TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

La mutagénesis de Rubisco proporciona una nueva percepción de las limitaciones en

fotosíntesis y crecimiento en Synechocystis PCC6803

El ortofosfato (Pi) estimula la activación de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa / oxigenasa (Rubisco) mientras que
paradójicamente inhibe su catálisis. De los tres sitios de unión a Pi, se han documentado los papeles de los sitios 5P y
pestillo, mientras que el del sitio 1P seguía sin estar claro. Los residuos conservados en el sitio 1P de Rubisco de la
cianobacteria Synechocystis PCC6803 se sustituyeron y se examinaron las propiedades cinéticas de los derivados de la
enzima y los efectos sobre la fotosíntesis y el crecimiento celular. Mientras que la activación de Rubisco estimulada por
Pi disminuyó para los mutantes enzimáticos T65A / S y G404A, la inhibición de la catálisis por Pi permaneció sin cambios.
Junto con estudios previos, los resultados sugieren que los tres sitios de unión Pi están involucrados en la estimulación
de la activación de Rubisco, mientras que solo el sitio 5P está involucrado en la inhibición de la catálisis. Si bien todas las
mutaciones redujeron la renovación catalítica de Rubisco (Kcat) entre 6 y 20 veces, la fotosíntesis y las tasas de
crecimiento bajo irradiancia saturada y las concentraciones de carbono inorgánico (Ci) solo se redujeron 40-50% (en los
mutantes T65A / S ) o no en absoluto (mutante G404A). El análisis de las células mutantes reveló un aumento de 3 veces
en el contenido de Rubisco que compensaba parcialmente la reducción de Kcat de modo que la tasa de carboxilación
por clorofila era un tercio de la que se encontraba en el tipo salvaje. La correlación entre las propiedades cinéticas de
Rubisco y la tasa fotosintética (Pmax) bajo irradiación saturada y las concentraciones de Ci indican que se puede tolerar
una reducción> 60% en Kcat antes de que la Pmax en Synechocystsis PCC6803 se vea afectada. Estos resultados indican
que la limitación de la actividad de Rubisco sobre la tasa de fotosíntesis en Synechocystis es baja. La determinación de
los metabolitos del ciclo de Calvin reveló que, a diferencia de las plantas superiores, la fotosíntesis de cianobacterias
está limitada por la reducción de fosfoglicerato probablemente debido a la limitación de ATP o NADPH.

Introducción
Ribulose-1,5-bisfosfato carboxilasa / oxigenasa (Rubisco,
EC 4.1.1.39), la principal enzima en la naturaleza que se asimila
carbono inorgánico (Ci) en compuestos orgánicos, cataliza la
reacciones primarias de fotosíntesis y fotorrespiración por
carboxilación u oxigenación de ribulosa-1,5-bisfosfato
(RuBP), respectivamente. Ambas reacciones se inician tras la carbamilación
de Lys201 en la subunidad grande de la enzima y posterior
estabilización del carbamato por un ion de magnesio, que
convierte la enzima catalíticamente activa. Encuadernación de RuBP
estimula el cierre del sitio catalítico y facilita el
conversión del fosfato de pentosa en su forma de enediol.
Este intermedio reacciona con CO2 (carboxilación) a
formar dos moléculas de 3-fosfoglicerato (PGA), o con
O2 (oxigenación) para formar una molécula de PGA y otra
molécula de 2-fosfoglicolato que ingresa al fotorrespiratorio
camino. Los productos de ambas reacciones son liberados
a medida que se abre el sitio catalítico (Taylor y Andersson, 1996;
Cleland et al., 1998; Duff et al., 2000).
A pesar de su papel central en el metabolismo fotosintético,
La catálisis de Rubisco se considera lenta e ineficiente, ya que
la rotación catalítica y la afinidad por el CO2 son bajas (120-720
carboxilaciones por sitio catalítico min1 y 10-300 lM, respectivamente). Además, la reacción de carboxilación es
competitiva
inhibido por O2, y reacciones secundarias de la enzima
generar productos inhibidores de la activación y la actividad
(revisado por Kellogg y Juliano, 1997). Sobre la base de
limitaciones bioquímicas y teniendo en cuenta las diferencias de energía libre
en las reacciones del ciclo de Calvin (Bassham y Krause, 1969;
Farquhar y otros, 1980; Dietz y Heber, 1984), así como
variaciones en la tasa de fotosíntesis, resultantes de
expresión diferencial de Rubisco usando tecnología antisentido
(Stitt et al., 1991; Furbank et al., 1996), Rubisco
actividad se ha considerado el principal factor limitante de
fotosíntesis bajo irradiación saturada y limitación
Concentraciones de CO2
La actividad de Rubisco está estrictamente regulada por activación
desactivación y accesibilidad de sustratos, así como
efectores estimuladores e inhibidores (Woodrow y Berry,
1988; Kellogg y Juliano, 1997). Ortofosfato (Pi) es
un efector regulador clave de la maquinaria fotosintética
(Heber et al., 1986; Woodrow y Berry, 1988) y afecta
Rubisco de manera antagónica. Por un lado,
estimula la activación de Rubisco y, por otro lado,
inhibe la actividad de la enzima por competencia con RuBP (Heldt
et al., 1978; Tabita y Colleti, 1979; McCurry y otros, 1981;
Parry y otros, 1985; Anwaruzzaman et al., 1995; Marcus y
Gurevitz, 2000). La estructura cristalina de Rubisco desde
Nicotiana tabaccum en complejo con Pi revela tres
Sitios de unión a Pi: un bolsillo con carga positiva en la enzima
superficie denominada el sitio 'pestillo' que también interactúa con el
C-terminal de la subunidad grande de la enzima durante la catálisis a
cerrar el sitio catalítico y dos sitios que se unen a 1P y 5P
de RuBP (Duff et al., 2000). Sustitución de residuos en el
5P- y sitios de retención de Rubisco de la cianobacteria
Synechocystis PCC6803 reveló que juegan un papel en
estimulación de la activación de Rubisco, mientras que solo el sitio 5P es
implicado en la inhibición de la actividad catalítica por Pi. Estas
experimentos, junto con la cinética bifásica de la
Activación estimulada por Pi de la enzima (Anwaruzzaman
et al., 1995), llevaron a la sugerencia de que la estimulación de
La activación de Rubisco ocurre a través de un mecanismo de múltiples sitios y
que el sitio inhibidor solo se solapa parcialmente con el
sitio estimulador en el sitio de unión 5P (Marcus et al., 2005).
Sin embargo, la posibilidad de que el sitio de unión 1P esté involucrado
en la regulación de la actividad Rubisco por Pi no ha sido
examinado. En el estado cerrado de la enzima, fosfato en el
El sitio de unión a 1P forma enlaces de hidrógeno con la columna vertebral
amidas de Gly381, Gly403 y Gly404, y con el lado
cadena de Thr65 (Fig. 1). A medida que se abre el sitio catalítico, fosfato
la interacción con Thr65 es reemplazada por una interacción con
Trp66 (Duff et al., 2000).
Usando un mutante de la cianobacteria Synechocystis
PCC6803, Syn6803Drbc (Amichay et al., 1993), que
permite la mutagénesis dirigida al sitio de Rubisco y el análisis
de los efectos en su entorno fotoautótrofo natural
(Marcus et al., 2003, 2005), el efecto de las sustituciones en
el sitio de unión 1P en la catálisis y regulación de la enzima
activación por Pi fueron examinados. Sorprendentemente, aunque
algunas de estas sustituciones disminuyeron sustancialmente la
volumen de negocios catalítico de Rubisco, la fotosíntesis y las tasas de crecimiento de las células mutantes solo se
vieron ligeramente afectadas.
Por lo tanto, el contenido y las propiedades cinéticas de Rubisco en
estas células mutantes fueron examinadas y una búsqueda de un
factor de limitación de velocidad adicional de la fijación de carbono en Synechocystis
en comparación con las plantas se llevó a cabo.
Fig. 1. Diagrama de interacciones RuBP en la unión 1P y 5P
sitios. En el estado cerrado de Rubisco, el fosfato forma hidrógeno
enlaces con Gly381, Gly403, Gly404 y Thr65 en la unión a 1P
sitio (líneas discontinuas), mientras que en el estado abierto de la enzima
la interacción con Trp66 reemplaza la interacción con Thr65 (no
mostrado). El fosfato también forma enlaces de hidrógeno con Arg295 y
His327 en el sitio de unión 5P en el estado cerrado de la enzima
(líneas puntedas). En el estado abierto de la enzima, la interacción de
fosfato con His327 se reemplaza por la interacción con His298 (no
mostrado). El diagrama se basa en la estructura cristalina de los no activados
espinaca Rubisco en complejo con RuBP (código PDB1RCX), y se produjo utilizando
el software RasMol. El carbono, los átomos de nitrógeno, oxígeno y fosfato están
coloreados en gris, azul,rojo y naranja, respectivamente.

materiales y métodos

Condiciones de crecimiento y ensayos de fotosíntesis

Synechocystis PCC6803 se cultivó en medio BG-11 como se describió previamente (Marcus et al., 2003). Las plantas de
Nuphar lutea, recolectadas en la cuenca del río Yarkon en la planicie costera de Israel, se cultivaron en un estanque
abierto. Las tasas netas de fotosíntesis se determinaron usando un electrodo de O2 de tipo Clark (Rank Brothers, Reino
Unido). Las tasas relativas de fotosíntesis bruta de hojas de N. lutea se midieron bajo irradiación saturante (2000 lmol
fotones m 2 s 1) y concentración de CO2 ambiental utilizando un fluorómetro modulado (Diving-PAM, Walz, Alemania)
como se describió previamente (Snir et al. , 2006). Rubisco se purificó parcialmente a partir de extractos de células
mediante dos etapas de fraccionamiento de sulfato de amonio seguido de diálisis (corte de 12000 Da). La integridad de
la enzima se evaluó electrofóricamente en geles de poliacrilamida desnaturalizantes y no desnaturalizantes seguido de
análisis inmunoquímico (Marcus et al., 2003, 2005). Ni la disociación ni los productos proteolíticos de Rubisco se
observaron en estos extractos (datos no mostrados). La concentración molar de los sitios catalíticos de Rubisco se
determinó incubando la enzima con 15 lM [14C] CPBP (carboxipentitol bisfosfato, 66,63107 Bq mol 1) durante 10 min a
30 LC. [14C] CPBP se sintetizó como se describió previamente (Marcus y Gurevitz, 2000). [14C] Rubisco unido a CPBP se
separó del ligando libre por filtración en gel usando Sephadex G-100. Se comparó la relación de unión de CPBP con el
Rubisco salvaje y mutante con la relación densitométrica de las bandas del enzimas de tipo salvaje y mutantes separadas
en un gel de poliacrilamida nativo. La similitud de las dos relaciones, independientemente del mutante analizado, indicó
que la determinación del número de sitio catalítico por la unión de [14C] CPBP era confiable. Los ensayos de activación y
carboxilasa de Rubisco se realizaron como se describe (Marcus y Gurevitz, 2000; Marcus et al., 2005).

Microscopio de electrones
Las células Synechocystis se fijaron en glutaraldehído al 2,5% y luego en OsO4, y se deshidrataron aumentando las
concentraciones de etanol. Las muestras fijas se incrustaron en éter glicídico y se tiñeron con acetato de uranilo y citrato
de plomo.

Mutagénesis y análisis genético

El plásmido pSynR4.0, un derivado pBluescript que contiene el operón rbc completo y las secuencias flanqueantes de
Synechocystis PCC6803 (Amichay et al., 1993), se usó para mutagénesis mediante PCR usando tres cebadores
oligonucleotídicos (Tabla S1 complementaria disponible en JXB en línea). Un cebador diseñado con una mutación se hizo
reaccionar con un cebador cadena arriba o cadena abajo que abarca los sitios de restricción usados para la subclonación.
El plásmido pSynR4.0 (Amichay et al., 1993) fue el molde de ADN y la ADN polimerasa Taq se usó para la amplificación. El
fragmento de ADN resultante se usó en una segunda etapa de PCR con un cebador complementario que abarca un sitio
de restricción. Se utilizó un fragmento XbaI de 580 pb para la mutagénesis de Thr65 y un fragmento NsiI-NruI de 516 pb
para la mutagénesis de Gly404 (Tabla S1 de suplemento). El producto de PCR final se escindió mediante las enzimas
apropiadas y se ligó en el vector pSynR4.0 que se usó para transformar el receptor Syn6803Drbc (Amichay et al., 1993).
Las células transformadas se inocularon en medio sólido BG-11 a concentraciones de CO2 ambiente. Las colonias
crecidas al aire aparecieron en 14-21 d. El análisis de PCR y la secuenciación del ADN verificaron la segregación completa
de las mutaciones introducidas en las pocas copias del genoma de la cianobacteria.

Determinación de las concentraciones de metabolitos del ciclo de Calvin

Las células Synechocystis (30-50 lg de clorofila ml 1) se incubaron en una cámara de electrodo de O2 transparente bajo
la iluminación indicada y la concentración de Ci a 30 LC hasta que se estabilizó la velocidad de la fotosíntesis. Las células
se succionaron rápidamente en una jeringa que contenía 0,35 M de ácido perclórico que desnaturalizó las proteínas
celulares e inmediatamente detuvo todas las actividades metabólicas. El ácido se neutralizó con K2CO3 y el precipitado
de perclorato de potasio se descartó después de la centrifugación. Las concentraciones de RuBP, PGA, GA3P
(gliceraldehído-3-fosfato) y DHAP (dihidroxiacetona-fosfato) se determinaron en el sobrenadante usando ensayos
enzimáticos publicados (Bergmeyer, 1974).

Análisis bioinformático

Las puntuaciones de conservación evolutiva de los residuos de glicina en 400 homólogos de Rubisco de Synechococcus
(código APB 1RBL) que se obtuvieron de la Swiss Protein Database utilizando el algoritmo PSI-Blast (Altschul et al., 1997)
se calcularon mediante
un método bayesiano que usa el software ConSurf (Landau et al., 2005). El modelo estructural se dibujó utilizando el
software RasMol.

Resultados

Efectos de las sustituciones en el sitio de unión a 1P sobre la regulación de la activación de Rubisco por Pi y sus
propiedades catalíticas

Para examinar el papel del sitio de unión 1P en la regulación de la activación de Rubisco y residuos conservados de
catálisis en

entraron en unión RuBP y Pi fueron sustituidos (Fig. 1). Mientras que no se recuperaron mutantes cianobacterianos para
W66A, G381A y G403A, presumiblemente debido a la baja actividad o inestabilidad de las enzimas modificadas, las
células mutantes G404A y T65A / S crecieron fotoautotróficamente a una velocidad similar a la del tipo salvaje (datos no
mostrados). ) Los principales efectos de estas sustituciones fueron una reducción drástica (85-95%) en el Kcat de Rubisco
y una disminución en el Km (RuBP) de los mutantes G404A y T65S, mientras que el Km aparente (CO2) en la
concentración de O2 ambiental para G404A y T65A / S fue similar a la del tipo salvaje (Tabla 1). Para analizar el papel del
sitio de unión a 1P en la regulación de Rubisco por Pi, se compararon las cinéticas de la carboxilación de RuBP
catalizadas por las enzimas mutantes a diversas concentraciones de RuBP y Pi bajo una concentración de CO2 saturada
con las de la enzima no modificada (Tabla 1). El análisis Dixon (Segel, 1975) de los datos para RuBP reveló que Pi inhibía
competitivamente la reacción de carboxilación de las enzimas mutantes y de tipo salvaje, sin una alteración significativa
en Ki (Pi) (Tabla 1). Sin embargo, mientras que la activación estimulada por Pi de los derivados de la enzima salvaje y
T65S fue similar en concentraciones subóptimas de CO2 y en presencia de MgCl2 (0.07 mM y 5 mM, respectivamente),
este efecto estimulante fue abolido por los mutantes T65A y G404A ( Figura 2). La diferencia en el efecto Pi entre T65A y
T65S podría atribuirse a la capacidad de la serina para mantener el enlace de hidrógeno con Pi a través de la cadena
lateral de hidroxilo (Morell et al., 1994). Notablemente, aunque la estimulación de la activación enzimática por Pi fue
abolida para T65A y

Tabla 1. Propiedades cinéticas de los mutantes de Rubisco. La enzima era

activado durante 30 minutos con 280 lM de CO2 y 10 mM de MgCl2 a 30 ° C.
Se agregaron alícuotas de 10 ll (1.25-1.5 lM de Rubisco activado) a
290 l de la mezcla de reacción que contiene varias concentraciones
de 14CO2 y 0.5 mM RuBP o varias concentraciones de
RuBP y Pi y 660 lM de 14CO2 (4 Bq nmol? 1), 5 mM
ditiotreitol, 10 mM de MgCl2 y 7.5 unidades de Wilbur-Anderson de
anhidrasa carbónica en HEPES 50 mM, pH 8,0. La reacción fue
terminado después de 2 minutos mediante la adición de 200 l de ácido acético 6 N,
y el material estable al ácido se contó después de 48 h. El catalizador
la concentración del sitio se determinó mediante unión a [14C] CPBP (ver
Materiales y métodos). Cada ensayo se realizó por triplicado.
Los datos se analizaron de acuerdo con Hanes-Woolf o Dixon (Segel,
1975), y las líneas que mejor se ajustan se calcularon utilizando los cuadrados leasts
método. Coeficientes de correlación para las líneas de regresión
fueron> 0.95.
 Fig. 2. Efecto de la concentración de Pi en la activación
de Rubisco. Los mutantes de tipo salvaje y Rubisco
G404A, T65A y T65S se activaron durante 30 min a 30 LC
con ditiotreitol 1 mM, 70 M M de CO 2, MgCl 2 5 mM y
diversas concentraciones de fosfato de potasio añadidas
después de un intervalo de 5 min. Se añadieron
alícuotas de enzima activada a una mezcla de reacción
en presencia de 0,5 mM de RuBP, 70 lM de 14CO2 (11,3
Bq nmol 1) (para más detalles, véase la Tabla 1). El
pliegue de activación se definió como la proporción de
actividad de Rubisco activada en presencia o ausencia
de Pi, respectivamente. La actividad de Rubisco en
ausencia de Pi fue 40, 5.5, 2.56 y 22.5 min 1 para el tipo
salvaje y los mutantes Rubisco G404A, T65A y T65S,
respectivamente.

G404A, la activación por CO2 y Mg2 + no se vio afectada por ninguna de las enzimas mutantes (datos no mostrados).

Efectos de las sustituciones en el sitio 1P en la fotosíntesis: a pesar de las marcadas reducciones en Kcat para los
mutantes Rubisco (de 6 a 20 veces), las tasas de fotosíntesis de las células se redujeron solo 40-50% (mutantes T65A / S)
) o apenas (mutante G404A) bajo irradiación saturante y concentraciones de Ci variables (Fig. 3). En un intento de
explicar la diferencia entre estas células mutantes, se determinó la concentración de Rubisco por clorofila, su capacidad
de carboxilación y las concentraciones de cuatro metabolitos del ciclo de Calvin (RuBP, PGA, GA3P y DHAP).

El contenido de Rubisco, determinado por la unión de CPBP [14C] radiomarcada, aumentó 2,6-, 3,5- y 4,6 veces,
respectivamente, en células mutantes G404A, T65S y T65A cultivadas con 20 lmol de fotones m 2 s 1 a concentración de
CO2 ambiente ( Fig. 4). Las micrografías electrónicas de estos mutantes revelaron un aumento en el contenido de
carboxisomas (figura 5), que encapsula a Rubisco en cianobacterias (Codd y Marsden, 1984; Marcus et al., 1992). Como
resultado, la capacidad de carboxilación por clorofila a concentraciones de sustrato de saturación alcanzó 25, 49 y 30%
de la del tipo silvestre en los mutantes G404A, T65S y T65A, respectivamente (figura 4).

Dado que las células de Synechocystis se cultivan rutinariamente en laboratorio bajo baja irradiancia (20 lmol de fotones
m 2 s 1), se puede suponer que en estas condiciones la tasa de fotosíntesis se limita en menor medida, como se
demostró para las plantas de tabaco (Stitt et al. ., 1991). Por lo tanto, se examinaron los efectos de la variación de la
irradiancia durante el crecimiento sobre el contenido de Rubisco y la fotosíntesis celular. Se encontró que aunque el
contenido de Rubisco se duplicó en las células de tipo salvaje y no cambió en las células mutantes cultivadas con 100
lmol de fotones m 2 s 1, la tasa de fotosíntesis no fue afectado por la irradiancia elevada (datos no mostrados). Estos
resultados condujeron al examen de la correlación entre la capacidad de carboxilación y las propiedades cinéticas, Km
(RuBP) y Kcat, de las variantes de Rubisco (Marcus et al., 2003, 2005; Figs. 6, 7) y la tasa de fotosíntesis en el células bajo
irradiación de saturación y concentración de Ci (Pmax).
 Fig. 3. Tasas de intercambio de O2 de Synechocystis wild type y G404A,
T65A, y T65S Rubisco mutantes. Se tomaron medidas a varias
irradiancias y Ci 2 mM (A) y a diversas concentraciones de Ci por debajo
de 400 lmol de fotones m 2 s 1 (B) en tampón HEPES 25 mM, pH 7,0,
usando un electrodo de O2 de tipo Clark (Rank Brothers , REINO
UNIDO). Cada ensayo se realizó por triplicado. Las desviaciones estándar
fueron <10%.

Análisis de las correlaciones entre las propiedades cinéticas de Rubisco y la tasa de fotosíntesis

A la luz de las relaciones inversas entre Kcat y Km (CO2) de Rubisco de varias especies (Savir et al., 2010),
las relaciones entre Kcat y Km (RuBP) de Rubisco se examinaron en 11 mutantes Synechocystis del presente trabajo
(Tabla 1) así como en estudios previos (Marcus et al., 2003, 2005). Se obtuvo una curva óptima (Fig. 6A) en la que los
valores máximos de Kcat se refieren a valores de Km (RuBP) de 140-170 lM, que también se determinaron en la enzima
de tipo salvaje. Con una afinidad mayor o menor para RuBP, la rotación catalítica fue menor. La curva óptima implica
que no hay relaciones simples entre la correlación de Pmax y

Rubisco Kcat y la correlación de Pmax y Rubisco Km (RuBP) si las relaciones entre Kcat y Km (RuBP) fueron recíprocas.

La correlación entre Km (RuBP) y la Pmax en estos 11 mutantes Rubisco reveló que las fluctuaciones en Km (RuBP) en

el rango de 50-250 lM tuvo poco efecto en el Pmax. Una excepción a esto fue el valor de Km (RuBP) para el H327Q

Rubisco mutante (490 lM), lo que podría ser una de las razones de su baja Pmax (Fig. 6B). Como los factores adicionales
(por ejemplo, contenido de Rubisco y Kcat, figuras 4, 5, 6C, tabla 1) podrían verse afectados por las sustituciones y
afectar de forma destacada la tasa de fotosíntesis, la varianza en este análisis de correlación fue alta. Dado que la
concentración de RuBP limita el

Pmax (Farquhar et al., 1980), la Pmax debería aumentar a medida que disminuye Km (RuBP). Sin embargo, la
disminución en Km (RuBP) de los mutantes de Rubisco G404A, T65S y C172A (Fig. 6B)
no se reflejó por un aumento en Pmax probablemente debido a la marcada disminución en Kcat, que redujo la
carboxilación

tasa (Figura 6C, Tabla 1, Marcus et al., 2003). En consecuencia, el efecto neto de estas alteraciones en Kcat y Km (RuBP)
en Pmax fue modesto. Esta relación entre Kcat y Km (RuBP) evitaría una mayor elevación en la afinidad Rubisco por
RuBP porque puede disminuir severamente el Kcat. Correlación entre Rubisco Kcat y Pmax de las células (Fig.

6C) reveló que una disminución en Kcat de 700 min 1 a 200 min 1 esencialmente no cambió la tasa de fotosíntesis,

aunque una disminución adicional en Kcat dio como resultado una reducción importante en Pmax. A medida que
Rubisco Kcat disminuyó mientras su contenido aumentaba en los mutantes modificados en el sitio de unión a 1P (Fig. 4),
las correlaciones entre la capacidad de carboxilación (carboxilación por clorofila bajo saturación de RuBP y
concentraciones de CO2) y Pmax se analizaron en extractos de nueve Rubisco. variantes (Marcus et al., 2003, 2005; Figs.
3, 4), y se compararon con correlaciones similares en plantas superiores. Mientras que la tasa de fotosíntesis saturada
de luz a la concentración de CO2 ambiente en la planta C3 N. lutea (Fig. 7) o en la planta C4 Flaveria bidentis (Furbank et
al., 1996) disminuyó junto con una capacidad de carboxilación reducida, hasta un ; La reducción del 66% en la capacidad
de carboxilación de Synechocystis apenas afectó la tasa de fotosíntesis
Fig. 4. Actividad de Rubisco, contenido y rotación catalítica en Synechocystis de tipo salvaje y mutantes. Las células, cultivadas en medio BG-11 a
CO2 ambiente bajo iluminación continua (20 lmol m 2 s 1), se centrifugaron y
resuspendieron en tampón HEPES 50 mM, pH 8,0, que contenía 285 lM de CO 2,
MgCl 2 10 mM, ditiotreitol 1 mM. y un cóctel inhibidor de proteasa (P2714, Sigma).
Las celdas se rompieron bajo 24000 lb pulgada 2 usando una prensa francesa. El
extracto crudo se centrifugó y el sobrenadante que contenía la enzima se activó por
incubación durante 30 minutos a 30 LC. El contenido de los sitios catalíticos de
Rubisco se determinó mediante la incubación de 200 l de enzima activada con 15 lM
[14C] CPBP (185 Bq nmol 1). La enzima unida a CPBP se separó del ligando libre
usando una columna Sephadex-G100 de 10 cm. La actividad de Rubisco se
determinó como se describe en la Tabla 1 en presencia de 1 mM de RuBP y 640 lM
de 14CO2 (1.3 Bq nmol 1) en la mezcla de reacción. Cada ensayo se realizó por
triplicado. Las desviaciones estándar fueron <10%.

(Fig. 7). En estas condiciones, el coeficiente de control [una medida cuantitativa de la limitación impuesta por un factor
único sobre el flujo a través de la vía, cuyo valor absoluto varía entre 0 para un no limitante a 1 para un factor que limita
totalmente el flujo (Kacser y Burns, 1973)] de Rubisco en la fotosíntesis era cero. Sin embargo, cualquier disminución
adicional en la capacidad de carboxilación dio como resultado una declinación pronunciada en la tasa de fotosíntesis de
Synechocystis (Fig. 7), elevando el coeficiente de control de la enzima en fotosíntesis a 0.6. Por interpolación, parece
que la capacidad de carboxilación mínima requerida para soportar el crecimiento fotoautotrófico de Synechocystis es:
20% la del tipo salvaje (Figs. 6, 7).

Análisis de los metabolitos del ciclo de Calvin

Como la limitación impuesta por Rubisco sobre la tasa de fotosíntesis es baja (Figs. 6, 7), se consideró la posibilidad de
que otra reacción en el ciclo de Calvin limite la tasa de fotosíntesis en Synechocystis. La relación de concentración de
productos a sustratos para una reacción limitante generalmente difiere de la calculada en equilibrio. Por lo tanto,
grandes desviaciones de las concentraciones de equilibrio de los productos y sustratos de una reacción dada podrían
sugerir

una reacción limitante (Bassham y Krause, 1969). Por lo tanto, las concentraciones de cuatro metabolitos del ciclo de
Calvin (RuBP, PGA, GA3P y DHAP, los productos y sustratos de las reacciones catalizadas por Rubisco, fosfoglicerato-
quinasa, glicedehído-3-fosfato deshidrogenasa y triosa-fosfato isomerasa, respectivamente) fueron determinado,

se calcularon sus relaciones producto a sustrato, y cómo se verían afectados por la variación de la irradiancia y las
concentraciones de CO2.

Al limitar la irradiancia, la concentración de RuBP era alta, mientras que las concentraciones de PGA, GA3P y DHAP eran
bajas (figura 8). A medida que aumentaba la irradiancia, la concentración de RuBP disminuía y las concentraciones de
PGA, GA3P y DHAP aumentaban. Consecuentemente, las relaciones de concentración de producto a sustrato de PGA a
RuBP y la de GA3P a PGA aumentaron con mayor irradiancia (Figura 8). La concentración de estos metabolitos también
fue

determinado para el mutante G404A y para un mutante previamente estudiado, H327Q (Marcus et al., 2005). Mientras
que Rubisco Kcat y el contenido fueron similares en los dos mutantes, Km (RuBP) fue diferente (46 lM y 490 lM,
respectivamente, Tabla 1 y Fig. 4, Marcus et al., 2005). Como sustitución H327Q

aumento de la inhibición competitiva de la carboxilación por Pi, uno esperaría una Km elevada (RuBP) in vivo,
dependiendo de la concentración de Pi intracelular (Marcus et al., 2005). De hecho, la concentración de RuBP en el
mutante H327Q fue mayor que en el tipo salvaje en cualquier irradiancia, mientras que en el mutante G404A fue menor
bajo irradiación limitante e igual a la del tipo salvaje bajo irradiación saturada. En ambos mutantes, la concentración de
PGA fue menor que la del tipo salvaje. En consecuencia, la relación de concentración de PGA a RuBP más alta se
determinó para el tipo salvaje, mientras que la más baja se determinó para el H327Q mutante. La concentración de
GA3P en ambos mutantes fue menor que la del tipo salvaje, y la concentración de DHAP fue mayor en el mutante G404A
en comparación con el tipo salvaje y con el mutante H327Q. La relación de concentración de GA3P a PGA fue similar en
el tipo salvaje y en ambos mutantes (Fig. 8).

Las diferencias en las concentraciones de RuBP, PGA, GA3P y DHAP en los mutantes G404A y H327Q aparentemente se
debieron a la gran diferencia en la afinidad de Rubisco por RuBP. La mayor afinidad por RuBP probablemente permitió
que el mutante G404A utilizara bajas concentraciones de RuBP que existen en estas células a saturaciones de irradiancia
y concentraciones de Ci y mantienen su tasa de fotosíntesis de tipo salvaje (Fig. 3).

Fig. 5. Micrografías
electrónicas de transmisión
de células Synechocystis. Los
mutantes de tipo silvestre
(A) y Rubisco T65A, T65S y
G404A (B-D,
respectivamente). Los
carboxisomas, designados
por flechas blancas, se
distinguen por su
composición granulosa y
forma poliédrica.

Discusión

Papel del sitio de unión 1P en la regulación de Rubisco por Pi

El análisis mutacional destacó el papel del sitio de unión 1P en la estimulación de la activación de Rubisco. Como se
muestra en la estructura cristalina del complejo Rubisco-Pi (Fig. 1), el fosfato interactúa con Thr65, Trp66, Gly381,
Gly403 y Gly404 (Duff et al., 2000). Mientras que la sustitución de Trp66, Gly381 y Gly403 con alanina parecía letal para
la viabilidad celular, el análisis de los mutantes T65A / S y G404A demuestra cómo las sustituciones afectan de manera
diferencial a la Km (RuBP) y Kcat de la enzima, así como su activación por Pi , pero no la inhibición competitiva Pi de su
actividad
(Tabla 1, Fig. 2). Estos hallazgos junto con análisis previos de los sitios de unión 5P y de pestillo de Pi (Marcus et al.,
2005) implican que los tres sitios de unión Pi desempeñan un papel en la estimulación de la activación de Rubisco,
mientras que solo el sitio 5P es involucrado en la inhibición de Pi de la actividad de Rubisco. Mientras que en los sitios de
unión 5P y pestillo, el fosfato forma hidrógeno e interacciones electrostáticas con las cadenas laterales de residuos
cargados positivamente (histidina, arginina y lisina), en el sitio de unión a 1P solo interactúa mediante enlaces de
hidrógeno con las amidas de la cadena principal de Gly381, Gly403 y Gly404, y con el hidroxilo de cadena lateral de
Thr65 (Figura 1, Taylor y Andersson, 1996; Duff et al., 2000). Aunque la interacción del fosfato con las amidas del
esqueleto de los residuos de glicina (figura 1) parece inespecífica, Gly381, Gly403 y Gly404 están altamente conservados,
y las sustituciones de Gly381 y Gly403 con alanina fueron letales. Evidentemente, incluso un cambio tan pequeño como
el cambio introducido en Gly404 (por ejemplo, la adición de metilo tras la sustitución con alanina) altera drásticamente
las propiedades cinéticas de la enzima (Tabla 1). Gly381 pertenece al bucle 7 entre la cadena b7 y la hélice a7, y Gly403
se encuentra en el bucle 8 entre la cadena b8 y la hélice aP. Sin embargo, Gly404 reside en el borde de la hélice aP (la
numeración de hélices y hebras sigue a Knight et al., 1990) y está ligeramente distante de RuBP, lo que puede explicar la
falta de letalidad de las células mutantes correspondientes. Curiosamente, esta estructura se asemeja a un "P-loop", un
motivo común que se ha encontrado en los sitios de unión de los fosfatos de nucleótidos. Este elemento consiste en una
secuencia rica en glicina que conecta una hoja B con una a-hélice (Rossman et al., 1974; Kinoshita et al.,
1999). Comparación de 400 secuencias rbcL distintas (ver
Materiales y métodos) revela que dos tercios de los
los residuos de glicina en la subunidad grande de Rubisco aparecen en
bucles y la mayoría de ellos están conservados (datos no mostrados).
Por lo tanto, la sustitución de la glicina puede afectar el ciclo
estructura o dinámica durante la catálisis. Alternativamente, el
cadena lateral de alanina podría estéricamente impedir la unión a RuBP

Fig. 6. Relaciones entre Km (RuBP) y Kcat de Rubisco (A) y entre la tasa de

fotosíntesis bajo irradiancia saturante y las concentraciones de Ci (Pmax) y Km
(RuBP) (B) y Kcat (C) de Synechocystis Rubisco derivadas en el tipo silvestre y
mutantes C172A, C172A-C192A, R134A, K305E, C399A, G404A, H298A,
H327Q, T65A y T65S Rubisco. La Pmax se determinó usando un electrodo de
O2 a 400 lmol m 2 s 1 y 2 mM NaHCO3, y las propiedades cinéticas de Rubisco
se determinaron como se describe en la Tabla 1.

{
 Fig. 7. Relaciones entre la actividad de Rubisco por clorofila y la
tasa de fotosíntesis en las hojas de Nuphar lutea y en
cianobacteria Synechocystis PCC6803. La actividad de Rubisco y el
tasa relativa de saturación de la luz de la fotosíntesis bruta se determinaron
durante el día en las hojas aéreas de Nuphar. La tasa relativa de
la fotosíntesis bruta se determinó a la concentración de CO2 ambiental
bajo 2000 lmol fotones m \ leq 2 s \ leq 1 usando un fluorómetro PAM.
La tasa de fotosíntesis saturada de luz y Ci de Synechocystis
células (tipo salvaje y C172A, C172A-C192A, R134A, K305E,
Mutantes H298A, H327Q, T65A y T65S Rubisco)
usando un electrodo de O2 a 400 lmol m? 2 s? 1 y 2 mM
NaHCO3. La actividad de Rubisco se determinó en saturar RuBP y
Las concentraciones de CO2 se describen en la Fig. 4. Los valores máximos de
cada parámetro para Nuphar y para Synechocystis de tipo salvaje definido como 100%

Los factores limitantes para la fotosíntesis en Synechocystis

Desde el descubrimiento del ciclo de Calvin en el medio del Siglo XX, extenso fisiológico, metabólico y genético
Los estudios han demostrado que la actividad de Rubisco es la principal factor limitante para la fotosíntesis bajo
irradiación saturaday limitar las concentraciones de Ci en C3 (Farquhar et al.,1980; Dietz y Heber, 1984; Stitt y otros,
1991; Snir et al.,2006) y C4 (Furbank et al., 1996) plantas, así como en Algas verdes que concentran CO2 (Bassham y
Krause,1969). Por el contrario, en el G404A Synechocystis PCC6803 mutante, la disminución del 90% en Rubisco Kcat
apenas afectó su fotosíntesis y tasas de crecimiento (Figuras 3-6, Tabla 1). Similar a las plantas que responden a la
actividad reducida de Rubisco por elevando su estado de activación (Stitt et al 1991), fue encontrado
que las células Synechocystis PCC6803 aumentaron su Rubisco contenido hasta 4,6 veces (figura 4). A pesar de esto
aumento, la capacidad de carboxilación no se devolvió a la nivel salvaje. A la luz del efecto menor de la sustitución
G404A sobre crecimiento celular y especialmente sobre Pmax (Fig. 3), Rubisco la actividad no parece ser el factor
limitante para la cianobacteria fotosíntesis bajo irradiación saturada y limitación Concentraciones de Ci. En contraste
con el mutante G404A, la tasa de la fotosíntesis en los mutantes T65A / S fue modestamente impidió saturar Ci y la
irradiancia (Fig. 3), sugiriendo que las limitaciones como la regeneración RuBP, en lugar de la actividad de Rubisco
limitaba la fotosíntesis.
Para examinar el alcance de la limitación de Rubisco en la tasade la fotosíntesis, Pmax se correlacionó con la
carboxilacióncapacidad de las células, y con Kcat, así como con Km (RuBP) de Rubisco, y la relación de concentración de
PGA a RuBP, el producto y sustrato de la carboxilación reacción, se determinó. Por un lado, la correlación entre Pmax y
la capacidad de carboxilación reveló que a diferencia de las plantas superiores C3 y C4 (Fig. 7, Stitt et al., 1991;
Furbank et al., 1996), la tasa de fotosíntesis en Synechocystis PCC6803 es insensible a grandes variaciones en
Rubisco Kcat y Km (RuBP) y en la carboxilación capacidad de las células (Figs. 6, 7). Por lo tanto, la limitación
impuesto por Rubisco sobre la tasa de fotosíntesis es bajo.

Fig. 8. Concentraciones y relaciones de concentración de los metabolitos del

ciclo de Calvin RuBP, PGA, GA3P y DHAP en Synechocystis de tipo salvaje y Rubisco
mutantes H327Q y G404A. Las células se incubaron a 30 LC bajo la irradiación
indicada en presencia de NaHCO3 3,75 mM hasta que la tasa de fotosíntesis fue
estable. Alícuotas (30-50 lg de clorofila ml 1) fueron succionadas rápidamente
0.35 M de ácido perclórico. Después de la neutralización del ácido con K2CO3, la
concentración de metabolitos fue determinada. RuBP se convirtió a PGA, y PGA,
GA3P y DHAP se redujeron por reacciones dependientes de NADH a glicerol-3-
fosfato.
Estos resultados están de acuerdo con los hallazgos de Daniell
et al. (1989), quien demostró que la sobreexpresión de Rubisco
no influyó en la tasa de crecimiento de la cianobacteria
Synechococcus, pero están en conflicto con los de Iwaki et al.
(2006), quien afirmó que la expresión del tipo extranjero 1
Rubisco estimuló la fotosíntesis en Synechococcus. En
Por otro lado, la relación de concentración PGA a RuBP
(Fig. 8) se vio afectada por la irradiancia y la concentración de Ci,
y por mutaciones en la enzima que redujo la carboxilación
capacidad. Estos efectos demostraron que la carboxilasa
reacción no estaba en equilibrio como se muestra para mayor
plantas (Dietz y Heber, 1984) y algas (Bassham y
Krause, 1969). Del mismo modo, grandes alteraciones en las concentraciones
de fructosa bisfosfatasa y fosforribosa
quinasa, que cataliza el no equilibrio altamente regulado
reacciones en el ciclo de Calvin, tuvieron un efecto insignificante en
tasa de fotosíntesis de las plantas superiores (para una revisión, ver
Raines, 2003).
Los hallazgos contradictorios con respecto a la limitación impuesta
por Rubisco sobre la tasa de fotosíntesis se puede racionalizar
si otras reacciones imponen una mayor limitación en la tasa
de la fotosíntesis. Por ese motivo, la limitación impuesta
por reducción de PGA y isomerización de fosfato de triosa en
la tasa de fotosíntesis fue examinada determinando
sus relaciones de concentración de sustrato a producto (PGA, GA3P)

La relación de concentración de GA3P a PGA aumentó con

irradiancia en células Synechocystis de hasta 500 lmol de fotones
m? 2 s1 (Fig. 8), mientras que en plantas superiores es constante o
disminuye (Heber et al., 1986). Suponiendo que el citoplasma
El pH es constante en las células iluminadas, la fotosíntesis
en cianobacterias, a diferencia de las plantas superiores, está limitado por ATP,
NADPH, o ambos por debajo de la irradiancia. A diferencia de
a las plantas superiores, las cianobacterias concentran CO2 en el
sitio de carboxilación por absorción de CO2 y HCO3 - o CO3
2-
impulsado por ATP, gradientes de iones y electrón fotosintético
transporte (Kaplan et al., 1987; Marcus et al., 1992; Badger
et al., 2006). El exceso de energía requerido para el transporte Ci
puede disminuir los grupos de ATP y NADPH, y por lo tanto
La reducción de PGA es limitada. Por el contrario, la competencia entre
Reducción PGA y transporte Ci en recursos limitados de
ATP y NADPH pueden limitar la absorción de Ci y, como resultado,
también la tasa de fotosíntesis. De hecho, se ha demostrado
que las células de Anabaena varibilis con alto contenido de CO2 están limitadas por
Captación Ci. Sin embargo, la elevación de la capacidad de captación de Ci en
las células crecidas con aire levantaron esta limitación (Kaplan et al., 1980).
A medida que la relación de concentración GA3P a PGA se estabiliza en
alta irradiancia (Fig. 8), no está claro si bajo
saturación de irradiancia ATP o NADPH limitan la reducción PGA
o la absorción de Ci y, en consecuencia, la tasa de fotosíntesis.

Conclusiones
Análisis mutagénico de los sitios de unión a fosfato en Synechocystis
Rubisco reveló que: (i) los tres enlaces de fosfato
sitios juegan un papel en la estimulación inducida por Pi de Rubisco
activación, mientras que solo el sitio de unión a 5P está involucrado
Inhibición de Pi de la actividad de la enzima; (ii) bajo irradiancia saturante
y limitando las concentraciones de Ci, Rubisco no es el
principal factor limitante de la velocidad para la fotosíntesis de cianobacterias, como
hasta un 90% de reducción en su Kcat o dos tercios de los
la capacidad de carboxilación de las células apenas afectó el carbono
tasas de asimilación y crecimiento; y (iii) límites de reducción de PGA
la tasa de fotosíntesis limitada a la luz debida a ATP o
Limitación de NADPH según lo revelado por el análisis del ciclo de Calvin
metabolitos.
Dato suplementario
Los datos complementarios están disponibles en JXB en línea.
Expresiones de gratitud
Agradecemos al Dr. Vered Holdengerber por preparar el
micrografías electrónicas. Esta investigación fue apoyada por
la Israeli Science Foundation (ISF), la subvención 620/08, y por
la Fundación Alemana Israelí (GIF), otorgar I-736-80.9 / 2002.