OSTEOMIELITIS VERTEBRAL ASOCIADA CON INFECCIÓN BACTERIANA ÚNICA Y MIXTA

EN POLLOS DE ENGORDE
PATOLOGÍA AVIAR

Juliana Fortes Vilarinho Braga, Camila Costa Silva, Maurício de Paula Ferreira Teixeira, Nelson Rodrigo da Silva Martins & Roselene Ecco.

RESUMEN
La osteomielitis vertebral (VO) es una enfermedad emergente en todo el mundo que afecta a los pollos de
engorde. El objetivo de este estudio fue determinar la frecuencia y la etiología de la VO en pollos de engorde en
una región de pollos de engorde altamente productiva. Para esto, se analizaron 608 pollos de engorde con
problemas de locomoción en 18 granjas. Se registraron los signos clínicos, se realizó necropsia y se tomaron
muestras de cuerpos vertebrales con grandes cambios para el análisis molecular e histopatológico y para el
aislamiento bacteriano. De los pollos de engorde con cambios de locomoción, 5.1% (31/608) tenían VO y, de éstos,
93.5% tenían 40 días o más y 89.7% eran machos. Las aves con VO presentaron diversos grados de movilidad
limitada y esto se relacionó con el nivel de compresión de la médula espinal. Las especies bacterianas del género
Enterococcus (ADN detectado en 53.6%) fueron los agentes etiológicos involucrados en la mayoría de los casos de
VO. Enterococcus faecalis se detectó con mayor frecuencia (35,7%), pero Enterococcus hirae también estuvo
presente en algunas lesiones (7,1%). Se detectó Escherichia coli en el 35,7% de las lesiones vertebrales y se
confirmó la coinfección con E. faecalis en 7,1% de los casos. Staphylococcus aureus estuvo involucrado en el 14.3%
de los casos, siendo el 7.1% en coinfección con Enterococcus spp. o E. hirae. Nuestro estudio ha indicado que, en
Brasil, la VO en pollos de engorde puede no ser causada por un solo agente infeccioso y tiene una frecuencia
inferior a la reportada recientemente en otros países. Este estudio sugiere que existen diferencias geográficas
entre Brasil y otros países con respecto a la frecuencia y etiología de la VO.

PALABRAS CLAVE
Pollos de engorde; osteomielitis vertebral; Especies de Enterococcus; Escherichia coli; patología molecular;
histopatología.

INTRODUCCIÓN confusión entre estas afecciones puede haber causado

La osteomielitis vertebral (VO) es una enfermedad que
afecta a los pollos de engorde y criadores de pollos de
engorde en todo el mundo. Los brotes de la
enfermedad informados hasta ahora se han asociado
con la infección por Enterococcus cecorum (Martin et
al., 2011). La posición de los pollos de engorde a
menudo se describe como "sentado sobre sus
corvejones", que se caracteriza por la extensión
craneal de las piernas con el apoyo de las articulaciones
tibiotarsal-metatarsianas, que se considera el clásico
signo clínico de la enfermedad. Sin embargo, esta
postura es similar a otras afecciones como la
espondilolistesis (Wood et al., 2002; Gingerich et al.,
2009), la discondroplasia tibial (Sauveur y Mongin,
1978) y la necrosis de la cabeza femoral
(condronecrosis) (Wiseman & Prisby, 2013). La
una subestimación de la prevalencia de VO en el
pasado (Wood et al., 2002, Gingerich et al., 2009).
Aunque la patogénesis de la VO no se ha dilucidado
completamente, la enfermedad se ha reproducido
experimentalmente (Martin et al., 2011), aunque con
signos clínicos más leves y lesiones macroscópicas. Se
desconocen las razones del tropismo de la infección,
precisamente en el cuerpo de la vértebra torácica libre
(T4). Sin embargo, como esta es la única vértebra de la
columna vertebral torácica que se mueve libremente,
es posible que los cambios en el flujo vascular o
microtraumas puedan desempeñar un papel (Aziz y
Barnes, 2007). E. cecorum se produce en el tracto
intestinal y puede tener acceso al torrente sanguíneo a
través de la lesión de la mucosa intestinal, causada por
enfermedades entéricas previas, como la coccidiosis o
la enteritis bacteriana (Gingerich et al., 2009). Además
de esta hipótesis, algunos autores especulan que la
bacteria podría alcanzar las vértebras a través de los
alvéolos, ya que algunas vértebras son huesos
neumáticos (Aziz y Barnes, 2007). Sin embargo, la
neumatización de la cuarta vértebra torácica libre y del
sinsacro por el saco aéreo abdominal ocurre más tarde,
a los 77 días después de la eclosión (Hogg, 1984).
En los últimos años, las especies del género
Enterococcus han surgido como una causa importante
de infecciones nosocomiales, particularmente
Enterococcus faecalis (Kola et al., 2010), que causa
infecciones extraintestinales en humanos (Creti et al.,
2004). Los microorganismos resistentes, ampliamente
involucrados en estos casos, se seleccionan por el uso
indiscriminado de antibióticos en medicina humana y
veterinaria (McGaw, 2013). Estos microorganismos
resistentes, cuando están presentes en animales y
subproductos animales, pueden transmitirse a los
seres humanos (Foulquié et al., 2006). Además, las
batas usadas por pacientes y trabajadores de la salud,
equipos médicos, camas de microesferas y superficies
ambientales (Gould y Freeman, 1993) podrían ser
fuentes de infección nosocomial. Con respecto a la
salud animal y pública, esto es muy importante
(Foulquié et al., 2006) y demuestra la necesidad de
estudios sobre enfermedades relacionadas con estas
bacterias.
En Brasil, no hay estudios sobre la frecuencia de VO,
aunque las observaciones de campo previas han
indicado la aparición de la enfermedad. El objetivo de
este estudio fue determinar la frecuencia y la etiología
del VO en pollos de engorde en una región de pollos de
engorde altamente productiva en Brasil.
MATERIALES Y MÉTODOS:
Muestras
Para determinar la frecuencia de VO, evaluamos 608
pollos de engorde con trastornos de locomoción, entre
2012 y 2014. Los pollos de engorde pertenecían al área
de producción de carne de aves de corral más grande
del estado de Minas Gerais, que es el quinto mayor
productor y exportador de carne de ave en Brasil. El
tamaño de la muestra se definió considerando una
prevalencia del 4% observada en un proyecto piloto
anterior, con un intervalo de confianza del 95% y un
margen de error del 15% (Centro Panamericano de
Zoonosis, 1979).
Las aves fueron de 38 rebaños de 18 granjas
comerciales localizados en nueve municipios
diferentes en el estado de Minas Gerais. Los pollos de
engorde se agruparon con menos de 40 días de edad (n
= 122) o 40 días o más (n = 486), con una edad mínima
de 21 días y una edad máxima de 56 días. En cuanto al
género, la mayoría eran machos (n = 479), con menor
número de hebras (n = 91), y para algunas aves (n = 38)
esta información no se registró. Los pollos de engorde
fueron evaluados clínicamente y luego sacrificados y
sometidos a necropsia como se describe a
continuación. Los procedimientos en este estudio se
realizaron de acuerdo con las recomendaciones del
Comité de Ética de Experimentación Animal de la
Universidad Federal de Minas Gerais (Protocolo
205/2011).
Signos clínicos
Los pollos de engorde que presentaban trastornos
locomotores fueron colocados en observación y se les
animó a moverse para la evaluación de los cambios en
la marcha y la postura. Estos fueron registrados
individualmente, además de los registros de imagen.
Necropsia
Después de registrar los signos clínicos, los pollos
fueron sacrificados por dislocación cervical (Oliveira et
al., 2002) para la necropsia en la que se observaron
todos los cambios observados en el sistema locomotor
(esqueleto axial - sección sagital), relacionados con
tamaño, forma, color y consistencia. fueron evaluados
y registrados. La vértebra torácica libre se consideró
como T4, ya que hay cinco vértebras torácicas en las
aves (Hogg, 1984) y la última vertebra (T5) se fusiona
con las vértebras lumbosacras para formar el sinsacro
(Baumel, 1979). La columna vertebral de todos los
pollos de engorde se seccionó a lo largo de la línea
media longitudinal para analizar el cuerpo vertebral y
la médula espinal. Las muestras para el cultivo
bacteriano y el aislamiento se recolectaron
asépticamente de pollos de engorde que presentaban
una vértebra torácica libre agrandada. Las muestras
vertebrales y el contenido fecal del intestino grueso de
pollos de engorde con osteomielitis también se
recogieron en microtubos estériles y se congelaron a -
20°C para extracción de ADN y posterior prueba de
reacción en cadena de polimerasa (PCR) para los
agentes etiológicos descritos a continuación (véase la
subsección PCR). Las columnas vertebrales con
lesiones macroscópicas se fijaron en formalina
tamponada neutra al 10% durante 48-56h para su
posterior procesamiento y análisis histopatológico.
Histopatología
Las columnas vertebrales correspondientes a
segmentos lumbares y torácicos se descalcificaron en
ácido fórmico al 24%. Para la preparación de
portaobjetos, los tejidos se deshidrataron en
concentraciones crecientes de etanol, aclarados en
xileno, incrustados en parafina para obtener secciones
en serie de 4 μm de espesor, teñidas con hematoxilina-
eosina (HE) y tinción Goodpasture (Luna, 1968) y
analizados bajo una luz microscopio.
Bacteriología
Los frotis recolectados asépticamente de las lesiones
vertebrales se inocularon en dos placas de agar con
sangre y una placa de agar Mac-Conkey. Una placa de
agar sangre se incubó en condiciones microaerófilas a
37°C durante 24-72h, mientras que las otras placas se
incubaron de manera similar, pero bajo condiciones
aeróbicas. Después del crecimiento inicial, se
examinaron las colonias para determinar su morfología
y se subcultivaron, se realizaron pruebas de Gram y
catalasa y oxidasa y los aislados también se sometieron
a identificación bacteriana automática mediante el
sistema VITEK 2 (bioMérieux Inc., Hazelwood, MO, EE.
UU.), tarjetas de identificación disponibles
comercialmente para bacterias Gram-positivas y Gram-
negativas, de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante. Después de la identificación bacteriana, las
colonias se cultivaron en agar Mueller-Hinton (MH) y
luego se inocularon en microtubos que contenían caldo
de infusión de cerebro y corazón, y 30% de glicerol y se
almacenaron a -80°C.
Extracción de ADN
Para la extracción de ADN de lesiones vertebrales, se
trituraron muestras de tejido en un mortero con pistilo,
y se combinaron con tres volúmenes de yoduro sódico
6M. El ADN se recuperó posteriormente en
microesferas de dióxido de silicio, como se describió
previamente por Vogelstein & Gillespie (1979) y Boom
et al. (1990). La extracción de ADN de cepas
bacterianas de referencia se realizó mediante
ebullición (Marques y Suzart, 2004) con
modificaciones. Brevemente, se tomó una unidad
formadora de colonias directamente de la placa de
agar Mueller-Hinton y se transfirió usando un bucle
calibrado de 10 μl en un microtubo que contenía 300
μl de agua desionizada estéril y se homogeneizó
durante 10 segundos mediante agitación vorticial (en
torbellino, remolino). El microtubo se colocó entonces
en un baño seco a 100°C durante 30min seguido de
centrifugación a 14,000×g durante 2min. El
sobrenadante se colocó en un nuevo microtubo y se
almacenó a -80°C. La extracción de ADN de las heces se
realizó mediante ebullición con Chelex® 100 (Bio-Rad,
Richmond, CA, EE. UU.). Brevemente, se añadieron
aproximadamente 5mg de heces a 300μl de Chelex®
100, se homogeneizaron mediante vortex, se
centrifugaron a 14,000×g durante 15 segundos y se
incubaron a 95°C. Las muestras se centrifugaron y el
sobrenadante se congeló a -20°C. La concentración y
pureza del ADN extraído de muestras vertebrales y
colonias bacterianas se evaluaron mediante
espectrofotometría.
PCR
El ADN extraído de lesiones vertebrales y heces se
sometió a PCR para Enterococcus spp., E. faecalis, E.
cecorum, E. hirae y E. durans y el de solo lesiones
vertebrales para Escherichia coli usando cebadores
específicos y protocolos de amplificación previamente
descritos (Tabla 1). Los cebadores utilizados para la
detección de Enterococcus spp. amplificó un producto
de 112 pares de bases (pb) de la región del gen tuf (Ke
et al., 1999). Para la detección de E. faecalis, E.
cecorum, E. hirae y E. durans, se usaron cebadores para
amplificar una región del gen sodA (superóxido
dismutasa dependiente de manganeso), generando
productos de 360 pb, 371 pb, 187 pb y 295 pb,
respectivamente (Jackson et al., 2004). Los cebadores
usados para la detección de E. coli amplificaron un
producto de 585 pb del gen promotor malB (Wang et
al., 1996). Para evaluar la viabilidad y calidad del ADN
extraído, todas las muestras se sometieron a PCR para
detectar β-actina (gen de control endógeno).
Tabla 1. Las secuencias de oligonucleótidos y los tamaños de productos amplificados utilizados para la detección de agentes etiológicos
seleccionados implicados en casos de VO.

Objetivo Nombre de la cartilla Secuencia de oligonucleótidos Producto (pb) Referencia

Enterococcus spp. ENT-1 TACTGACAAACCATTCATGATG 112 Ke et al. (1999)
ENT-2 AACTTCGTCACCAACGCGAAC
E. faecalis FL-1 ACTTATGTGACTAACTTAACC 360 Jackson et al. (2004)
FL-2 TAATGGTGAATCTTGGTTTGG
E. cecorum CE-1 AAACATCATAAAACCTATTTA 371 Jackson et al. (2004)
CE-2 AATGGTGAATCTTGGTTCGCA
E. hirae HI-1 CTTTCTGATATGGATGCTGTC 187 Jackson et al. (2004)
HI-2 TAAATTCTTCCTTAAATGTTG
E. durans DU-1 CCTACTGATATTAAGACAGCG 295 Jackson et al. (2004)
DU-2 TAATCCTAAGATAGGTGTTTG
E. coli ECO-1 GACCTCGGTTTAGTTCACAGA 585 Wang et al. (1996)
ECO-2 CACACGCTGACGCTGACCA

Las PCR se realizaron usando un volumen final de 25μl
(PCR Master Mix Promega, Madison, WI, EE. UU.) Y
200-300ng de DNAtemplate, en un termociclador
(Veriti® Thermal Cycler, Applied Biosystems, Inc.,
Foster City, CA, EE. UU.). Cepas de referencia de E.
faecalis (CCCDE006, Cefar Diagnostica, São Paulo,
Brasil), E. hirae (INCQS 00036; ATCC 8043), E. durans
(INCQS 00552; ATCC 6056), E. cecorum (cortesía de
Poultry Diagnostic and Research Center), Universidad
de Georgia, Athens, GA, EE. UU.) Y E. coli (cortesía del
Prof. Dr. Marcos Bryan Heinemann, Universidad
Federal de Minas Gerais) como controles positivos.
Como control negativo, se realizaron reacciones con
todos los reactivos a excepción del molde de ADN. El
producto final de cada reacción se sometió a
electroforesis en gel de agarosa al 1,5% que contenía
bromuro de etidio junto con un marcador de peso
molecular de 100pb (LowRanger 100pb DNA Ladder
Norgen®, Thorold, ON, Canadá).
RESULTADOS
Historia
Los pollos de engorde provenían de los municipios de
Belo Horizonte, Bom Jesus do Amparo, Curvelo,
Igarapé, Itabira, Igaratinga, Pará de Minas, Prados y
São Sebastião do Oeste, todos en el estado de Minas
Gerais (Brasil). Las granjas de pollos tuvieron diferentes
prácticas de manejo y bioseguridad, con una cantidad
de pollos de engorde por bandada de 20,000 a 40,000.
Las granjas de pollos suelen criar aves hasta
aproximadamente 42-45 días antes del procesamiento.
Aunque la información con respecto a la utilización de
promotores de crecimiento no estaba disponible para
todas las granjas, se confirmó que los antibióticos
como la bacitracina de zinc y la colistina son de uso
frecuente. Los usos históricos de los antibióticos en las
granjas muestreadas incluyen enrofloxacina,
fosfomicina, amoxicilina y trimetoprima sulfa, que se
usaron con mayor frecuencia para tratar
enfermedades respiratorias o entéricas.
Frecuencia de la enfermedad
De los pollos de engorde con alteración locomotriz
evaluados en este estudio, 5,1% (31/608) tenían VO.
De estos, 93.5% (29/31) tenían 40 días o más
(promedio de 44.1 días), mientras que 6.5% (2/31)
tenían menos de 40 días (promedio de 35 días). De los
pollos de engorde afectados, el 89.7% (26/29) fueron
machos y el 10.3% (3/29) hembras. También se
encontraron otras causas de alteraciones
locomotrices, como espondilolistesis, escoliosis,
artritis, discondroplasia tibial, bumblefoot (una
condición inflamatoria de los pies de las aves,
generalmente causada por una infección) y necrosis de
la cabeza femoral (datos no publicados).
Signos clínicos
Los pollos de engorde con VO presentaron diferentes
grados de movilidad limitada, que estaban
relacionados con el nivel de compresión de la médula
espinal (Figura 1). En los casos de signos clínicos leves
(6.4%, 2/31), a menudo asociados con una compresión
leve, los pollos de engorde presentaron una capacidad
deteriorada para pararse y moverse, con la postura
encorvada y el desplazamiento de su centro de
gravedad (Figura 1 (a)). En los casos de signos clínicos
moderados (58.1%, 18/31), generalmente asociados
con una compresión moderada de la médula espinal,
los pollos de engorde se apoyaban sobre las
articulaciones tibiotarso-metatarsianas y los músculos
pectorales, pero no presentaban las piernas extendidas
cranealmente (Figura 1 (b)). Solo en los casos de signos
clínicos marcadas (35.5%, 11/31) con marcada
compresión de la médula espinal, los pollos de engorde
presentan los signos clínicos clásicos de la enfermedad,
es decir, piernas extendidas cranealmente y soporte
proporcionado principalmente por los músculos
pectorales, lo lo que perjudica considerablemente las
actividades locomotrices. Esto se conoce como
"sentarse en los corvejones" (Figura 1 (c)). Algunos
pollos de engorda se habían deshidratado y estaban en
malas condiciones corporales.

Figura 1. Pollos de engorde con diferentes grados de osteomielitis vertebral que muestran (a) signos leves, (b)
moderados y (c) marcados. Sección sagital de la columna vertebral con cantidades variables de material necrótico
caseoso en el cuerpo vertebral T4 (d), (e) y (f). El tejido necrótico en la región de los cuerpos vertebrales se
proyecta hacia el canal espinal, lo que lleva a la compresión de la médula espinal. En las imágenes microscopicas
de las mismas lesiones vertebrales (g), (h) e (i) observe el aumento del volumen del cuerpo vertebral que se
proyecta hacia el canal vertebral y comprime la médula espinal (flecha) en diferentes grados. Se observa una
gruesa capa de tejido fibroso y neocartílago desorganizado (*) que conecta ambos cuerpos vertebrales en el área
necrótica que comprime la médula espinal (flecha). H&E
Necropsia
Se observaron diversos grados de agrandamiento de la
vértebra T4 (móvil) y las vértebras adyacentes (T3 y
T5). Las lesiones macroscópicas se clasificaron según
intensidad leve, moderada y marcada, basada en la
extensión de la lesión y la fuerza de compresión de la
médula espinal, ya que el aspecto macroscópico no
mostró gran variación. La mayoría de los pollos de
engorde tenían lesiones moderadas (54.8%, 17/31),
seguidos por marcadas (29.1%, 9/31) y leves (16.1%,
5/31). El agrandamiento fue de color amarillo a gris
amarillento y firme, debido a una cápsula fibrosa que
rodea el cuerpo vertebral. En la superficie cortada,
había una cantidad variable de material amarillo y
friable, que reemplazó completamente el cuerpo
vertebral y el espacio intervertebral en lesiones más
avanzadas. La presencia del material necrótico caseoso
condujo a la ampliación del cuerpo vertebral y su
protrusión en el conducto vertebral, lo que ocasionó
compresión y malacia de la médula espinal en
diferentes grados (Figura 1 (d) - (i)). Además de las
lesiones vertebrales T4, algunos pollos de engorde
mostraron dermatitis necrotizante y miositis en la
región pectoral, caracterizada por varios grados de
necrosis y hemorragias en los músculos pectorales, que
se debieron a que los pollos de engorde descansaban
sobre su tórax. En los casos sin correlación entre los
signos clínicos y las lesiones, es decir, los signos clínicos
graves y las lesiones vertebrales leves (22,6%, 7/31), los
pollos de engorde por lo general presentaban
enfermedades concomitantes como necrosis de la
cabeza femoral (19,4%, 6/31), coccidiosis (9.7%, 3/31),
artritis (6.4%, 2/31), hepatitis necrótica (6.4%, 2/31),
osteomielitis tibial (3.2%, 1/31) o aerosaculitis (3.2%,
1/31).
Otros doce pollos de engorde con trastornos
locomotores tenían lesiones sólo en la parte craneal de
la vértebra T5, que implicaba la placa de cartílago
articular y el crecimiento. Estas lesiones se caracterizan
por una zona gris focal, o focalmente extensa, y
moderadamente friable, que se asocia ocasionalmente
con hendiduras.
Histopatología
Las lesiones variaron de leves a marcadas,
considerando una clasificación descriptiva con
respecto a la extensión de la lesión. El tejido necrótico
del cuerpo vertebral sobresalía hacia el canal vertebral
y causaba la compresión de la médula espinal
suprayacente, lo que provocaba isquemia y posterior
degeneración y pérdida de axones en la sustancia
blanca (Figura 2 (a)). En pollos de engorde con lesiones
marcadas, el daño también se extendió a la materia
gris, caracterizada por necrosis neuronal y neuropil.
Los cambios principales en el cuerpo vertebral
incluyeron áreas de necrosis ósea, que estaban
fragmentadas y tenían trabéculas intensamente
eosinófilas que contenían osteocitos picnóticos y se
acompañaban de varios grados de osteoclasia,
caracterizada por la presencia de osteoclastos en la
laguna de Howship (Figura 2 (b)). El infiltrado
inflamatorio marcado, compuesto
predominantemente de heterófilos y algunos
macrófagos, se observó en áreas de necrosis ósea. En
los casos más agudos, hubo intensa infiltración
heterofílica y fibrina, mientras que, en aquellos con la
mayor población de macrófagos, se observó una
intensa proliferación de tejido conectivo fibroso en la
médula ósea, que caracteriza la mielofibrosis. En
algunos casos, hubo formación de neocartílago
periférico a las lesiones y/o hubo ciertas bacterias
asociadas con áreas de necrosis (Figura 2 (c)). Se
detectaron colonias bacterianas en 35.5% (11/31) de
las lesiones y fueron identificadas como Gram-
positivas (25.8%, 8/31), Gram-negativas (16.1%, 5/31)
o ambas en la misma lesión (6.4%, 2/31) por tinción
Goodpasture (Figura 2 (d)). En todos estos casos, PCR
identificó la bacteria como Enterococcus spp., E.
faecalis y/o E. coli.
Los cambios histológicos de los pollos de engorde que
tenían lesiones macroscópicas en la vértebra T5 solo se
caracterizaron por áreas de degeneración y necrosis
del cartílago articular (T4 / T5), y ocasionalmente por la
formación de hendiduras, que se asociaron, o no, con
hemorragias que se extendieron a la metáfisis. Se
observaron colonias bacterianas en varias hendiduras.
Figura 2. Los pollos de engorde con osteomielitis vertebral. (a) Los procesos inflamatorios y necróticos, que modifican la morfología del
cuerpo vertebral (*) y comprimen la médula espinal (flecha), conducen a la pérdida axonal (cabeza de flecha). H&E. (b) Tejido óseo necrótico
(*) con áreas de reabsorción (osteoclastos en la laguna de Howship) (flecha). Nótese los restos necróticos con colonias bacterianas
intralesionales (flecha). H&E. (c) En el cuerpo vertebral, hay numerosas colonias bacterianas intralesionales (*), que están rodeadas por
tejido óseo necrótico y restos celulares (es decir, heterófilos, eritrocitos y fibrina). H&E. (d) Se observaron bacterias Gram-negativas y Gram-
positivas (*) en las lesiones vertebrales. Goodpasture.

Aislamiento e identificación bacteriana como se describió previamente. Se detectó S. aureus

El principal agente bacteriano identificado por VITEK 2
fue E. faecalis (Tabla 2). En el 44.0% (11/25) de los
casos, la bacteria fue el único agente involucrado en las
lesiones vertebrales y en el 16.0% (4/25), E. faecalis
estaba en coinfección con E. coli o S. aureus. Todas las
especies de Enterococcus en una sola infección fueron
identificadas como E. faecalis por VITEK 2 y por PCR, y
en los casos de coinfección con S. aureus, las bacterias
no fueron E. faecalis identificadas por PCR, sino otros
enterococos (Tabla 2)., ver sección de resultados de
PCR). Otra bacteria frecuentemente aislada fue E. coli,
presente en una sola infección en 32.0% (8/25) de los
casos y en 8.0% (2/25) en coinfección con E. faecalis,
en una sola infección en el 8,0% (2/25) de los casos, y
en un 8,0% adicional (2/25) de los casos, la bacteria se
asoció con E. faecalis, que se identificó mediante PCR
como Enterococcus spp. o Enterococcus hirae. Para tres
muestras, no hubo crecimiento bacteriano en el medio
de agar y para otras tres muestras, el muestreo
bacteriológico no fue posible.
Tabla 2. Agentes etiológicos implicados en la VO en pollos
de engorde en infección única y coinfección evaluada por
aislamiento bacteriano y PCR.
 Agente etiológico Aislamiento PCR% (n/N) aislamiento bacteriano, ya que no se pudo realizar la
bacteriano%
(n/N) PCR para esta especie.
Infección sola Enterococcus spp. 44.0 (11/25) 42.8 (12/28)
E. faecalis 100.0 58.3 (7/12) La comparación entre el aislamiento bacteriano y la
(11/11) PCR fue posible en 25 casos y estuvo de acuerdo en el
E. hirae 0.0 (0/11) 8.3 (1/12)
64% (16/25) de los resultados. En el 36% (9/25) de los
E. cecorum 0.0 (0/11) 0.0 (0/12)
UI species 0.0 (0/11) 33.3 (4/12)
casos, hubo diferencias entre los resultados,
E. coli 32.0 (8/25) 35.7 (10/28) principalmente relacionados con la identificación de
S. aureus 8.0 (2/25) ND especies de Enterococcus. Considerando cinco casos en
Coinfección E. coli + E. faecalis 8.0 (2/25) 7.1 (2/28) los que las bacterias aisladas fueron identificadas como
S. aureusa + 3.6 (1/28) E. faecalis por VITEK 2, los resultados por PCR indicaron
Enterococcus
el género Enterococcus sin discriminar la especie para
spp.b
S. aureusa + E. 3.6 (1/28) tres aislamientos e identificaron E. hirae para los otros
hiraeb dos aislados. En los otros cuatro resultados, hubo una
a
identificado por aislamiento bacteriano. divergencia entre el aislamiento bacteriano y la
b
identificado por PCR como Enterococcus spp. y E. hirae, pero detección de ADN. En cuatro casos, aunque la
como E. faecalis por aislamiento bacteriano. N/N = número positivo bacteriología permitió el aislamiento individual de E.
de la cantidad de casos de VO. UI species = Especie no identificada coli, el análisis de ADN reveló una coinfección de E. coli
de Enterococcus. ND = no hecho.
y E. faecalis por PCR. En estos casos, los acuerdos entre
la detección de ADN de tejido necrótico de la vértebra
y la histopatología (tinción de Goodpasture de
PCR
bacterias intralesionales) se consideraron resultados
Especies bacterianas del género Enterococcus fueron
concluyentes. Es importante destacar que la PCR se
los agentes etiológicos implicados en la mayoría de los
realizó por duplicado utilizando ADN de colonias
casos de VO en este estudio, con ADN de este género
aisladas e identificadas y del exudado recogido
detectado en una sola infección en 42.8% (12/28) de
asépticamente de las lesiones vertebrales, para
los casos. Se detectó E. faecalis únicamente en el 58.3%
confirmar el agente etiológico intralesional.
(7/12) y E. hirae en el 8.3% (1/12) de los casos. En
33.3% (4/12), las especies de Enterococcus
DISCUSIÓN
involucradas en una sola infección no fueron
Este estudio proporciona la primera información sobre
determinadas por PCR. Se detectó ADN de E. coli en
la frecuencia y la etiología de la VO en pollos de
una sola infección en 35.7% (10/28) de las lesiones
engorde en Brasil y demuestra diferentes aspectos de
vertebrales, y se confirmó la coinfección con E. faecalis
la enfermedad en relación con otros países donde se
en 7.1% (2/28) de los casos, basado en la detección de
ha notificado la enfermedad (Devriese et al., 2002;
ADN bacteriano en la misma muestra. Tres casos
Wood et al., 2002).; de Herdt et al., 2008; Aziz &
fueron PCR negativos para todos los agentes
Barnes, 2009; Gingerich et al., 2009; Stalker et al.,
etiológicos estudiados. En otros tres casos con lesiones
2010; Kense & Landman, 2011; Makrai et al., 2011;
vertebrales leves, el material necrótico fue escaso y la
Boerlin et al., 2012). La frecuencia de VO fue del 5.1%
recolección de muestras para la extracción de ADN y la
en estos pollos de engorde, considerando que todos los
histopatología no fue factible. Todas las muestras
pollos de engorde muestreados tenían desórdenes
fueron negativas para E. cecorum y positivas para β-
locomotrices.
actina, lo que confirma la viabilidad del ADN extraído y
la ausencia de este agente etiológico en los casos
La enfermedad se diagnosticó con mayor frecuencia en
estudiados. Todas las muestras fecales fueron positivas
los machos de los rebaños estudiados, de acuerdo con
para Enterococcus spp., Una fue positiva para E.
los hallazgos descritos anteriormente (Wood et al.,
cecorum, 25.0% (7/28) para E. durans y 89.3% (25/28)
2002, Gingerich et al., 2009; Zavala et al., 2011). La
para E. coli. Las muestras se consideraron positivas
mayor frecuencia de la enfermedad observada en los
para S. aureus sobre la base de los resultados de
machos puede ser el resultado de su mayor eficiencia
de crecimiento que las hembras (Longo et al., 2006).
Las hembras son precoces y completan el proceso de
osificación de huesos largos antes que los machos
(Naldo et al., 1998). Por lo tanto, los machos
necesitarán apoyar una mayor masa muscular en los
huesos menos maduros, en comparación con las
hembras de la misma edad.
La identificación individual de pollos de engorde
permitió la demostración de la naturaleza progresiva
de la enfermedad, ya que la movilidad alterada variaba
en intensidad clínicamente, de acuerdo con el grado de
compresión de la médula espinal. Solo en los casos
graves, con compresión avanzada de la médula espinal,
observamos los signos clínicos clásicos comúnmente
informados en los casos de la enfermedad (Wood et al.,
2002; Aziz & Barnes, 2007; Gingerich et al., 2009;
Stalker et al. al., 2010). Sin embargo, fue interesante
observar que, en los casos menos avanzados de la
enfermedad, los signos clínicos presentados por los
pollos de engorde afectados fueron inespecíficos y
comunes a otros trastornos locomotores.
Las lesiones macroscópicas revelaron que, en la
mayoría de los casos, la VO producía una ampliación
(agrandamiento) significativa del cuerpo vertebral
afectado, diferente de la espondilolistesis, que puede
producir signos clínicos similares (Gingerich et al.,
2009). El diagnóstico diferencial de estas
enfermedades debe realizarse por corte longitudinal
de la columna vertebral. Aunque en ambas
enfermedades hay compresión de la médula espinal de
la vértebra afectada, solo en VO se observa material
necrótico y / o caseoso en el cuerpo vertebral, mientras
que en la espondilolistesis hay una subluxación en un
plano transversal de los cuerpos vertebrales
adyacentes (Thorp, 1994; Wood et al., 2002; Gingerich
et al., 2009).
La histopatología confirmó la naturaleza crónica de la
enfermedad, como se demostró principalmente por la
formación de mielofibrosis y neocartílago observada
en varios casos en este estudio. Además, la
visualización de las colonias bacterianas adheridas a la
lesión utilizando H & E y tinción Goodpasture se asoció
con el aislamiento bacteriano y los resultados de la
PCR, proporcionando un diagnóstico más confiable. Los
cambios histopatológicos observados en nuestros
casos de VO fueron similares a otros informes de esta
enfermedad (Stalker et al., 2010; Martin et al., 2011).
La determinación de los agentes etiológicos implicados
en la VO fue posible mediante el aislamiento y la
identificación bacteriana, y la detección de ADN
mediante PCR. Invariablemente, las técnicas
demostraron que las bacterias presentes en las
lesiones vertebrales eran Enterococcus spp., En
particular E. faecalis, E. hirae, E. coli y S. aureus. Este
resultado es interesante, considerando que los últimos
casos reportados de VO se han asociado
principalmente con la bacteria E. cecorum (Wood et al.,
2002; Aziz & Barnes, 2007; Gingerich et al., 2009;
Stalker et al., 2010), que no se detectó en las lesiones
vertebrales en este estudio, a pesar de que la especie
ha sido ampliamente investigada.
Recientemente, Borst et al. (2012) sugirieron que los
nuevos casos de VO podrían ser iniciados por clones
patógenos de E. cecorum, que se diseminan a
diferentes lugares de la producción de pollos de
engorde posiblemente por transmisión horizontal. Esto
es respaldado por informes de la enfermedad en
manadas sucesivas, lo que sugiere la persistencia de la
bacteria en el medio ambiente (de Herdt et al., 2008).
Si esta hipótesis es cierta, y considerando los
resultados de nuestro estudio, se puede inferir que
tales clones patógenos de E. cecorum no están
presentes en los lotes de pollos de engorde brasileños.
E. faecalis y E. coli están presentes en el tracto
intestinal y pueden recuperarse del intestino delgado y
grueso en cantidades variables, según la edad del pollo
de engorde (Salanitro y Blake, 1978; Asrore et al.,
2015). De acuerdo con Devriese et al. (1991), E. faecalis
rara vez se encuentra en el tracto digestivo de pollos
de engorde de 3-5 semanas de edad. Sin embargo,
Gomes (2008) afirmó que existen informes
controvertidos sobre la composición de la microbiota
intestinal de diferentes segmentos del tracto digestivo
de las aves y que no sería posible determinar la
existencia de una microbiota típica, ya que la
composición de los alimentos, el clima, el estrés y los
patógenos afectan a las especies de bacterias de
diferentes maneras.
Además de los factores anteriores, el uso de especies de Enterococcus, es decir, Enterococcus
promotores de crecimiento puede influir en la distintos de E. faecalis y E. faecium. Por lo tanto, se
composición de la microbiota intestinal, incluidos los recomienda el uso de PCR para la identificación de
antibióticos, que pueden exacerbar la proliferación de otras especies de enterococos.
algunas poblaciones de enterobacterias debido a un
desequilibrio en la microbiota intestinal normal Nuestro estudio mostró que la osteomielitis vertebral
(Reynolds et al., 1997). Los productos probióticos en pollos de engorde tuvo una frecuencia menor en
promotores del crecimiento, designados como aditivos comparación con informes recientes en otros países, y
alimentarios, pueden estar compuestos de cultivos no es causada por un solo agente infeccioso en Brasil.
puros o mixtos de microorganismos vivos, incluidos E. Las bacterias involucradas en los casos naturales de la
faecalis, E. faecium y E. coli (Cantarelli et al., 2005). enfermedad fueron E. faecalis, E. hirae, Enterococcus
Estos tienen la capacidad de colonizar y proliferar en el spp., E. coli y S. aureus, que pueden actuar solos o en
tracto gastrointestinal, promoviendo cambios en el conjunto. Es importante destacar que, dado el papel de
equilibrio de la microbiota intestinal (Silva, 2000; estas bacterias en la salud pública, son esenciales los
Cantarelli et al., 2005; Bittencourt et al., 2006). Sin estudios que proporcionan la caracterización de la
embargo, los probióticos pueden alterar la microbiota virulencia y la detección de genes de resistencia a los
intestinal y convertirse en patógenos para los pollos de antimicrobianos en los microorganismos implicados en
engorde (Loddi et al., 2000). la enfermedad. Además, también se debe considerar
una relación entre esta enfermedad y el crecimiento
Observamos que algunos pollos de engorde solo tenían rápido y el aumento de peso de los pollos de engorde.
un proceso degenerativo en el cuerpo vertebral, y en
algunos casos se asoció con colonias bacterianas, pero
con infiltrado inflamatorio mínimo y sin características
macroscópicas de osteomielitis. Estos resultados son
particularmente interesantes cuando se considera la
patogénesis de la condronecrosis bacteriana con
osteomielitis. En esta condición, el alto estrés
biomecánico en los huesos largos y las vértebras
torácicas libres puede desencadenar un proceso
degenerativo del cartílago, con la posterior
colonización bacteriana sin la participación de agentes
etiológicos específicos (Wiseman y Prisby, 2013),
similar a la observada en los casos de la osteomielitis
en el presente estudio.

Curiosamente, en el 53,6% de los casos de la

enfermedad, el ADN de Enterococcus spp. se confirmó
en las lesiones vertebrales, aunque no fue posible
identificar la especie por PCR en tres de estos casos. Sin
embargo, las técnicas convencionales (datos no
mostrados) y automatizadas permitieron la
identificación de la especie como E. faecalis. En un
estudio llevado a cabo por Fang et al. (2012), el sistema
VITEK 2 identificó correctamente el 99.2% y el 91.7%
de las muestras a nivel de género y especie,
respectivamente, para diferentes aislados de
Enterococcus. Sin embargo, en nuestro estudio VITEK 2
resultó ser menos eficiente en la identificación de otras