de laboratorio en 27 casos.
4.- Frenkel J.K.; Toxoplasmosis mechanisms of infection. Laboratory
diagnosis mangement; Curr Ttop Path 1971; 541; 28-75
5.- Mollinedo S.; Desjeux P.; Alvarez H.; Martinez E.; Torrez M.; Sainz Z.;
Toxoplasmosis; Anuario Instituto Bolivianao de Biología de la Altura;
1986-1987.
6.- Mollinedo S.; Desjeux P.; Torrez M.; Sainz Z.; Alvarez H.; Evaluación de
los métodos: Hemaglutinación indirecta (HAI), Inmunofluorescencia
indirecta (IFI), ELISA y Latex; en el despistaje seroinmunológico de la
Toxoplasmosis en La Paz, Bolivia; Anuario Bodas de Plata Instituto
Boliviano de Biología de la Altura; 1988.
7.- Pedro Jiménez Monroy; Guias de manejo de la Toxoplasmosis en el
embarazo; Santafé de Bogotá, Colombia.
8.- Norma Cecilia Serrano; María Eugenia Cárdenas; Estado Actual del
Diagnóstico de la Toxoplasmosis en la Mujer Embarazada y su Feto.
9.- Sera Quest.Manual técnico.
10.-Juan J. Picazo; Antonio Fuertes Ortiz de Urbina; Protocolos Clínicos de
diagnóstico serológico comentado. Nº 6; Versión 1. Enero 1998
Innogenetics Diagnóstica y Terapéutica

41
 GLOSARIO

- Anticuerpo: Glucoproteína producida en el organismo en respuesta

directa a la introducción de un antígeno o de un hapteno.
- Antígeno: Sustancia que produce en los animales superiores la
formación de anticuerpos y/o de reacción de hipersensibilidad
inmunológica activa.
- Absorbancia: Cantidad de rayos luminosos absorbidos por una
sustancia coloreado.
- Liofilizado: Sustancia congelada rápidamente a una temperatura muy
baja y luego deshidratada rápidamente.
- Anticuerpo: Glucoproteína producida en el organismo en respuesta
directa a la introducción de un antígeno o de un hapteno.
- Antígeno: Sustancia que produce en los animales superiores la
formación de anticuerpos y/o de reacción de hipersensibilidad
inmunológica activa.
- Anticoagulante: Sustancia que previene o se opone a la coagulación.
- Fluorescencia: Propiedad de ciertos cuerpos de absorber luz de una
determinada longitud de onda y emitirla a una longitud de onda
superior.
- Fluoresceína:: Ftaleína de la resorcina; materia colorante que en
solución alcalina presenta una fluorescencia verde muy intensa.

42
 ANEXO
LABORATORIO DE ZOONOSIS PARASITARIAS
DIAGNOSTICO DE TOXOPLASMOSIS

Nombre: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Edad: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Procedencia: . . . . . . . . . . . . .
Médico Tratante: . . . . . . . . . . . . . . . . Folio: . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Fecha toma de muestra: . . . . . . . . . . . Fecha resultado: . . . . . . . . . .
Impresión diagnóstica: . . . . . . . . . . . .
Examen solicitado: . . . . . . . . . . . . . . .

Resultado a ser llenado de acuerdo al nivel de complejidad del laboratorio

A) AGLUTINACIÓN DIRECTA (AD):

B) HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA:
 Inmunoglobulina G (IgG):

 Inmunoglñobulina M (IgM):

C) Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA):

 Inmunoglobulina G (Ig G): . . . . . . . . . . . . . . .

 Inmunoglobulina M (Ig M);

D) INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI):

 Inmunoglobulina G (Ig G): . . . . . . . . . . . . . . .

 Inmunoglobulina M (Ig M);

________________________________________________________________________
Interpretación:
_ Reacción Negativa correspondiente a una Toxoplasmosis antigua
_ Baja tasa de anticuerpos IgG considerada como Negativa
_ Presencia de Inmunoglobulina M específica.
_ Se sugiere efectuar control serológico a las 2 semanas

FIRMA
Responsable del laboratorio

43
 Control serológico de la embarazada para la prevención de la toxoplasmosis

a
Ante un título estable de IgG, o en espera de que transcurran las 3-4 semanas para la
obtención de la 2ª muestra, podemos determinar la avidez de las IgG, efectuar una
determinación de IgA anti-Toxoplasma y valorar todos los factores de probabilidad de
toxoplasmosis, cuya positividad incrementará el grado de probabilidad de infección aguda:

 predominio de IgG de baja avidez

 título de IgG elevado (>300 UI/ml)

 título de IgM elevado

 título de IgA elevado

 antecedente de adenopatías

44
Pauta de actuación ante un recién nacido con sospecha de infección congénita (TC).

a
La presencia de calcificaciones cerebrales, hidrocefalia o coriorretinitis en el recién nacido (RN), es muy
sugestiva de toxoplasmosis congénita (TC). Hay que considerar la posibilidad de efectuar PCR o aislamiento
del parásito en LCR, sangre u orina. La positividad de cualquiera de estas técnicas, confirmará el diagnóstico
de TC. En el RN asintomático se realizará el seguimiento serológico según el algoritmo propuesto.
b
Es muy importante no efectuar la determinación en sangre de cordón, para evitar la contaminación con IgM
maternas.

45
 Toxoplasmosis (Toxoplasma gondii)

Detección de Anticuerpos El examen serológico es usado para indicar la presencia de la

infección a través de la detección de anticuepos anti toxoplasma específicos en suero,
plasma, líquido cefalo-raquídeo o fluidos oculares Si se quiere determinar seropositividad,
una sola muestra es suficiente. Si se quiere determinar el tiempo de infección se toman dos
muestras obtenidas entre 21 días a tres meses de diferencia. Algunas veces la detección de
una elevación de títulos o niveles de IgG o IgM , no es posible debido a que los títulos
todavía no han alcanzado un nivel en el momento en que la muestra inicial es tomada.

Test en suero para detectar la presencia de anticuerpos anti Toxoplasma – IgG específicos

Ig G Negativo : Ig G Positivo:
No infectada Infectada

Para determinar tiempo aproximado de la infección, test

serológico para detectar la presencia de anticuerpos anti
Toxoplasma IgM especificos

IgG Positivo
IgM Positivo: IgG Positivo
1. Infección dentro de IgM Negativo:
los últimos 2 años, o Infectado por más de 1
2. Falso positivo IgM año

Obtener la 2da muestra 2 semanas después de la

primera, enviar ambas muestras al laboratorio de
referencia para la confirmación antes de cualquier
intervención

En nuestro país muchos test serológicos están disponibles, la sensibilidad y la especificidad

de estos Kits pueden variar ampliamente de una casa comercial a otra. Esto es importante,
porque los resultados serológicos pueden influir en la toma de decisiones para continuar o
detener un embarazo.

46
 LABORATORIO NACIONAL DE PARASITOLOGÍA
PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD
RED NACIONAL DE DIAGNOSTICO DE LA TOXOPLASMOSIS (2003)

1. IDENTIFICACIÓN DEL PARTICIPANTE:

NOMBRE: Laboratorio

2. RESULTADO DE SU PARTICIPACIÓN:
TÉCNICA AD HAI ELISA IFI OTROS
Total de muestras
Positivo Ig. G (tasa)
Positivo Ig. M (tasa)
Negativo Ig. G
Negativo Ig. M

3. ERRORES ENCONTRADOS:
Informe de resultado falso negativo
Informe de resultado falso positivo
Resultados con solo una técnica serológica
Solamente determinación de Ig G
Falta de titulación de la muestra
Contaminación de la muestras
Resultados sin interpretación

4. RESULTADOS:
Control positivos Control negativos TOTAL
Laboratorio positivos
Laboratorio negativos
TOTAL

SENSIBILIDAD: %
ESPECIFICIDAD: %
VALOR PREDICTIVO POSITIVO: %
VALOR PREDICTIVO NEGATIVO: %

5.- COMENTARIO:
La Paz, ...............................de 2003

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 UNIDAD DE PARASITOLOGÍA Y MEDICINA TROPICAL (UPAMET)
RED NACIONAL DE DIAGNOSTICO DE LA TOXOPLASMOSIS (2003)

PRIMERA REUNIÓN

PROGRAMA
Lugar: Auditórium INLASA

Fecha: 24 Abril 2003

08:00 a 9::15 a.m. Inscripción y entrega de material

09:15 a 10:00 a.m. Toxoplasmosis Generalidades.

10:00 a 10:15 a.m. Red Nacional de Laboratorios

Proyección de la Red de Laboratorios de Parasitología.

10:15 a 10:30 a.m. Refrigerio.

10:30 a 11:00 a.m. Diagnostico de la Toxoplasmosis

 Diagnóstico Clínico
 Diagnóstico Biológico (Métodos Directos e Indirectos)

11:00 a 11:30 a.m. Principales técnicas de diagnostico.

 HAI
 ELISA

11:30 a 12::00 a.m. Fijación de responsabilidades y calendario de próximas

reuniones.

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