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CV = cellule végétale
LA TRANSGÉNÈSE VÉGÉTALE
Pour quoi faire ?
I. Introduction
Une plante est dite transgénique lorsqu'il y a une introduction artificielle d'un nouveau gène
(non naturel) appelé transgène, qui doit s'exprimer et être transmis à la descendance. Cette
plante sera alors appelée OGM-S ou encore PGM (Plante Génétiquement Modifié).
OGM
• + une lettre en fonction du lieu de confinement :
◦ OGM-S pour les végétaux car confinés dans des serres.
◦ OGM-A pour les animaux car confinés en Animalerie
◦ OGM-L pour les micro-organismes car confinés en Laboratoire
• + un chiffre de 1 à 4 en fonction du facteur de risque pour l’environnement (repose sur le
vecteur), le plus grand risque correspondant à 4 :
◦ Principalement des plasmides pour les végétaux, ce qui n’entraîne pas de risque de
contamination aux animaux ou aux hommes. C'est pourquoi on dépasse rarement le
2 pour la transgenèse végétale
◦ On peut utiliser des virus pour les animaux, ce qui entraîne plus de risques
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B – Régénérer la plante entière
La cellule végétale est totipotente ! Modification d’une seule cellule donne donc une plante
complète transformé.
Le schéma représente les différentes méthodes qui se sont succédé. Avec la transgenèse, on arrive
sur des manipulations de plus en plus fines et de plus en plus ciblé.
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On peut rechercher à introduire un transgène que l’on va donner à des cellules : soit ces
cellules on le garde en bioréacteur et qui vont produire la nouvelle molécule, soit on
reconstitue la plante qui produire la molécule.
Obtention d'un vecteur pour pouvoir amplifier le gène d’intérêt. On intègre le transgène au
vecteur, souvent un plasmide bactérien (E. Coli par exemple), que l’on va multiplier et ainsi
augmenter le nombre de copie du gène.
1) Transfert indirect
a. Infection : le plasmide Ti
TI : pour tumor inducing (c’est un plasmide qui va induire des tumeurs chez le végétal une
des techniques les plus anciennes)
Ce plasmide vient de la bactérie agrobacterium tumefaciens
C'est le modèle naturel : la plante subit une infection bactérienne et la bactérie lui transmet
des gènes plasmidiques.
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Agrobacterium tumefaciens est une grosse bactérie qui induit une « tumeur », c'est à dire une
prolifération cellulaire. Cette tumeur est due à l’acquisition des plasmides.
C'est le cas par exemple dans la gale du collet chez le maïs.
En plus de la prolifération cellulaire, le plasmide Ti (Tumor inducing) de cette bactérie permet
aux cellules de synthétiser des éléments nutritifs pour la bactérie (production massive)
appelées OPINES.
ii. Le plasmide Ti
Une partie de l’ADN est transféré à la cellule végétale et l’autre partie reste dans la bactérie
(agrobacterium).
Deux frontières délimitent la partie d'ADN transférée à la cellule végétale (ADN-T soit ADN
Transféré). Dans cette partie, il y a deux zones notables :
• ONC : zone oncogène (qui induit la prolifération cellulaire et le développement de la
tumeur)
• OPS : pour la synthèse d'OPINES
En dehors de l'ADN-T, il y a différentes zones importantes (non transmises) :
• Ori : origine de réplication du plasmide multiplication du plasmide
• OCC : élément de régulation dans la synthèse des opines
• Vir : région responsable de la « virulence », intervient dans le mécanisme de transfert
du gène.
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iii. Mécanisme d'infection naturelle
Tout d'abord, on a une blessure au niveau de la plante. Cette blessure va provoquer une
réaction : l’infection par l'Agrobacterium tumefaciens. La plante va libérer des composés
phénoliques ou ponyphénols qui vont activer une partie de la région Vir du plasmide de la
bactérie. La région Vir A activé active l’infection. (La région Vir peut être divisée en plusieurs
régions : Vir A, B, C, D, E, G.) Il va se créer un pore entre les deux cellules.
Les autres zones de la région Vir vont s'activer à la chaîne pour finalement activer une
endonucléase qui va couper et libérer un seul brin d'ADN-T qui sera transféré à l’ADN végétal.
L’autre brin reste intégré pour reconstruire le double brin.
Une autre zone de la région Vir (VirE) va prendre en charge ce brin pour le transmettre à la CV.
Il va ensuite être répliqué et induire la prolifération cellulaire et la production d'OPINE avec
des cellules génétiquement modifiées mais avec un modèle naturel.
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b. Le plasmide D-Ti
A partir du plasmide Ti, l’idée est de construire un plasmide D-Ti (gène désarmé, non nocif
pour la CV).
Les chercheurs ont ensuite voulu remplacer la partie de l’ADN comprenant ONC et OPS et
remplacer par le gène d’intérêt ainsi qu’un gène de sélection pour résistance aux herbicides.
Méthode :
Il est tout d'abord intégré dans un petit plasmide d'E. Coli le gène d’intérêt pour se multiplier
de manière importante et ainsi obtenir un grand nombre de copies.
On modifie le plasmide de l'Agrobacterium tumefaciens pour donner un plasmide désarmé :
on remplace les zones ONC et OPS par le gène d'intérêt, tout en gardant les zones non
transmises nécessaires à la régulation comme la zone Vir (on a supprimé la zone oncogène).
On croise ensuite les deux plasmides (petit plasmide + plasmide désarmé) pour donner un
plasmide recombiné (avec gène d'intérêt + gène de sélection). Ce plasmide est introduit dans
l'Agrobacterium tumefaciens pour infecter une cellule végétale en laboratoire.
Mécanisme avec faible rendement car certaines plantes ne sont pas sensibles à agroB
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2) Transfert direct
a. La biolystique
Cette méthode consiste à propulser des micro-billes (en or le plus
souvent) recouvertes d'ADN recombinant sur, soit des cellules
végétales isolées, soit une partie d'un végétal (souvent une partie
reproductrice pour obtenir une hérédité), grâce à un canon à
particules. Les micro-billes pénètrent dans la CV.
Les micro-billes se localisent de façon aléatoire : soit elles restent dans le cytoplasme soit (par
chance) elles atteignent le noyau.
L'ADN-T se détache de sa bille pour s'intégrer au génome. La micro-bille sera éliminée à la prochaine
mitose de la cellule.
Le rendement de cette technique est assez correct.
Si le transfert se fait sur la partie d'un végétal, il y a un espoir de transmission à la descendance
(en bombardant les fleurs), on obtient donc un végétal transgénique alors appelée végétal
MOSAÏQUE (car les plantes sont partiellement transgéniques, certaines parties ne le sont pas.
On doit attendre des croisements pour obtenir une plante totalement transgénique)
Si on utilise le canon sur les cellules reproductrice, ça permet d’avoir une descendance
transgénique aussi.
b. Les protoplastes
Cellule végétale sans paroi pecto-cellulosique (risque d'explosion à cause de la vacuole rempli
d’eau qui exerce une pression de l’intérieur sur la paroi). Le transfert sera donc facilité.
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Au bout que qql jours en culture, la protoplaste régénère la paroi. C’est donc pdt ces
qql jours qu’il faut faire la manipulation.
C'est une méthode plus ancienne (vue au cours dernier) croisement au niveau du noyaux, des
mitochondries…. On met en contact 2 espèces sous forme de protoplaste et on les fait fusionner soit
par intermédiaire d’agents chimique soit par des chocs électrique intense plusieurs combinaisons
possibles car on recherche des fusions binaire (entre 2 protoplastes et non pas 3 ou plus) de
protoplaste d’espèce différente. On peut avoir différente hybridation :
- Au niveau du noyaux comme par exemple la moitié de chaque génome mais on peut
avoir des cas où la fusion préserve en grande partie celui d’une espèce et faiblement de
l’autre.
- On peut aussi avoir des fusions au niveau des mitochondries donc mélange de leur
ADN. Le gène de stérilité mal est présent au niveau des mitochondries permet de rendre
espèce stérile (utilisé parfois pour éviter diffusion à l’environnement ainsi que la production
de semence transgénique ce qui oblige l’agriculteur à racheter tous les ans).
- Par contre, on n’aura pas de croisement au niveau des chloroplastes donc la seule
possibilité est qu’une espèce acquière les chloroplastes d’une autre espèce. Intéressant car
les chloroplastes portent souvent les gènes de résistance aux herbicides.
• Électroporation
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Création de pores dans la membrane plasmique (il n’y a plus de paroi) par choc électrique
(puissants mais brefs). Le pore laisse le passage au gène d'intérêt (l’ADN-T) qui peut alors
pénétrer dans le protoplaste.
Ce n'est pas efficace à 100%, il faudra donc sélectionner les cellules.
Au bout d’un certain temps, on a une régénération de la paroi donc de la cellule puis
génération de la plante entière.
Plus fin car on sait ce qui l’on donne comme gène
• Lipotransfection
• Microinjection
Se fait sous microscope. Le micro-
manipulateur (système de curseur qui
permet d’avancer doucement et de
déplacer le système d’injection)
injecte directement une solution
d'ADN-T dans le protoplaste grâce à
une micro-pipette.
C’est une méthode longue car elle
doit se faire protoplaste par
protoplaste, et il faut que l’ADN-T
atteigne bien le noyau, c’est une
méthode fastidieuse.
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A – Réglementation des OGM
Les autorisations d'expérimentation sont régies par l'UE. La France est globalement réticente
au recours aux OGM.
B – Aspect réglementaire
1) Organismes impliqués
2) Conditions de culture
NB : 1973 pour agroB et depuis 2002 : culture à grande échelle.
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Pour les végétaux on est au max au risque 1 ou 2. Car les risques sont assez restreints (pas de
virus et pas de risque pour le monde animal ou l’homme)
Matériaux de construction : quelconques, normes bâtiment imperméables à l’eau, résistance contrôlée et
Nature du sol : quelconque ou gravier désherbé désinfectable ou imperméable, collecte et stérilisation des eaux
Aération : filets anti-animaux obligatoires, filtres anti-insectes pollinisateurs < 1mm, hygrométrie contrôlable local
Abords, système de vide paillasse, douche, signalisation des risques, destruction des plantes,
vêtements, accès, effluents...
Il doit y avoir une signalisation autour de la serre et il y a une réglementation aussi au niveau
de la destruction des plantes (incinération par ex), des vêtements...
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◦ ces nouvelles plantes entrainent-elles des allergies alimentaires ??? (de plus en plus
présentes aujourd’hui)
80% de la totalité des OGM entre dans la chaîne alimentaire par le biais de l’alimentation
animale
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IV. Applications
A - Domaines
Application santé/nutrition
Le riz de contient pas de β-carotène (Vit A) or c’est une des principales céréales. Pour lutter contre
des carences en Vit A (vision, résistance aux infections, …), on a donc créé un riz transgénique avec
surexpression du gène de la β-carotène. On a donc du riz plus jaune riz dorés. On a donc pu
alimenter la population car 40g de riz suffise.
Molecular pharming
Production de végétaux transgénique exprimant une nouvelle protéine. Ces cellules seront cultivé
en bio-réacteur. Il suffira d’extraire le métabolite secondaire usine à mdct. On étudie d’abord en
mini bio réacteur pour déterminer l’O2, les nutriments et toute les autres conditions nécessaires.
Cela permettra ensuite une production de masse. L’intérêt de le faire avec des végétaux et que l’on
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va le faire en champs cout de prod faible (cf tableau ci-dessous). De plus, il faut des
environnements de stockage tout simple. Le cout le plus important sera pour l’extraction de la
molécule d’intérêt.
Bactérie Levure Mammifère Plante
Production * * ** **
250 mg/L 200 mg/L g/L 600 mg/kg de
matière sèche
B – Molécules produites
Gène de l’hirudine de la
sangsue Colza Anticoagulant
(Plutôt à titre expérimental)
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