Sunteți pe pagina 1din 115

3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Username / Parola inexistente

email ••••••
Login Am uitat parola x Creaza cont nou

Home Exploreaza Upload

EXTRACTIA ENZIMELOR
biologie

EXTRACTIA ENZIMELOR
Este evident ca pentru a putea intelege in detaliu Enciclopedii Vizuale. Stii…
comportarea unei enzime intr-un sistem complex in care Un ghid vizual sclipitor despre
lumea fascinanta a fizicii, chi…
exista ea in mod obisnuit - asa cum sunt organitele celulare
32,99 lei
(mitocondrii, lizozomi, ribozomi etc.), celule, tesuturi, organe
parti sau intregul organism – este necesar sa incercam in Vezi oferta

primul rand sa-i intelegem proprietatile in cel mai simplu


Pagini de jurnal (1891-19…
sistem posibil. In cele mai multe cazuri, cand enzima este Jurnalul inedit al unei doamne
exocelulara, sistemul simplu este constituit dintr-o solutie de onoare a Reginei Maria F…
41,99 lei
enzimatica care contine si mici cantitati de ioni, molecule
tampon, cofactori, etc. In alte cazuri, insa, cum sunt cele in Vezi oferta

care enzimele sunt endocelulare, componente a unor


Istoria Imperiului bizantin
organite celulare sau sunt legate de membranele celulare Studiu introductiv de
izolarea enzimei este un proces mai complicat, deoarece Ionut‑Alexandru Tudorie Scri…

enzima poate fi inactivata daca in mediu nu exista unii 62,99 lei

componenti aditionali specifici. Vezi oferta

O istorie a lumii in doua…


Enciclopedii Vizuale. Stiinta
Aceasta carte face parte din
Un ghid vizual sclipitor despre colectia HISTORIA a editurii…
lumea fascinanta a fizicii, chimiei
si biologiei. 38,99 lei
32,99 lei Vezi oferta
Vezi oferta

Picturepedia - English v…
Nazismul. O istorie ilustrat…
Explore the wonders of history,
Aceasta carte se deosebeste de space, the natural world and…
majoritatea lucrarilor
conventionale despre al Treilea… 63,99 lei
23,99 lei
Vezi oferta
Vezi oferta
Ads by elefant.ro
Ads by elefant.ro

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 1/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Strategia de alegere a sursei enzimatice

Pentru studierea proprietatilor structurale sau/si biochimice


ale unei enzime trebuie aleasa sursa care raspunde cel mai ALTE DOCUMENTE
ANATOMIA PATOLOGICĂ A CAVITĂŢII BUCALE
bine cerintelor de izolare cu o
PEŞTII NOŞTRI STRANII
MEIOZA
activitate catalitica maxima adica enzima prezenta sa Test de evaluare din materia clasei a XI a
nu fie degradata sau inactivata si sa fie de ANATOMIA DEZVOLTARII
PROKARYOTE SI PROTISTE
puritate maxima posibila adica nu trebuie sa contina Organele sexuale masculine
alte enzime sau molecule mari. Daca se urmareste SENSIBILITATEA LUMII VEGETALE ESTE O
REALITATE?
si purificarea enzimei, scopul purificarii trebuie sa fie Clasificarea bacteriilor in functie de patogenitate
obtinerea unui preparat cu un STRUCTURI CAPABILE SA PRELUCREZE
INFORMATIE

randament maxim posibil rezultat din procentul de


căutare personalizată Search
activitate recuperata comparativ cu activitatea
extractului original.

Strategia de alegere a unui material biologic pentru extragerea unei enzime utilizabile in diferite scopuri sau
pentru studiul ei este necesar sa se tina cont de o serie de factori cum sunt:

Ø abundenta enzime;

Ø disponibilitatea si pretul de cost;

Ø localizarea intracelulara;

Ø caracterizarea sursei;

Ø studii comparative.

In toate etapele de alegere a sursei trebuie sa se aibe in vedere si stabilitatea enzimei si posibilele dificultati
in manipularea sursei.

1. Abundenta enzimei. Deoarece pentru orice studiu, experimentare sau aplicare este necesar sa se
obtina extracte proteice totale cu concentratii ridicate ale enzimei de interes trebuie alese surse biologice
bogate in enzima dorita.

Astfel radacinile de hrean sunt surse extrem de bogate de peroxidaze, muschiul inimiii este bogat in
lactatdehidrogenaze, glandele mamare in periada lactatiei sunt o sursa buna de acetil CoA carboxilaza si
rinichii sunt bogati in hidrolaze.

Microorganismele sunt surse de obtinere prin procese biotehnologice a enzimelor utilizate in diverse domenii
cum sunt agricultura, industria alimentara, industria farmaceutica, pielarie etc. De exemplu un microorganism
cunoscut de toata lumea, drojdia de bere (Saccharomyces cerevisiae), care este utilizata in special in
panificatie si industria berii, se obtine usor in cantitati mari si este foarte bogata in enzime glicolitice.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 2/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Avantajul utilizarii microorganismelor ca surse de enzime consta in faptul ca prin modificari ale mediului de
cultura sau modificari genetice se poate creste nivelul de productie a enzimei de interes.

Astfel sinteza b-D-galactozidazei poate fi indusa la E. coli prin cresterea bacteriei intr-un mediu care contine
lactoza (substratul enzimei) ca unica sursa de carbon.

Dezvoltarea tehnicilor de clonare moleculara, a ADN-ului recombinant, a determinat aparitia unor noi metode
de realizare a unor tulpini de microorganisme inalt producatoare de enzime. In aceasta tehnica, gena care
codifica o enzima este izolata de la organismul parental si expresata la un nivel ridicat intr-un organism de
crestere convenabil cum sunt E. coli si drojdiile. Prin aceasta tehnica o tulpina de E. coli a produs de 100
pana la 200 de ori mai multa glutation reductaza decat tulpina salbatica.

Trebuie sa subliniem ca desi aceste tehnici reprezinta posibilitati reale de crestere a capacitatii de biosinteza
a unei enzime pot aparea probleme considerabile la exprimarea unor gene eucariote in celule procariote,
astfel incat, in unele cazuri proteinele supra exprimate pot forma agregate insolubile si recuperarea activitatii
enzimatice din acestea nu a fost totdeauna posibila.

2. Disponibilitatea sursei si pretul de cost. Sursa biologica trebuie sa fie accesibila atat din punct de
vedere geografic cat si economic. In acest sens nu se recomanda utilizarea unor surse scumpe, ca de
exmplu muschiul de homar, sau a unor surse care se gasesc in regiuni indepartate, „exotice”, ale globului
(specii bioluminiscente).

Tesuturile umane sunt surse greu de procurat in multe tari si in cele mai multe cazuri cad sub incidenta unor
legi protective fata de etica de obtinere a acestora.

In multe situatii sursele clasice pentru anumite enzime au fost inlocuite de surse alternative:

v De exemplu creierul porcului de guinea, sursa clasica pentru extractia si purificarea histamin-
metiltransferazei, poate fi inlocuit cu rinichiul de porc, sursa mai ieftina si mai accesibila;

v In studiul structurii subunitare a ceruloplasminei umane, o problema a fost sensibilitatea mare a


acestei proteine la atacul enzimelor proteolitice. Cand s-a descoperit ca ceruloplasmina umana este
aproape similara cu cea porcina, studiile au fost orientate spre aceasta sursa in care proteina se
gaseste in cantitati mult mai mari si este mai stabila la atacul enzimelor proteolitice;

v Enzimele pectolitice necesare obtinerii sucurilor limpezi din fructe sau legume se obtin cu ajutorul
microorganismelor. Obtinerea lor din fructe le-ar ridica pretul foarte mult ceea ce ar duce la
indisponibilitatea lor pentru industria de sucuri.

Sursele animale sau microbiene traditionale pentru anumite enzime pot fi inlocuite la ora actuala de
microorganisme obtinute prin inginerie genetica sau de culturi de celule eucariote. Proteinele de origine
eucariota, produse prin clonare si expresare in bacterii de tipul E. coli, pot fi localizate in citoplasma sau pot fi
secretate prin membrana celulara. In al doilea caz, ele se pot acumula in interiorul spatiului periplasmatic,
sau pot fi secretate in mediul de cultura. O enzima care se acumuleaza in interiorul spatiului periplasmatic

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 3/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

poate fi si ea secretata in mediul de cultura prin schimbarea conditiilor de crestere. Aceasta metoda conduce
la obtinerea unui grad avansat de purificare pentru enzimele secretate, pentru ca, majoritatea proteinelor
biosintetizate raman in interiorul celulelor.

In alegrea sursei de izolare si purificare a unei enzime trebuie sa se faca un compromis intre abundenta si
accesibilitatea acesteia.

3. Localizarea intracelulara a unei enzime este esential de cunoscut pentru a se putea stabili cea mai
convenabila metoda de extractie. Astfel daca o enzima are o singura localizare in celula (cum sunt de
exemplu succinat dehidrogenaza si alte enzime din ciclul acizilor tricarboxilici care se gasesc exclusiv in
mitocondrii) se poate utiliza pentru purificare si studiu un omogenat obtinut din intregul tesut.

In cazul unor enzime similare ca functionalitate si structura, localizate in mai multe formatiuni intracelulare,
este necesara o fractionare subcelulara inainte de a incepe purificarea enzimei de interes. Astfel, in cazul
purificarii adenozintrifosfatazei mitocondriale, enzima implicata in transportul H+, este necesara obtinerea
unui preparat mitocondrial cu puritate rezonabila, pentru a se evita contaminarea cu alte adenozintrifosfataze
implicate de exemplu in transportul Na+ si K+ prin membrana celulara.

Fractionarea subcelulara se realizeaza prin procese de centrifugare, deoarece organitele celulare


sedimenteaza la diferite valori ale fortelor centrifugale

4. Caracterizarea sursei. Sursa aleasa trebuie sa fie perfect caracterizata.

Cand sursa aleasa este vegetala, este necesara cunoasterea genului, speciei si varietatii acesteia. Adeseori
este necesara si cunoasterea zonei, climei in care s-a dezvoltat sursa vegetala precum si perioada de
recoltare.

In cazul microorganismelor este necesara unei tulpini bine caracterizate, crescuta pe medii de cultura cu
compozitie bine determinata.

Pentru surse animale, este necesara prelevarea de tesuturi sau organe de la animale normale, avand
acelasi sex, aceiasi greutate si varsta, care au fost supuse unui regim alimentar identic. In cazul surselor
animale este necesara cunoasterea aproximativa a compozitiei sursei pentru a inlatura unele interferente
care pot aparea pe parcursul extractiei si purificarii. De exemplu, ficatul contine o cantitate mare de glicogen
care interfera in multe dozari. Pentru a limita aceste interferente, animalele de laborator trebuie supuse unui
regim de inanitie inainte de sacrificare. Partea endocrina a pancreasului este bogata in lipide care interfera in
extractia enzimelor. Pentru a limita acest neajuns se recomanda indepartarea mecanica a acesti parti a
pancreasului inainte de extractia enzimelor.

5. Studii comparative.

Unele enzime au fost studiate in unele specii sau in diferite tesuturi ale unor specii. In asemenea cazuri este
de mare importanta sa se studieze enzimele respective si in diferite alte specii sau tesuturi in vederea
evaluarii evolutiei enzimei, proprietatile ei comparativ cu altele similare, structura primara, tertiara, diferitele
izoenzime etc.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 4/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Metode de extractie

Exista numeroase metode de extractie a enzimelor extracelulare (medii in care acestea se afla in afara
celulelor) cat si endocelulare (enzimele se afla in interiorul celulelor) In ultimul caz sunt necesare metode
speciale de spargere a celulelor. Alegerea metodei de extractie este dependenta de natura tesutului,
organismului sau mediului utilizat ca sursa enzimatica.

Astfel unele materiale biologice permit obtinerea de solutii clare sau aproape clare de proteine, enzime, prin
simple procedee de filtrare sau centrifugare deoarece enzimele sunt, in aceste cazuri, libere in solventul (in
majoritatea cazurilor apa) materialului biologic respectiv. In aceasta categorie putem aminti ca exemple
urmatoarele: urina, laptele, serul sanguin, sucul unor fructe, veninul de sarpe, mediile extracelulare rezultate
dupa cultivarea microorganismelor sau a celulelor animale sau vegetale. Alegerea unei astfel de surse
prezinta avantajul ca materialul de la care se porneste procedeul de extractie contine un numar relativ mic de
componente, iar proteinele extracelulare sunt relativ stabile. Unele dintre aceste surse, cum este urina sau
supernatantele culturilor de celule, datorita dilutiei existente, trebuie supuse unor operatii de concentrare
inainte de inceperea purificarii efective.

In cazul unor surse este, insa, necesara extractia proteinei cu o anumita activitate enzimatica dintr-un tesut
sau dintr-un anumit tip de celula. In aceste cazuri, alaturi de proteina de interes sunt eliberate un numar
mare de alte molecule contaminante, printre care si enzime proteolitice, enzime care fac destul de dificila
purificarea proteinei de interes. Astfel, extractia si purificarea unei proteine particulare dintr-o sursa solida
implica cel mai adesea un compromis intre gradul de recuperare (randament) si puritatea acesteia (factor de
purificare).

Dezintegrarea celulelor sau tesuturilor si eliberarea continutului acestora in mediul de extractie se poate
realiza printr-o serie de metode specifice. In anumite cazuri se prefera sau este necesara dezintegrarea
tesuturilor si prepararea unor populatii omogene de celule intacte inainte de ruperea membranelor celulare.

Alegerea metodei de dezintegrare depinde de sursa si de tipul de tesut sau organ utilizat ca sursa de izolare
a enzimei. In urma dezintegrarii celulare se obtin omogenate celulare care contin componentele celulare
suspendate in mediul de extractie. Principalele metode utilizate pentru dezintegrarea celulelor sunt :

Metoda Principiul de baza

Metode blande

Liza celulara Ruperea osmotica a membranei celulare

Digestia enzimatica Ruperea peretilor celulari; eliberarea continutului celular in mediu.

Omogenizator Potter- Elvehjem Celulele sunt dezintegrate intr-un spatiu ingust existent intre pistil si
peretii de sticla; membranele celulare sunt rupte datorita fortelor care
apar;

Metode moderate

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 5/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Omogenizator cu cutite (Warning Membranele sunt taiate cu ajutorul unor lame care se rotesc
blendor)

Mojarare in prezenta de nisip, Membranele sunt indepartate prin actiunea abraziva a particulelor de
alumina sau perle de sticla nisip sau alumina

Metode severe

Presare Celulele sunt fortate sa treaca prin orificii mici la presiuni foarte mari
astfel incat fortele de rupere afecteaza integritatea membranelor
(French press)

Decompresiune exploziva Celulele sunt echilibrate cu un gaz inert la presiune mare, ceea ce
determina ruperea membranelor si eliberarea continutului celular

Macinare cu bile Vibratiile rapide realizate cu ajutorul perlelor de sticla conduc la


indepartarea peretilor celulari
(bead mill)

Ultrasonicare Tratarea suspensiilor celulare cu frecvente sonice determina ruperea


membranelor

Inghet-dezghet repetat Ruperea legaturilor de hidrogen si a celor hidrofobe realizate intre


enzime si alte componente precum si a membranelor ca urmare a
inghetarii apei.

Se recomanda pe cat posibil utilizarea unor metode de dezintegrare blande, care sa nu afecteze enzima de
interes si sa nu determine eliberarea enzimelor degradative din organite celulare de tipul vacuolelor sau/si a
lizozomilor.

Separarea, extractia enzimelor

O extractie, separare, o purificare de succes, este determinata, pentru o enzima, o substanta, de evaluarea
corecta a proprietatilor specifice ale acesteia.

Pentru alegerea procesului de separare trebuie sa se tina cont in primul rand de sursa enzimatica si de
principalele caracteristici ale enzimelor, ce pot fi exploatate in procesele de separare si anume:

Ø dimensiunea;

Ø sarcina electrica;

Ø solubilitatea si

Ø prezenta unor situsuri specifice de legare.

Procesele, etapele fiecarui proces, utilizate pentru separarea, extractia si daca este cazul purificarea unei
enzime, trebuie astfel alese incat sa fie cat mai convenabile pentru enzima de interes.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 6/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Pentru realizarea unei extractii, indiferent daca este vorba de omogenat global sau din fractii subcelulare si
indifferent de natura sursei, prima etapa este omogenizarea totala sau partiala a sursei. O schema
generala ce trebuie urmata in acest scop este prezentata in fig nr.:1 In functie de natura sursei, metodele de
omogenizare sunt diferite.

Extractia enzimelor din sangele mamiferelor.

Sangele poate fi pastrat in mai multe feluri. Majoritatea enzimelor raman in stare activa pentru o perioada de
cel putin o luna, daca 1 ml sange se adauga 0,15 ml de amestec acid – citrat – dextroza (ACD), cu un
continut de 0,8 g de acid citric, 2,2 g de citrat trisodic si 2,45 g de dextroza la 100 ml solutie. Amestecul ACD
trebuie adaugat chiar daca sangele a fost prelevat pe anticoagulanti de tipul heparinei sau EDTA – ului.
Sangele cu ACD poate fi pastrat la temperaturi cuprinse intre +20 si +60C. Inghetarea acestuia poate inactiva
unele enzime, ca de exemplu lactat dehidrogenaza.

Pentru a obtine ser, sangele este prelevat in absenta anticoagulantilor in tuburi de sticla. Dupa formarea
cheagului de sange, se centrifugheaza, supernatantul limpede fiind serul.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 7/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 8/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Fig. 1
Schema generala a etapelor implicate in extractia si purificarea
enzimelor

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 9/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Metode de omogenizare a microorganismelor

Enzimele biosintetizate de microorganisme sunt de doua feluri : exocelulare si endocelulare.

Enzimele exocelulare sunt eliberate de microorganisme in mediul de cultura, izolarea acestora realizandu-se
printr-o filtrare a mediului.

Izolarea enzimelor endocelulare este mai dificila datorita peretilor celulari duri ai microroganismelor. Ruperea
peretilor celulari se poate realiza prin utilizarea unor metode severe de dezintegrare cum ar fi:

Ø sonicarea;

Ø mojararea in prezenta agentilor abrazivi perioade lungi de timp;

Ø agitarea in prezenta perlelor de sticla;

Ø inghet – dezghet repetat;

Ø aplicarea unor presiuni mari (French press).

Gradul de rupere al peretilor celulari poate fi monitorizat prin examinare microscopica. Daca suspensia
celulelor dezintegrate contine agregate gelatinoase de acizi nucleici este indicata sonicarea acestora inainte
de centrifugare.

Pe langa problemele ridicate de prezenta peretelui celular dur, drojdiile si alti fungi contin cantitati mari de
enzime proteolitice. Acest dezavantaj poate fi minimalizat prin selectia sau constructia unor mutante
deficitare in productia de proteinaze sau prin represarea sintezei acestora prin cresterea pe medii care nu
contin substraturi proteice. Daca acest lucru nu este posibil este necesara adaugarea de inhibitori ai
proteinazelor.

Metode de omogenizare a tesuturilor mamiferelor

Omogenizarea tesuturilor mamiferelor este relativ usoara deoarece cele mai multe dintre acestea nu au
peretii celulari rigizi. Extractiile se realizeaza in mod obligatoriu din tesuturi proaspete sau pastrate la – 800C.
Inainte de pastrare tesuturile proaspete trebuie inghetate rapid in azot lichid (- 1960C). Inainte de a fi
prelucrate/omogenizate este necesar ca probele de tesut sa fie spalate cu o solutie salina de concentratie
1,8% pentru indepartarea sangelui contaminant.

In mod obisnuit tesutul este taiat in bucati mici, maruntit apoi omogenizat cu ajutorul unor aparate numite
omogenizatoare de tip Waring Blender sau Potter-Elvehjem. In general tesuturile mai tari, cum sunt muschii
scheletici sau cei ai inimii, sunt tocate si omogenizate cu aparate de tip Waring Blender care este prevazut
cu cutite metalice. Tesuturile moi, cum sunt cele de ficat sau creier sunt omogenizate cu aparate de tip
Potter-Elvehjem. Acesta este format dintr-un pistil de Teflon sau sticla care este atasat la o tija de metal si
introdus intr-un vas de sticla grunjos pe interior. In spatiul ingust dintre sticla si pistil se introduce o cantitate

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 10/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

corespunzatoare de tesut si mediu de extractie. Pistilul este rotit rapid (in medie cu 1000 rpm), miscare care
determina dezintegrarea tesuturilor si celulelor.

Omogenizarile cu astfel de aparate trebuie realizate la rece pentru a preveni incalzirea probelor.

Extractia enzimelor prin procesul de omogenizare se realizeaza in cele mai multe cazuri timp de 30 de
minute. Omogenatul obtinut este centrifugat si extractul clar obtinut este extractul proteic total (EPT).

Pentru realizarea unei extractii prin omogenizare se folosesc medii extractive. Mediile de extractie utilizate
sunt diverse si se aleg in functie de tesutul ce se omogenizeaza de natura enzimei si de localizarea
intracelulara a enzimei de interes.

Taria ionica a mediilor de extractie se alege in functie de solubilitatea enzimeleor de interes. Astfel enzimele
usor solubile se extrag in medii cu tarii ionice mici (de exemplu creatin kinaza din muschi este extrasa cu o
solutie de KCl 0,01 M), iar cele mai greu solubile in medii cu tarii ionice mari. In cazul in care se doreste
dezintegrarea organitelor subcelulare se utilizeaza medii de extractie izotonice. Solutiile izotonice realizeaza
aceiasi presiune osmotica ca cea datorata continutului celular si contin in general 0,3 moli٠L-1 specii
dizolvate. Astfel de solutii sunt cele de zaharoza sau manitol tamponate cu Tris
[Tris(hidroximetil)aminometan)] sau Hepes [acid 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetan sulfonic] la pH =
7,4zaharoza

Tris Hepes

Unele enzime nu pot fi eliberate in mediu dupa dezintegrare cu ajutorul omogenizatoarelor. De exemplu
mitocondriile nu sunt dezintegrate complet prin astfel de metode. In astfel de situatii se procedeaza fie la
sonicare pe perioade de timp de pana la 1 minut, fie la aditia unor cantitati mici de detergenti (Triton X-100,
deoxicolat de sodiu). De exemplu Triton X-100 in concentratie de 0,1% (w/v) creste solubilizarea 5-
nucleotidazei si adenozin kinazei din multe tesuturi.

Unele enzime exista 626f56g in tesuturile animale sub forme interconvertibile, dintre care unele sunt mai
putin active. In astfel de cazuri se recomanda alegerea mediului si conditiilor de extractie adecvate pentru
obtinerea formei active. De exemplu, forma activa a glicogen fosforilazei, forma a, poate fi obtinuta daca
extractia se realizeaza la pH = 6,2 si in prezenta ATP – ului, Mg2+, Ca2+ si F-. In aceste conditii fosforilaza
fosfataza, enzima care converteste forma a la forma inactiva b, sunt inhibate, iar fosforilaza kinaza, enzima
care catalizeaza conversia la forma a este activata. Fosforilaza b poate fi extrasa in prezenta activatorului
sau alosteric AMP-ul.

Metode de omogenizare a materialelor biologice vegetale

Extractia enzimelor din plante ridica probleme speciale datorita:

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 11/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Ø prezentei peretelui celulozic tare;

Ø volumului mare ocupat de vacuole;

Ø concentratiilor mari de pigmenti si compusi fenolici;

Ø a concentratiilor mici de proteine.

Pentru spargerea peretilor celulozici tari se folosesc metode de omogenizare dure.

Ruperea vacuolelor conduce la eliberarea proteinazelor si la scaderea pH – ului extractului daca acesta nu
este tamponat corespunzator.

Pentru evitarea efectelor nedorite se utilizeaza procedee si medii de extractie diferite in functie de tesutul
vegetal ales ca sursa biologica.

O mare problema in cazul plantelor sunt compusii fenolici, care in prezenta oxigenului, sub actiunea unei
enzime numite fenoloxidaze, sunt transformati in pigmenti polimerici. Acesti pigmenti pot adsorbi si inactiva
unele enzime din extracte. Pentru a minimaliza aceste efecte si avand in vedere ca fenoloxidazele sunt
active numai in prezenta oxigenului este convenabil ca extractele sa se prepare la rece si in atmosfera de
N2mai ales in cazul tesuturilor plantelor lemnoase. Prin inghetare in azot lichid inainte de dezintegrare
acestea devin fragile si usor de macinat. Daca tesuturile sunt moi sau nu avem azot lichid, in mod obisnuit se
adauga in mediile de extractie,: 2 – mercaptoetanol, substanta care inhiba fenoloxidazele si un polimer de
tipul polivinilpirolidona care adsoarbe polimerii fenolici.

HS-CH2-CH2-OH

2 – mercaptoetanol polivinilpirolidona

Observatie

Contaminarea EPT – ului cu acizi nucleici poate fi estimata prin masurarea absorbtiei la 260 si la 280 nm. Daca raportul
absorbantelor se apropie de valoarea 1, contaminarea cu acizi nucleici este mare.

Interactiile proteine – acizi nucleici pot fi slabite prin cresterea tariei ionice a mediului si ca un rezultat
precipitare fie a acizilor nucleic fie a proteinelor.

Acizii nucleici pot fi indepartati prin metode de precipitare cu sulfat de protamina (concentratie finala de 0,2 –
0,4 g la 100 ml), streptomicina (concentratie finala de 1 – 2 g la 100 ml) sau MnCl2 (50 mM). O alta
alternativa este aditia de deoxiribonucleaza I (10 mg/ml), enzima care degradeaza ADN-ul.
http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 12/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Proteinele se precipita in general prin intermediul sulfatului de amoniu pana la o concentratie de 0,2 M.
Dupa realizarea extractiei sulfatul trebuie indepartat din mediu acest lucru efectuandu-se de obicei prin
dializa.

Izolarea organitelor celulare

Izolarea organitelor celulare este necesara atunci cand enzima de interes are o localizare intracelulara.
Avand in vedere faptul ca, formele moleculare ale enzimelor pot avea proprietati cinetice si moleculare
diferite, studiul uneia dintre forme, cu o localizare intracelulara caracteristica, nu poate fi realizat decat prin
separarea fractiei subcelulare in care aceasta se gaseste.

Au fost puse la punct mai multe procedee de separare a organitelor celulare dintre acestea cele mai utilizate
fiind:

Ø Separarea organitelor celulare prin centrifugare diferentiata

Ø Separarea organitelor celulare prin centrifugare izopicnica

Separarea organitelor celulare prin centrifugare diferentiata.

Dupa liza peretilor celulari, organitele celulare din depozitele celulare ale microorganismelor sau tesuturile
animale/vegetale pot fi separate prin cresterea treptata a fortei centrifugale. In aceasta tehnica fractiile
sedimentate la diferite valori ale fortei centrifugale aplicate, contin diferite organite celulare.

Sedimentarea diferitelor componente ale unui amestec, intr-un camp centrifugal se poate caracteriza prin
ecuatia:

in care:

- v = viteza de sedimentare;

- d = diametrul particulelor;

- ρS = densitatea particulelor;

- ρl = densitatea solutiei;

- ω = viteza angulara (in radiani, s-1);

- r = raza sistemului de rotatie;

- η = vascozitatea cinematica;

- θ = factor geometric ce caracterizeaza particulele (pentru particulele sferice este egal cu 1);

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 13/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

- FS = factor de corectie pentru interactiile particulei si obstructionarea depunerii.

Un model general de separare a organitelor celulare este prezentat in fig.nr.2

Sedimentele obtinute sunt reluate in tampon si resedimentate. Repetarea acestor operatii de 2 – 3 ori pentru
fiecare fractie in parte, conduce la o mai buna separare a nucleilor, mitocondriilor si microzomilor (microzomii
apar ca urmare a ruperii reticulului endoplasmatic prin procedeul de dezintegrare celulara aplicat). Procedeul
nu conduce la o buna separare a mitocondriilor de lizozomi, intrucat aceste formatiuni au mase si densitati
foarte apropiate.

De exemplu o modalitate de a realiza o buna separare a lizozomilor de mitocondriile din ficatul de sobolan
consta in injectarea animalului inainte de sacrificare cu Triton WR 1339 (detergent anionic, sare de sodium a
unui alchil aril poliester sulfat) sau cu aur coloidal. Cele doua substante sunt fagocitate cu ajutorul
lizozomilor, cauzand cresterea, respectiv, descresterea densitatilor lizozomilor si implicit separarea lor de
mitocondrii.

Fig.2 Schema generala de separare a organitelor celulare prin centrifugare diferentiata.

Observatie:

Exprimarea conditiilor de centrifugare se poate face prin Forta centrifugala relativa (RCF), exprimata prin unitati de
gravitatie (g), sau prin viteza (rotatii pe minut)(RPM). Relatia de transformare dintre RCF si RPM este:

g = (1,118x10-5) R S2

unde g este forta centrifugal, R raza rotorului in cm si S viteza centrifugii in rotatii per minut.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 14/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Integritatea organitelor obtinute se poate evalua prin studii de microscopie electronica.

Puritatea organitelor celulare separate poate fi testata biochimic, prin determinarea activitatii enzimelor
marker specifice pentru fiecare formatiune intracelulara. De exemplu, prezenta unei activitati succinat
dehidrogenazice, enzima exclusiv mitocondriala, in preparatele nucleare, indica o contaminare a acestora cu
mitocondrii.

De exemplu unele enzime marker sunt pentru:

Ø Nuclei: ADN nucleotidiltransferaza si nicotinamid-nucleotid adeniltransferaza;

Ø Mitocondrii: succinat dehidrogenaza si citocrom c oxidaza;

Ø Reticul endoplasmatic: glucozo 6-fosfataza;

Ø Lizozomi: fosfataza acida si ribonucleaza;

Ø Peroxizomi: catalaza;

Ø Citosol: glucozo 6-fosfat dehidrogenaza, lactat dehidrogenaza si 6-fosfofructokinaza.

Separarea organitelor celulare prin centrifugare izopicnica

In aceasta tehnica organitele celulare sunt separate prin centrifugare in gradient de densitate. Gradientul de
densitate se realizeaza cu ajutorul unui mediu, numit Percoll, cel mai usor de obtinut de la firma suedeza
Pharmacia. Percollul consta din particule coloidale de silicagel, cu diameter cuprinse intre 15 si 30 nm,
acoperite cu polivinilpirolidona. Cu ajutorul Percoll-ului se pot forma gradiente de densitate cuprinse intre 1,0
si 1,3 mg/ml, pe un interval de pH cuprins intre 5,5 si 10. Valori de pH sub 5,5 si prezenta ionilor bivalenti
determina gelificarea matricei de silicagel. Gradientele necesare separarii organitelor pot fi create, fie printr-o
crestere regulata a densitatii (lineara sau sigmoidala), fie printr-o crestere in trepte a densitatii.

Percoll-ul poate fi separat de organitele purificate prin centrifugare timp de 2 ore la 100.000g, organitele
ramanand plasate deasupra sedimentului format.

Datorita faptului ca Percoll-ul este un mediu care imprastie lumina, in evaluarea activitatilor enzimatice in
prezenta acestuia sunt preferate metodele de fluorescenta in detrimentul celor spectrofotometrice.

Factori ce influenteaza extractia

Solubilizarea propriu-zisa a unei proteine se realizeaza prin tratarea sursei biologice dezintegrate cu un
volum dintr-un anumit mediu de extractie, in diferite conditii experimentale. Alegerea metodei optime de
extractie a unei enzime dintr-o sursa biologica necesita o serie de experimente preliminare prin care se
stabilesc conditiile optime de extractie, respectiv: metoda de dezintegrare, mediul optim de extractie, raportul
optim de extractie (raportul dintre g de tesut si ml mediu de extractie), timpul optim de extractie si
temperatura optima de extractie.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 15/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Este important ca in timpul procesarii sursei enzimatice si a prelucrarii pana la preparatul enzimatic dorit sa
se retina in acesta maximum de activitate enzimatica.

Problemele majore care apar pe parcursul extractiei, purificarii unei proteine sunt:

Ø Denaturarea termica;

Ø Fortele de forfecare;

Ø Variatia/scaderea pH-ului mediului;

Ø Dilutia;

Ø Schimbarea structurii conformationale;

Ø Fenomene de oxidare;

Ø prezenta ionilor metalici;

Ø formarea radicalilor liberi;

Ø prezenta enzimelor proteolitice in cantitati mari;

Ø contaminarea cu acizi nucleici, bacterii si virusuri;

Ø formarea de spuma.

Aceste probleme pot fi limitate prin alegerea unui mediu de extractie corespunzator, prin scurtarea timpului
de preparare a extractului proteic si prin desfasurarea procedeului de extractie ales la temperaturi scazute.

Denaturarea termica

Prin cresterea temperaturii ca urmare a consumului de energie care genereaza caldura fenomen ce
caracterizeaza majoritatea metodelor de omogenizare/dezintegrare celulara.

Temperatura de extractie este un parametru important care trebuie optimizat cu grija.

Procesarea la temperaturi scazute este esentiala pentru cele mai multe enzime. Totusi

trebuie subliniat faptul ca, temperaturile scazute nu sunt necesare in toate cazurile, pentru anumite enzime
fiind chiar nerecomandate ca de exemplu enzimele alosterice.

Prezenta unor substante cum sunt poliolii de tipul glicerolului, glucozei sau zaharozei ajuta la stabilizarea
enzimelor in conditii termice denaturante. Astfel glicerolul, in concentratie de 50 % (g/v) determina scaderea
punctului de topire al solutiilor apoase sub temperatura normala a congelatoarelor (-200C). Solutiile proteice
cu glicerol se preteaza de asemenea conservarilor pentru perioade mari de timp, intrucat previne inghetarea
multor enzime.

Fortele de forfecare
http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 16/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Dezintegrarea celulelor prin metode severe (presare, sonicare) supune componentele celulare peretii celulari
si chiar enzimele de interes la presiuni ridicate care pot conduce la denaturarea structurii pana la ruperea
lanturilor proteice, deci la inactivarea enzimelor. Efectele presiunilor ridicate asupra enzimelor pot fi
complexe. Enzimele oligomere, ca de exemplu lactat dehidrogenaza sau gliceraldehid-3-fosfat
dehidrogenaza, supuse la presiuni moderate (de pana la 2 kbari) sunt disociate reversibil la monomeri
inactivi. La presiuni ridicate monomerii se agrega si formeaza o structura denaturata, proces care este
ireversibil. Pentru a minimaliza efectul daunator pe care metodele severe de dezintegrare il pot avea asupra
enzimelor, presiunile si perioadele de timp de aplicare ale acestora trebuie controlate.

pH – ul

In mod normal, valoarea pH-ului mediului de extractie este valoarea la care enzima de interes are activitate
catalitica maxima. Insa pentru anumite enzime, pH-ul optim de actiune nu este si cel la care se realizeaza
cea mai eficienta extractie, fiind necesara o extractie la un pH la care enzima are o stabilitate maxima.

ca urmare a eliberarii de acizi in urma dezintegrarii celulare

De exemplu tripsina este mult mai stabila la pH = 3 valoare la care autoliza nu se produce, decat la valorile
de pH cuprinse intre 8 si 9, valori la care enzima are capacitate catalitica maxima.

Valoarea pH – ului ales trebuie sa fie cat mai indepartata de cea corespunzatoare pI – ului proteinei.

Valoarea pH – ului optim in extractia unei enzime este realizat si mentinut constant cu ajutorul sistemelor
tampon.

Tampoanele utilizate

Sistemul tampon ales pentru extractia unei enzime dintr-o anumita sursa biologica poate influenta
capacitatea de solubilizare si activitatea catalitica a acesteia prin:

v valoarea pH – ului sau;

v taria sa ionica si

v compozitia sa.

Astfel, la alegerea unui tampon pentru extractia unei enzime trebuie avuti in vedere urmatorii factori:

Ø sa aiba solubilitate mare in apa;

Ø sa nu fie volatile;

Ø Taria ionica a tamponului trebuie sa corespunda unei capacitati de tamponare suficiente si sa


determine extractia optima a enzimei;

Ø sa asigure manifestarea unei activitati catalitice maxime;

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 17/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Ø sa asigure stabilitatea enzimei (domeniul pe care tamponul mentine pH – ul mediului constant sa


corespunda cu cel de stabilitate al enzimei);

Ø Componentele tamponului nu trebuie sa manifeste efecte negative asupra activitatilor enzimatice


si sa nu interfere in metodele de determinare a concentratiilor proteice (tampoanele polianionice
de tipul citratului si fosfatului sunt agenti de chelatare ai unor ioni metalici care pot fi esentiali in
actiunea unor enzime);

Ø sa nu interactioneze cu substraturi, cu cofactori sau cu ioni metalici;

Ø Concentratia tamponului nu trebuie sa interfere in etapele ulterioare extractiei (concentratii mari


de tampoane polivalente pot competitiona cu proteinele in legarea la situsurile incarcate ale
schimbatorilor de ioni).

Pentru calcularea pH-ului mediilor de extractie, tampoanelor se utilizeaza relatia Henderson –


Hasselbach:

Aceasta relatie stabileste o corelatie directa intre pH-ul unei solutii de acid, constanta sa de
aciditate si raportul dintre concentratia bazei sale conjugate in conditii de echilibru. Daca intr-o solutie
apoasa sunt prezente doua cupluri acid-baza, se ajunge la relatia:

Solutiile tampon sunt caracterizate prin indicele de tamponare (value buffer) care se defineste ca fiind
raportul dintre adaosul de acid tare sau baza tare, exprimat in echivalenti la litru si variatia corespunzatoare a
pH-ului si arata capacitatea de tamponare a solutiilor tampon, deci:

unde: dn este numarul de echivalenti de acid sau baza tare adaugat dpH – variatia de pH la adaosul de acid
sau baza tare.

Maximul capacitatii de tamponare apare atunci cand pH – ul mediului este egal cu valoarea pKa si sistemele
tampon au o capacitate buna de tamponare pe un domeniu de pH egal cu pKa 1.

Din punctul de vedere al tariei ionice, notata cu μ se calculeaza ca jumatate din suma termenilor obtinuti prin
inmultirea concentratiilor, c (molalitati sau molaritati), ale fiecarui ion din solutie, cu patratul valentei sale, Z.
Astfel, pentru o solutie continand mai multe specii de ioni, notati cu indicii 1, 2, 3, … n, taria ionica a tuturor
ionilor din solutie va fi:
http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 18/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Majoritatea proteinelor au solubilitate maxima la tarii ionice moderate, cuprinse inttre 0,05 si 0,1 M, valori
care sunt alese daca capacitatea de tamponare a sistemului tampon este suficienta in aceste conditii.

Deoarece solutiile tampon sunt in general solutii destul de diluate, in evaluarea celor mai bune
tampoane pentru extractia unei enzime de interes se utilizeaza legea dilutiei sau

legea lui Ostwald. Aceasta arata dependenta constantei de disociere, de gradul de disociere si de

concentratie:

Extractia proteinelor din tesuturi sau celule poate conduce la obtinerea unor solutii de enzime foarte
concentrate. In unele compartimente celulare, cum ar fi de exemplu matricea mitocondriala, concentratia
proteinelor este de peste 500 mg/ml. Pentru a putea determina activitatea enzimelor, concentratia proteica
trebuie redusa la 5 mg/ml in extractele celulare si la 5 mg/ml in solutia unei enzime pure.

In practica s-a constatat insa ca multe enzime isi pierd rapid activitatea daca sunt pastrate in solutii diluate.
Acest efect poate fi contracarat prin introducerea unei proteine „inerte”, cum este albumina serica bovina, in
concentratie de 1 – 10 mg/ml. Introducerea acestei proteine poate preveni pierderea activitatii enzimatice
datorate adsorbtiei pe suprafata veselei utilizate sau degradarii prioritare a acesteia de catre enzimele
proteolitice coprezente. Dilutia extractelor proteice poate avea ca efect si disocierea unor cofactori de
apoenzima, fenomen care poate determina pierderea activitatii catalitice. Pentru ca acest efect sa poata fi
compensat, se recomanda introducerea cofactorului in sistemul tampon utilizat pentru extractie.

Cateva tampoane utilizate pentru extractia proteinelor sunt prezentate in tabelul Utilizarea unor tampoane
cu capacitate slaba de tamponare pentru cantitati mari de proteine necesita verificare pH – ului mediului,
intrucat proteinele actioneaza ca sisteme tampon. Tampoanele utilizate pentru extractia proteinelor au in
general concentratii cuprinse intre 20 si 100 mM (concentratia unui tampon se refera la concentratia tuturor
speciilor componente).

Tabel….

Sisteme tampon utilizate pentru extractia proteinelor

Tampon Valori pKa

Acid acetic/Acetat de sodiu 4,75;

Acid acetic/Acetat de amoniu 4,74; 9,25;

Acid carbonic/Bicarbonat de sodiu 6,50; 10,25;

Acid carbonic/Bicarbonat de amoniu 6,50; 9,25;


http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 19/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Acid citric/Citrat de sodiu 3,09; 4,75; 5,41;

fosfat monosodic/fosfat disodic 7,21;

Tris - HCl 10,25;

Tris - fosfat 1,5; 7,5; 12,0; 8,21;

Tris : Tris (hidroximetil) aminometan

Unele dintre tampoanele clasice prezentate in tabelul …prezinta unele dezavantaje. Tampoanele fosfat tind
sa precipite ionii bivalenti de Mg, Ca, Fe si alti cationi polivalenti. Fosfatul, un metabolit important, inhiba
unele enzime cum sunt: kinazele, dehidrogenazele, carboxipeptidazele, ureaza, aril sulfataza,
fosfoglucomutaza si altele. Tampoanele care contin pirofosfat precipita cationii polivalenti si au tendinta de a
forma complexe, iar cele pe baza de citrat precipita ionii bivalenti de calciu. Astfel de tampoane nu trebuie
utilizate in extractia enzimelor pentru care prezenta cationilor respectivi este esentiala in manifestarea
functiei lor catalitice.

O alternativa mai buna pentru inlocuirea tampoanelor pe baza de fosfati sunt tampoanele de tip Mops [acid
3-morfolinopropan-1 sulfonic] sau Bes [acid N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanesulfonic], tampoane pentru
care baza conjugata are sarcina – 1.

Mops Bes

Alegerea unui tampon adecvat este un factor esential in extractia unei enzime. pH – ul din interiorul unor
organite subcelulare poate diferi de cel exterior din tesut. De exemplu cel din afara organitelor este 7 in timp
ce pH – ul din interiorul vacuolelor si lizozomilor este de aproximativ 5. Capacitatea de tamponare a
tampoanelor utilizate in astfel de situatii trebuie sa tina seama de acest lucru atunci cand astfel de formatiuni
sunt supuse dezintegrarii.

De asemenea in cele mai multe cazuri in extractele obtinute, procesele metabolice continua, fapt care
afecteaza pH – ul. Astfel degradarea glicogenului in extractele musculare poate produce o scadere cu o
unitate a pH – ului mediului in timp de o ora, scadere datorata acumularii de acid lactic.

Detergentii

In multe cazuri proteinele care trebuie extrase sunt legate de membrane sau se gasesc sub forma de
agregate. Pentru solubilizarea unor astfel de proteine interactiile hidrofobe in care acestea sunt implicate
trebuie diminuate prin utilizarea detergentilor sau a agentilor caotropici.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 20/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Detergentii sunt molecule amfipatice. Cand concentratia lor in mediu creste, ei pot forma micele, la asa
numita concentratie critica micelara. Deoarece micelele formate ingreuneaza purificarile prin procedee
cromatografice, trebuie utilizate concentratii sub valoarea celei critice micelare.

Citiva dintre detergentii care se utilizeaza frecvent pentru extractia enzimelor sunt prezentati in tabelul…

Tabel….

Detergenti utilizati pentru solubilizarea proteinelor

Detergent Caracter ionic Efect asupra proteinelor Concentratie critica micelara

mM % (w/v)

Tween 80 neionic Denaturant slab 0,012 0,0016

Triton X – 100 neionic Denaturant slab 0,240 0,0151

Nonidet P – 40 neionic Denaturant slab 0,290 0,0175

Dodecil sulfat de sodiu(SDS) anionic Denaturant puternic 6-8 0,1728 –

0,2304

Octil glucozid neionic Denaturant slab 9,000 0,2772

CHAPS Zwiter-ioni Denaturant slab 8 - 10 0,4920 –

0,6150

Unii detergenti nu denatureaza proteinele globulare sau nu interfera cu activitatile biologice ale acestora, in
timp ce altii, cum ar fi SDS, sunt puternic denaturanti. In prezenta SDS proteinele globulare sufera modificari
conformationale puternice care le afecteaza functia biologica, iar proteinele cu structura oligomera sunt
disociate in subunitati.

Detergentii trebuie utilizati cu discernamant in extractia enzimelor. Pentru unele enzime detergentii reprezinta
singura posibilitate de solubilizare din formatiunile celulare in care sunt incluse, iar pentru altele detergentii
sunt agentii denaturanti puternici. In cazul unor enzime utilizarea detergentilor este necesara nu numai la
extractie, ci si pe tot parcursul procedeelor de purificare, la finalul purificarii obtinandu-se complexe detergent
– enzima.

Fenomene de oxidare

Gruparile tiol ale resturilor de cisteina din structura proteinelor pot suferi modificari pe parcursul procedeelor
folosite pentru extractia acestora. In interiorul celulelor, catenele laterale ale resturilor de cisteina, metionina,
sunt mentinute in forma redusa (-SH) datorita mediului reducator existent. In urma dezintegrarii, celulele

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 21/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

devin expuse oxigenului si apare tendinta ca gruparile SH sa formeze punti disulfurice sau sa fie oxidate.
Protejarea gruparilor SH contra oxidarii se realizeaza prin includerea in mediul de extractie a unor agenti
reducatori ca: mercaptoetanolul, 1,4-ditioeritritol (DTE) si 1,4-ditiotreitol (DTT). Structura acestor agenti
reducatori este prezentata in tabelul . de obicei concentratii cuprinse intre 1 si 25 mM sunt suficiente in
protejarea gruparilor tiolice din structura proteinelor, fara a produce scindarea puntilor disulfurice.

Tabel..

Structura unor agenti reducatori

Agent Structura

2 - mercaptoetanol HS-CH2-CH2-OH

1,4-ditioeritritol (DTE) HSCH2-HCOH-HCOH-CH2SH (cis)

1,4-ditiotreitol (DTT) HSCH2-HCOH-HOCH-CH2SH (trans)

2 – mercaptoetanolul este un lichid dens, cu un miros neplacut si toxic. Prezenta acestuia in concentratii de
10 – 20 mM in mediul de extractie asigura protectia gruparilor tiol din structura proteinelor pe o perioada de
24 ore. Ditiotreitolul si ditioeritritolul, substante reducatoare puternice, realizeaza protectia gruparilor tiol la
concentratii mai scazute ale acestora in mediu (1 mM). Principalul dezavantaj al ditiotreitolului este pretul sau
de cost ridicat.

Un agent reducator ce se gaseste in toate plantele este acidul ascorbic. Utilizarea lui este insa limitata doar
la produse farmaceutice sau alimente deoarece trebuie adaugat in cantitati mult mai mari decat agentii
mentionati anterior si are un pret de cost ridicat.

Un studiu intreprins asupra stabilitatii solutiilor agentilor reducatori a evidentiat ca acestia sunt putin stabili la
valori ridicate de pH, la temperaturi ridicate si in prezenta unor concentratii mici de ioni de Ca2+. Includerea
in solutiile de acid etilendiamino tetraacetic (EDTA) le mareste stabilitatea.

Prezenta ionilor metalici

O serie de enzime necesita pentru a-si indeplini rolul catalizator prezenta in mediu a unor ioni metalici, in
cantitati sub foarte mici, urme, cum sunt a - amilaza (Ca2+), alcool dehidrogenaza (Zn2+), peroxidaza (Fe3+),
carbonic anhidraza (Zn2+) sau a altor ioni, majoritatea bivalenti.

Prezenta acestor ioni peste o anumita limita sau a ionilor metalelor grele (Cd, Pb, Hg, Ni) in mediu poate
deteriora functia biologica a unor enzime.

Unii ioni au actiune toxica deoarece reactioneaza cu gruparile tiol din structura proteinelor sau intensifica
oxidarea acestora in prezenta oxigenului. Metalele grele pot proveni din tesutul utilizat ca sursa biologica, din
sticlarie sau din reactivi.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 22/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Protectia contra efectelor induse de metalele grele se realizeaza prin introducerea in mediul de extractie a
unor agenti de chelatare ai acestora. Cel mai utilizat agent de chelatare este EDTA, care la concentratii 1
mM in mediul de extractie minimalizeaza efectele metalelor grele, capacitatea de chelatare a acestora
crescand cu cresterea pH –ului. Avand in vedere ca EDTA este un tampon, se recomanda aditia sarii
disodice a acestuia inainte de ajustarea pH – ului final al mediului.

In cazul in care prin introducerea de EDTA se poate afecta chiar metalul implicat in activitatea enzimatica, fie
EDTA este introdus in mediu in cantitati mici, fie mediul de extractie se suplimenteaza cu ionul metalic
respectiv. Suplimentul de ion metalic trebuie realizat cu reactivi foarte puri pentru a se evita o potentiala
contaminare cu metale grele.

Formarea radicalilor liberi;

Extractele celulare preparate prin ultrasonicare sunt supuse actiunii radicalilor liberi care apar ca urmare a
scindarii moleculelor de apa la temperaturi locale ridicate induse in aceasta metoda de dezintegrare. Studiile
intreprinse au aratat ca efectele nedorite induse de ultrasunete asupra proteinelor pot fi minimalizate prin
sonicare unor suspensii avand concentratii celulare mari in prezenta in mediu a unor compusi de tipul
zaharurilor sau a N2O, compusi cu actiune protectoare contra radicalilor liberi.

Prezenta enzimelor proteolitice

Una dintre cel mai dificile probleme care apare atat in timpul extractiei cat si pe parcursul purificarii enzimelor
este controlul degradarii acestora de catre enzimele proteolitice endogene mai ales in cazul surselor bogate
in enzime proteolitice (de exemplu tesuturile animale ca ficatul, splina sau rinichii). Degradarea proteolitica a
unei enzime este evidentiata prin urmatoarele constatari experimentale :

Ø Enzima este izolata cu un randament scazut;

Ø Pierderea activitatii enzimatice la incubarea enzimei;

Ø Obtinerea unei rezolutii slabe prin electroforeza in gel de poliacrilamida in prezenta de dodecil
sulfat de sodiu (SDS – PAGE), datorata unei heterogenitati la nivelul masei moleculare a enzimei;

Ø Discrepante intre proprietatile enzimei raportate in alte cercetari si cele determinate experimental.

Exista o serie de strategii care minimalizeaza sau suprima proteoliza nedorita. Acestea includ : manipulari la
temperaturi scazute la care actiunea proteazelor este incetinita; alegerea ca sursa biologica a unor tesuturi
cu putini lizozomi sau a unor tulpini microbiene deficitare in enzime proteolitice; extractia rapida a
omogenatului proaspat intr-o solutie apoasa a unui polimer in sistem bifazic; adsorbtia proteazelor pe
adsorbanti prin interactii hidrofobe. Inhibarea proteazelor se poate realiza si prin ajustarea pH – ului mediului
la o valoare la care acestea nu actioneaza, cu conditia ca aceasta valoare de pH sa nu afecteze stabilitatea
proteinei supusa purificarii.

Totusi, cea mai utilizata metoda implica utilizarea, in etapele de extractie si in cele ulterioare, de inhibitori ai
enzimelor proteolitice. Inhibitorii reactioneaza si modifica ireversibil unele resturi de aminoacizi implicate in
functia enzimelor proteolitice. Cateva exemple de astfel de substante sunt :
http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 23/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

¶ Diizopropil fluorofosfatul (DIP), inhibitor ireversibil al serin – proteinazelor la concentratii de 1 mM in


mediu, substanta foarte toxica si instabila in solutii apoase:

E-OH + + HF

¶ Fluorura de fenilmetansulfonil (PMSF), inhiba puternic toate serin proteinazele, la concentratii


cuprinse intre 0,1 si 1 mM, cat si unele tiol proteinaze. PMSF trebuie manipulat cu atentie pentru ca
este foarte toxic:

E-OH + + HF

¶ EDTA – ul, substanta solubila in apa, la concentratii cuprinse intre 1 si 10 mM inhiba proteazele
activate de metale;

¶ Acidul monoiod acetic sau moniod acetamida ( IAA, IAN), sunt inhibitori ai cistein – proteinazelor la
concentratii mici, cuprinse intre 10 si 100 mM:

E – SH + ICH2- CONH2'E – S – CH2- CONH2 + HI

IAN

¶ Cistatinele, inhibitori naturali de natura peptidica, se leaga reversibil si inhiba unele tiol proteinaze;

¶ Pepstatina A, o substanta naturala, cu structura asemanatoare unei pentapeptide, secretata de unele


specii de Streptomyces, inhiba la concentratii de 1 mM unele proteaze acide cu resturi de acid
aspartic in centrul catalitic activ.

Pentru a inhiba toate tipurile de enzime proteolitice prezente intr-un extract proteic total se utilizeaza
amestecuri de astfel de inhibitori.

Exemple de amestecuri de inhibitori necesar minimalizarii actiunii principalelor tipuri de enzime proteolitice
din diferite tesuturi sunt prezentate in tabelul.

Tabelul..

Inhibitori utilizati pentru controlul proceselor de proteoliza


http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 24/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Tip de tesut Tipuri de proteinaze Inhibitori adaugati Solutii stoc utilizate

Tesuturi animale Serin-proteinaze PMSF (1mM) 0,2 M in metanol

Metalo-proteinaze EDTA (1mM) 0,1 M in apa

Aspartic- proteinaze Benzamida (1mM) 0,1 M in apa

Leupeptina (10 mg/ml) 1 mg/ml in apa

Pepstatina A(10 mg/ml) 5 mg/ml in metanol

Aprotinina (1 mg/ml) 0,1 mg/ml in apa

Tesuturi ale plantelor Serin-proteinaze PMSF (1mM) 0,2 M in metanol

Cistein-proteinaze Chimostatina(20mg/ml) 1 mg/ml in DMSO

EDTA (1mM) 0,1 M in apa

E64 (10 mg/ml) 1 mg/ml in apa

Drojdii, fungi Serin-proteinaze PMSF (1mM) 0,2 M in metanol

Aspartic- proteinaze Pepstatina A(15 mg/ml) 5 mg/ml in metanol

Metalo-proteinaze Fenantrolina (5 mM) 1 M in etanol

Bacterii Serin-proteinaze PMSF (1mM) 0,1 M in metanol

Metalo-proteinaze EDTA (1mM) 0,1 M in apa

E64 : L – trans – epoxisuccinil leucilamino (4-guanidino) butan

Amestecurile de inhibitori prezentate in tabel sunt numai orientative. Pentru fiecare enzima si pentru fiecare
sursa biologica sunt necesare experimente prealabile prin care sa se stabileasca tipurile de inhibitori care
stopeaza cel mai eficient procesele de proteoliza care pot afecta functia catalitica a enzimei supuse studiului.

Cateva aspecte legate de utilizarea inhibitorilor enzimelor proteolitice trebuie cunoscute:

Ø Masuri de protectie. Inhibitorii cum sunt PMSF si DIP sunt foarte toxici si trebuie manipulati cu mare
atentie. O alternativa mai putin periculoasa este inlocuirea lui prin 3,4 – dicloroisocumarina (DCI), compus
mult mai putin toxic si mai reactiv fata de serin – proteinaze, dar mult mai scump. DCI este greu solubil in
apa (se prepara in dimetilsulfoxid – DMSO) si este destul de instabil, timpul de viata a acestuia la pH
neutru fiind de 20 – 30 minute. Concentratia acestuia in mediile de extractie trebuie sa fie de 0,1 mM.

Ø Solubilitate. Unii inhibitori, prezentati in tabel, sunt putin solubili in apa si de aceea se prepara solutii stoc
in solventi organici. Volumul din solutiile stoc care se adauga in mediul de extractie trebuie sa fie cit mai
mic pentru a minimaliza efectul denaturant al solventilor organici;

Ø Stabilitatea. Inhibitorii sunt instabili in solutii apoase avand timpi de injumatatire redusi. Acest dezavantaj
poate fi inlaturat prin adaugarea repetitiva de volume mici din solutiile stoc la extractele proteice.

Contaminarea cu microorganism (mai ales bacterii si virusuri)


http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 25/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Guarana

Ajută la funcţionarea normală a


sistemului nervos central.

46 lei
Cumpără

Alpha GPC 300mg

Ajută la îmbunătățirea capacitățilo


mentale.

187 lei
Cumpără

O modalitate de a evita cresterea bacteriana in solutiile proteice este utilizarea solutiilor tampon care au fost
in prealabil sterilizate si filtrate. Unele tampoane, cum ar fi cele pe baza de fosfat, acetat si carbonat, la pH
neutru sunt medii bune de dezvoltare a microorganismelor. Tampoanele cu pH – uri sub 3,0 si cele cu pH
peste 9,0 nu permit in mod normal cresterea microorganismelor cu exceptia unor mucegaiuri.

Pentru prevenirea contaminarii bacteriene se recomanda adaugare de agenti antibacterieni la solutiile


tampon. Cei mai eficienti agenti bacteriostatici sunt : azida de sodiu in concentratie de 0,001 M, mertiolatul in
concentratie 0,005 M si unii alcooli, ca de exemplu butanolul in concentratie de 1%. Azida prezinta
dezavantajul ca este o substanta nucleofila care leaga metalele. In cazul in care aceste substante interfera in
determinarile de activitate enzimatica sau in separari cromatografice se recomanda adaugarea lor doar la
solutiile proteice supuse conservarii.

Formarea de spuma poate duce la distrugerea conformatiei enzimei de interes. Evitarea sau micsorarea
cantitatii de spuma ce poate aparea in procesul de separare/extractie a proteinelor este de adaugare a unor
antispumanti inerti cum sunt de exemplu uleiul alimentar sau Tween.

PURIFICAREA ENZIMELOR
Comportamentul ideal al unei enzime are loc in conditiile sale naturale de existenta, deci
in celula, tesut, mediu de cultura etc. Totusi dupa alegerea unui surse optime si separarea
proteinei de interes intr-un Extract Proteic Total (EPT) de cele mai multe ori enzima se purifica
mai mult sau mai putin in functie de scopul sau scopurile pentru care a fost izolata. Astfel
enzimele se purifica pentru numeroase motive cum sunt de exemplu:

? Intelegerea proceselor care au loc in celula sau intre celule – rolul


enzimelor in diverse procese metabolice, cinetica lor, studiul reactiilor etc;

? Intelegerea deviatiilor care au loc in metabolism in procese anormale, boli,


efecte degenerative etc.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 26/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

? Realizarea unor medicamente, aditivi, cat mai aproape de substantele


existente deja in natura (ex. Indulcitori, insulina), biocatalizatori terapeutici
etc.

Nu exista un procedeu standard cu etape specifice care ar putea fi utilizat pentru


purificarea tuturor enzimelor. Diferite tehnici de separare/purificare pot fi realizate practic intr-
un numar infinit de combinatii variabile pentru parametrii de separare (pH, temperatura, tarie
ionica etc.). Practic fiecare tehnica de separare, purificare, trebuie optimizata pentru fiecare
produs in parte. Adeseori procesele de prelucrare, ale mediului de cultura sau a unei alte surse
pentru o enzima, sunt prin dificultatea sau pretul lor mare, factori limitativi pentru dezvoltarea
unui proces biotehnologic de obtinere a unei enzime.

De asemenea trebuie sa stim ca termenul de “puritate” pentru enzime este un termen


relativ deoarece practic nu s-a obtinut o enzima 100% pura.

Procedeul ales pentru purificarea unei enzime depinde de proprietatile acesteia si de


gradul de purificare dorit. In orice procedeu de purificare trebuie insa sa se pastreze structura
si activitatea enzimei in cea mai mare masura posibila intacte. Obiectivele ce trebuie urmarite
intr-un proces de purificare cand se doreste obtinerea unei “enzime pure” sunt deci: obtinerea
unui preparat enzimatic “de puritate maxima” si cu “activitate maxima posibila”.

Principalele metode de purificare ale enzimelor se bazeaza pe proprietatile acestora si


anume:

1. Solubilitate: modificarea pH-ului, modificarea tariei


ionice, modificarea constantei dielectrice;

2.Dimensiunea sau masa moleculara: centrifugarea, separarea prin membrane


(dializa, ultrafiltrarea, osmoza inversa), gel-
filtrarea;

3. Polaritatea:– sarcina electrica: cromatografia de schimb ionic,


cromatofocusarea, electroforeza, focusarea
isoelectrica;

– caracterul hidrofobic: cromatografia hidrofoba

4. Interactia specifica cu alte biomolecule prin situsuri specifice de legare sau


trasaturi structurale: cromatografia de
afinitate, elutia de afinitate,

cromatografia cu liganzi colorati, cromatografia


covalenta, imunoadsorbtia,

Alegerea metodelor de separare este evident dependenta si de cantitatea de preparat


care se prelucreaza. In general se considera termenul de “scara mare” cand se lucreaza cu

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 27/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

cantitati mari (peste 10 L) de extracte si care contin cantitati relativ mari a enzimei de interes
(peste 100 mg/L). Astfel in functie de scara delucru, metodele pot fi grupate astel:

Clase de metode Scara mare Scara mica

Solubilitate modificarea pH-ului

modificarea tariei ionice modificarea tariei ionice

modificarea constantei dielectrice

Dimensiunea sau masa moleculara centrifugarea centrifugarea

Dializa, ultrafiltrarea, osmoza inversa

gel-filtrarea

Polaritatea cromatografia de schimb ionic cromatografia de schimb ionic

cromatofocusarea

electroforeza

focusarea isoelectrica

cromatografia hidrofoba

Interactia specifica cu alte cromatografia de afinitate


biomolecule prin situsuri specifice
de legare sau trasaturi structurale
elutia de afinitate elutia de afinitate

cromatografia cu liganzi colorati cromatografia cu liganzi colorati

cromatografia covalenta

imunnoadsorbtia

1. Metode bazate pe solubilitate

O serie de procese de bioseparare se bazeaza pe proprietatile substantelor de a precipita


in diferiti solventi la modificarea unor proprietati a solutiilor respective cum sunt : concentratia
de saruri, valoarea de pH, temperatura, prezenta unor solventi organici.

In biotehnologii se utilizeaza procesele de precipitare pentru izolarea si concentrarea


preparatului de compus activ. De altfel fractionarea prin precipitare este larg folosita in
procesele de separare a proteinelor, antibioticelor sau acizilor nucleici la scara pilot sau chiar
industriala.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 28/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Solubilitatea proteinelor in solutii/tampoane apoase este determinata de distributia


aminoacizilor hidrofilici respective hidrofobici la suprafata proteine. In general resturile de
aminoacizi hidrofobici se gasesc predominant in centrul proteinelor globulare. Proteinele cu
numeroase resturi hidrofobice la suprafata au o solubilitate scazuta in solutiile apoase in timp
ce cele incarcate ionic sau polare vor reactiona cu ionii din solutie determinand o solubilitate
crescuta. Cunoasterea compozitiei in aminoacizi a unei proteine permite alegerea celei mai
adecvate metode de precipitare.

Adaugarea unui agent de precipitare destabilizeaza solutia proteica si determina


precipitarea. In timpul adaugarii de precipitant solutia proteica este amestecata pentru a
permite difuzia uniforma a moleculelor in solutie. La adaugarea primelor molecule de
precipitant are loc faza de nucleatie cand se genereaza particule submicroscopice care cesc
apoi corespunzator cu fenomenul de difuzie Browniana. Cand particulele ating dimensiuni
critice de 0,1μ pana la 10μm in functie de fortele de forfecare respective (mari – scazute)
moleculele proteice vor incepe sa formeze agregate pana cand particule stabile, de dimensiuni
specifice fiecarei proteine si metodei de precipitare utilizate, se depun la incetarea amestecarii.

Modificarea Tariei Ionice

Modificarea tariei ionice se realizeaza prin adaugarea unor saruri minerale formate din
acizi si baze tari.

Precipitarea cu saruri minerale este o metoda larg folosita pentru fractionarea proteinelor
deoarece este o metoda ieftina si produce foarte putine denaturari. La adaugarea unor saruri
intr-o solutie proteica apoasa, solubilitatea acestora creste cu cresterea concentratiei de sare
pana la o anumita valoare limita si fenomenul se numeste „salting in” (intrarea proteinei in
solutie). Dupa valoarea limita, specifica pentru fiecare proteina pentru o anumita sare, apare
fenomenul invers de „salting out”, adica de precipitare.

Proteinele, dar si alte substante produse de agentii vii, sunt incarcate, mai mult sau mai
putin, electric. La adaugarea sarurilor minerale aceste sarcini sunt neutralizate astfel incat la
un moment dat moleculele devin practic neutre, hidrofobe, hidratarea si solubilitatea
moleculelor proteice scade ceea ce conduce la precipitarea lor determinand de asemenea si
realizarea unor asocieri intre moleculele proteice marindu-le stabilitatea. De asemenea la
concentratii mari ale sarii multi ioni ai sarii se hidrateaza, fapt ce conduce la scaderea cantitatii
de apa disponibila fenomen care contribuie la procesul de precipitare.

Seriile Hofmeister prezinta cationii si anionii in functie de eficacitatea lor pentru


procesele de precipitare. Un exemplu de serii Hofmeister este:

citrat (3-) > PO > SO > H2PO > CH3COO- > Cl- > Br- > NO

NH > K+ > Na+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ > Ba2+

Curba de precipitare a unei proteine este diferita pentru fiecare pereche de ioni adaugati
in solutie.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 29/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Procesul de precipitare este reversibil deoarece precipitatele obtinute pot fi usor


solubilizate in apa sau tampoane adecvate.

Desalifierea preparatelor precipitate cu saruri se realizeaza prin dializa, ultrafiltrare sau


gel filtrare.

O alta modalitate de modificare a tariei ionice este si utilizarea de polielectroliti cum


sunt alginatii, carboximetilceluloza, acidul poliacrilic, acidul tanic, polifosfatii. Acesti polimeri
formeaza retele intre moleculele de proteine din solutie determinand coagularea lor si
depunerea. Eficacitatea polielectrolitilor depinde de valoarea pH-ului din solutia proteica.

Polimerii anionici se utilizeaza la valori de pH mai mici decat pI, iar cei cationici la valori
mai mari de pI. Excesul de polielectroliti insa poate determina redizolvarea proteinelor

Procesul de flocularea se realizeaza prin adaugarea de mici cantitati de substante cu greutate


moleculara mare si incarcate electric care realizeaza punti cu particule cu sarcini opuse usurand
depunerea particulelor solide.

Coagularea si flocularea sunt procedee ieftine si usor de folosit pentru imbunatatirtea


proceselor de filtrare si centrifugare fiind curent utilizate in procese de separare a celulelor, a
unor fragmente celulare, proteine sau preparate enzimatice. Este important ca agentii alesi in
acest scop sa nu afecteze activitatea biochimica a produsilor de interes. De asemenea alegerea
acestor agenti este determinata atat de natura particulelor dar si de valoarea de pH si taria
ionica a solutiei.

Un astfel de agent, utilizat pentru separarea de particule celulare, proteine, recent


introdus pe piata, este o celuloza usor derivatizata cu grupe functionale de dietilaminoetil.
Acest material (Whatman CDR) este ieftin, se leaga de sarcinile negative neinteresante ale
particulelor de interes, actioneaza ca adjuvant de filtrare si poate fi incinerat pentru a nu
furniza deseuri nedorite.

Modificarea Constantei Dielectrice

Precipitarea cu nonsolventi este posibila deoarece acestia modifica potentialul chimic al


solutului. Termenul de nonsolvent este diferit in functie de natura substantei ce se doreste a se
precipita si mai ales de masa sa moleculara. De exemplu majoritatea antibioticelor sunt
solubile in solventi organici cum sunt etanolul, acetona sau t-butanolul, iar apa este pentru ele
nonsolvent. In cazul mai cunoscut al proteinelor solventii organici mentionati anterior sunt
nonsolventi.

Precipitarea cu solventi organici se explica prin faptul ca acestia au constante dielectrice


foarte mici comparativ cu cea a apei (81). La adaugarea unui solvent organic intr-o solutie
apoasa constanta dielectrica a acesteia scade fapt ce determina scaderea legaturilor ionice
dintre moleculele proteice si apa si cresterea fortelor de atractie dintre moleculele proteice.
Aglomerarea lor conduce in final la precipitarea lor.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 30/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Cei mai utilizati solventi pe scara industriala sunt etanolul, metanolul, isopropanolul si
mai rar acetona. Acetona este insa folosita destul de des in conditii de laborator sau micropilot.
Solventii organici sunt inflamabili astfel incat, atunci cand se lucreaza cu ei, trebuie respectate
conditii specifice de protectie.

Pentru precipitarea cu nonsolventi au fost testati si o serie de polimeri organici inerti.


Polietilenglicolul, dextranii si polietilenimina si-au gasit aplicatii in procesele industriale.

Acesti nonsolventi sunt preferati solventilor organici deoarece sunt mai putin inflamabili si au o
tendinta de a denature proteinele mai scazuta decat de exemplu prin precipitarea la pH
Isoelectric.

Modificarea pH-ului

La modificarea valorii de pH proteinele coaguleaza, deoarece sarcinile electrice ale


moleculelor sunt neutralizate fapt ce determina scaderea afinitatii fata de solvent, aderarea
moleculelor intre ele si formarea unor conglomerate cu greutate moleculara mare care se
depun. Valoarea de pH la care sarcina proteinei de interes devine egala cu zero este pH-ul
izoelectric (pI) al proteinei respective. La valori de pH mai mari decat a pI proteina este
predominanat incarcata negativ si moleculele se vor respinge intre ele. In acelasi mod la pH
sub valoare pI proteina va fi incarcata pozitiv si moleculele de asemenea se vor respinge.

pI a majoritatii proteinelor se afla in domeniul 4-6. Pentru atingerea valorii pI se utilizeaza acizi
minerali cum sunt HCl si H2SO4.

Dezavantajul cel mai mare este ca prin precipitare utilizand acesta metoda are loc o
denaturarea ireversibila a proteinelor determinate de acizii minerali utilizati. De aceea
precipitarea la pI este utilizata mai ales pentru indepartarea enzimelor, proteinelor
contaminante decat pentru precipitarea enzimei de interes.

Un exemplu este utilizarea acestei metode in procesele de preparare a branzei.

Modificarea temperaturii

Utilizarea temperaturii ca agent de precipitare se foloseste mai ales in cazurile speciale


de concentrare sau fractionare a unor proteine stabile termic cum sunt de exemplu amilazele
termostabile.

Prin cresterea temperaturii se realizeaza o denaturare selectiva si in consecinta o


precipitare a unor proteine. Analiza temperaturii care induce precipitarea pentru o proteina
data se bazeaza pe presupunerea ca denaturarea termica urmeaza o cinetica chimica de
ordinal intai conform dependentei termice a lui Arrhenius care arata dependenta principala de
energia de activare a denaturarii pentru o protein data.

Totusi metodele termice sunt utilizate destul de rar pentru purificarea de enzime
deoarece in majoritatea cazurilor conduc la pierderi de activitate fapt care le face neeconomice.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 31/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Un exemplu de utilizare a temperaturii pentru purificarea enzimelor este cel utilizat pentru
purificarea dehidrogenazelor din drojdie.

2. Dimensiunea sau Masa Moleculara

Dimensiunea si/sau masa moleculara ofera posibilitatea de separare a macromoleculelor


prin metode relativ simple si accesibile cum sunt: centrifugarea, dializa, ultrafiltrarea si gel-
filtrarea.

Separarile centrifugale se bazeaza pe diferentele de dimensiune, forma si densitate ale


particulelor, vascozitatea mediului si viteza de rotatie a rotorului unei centrifugi.

Diferenta de densitate a particulelor in solutie face posibila separarea lor ca urmare a


unei miscarii circulare a eprubetei cu amestec in care acestea sunt dispersate.

Separarea unei enzime de alta prin centrifugare nu este foarte eficienta tocmai din cauza
proprietatilor acestora. De aceea in majoritatea cazurilor, cetrifugarea este folosita pentru
indepartarea impuritatilor cu mase moleculare mari si separarea enzimelor se realizeaza mai
ales prin ultracentrifugare.

Dializa si ultrafiltrarea sunt procese asemanatoare si se utilizeaza mai ales pentru


enzime cu masa moleculara de zeci de mii. In mod obisnuit prin aceste metode se indeparteaza
moleculele mici - saruri, molecule mici, solventi organici etc. – si se realizeaza concentrarea
proteinelor.

Gel-filtrarea se utilizeaza in principal pentru enzime cu masa moleculara de sute de mii.


Se utilizeaza in general pentru purificari la scara mica in ultimele stadii de purificare deoarece
foloseste materiale scumpe - Sephadex, Bio-Gel P, Sephacryl si Sepharose – si este
consumatoare de timp.

Separarea prin membrane

Procesele de filtrare prin membrane au la baza fenomene de difuziune. Astfel sub


influenta unui gradient de concentratie moleculele unei substante dintr-o solutie trec in solutia
mai diluata datorita miscarilor de agitatie moleculara formind un flux de difuziune (Fig.– a).
Osmoza este o miscare neta a solventului (apa) prin membrana selectiva datorita diferentelor
de concentratie a solutului de cele doua parti ale membranei, adica trecerea apei din partea
mai diluata spre cea mai concentrata pana cand presiunea din ambele parti este
echilibrata(Fig.– c). In procesul de ultrafiltrare sub actiunea presiunii prin membrana trec atat
molecule de solvent cat si molecule de mici dimensiuni (Fig.– c). Fenomenul de difuziune al
unui solvent intr-o solutie, de care este separat printr-o membrana semipermeabila, genereaza
o presiune osmotica, definita ca presiunea de exces care trebuie aplicata solutiei, pentru a
preveni trecerea solventului in solutia mai concentrata

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 32/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Aceste fenomene au condus in ultimul timp la dezvoltarea unor proceduri de izolare si


purificare nu numai ieftine ci si superioare calitativ.

Dializa

Procesul de dializa se utilizeaza in biotehnologii in special pentru procese de desalinizare.


Moleculele de solut destul de mici pentru a trece prin porii membranei vor difuza din partea cu
concentratie ridicata in cea cu concetratia scazuta. Trasatura principala a procesului de dializa
este diferenta de concentratie a solutului care va determina miscarea acestuia spre egalizarea
concentratiei, nefiind necesare pompe sau vid pentru a determina aceasta migrare.

Acest procedeu este larg folosit mai ales in laborator deoarece desi nu este scump
necesita un timp de lucru destul de mare.

De exemplu in procesele de purificare a proteinelor adeseori se utilizeaza precipitarea


cu saruri neutre. Pentru indepartarea sarurilor proteinele precipitate sunt introduse in saci de
dializa, formati din membrane specifice, acestia sunt inchisi etans si apoi scufundati in volume
mari de apa distilata sau solutii tampon adecvate. Moleculele mari de proteine nu trec prin porii
membranei, raman in interiorul sacului, in timp ce moleculele mici de sare difuzeaza in apa sau
tampon pana la atingerea unui echilibru. Se observa ca sarurile nu au fost eliminate complet
din sacul de dializa dar concentratia lor a scazut foarte mult. Pentru eliminarea practic totala a
sarurilor sacul de dializa se pune in solutii proaspete de tampon sau apa pana se ajunge la
purificarea dorita (fig.).

In prezent exista si sisteme, comerciale, care contin o membrana intre doua spatii, un
spatiu pentru proba ce se va dializa si un spatiu pentru tamponul fata de care se face dializa si
care este mai mare deoarece tamponul (apa) fata de care se dializeaza se afla intr-un volum
de 200-300 ori mai mare (fig.).

Pe langa desalifiere, este necesar ca in procesele de purificare sa fie indepartate si alte


molecule. De exemplu in lucrul cu proteine si acizi nucleici este adeseori necesar sa fie
indepartati agentii reducatori (ditiotreitol, 2-mercaptoetanol), liganzi care nu au reactionat,
reactivi de marcare sau conservanti.

De asemenea acest procedeu se foloseste si atunci cand este necesar sa se schimbe


tamponul in care se afla proba.

Ultrafiltrarea

Prin ultrafiltrare, un proces asemanator dializei rezultat din diferente de presiune, se


separa compusii in functie de greutatea lor moleculara.

In procesele de ultrafiltrare fluidele sunt trecute dintr-un tanc de prelucrare in modulul


de ultrafiltrare care contine membrana specifica prin care moleculele mari nu pot trece. Solutia
ce contine moleculele ce nu trec prin membrana se numeste reject sau retentat. Solutia
apoasa care a trecut prin membrana se numeste permeat. Modul in care are loc un proces de
ultrafiltrare este prezentat in fig.
http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 33/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Fluxul solventului este proportional cu presiunea/forta ce se aplica asupra lui. Ecuatia


care reda aceasta curgere este:

jv= Lp∆p (1)

unde jv este volumul de solvent pe unitatea de suprafata si pe unitatea de timp, Lp este


permeabilitatea membranei, iar ∆p este scaderea presiunii pe membrana. Fluxul solventului
este acelasi cu viteza solventului dar se foloseste termenul de flux pentru a se accentua
paralelismul cu ecuatiile de transport pentru procesele de difuzie si electroforeza. Aceasta
ecuatie este o alta forma a legii lui Darcy care exprima viteza de curgere intr-un process de
filtrare printr-un pat poros:

v= (2)

unde k este constanta de proportionalitate ce defineste permeabilitatea patului poros, l


grosimea patului poros, µ vascozitatea solutiei, iar ∆p este scaderea presiunii pe patul poros.

De fapt ecuatia (1) este un artifact istoric reflectand evolutia ultrafiltrarii de la


membrane de separare si nu de la filtrarea conventionala. In general aceasta nu reprezinta o
ecuatie exacta deoarece neglijeaza presiunea osmotica existenta. Forta reala ce se aplica
solutiei deriva din variatia de presiune ce se aplica din care se scade presiunea osmotica si
efectul datorat trecerii prin membrana a unei cantitati de solut. Deci o ecuatie mai aproape de
realitate este:

jv= Lp(∆p-σ∆Π) (3)

unde σ este “coeficient de reflectie”, iar ∆Π este diferenta de presiune osmotica. Atunci cand
membrana reflecta toti solutii σ=1, iar daca prin membrane trec usor si solutii si solventul σ=0.
Aceasat ecuatie este ecuatia fundamentala pentru procesele de ultrafiltrare.

Membranele disponibile in prezent pentru procese de ultrafiltrare au diametrul porilor de


la 1Å la 100Å si pot separa particule cu greutati moleculare de la 1.000 la 1.000.000 daltoni.
Ca o regula membranele utilizate sunt anizotropice, formate dintr-un strat subtire de 0,1 –
0,5 µ si reprezinta un filtru care se ataseaza pe o substructura, relativ, groasa (20 µm – 1mm),
poroasa care imbunatateste rezistenta mecanica a filtrului.

Filtrele extrem de subtiri permit realizarea unor viteze mari ale fluxului ceea ce permite
virtual ca blocajul membranei sa poata fi evitat. Totusi adeseori la suprafata membranei se
formeaza un strat secundar de molecule care poate conduce la considerabile schimbari in
vitezele de curgere. Pentru a se pastra un strat de grosime minima posibila, solutia este
pompata cu o viteza inalta in curent laminar sau turbulent pe langa si prin membrana astfel
incat sa se asigure transportul inapoi in solutie a moleculelor colectate la suprafata membranei.
Aceasta viteza conduce insa la o crestere considerabila a fortelor de forfecare care pot eventual

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 34/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

inactiva enzimele sensibile. S-a constatat insa ca pierderile de activitate sunt totusi relativ
scazute mai ales daca concentratiile de proteine sunt destul de scazute.

Aplicatiile ultrafiltrarii pot fi grupate in procese de fractionare, concentrare sau


desalifiere.

Fractionarea reprezinta separarea particulelor mari de cele mici.

In concentrare solventul este trecut prin filtru, iar solutul este concentrat la suprafata
membranei. Se reduce astfel volumul initial al probei si speciile cu greutate moleculara mare
sunt concentrate in asa numitul retentat.

In desalifiere sarurile cu greutate moleculara mica sunt indepartate din proba in


permeat. Acest process este denumit si diafiltrare. Indepartarea sarurilor sau inlocuirea lor cu
altele se realizeaza prin inlocuirea permeatului permanent cu apa sau un tampon adecvat.
Ecuatiile utilizate pentru evaluarea concentratiilor de sare din solutia ce se prelucreaza sunt:

Ø pentru eliminarea sarurilor : ln = ; unde C0 este concentratia initiala de sare, Cf


concentratia finala de sare in solutia proteica, V0 volumul initial si Vf volumul final al
lichidului de schimb;

Ø pentru inlocuirea unei sari cu alta: ln = ; unde C este concentratia de sare in


solutia prelucrata, iar Cf este concentratia de sare in solutia de alimentare.

Ecuatiile de mai sus se utilizeaza doar in cazul in care schimbul de solutii are loc intr-un
mod continuu. Exista evident si alte modalitati de schimb ca de exemplu in trepte discrete.

Eficienta indepartarii unui contaminant este adesea considerata folosindu-se procentul


de rejectie, care este procentul contaminantului particular care nu trece prin membrana sau
este rejectata de catre membrana.

Principiul ultrafiltrarii este simplu, eficace, nepoluant si economic. Aceste calitati fac din
ultrafiltrare una dintre cele mai convenabile metode de purificare si concentrare in
biotehnologii.

Osmoza inversa

Osmoza inversa se bazeaza pe procesul de osmoza.osmoza Pentru a intelege procesul de


osmoza sa consideram doua solutii de macromolecule, una concentrata cealalta diluata
separate printr-o membrana semipermeabila. Osmoza implica miscarea selectiva a solventului
(apa) din partea mai diluata spre latura mai concentrata. Ca rezultat solventul ce trece in
solutia mai concentrata o va dilua si nivelele din cele doua capilare se vor diferentia , mai inalt
fiind cel in care a trecut solventul. Cresterea nivelului in capilar va determina o crestere a
presiunii in aceasta solutie si va incetini procesul de dilutie pana la echilibrarea presiunilor cand

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 35/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

trecerea solventului se opreste. Aceasta presiune ce poate fi masurata experimental se


numeste presiune osmotica. In procesul de osmoza inversa prin aplicarea unei presiuni asupra
solutiei mai concentrate se forteaza trecerea apei in sens invers spre solutia diluata (fig.).

Desi procesul de osmoza inversa era folosit doar in industria vinului in prezent este
inteles si larg folosit in diferite domenii.

Prin osmoza inversa pot fi concentrati toti compusii care au o greutate moleculara mai
mare de 150 – 250 Daltoni asa cum sunt: bacteriile, saruri organice, glucide, proteine,
coloranti, saruri etc.

Deoarece cei mai multi dintre contaminanti nu trec prin membrane specifice o data cu
apa, prin acest procedeu se poate obtine apa pura. Membranele utilizate in mod obisnuit in
acest scop sunt realizate din celuloza – triacetat, celuloza – diacetat sau membrane realizate
din poliamide aromatice.

Membranele utilizate pentru osmoza inversa sunt mult mai restrictive decat cele
utilizate pentru ultrafiltare.

Prin particularitatile sale osmoza inversa este deosebit de importanta pentru purificarea
apei fiind utilizata in tehnicile moderne aplicabile in acest scop.

Desi ultrafiltrarea si osmoza inversa sunt similare ele sunt diferentiate prin unele
criterii cum sunt cele prezentate in tabelul nr.

Tabel

Criterii care diferentiaza ultrafiltrarea de osmoza inversa

(Präve, P si colab., 1989)

Criteriu Ultrafiltrare Osmoza inversa

Dimensiunea particulelor retinute Greutate moleculara >1000 Greutate moleculara

< 500 – 1000

Presiunea osmotica neglijabila Considerabila, poate ajunge la 800


– 1000 N/cm2

Presiunea de lucru Pana la 100 N/cm2 Mai mare de 100 N/cm2 si poate
ajunge la 1500 N/cm2

Procese principale Separare dupa dimensiunea Transport prin difuzie; materialul


moleculara; efectul de sita; membranei poate afecta
materialul membranei nu are nici o proprietatile de transport.
influenta caracteristica importanta
fiind dimensiunea porilor.

Gel-filtrarea
http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 36/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

In purificarea enzimelor un loc important este ocupat de


procesele de cromatografie. Cromatografia reprezinta o familie
de tehnici de separare bazata pe diferitele interactiuni ale
biomoleculelor cu cele doua faze: stationara si mobila. Asa cum
sugereaza si denumirea, faza stationara reprezinta o faza fixa,
imobila, iar faza mobila este un lichid sau un gaz care trece prin
faza stationara si preia, elueaza, moleculele. Interactia diferita a
moleculelor cu cele doua faze permite separarea lor datorita

Fig. 1 Reprezentarea unui proces de cromatografie lichida

vitezelor lor de miscare, de iesire din coloana cromatografica. Metodele, tehnicile


cromatografice sunt extrem de numeroase, de variate. Purificarea biomoleculelor, a proteinelor
in special, se realizeaza in in mare masura prin metode cromatografice pe coloana, utilizandu-
se un lichid ca faza mobila. Schema generala a unei separari printr-o coloana cromatografica
este prezentata in fig.1. Cele mai utilizate tehnici pentru purificarea enzimelor, proteinelor, sunt
tehnicile de gel filtrare, cromatografia de schimb ionic si cromatografia de afinitate.

Gel filtrarea (GF) denumita si Cromatografia de permeatie prin gel (GPC) sau
Cromatografia de excludere moleculara (SEC) foloseste asa numitele site moleculare sau site
structurale. Metoda se bazeaza pe diferentele de marime si structura ale biomoleculelor.
Moleculele mici intra in porii matricei fiind retinute in faza stationara in timp ce moleculele mari
trec prin coloana cu viteze diferite in functie de greutatea lor moleculara si structura lor
(fig.2.).

Separarea depinde nu numai de dimensiunea si de forma moleculelor, dar si de structura


gelului si a porilor care depind la randul lor de gradul de imbibare a gelului. Prin aceasta
metoda se pot separa la scara enzime, acizi nucleici, carbohidrati si peptide. Este o metoda
foarte potrivita pentru bioprodusii sensibili la schimbari de pH, ioni metalici, cofactori sau
conditii severe de mediu.

Pentru acest tip de separari paturile cromatografice trebuie sa fie poroase si inerte. Deoarece
matricea acestor paturi este constituita in majoritatea cazurilor dintr-un gel inert inalt hidratat
metoda este cel mai adesea cunoscuta ca gel filtrare.

Gelurile obisnuite pentru formarea fazei


stationare, utilizate in acest scop, sunt formate din dextran, agaroza sau poliacrilamida. Gradul
http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 37/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

de legare incrucisata a particulelor de gel vor determina diametrul porilor si domeniul de


fractionare al biomoleculelor de diferite marimi.

Gelurile formate din dextran sau poliacrilamida pot separa si molecule globulare cu o
greutate moleculara in jur de 800.000 daltoni in timp ce gelurile de agaroza avand o porozitate
mai mare pot separa si molecule, complexe macromoleculare, de cateva milioane daltoni.
Cateva dintre cele mai utilizate geluri sunt prezentate in tabelul nr…

Tabel …

Tipuri de geluri utilizate in gel filtrare.

Denumirea matricei Tipul de gel Domeniul de fractionare pentru peptide si proteine


globulare

Sephadex G-101 dextran 50 – 700

Sephadex G-501 1500 – 30000

4000 – 150000
Sephadex G-1001
5000 – 250000
Sephacryl S-200 HR1
5000 – 600000
Sephadex G-2001

Bio-Gel P-22 poliacrilamida 100 – 1800

Bio-Gel P-102 1500 – 20000

3000 – 60000
Bio-Gel P-602
15000 – 150000
Bio-Gel P-1502
60000 – 400000
Bio-Gel P-3002

Ultrogel AcA 543 poliacrilamida/agaroza 6000 – 70000

Ultrogel AcA 443 12000 – 130000

20000 – 400000
Ultrogel AcA 343

Sepharose 6B1 agaroza 10000 – 4000000

Sepharose 2B1 70000 – 40000000

10000 – 5000000
Bio-Gel A-52
1000000 – 150000000
Bio-Gel A-1502

1= marca Amersham Pharmacia Biotech; 2= marca Bio-Rad Laboratories, INC; 3= marca Pharmacia LKB.

Particulele de gel, indiferent de natura lor se obtin prin legarea incrucisata a unor
monomeri specifici. Are loc o polimerizare sau copolimerizare intr-o retea tridimensionala.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 38/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Procesul se mai numeste si reticulare.

Pentru realizarea gel filtrarii, faza stationara formata din gelul realizat prin
amestecarea particulelor sferice de gel uscat – matricea poroasa in forma de particule sferice –
cu tamponul, potrivit proteinei care trebuie separata, este turnat in coloana aleasa si dupa
spalarea si echilibrarea gelului cu tamponul adecvat se obtine asa numitul pat cromatografic.
Operatia de realizare a patului cromatografic se numeste impachetarea patului. Tamponul cu
care se echilibreaza patul va umple porii matricei si spatiul dintre particule. Lichidul din
interiorul porilor este adesea considerat faza stationara si este in echilibru cu lichidul dinafara
particulelor considerat faza mobila. Deoarece aceasta metoda se bazeaza pe dimensiunea
moleculelor ce se separa, trebuie specificat ca probele sunt eluate in mod isocratic adica nu
este necesar sa se utilizeze tampoane diferite in timpul procesului de separare. De asemenea
la sfarsitul procesului de separare spalarea coloanei se realizeaza cu acelasi tampon pentru
indepartarea tuturor moleculelor care ar fi putut fi retinute pe coloana si pregatirea acesteia
pentru un nou proces.

Rezultatele unei gel filtrari se exprima de obicei ca un profil de elutie sau o


cromatograma care arata variatia in concentratia biomoleculelor (in majoritatea cazurilor ca
absorbanta in UV la A280nm) din proba ca eluenti in ordinea greutatii lor moleculare, primele
fiind biomoleculele cu masa cea mai mare.

Parametrii ce caracterizeaza un proces de gel filtrare si in general un proces


cromatografic, sunt:

Vt = volumul total al coloanei;

V0 = volumul spatiului gol, volumul liber accesibil tuturor moleculelor sau volumul fazei
mobile; reprezinta in jur de 35% din volumul total al coloanei;

Vi = volumul intern al particulelor, accesibil doar moleculelor mici si sarurilor in functie de


dimensiunea porilor si moleculelor; este definit si ca volumul fazei stationare, Vs.
Deoarece in practica este dificil de determinat, acest volum este uzual considerat a fi: Vs
= Vi = Vt – V0. Din aceasta relatie se observa ca volumul fazei stationare include si

volumul materialului solid din care este realizata matricea.

Vg = volumul particulelor de gel imbibate ce formeaza matricea coloanei.

Ve = volumul de elutie este volumul de solvent cu care este eluat un component din stratul
cromatografic. Acest volum este usor de determinat din cromatograma dar nu defineste
complet comportarea unei probe deoarece va varia cu volumul total al patului
cromatografic si cu modul in care a fost coloana impachetata. Poate fi calculat cu
ajutorul relatiei: Ve = V0+ KavVi.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 39/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Kd = este definita ca fractia fazei stationare care este disponibila pentru difuzia unor specii
moleculare sau este coeficientul de distributie a speciei moleculare intre faza stationara

si cea mobila: Kd= =

Kav=coeficientul de distributie mediu al probei intre faza mobila si cea stationara si care
caracterizeaza mai bine elutia unei probe; poate fi definit si ca fractia fazei stationare
disponibila pentru difuzia unei specii moleculare (0<Kav<1). Acest coeficient se
calculeaza prin relatia: Kav=(Ve – V0) / (Vt – V0). De fapt Kav nu este un coeficient real
de partitie dar pentru un mediu dat exista un raport constat intre acesta si adevaratul
coefficient de partitie, Kav:Kd, raport care este independent de natura si concentratia
moleculei de interes.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 40/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

In aceste relatii Ve este


determinat de exemplu prin masuratori de activitate sau din cromatograma, V0 se masora prin

elutia “blue dextranului” (Mr>106), iar Vt este fie calculat geometric (πr2∙I - unde r este raza
coloanei, iar I inaltimea patului cromatografic) fie determinat prin elutia unor molecule mici ca
de exemplu acetona.

Fig…

Gradul de separare dintre diferitele macromolecule/molecule depinde de o serie de


factori: volumul probei, raportul dintre volumul probei si volumul coloanei, dimensiunile
coloanei, dimensiunea particulelor de gel, distributia particulelor, densitatea patului
cromatografic, dimensiunea porilor din particule, viteza de curgere, vascozitatea probei si
solventului.

Eficienta, succesul unei gel filtrari depinde in primul rand de conditiile alese astfel incat
sa se realizeze o selectivitate suficienta si picuri cat mai inguste si fara efecte de asimetrie,
varfuri asimetrice “cu coada” sau “frontale”, capacitate de separare slaba sau elutii tarzii.

Separabilitatea a doua componente este caracterizata prin Rezolutia cromatografica RS si


se exprima prin:

V1, V2 reprezinta volumele de elutie a doua varfuri adiacente; W1, W2 largimile la baza varfurilor

Rs = respective; (V2 - V1) distanta dintre cele doua varfuri; reprezinta media largimi
bazelor celor doua varfuri.

Parametrii utilizati pentru exprimarea rezolutiei sunt reprezentati in fig..

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 41/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Fig…. Rezolutia a doua varfuri cromatografice

Aceasta rezolutie reprezinta o punte intre teorie si practica, si caracterizeaza succesul unei
separari. Acest concept de rezolutie se aplica oricarei metode cromatografice ce se limiteaza la varfuri
de tip Gauss.

Alegerea celui mai potrivit gel pentru separarea unor biomolecule se realizeaza prin asa
numita curba de selectivitate pentru fiecare matrice posibil a fi utilizata intr-un proces de gel
filtrare.

Selectivitatea gel filtrarii depinde numai de distributia si dimensiunea porilor. Daca se se


efectueaza un grafic raportand Kav fata de logaritmul greutatii moleculare a unor proteine
standard se obtine curba de selectivitate pentru fiecare mediu utilizat pentu gel filtrare. Aceste
curbe se folosec pentru alegerea celui mai potrivit mediu pentru o separare data. In cazul unei
alegeri corespunzatoare a mediului de filtrare si a conditiilor de lucru pentru anumite proteine
curba obtinuta este o dreapta (fig ). In general curba de selectivitate este liniara pe un
domeniu al valorilor Kav intre 0,1 si 0,7. Aceasta parte a curbei este utilizata pentru
determinarea domeniului de fractionare pentru un gel.

Fig..Relatia dintre Kav si logaritmul masei moleculare.

Domeniul de fractionare defineste pentru un gel domeniul de mase moleculare care au


acces partial la porii matricei. Din curba de selectivitate se poate de asemenea determina si
limita de excludere care arata dimensiunea moleculelor care pot fi eluate cu volumul liber
accesibil tuturor moleculelor sau volumul spatiului gol.
http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 42/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Gel filtrarea este utilizata mai ales la nivel de laborator sau pilot dar poate fi utilizata in
anumite cazuri si la scara mare.

Aplicatiile gel filtrarii pot fi:

Ø preparativa de fractionare a amestecurilor proteice (volumul probelor trebuie sa fie mai


mic de 5% din Vt),

Ø de indepartare a sarurilor din solutiile proteice (volumul probelor pana la 25 – 30% din
Vt) si

Ø analitic de determinare a maselor moleculare a proteinelor.

In cazul ultimului exemplu se folosesc proteine marker cu mase moleculare cunoscute


si se raporteaza Kav, Kd, Ve sau Ve/V0 fata de logaritmul maselor moleculare a proteinelor
standard. Se prefera insa raportarea fata de Kav deoarece este mai putin senzitiva la erorile ce
pot fi introduse ca rezultat a variatiilor in timpul prepararii coloanei si dimensiunilor coloanei si
nu necesita o determinare indoielnica a Vi asa cum este necesar pentru Kd. Un exemplu a unei
astfel de curbe obtinuta prin utilizarea a diferite proteine marker este prezentata in fig

3. Metode bazate pe polaritatea enzimelor

Cromatografia de schimb ionic (IEC = ion exchange chromatography, IEX =


Ionenaustauschchromatographie).

Cromatografia de schimb ionic se utilizeaza inca din secolul 19 (1850), cand Thomson H.
si Way, J.T. din Anglia au utilizat argila pentru separarea ionilor de amoniu de ionii de calciu, iar
in 1927 s-a utilizat pentru prima oara o coloana de zeolit mineral pentru separarea ionilor de
calciu si magneziu de ionii sulfat. Tehnica moderna a cromatografiei de schimb ionic isi are
radacinile insa in perioada celui de-al doilea razboi mondial; cand se lucra la realizarea unor
metode de separare a elementelor transuranice. Aceste tehnici au condus mai tarziu la
dezvoltarea IEC pentru separarea de bioprodusi dar si compusi anorganici.

Astazi cromatografia de schimb ionic (IEC, IEX) este una dintre metodele utilizate curent
in purificarea proteinelor in functie de sarcina lor electrica. Separarea proteinelor prin
cromatografie de schimb ionic depinde de adsorbtia reversibila a moleculelor incarcate electric
catre ionii de semn opus ai matricei.

Succesul utilizarii IEC rezida in faptul ca este o tehnica cu larga aplicabilitate, este o
metoda simpla si controlabila, ofera posibilitatea obtinerii unor rezolutii inalte si capacitati de
ridicare la scara fara dificultati.

IEC utilizeaza atat faze stationare solide cat si lichide spre deosebire de celelalte metode
care se pot ridica la scara folosind aproape numai suporturi solide. O data cu dezvoltarea
sintezei polimerilor sintetici s-a realizat si un numar mare de schimbatori de ioni care se
folosesc astazi pe scara industriala nu numai pentru purificarea unor bioprodusi ca antibioticele
http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 43/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

sau enzimele dar si pentru decolorarea sau demineralizarea solutiilor native ale bioprodusilor
sau pentru depoluarea/epurarea unor ape reziduale.

In cromatografia de schimb ionic materialele utilizate pentru realizarea paturilor


cromatografice, numite si rasini, au numeroase molecule incarcate electric, pozitiv sau negativ,
prin grupari legate covalent de suportul de baza al matricei.

Rasinile incarcate pozitiv vor atrage si vor lega reversibil ionii negativi, adica anionii, de
aceea ele se numesc schimbatori anionici sau anioniti. In acelasi mod rasinile incarcate negativ
se vor numi schimbatori cationici sau cationiti.

Cand rasina este suspendata in tampon gruparile incarcate se asociaza usor prin legaturi
ionice cu ionii de sarcina opusa din tampon, ca de exemplu ionii clorurii de sodiu. Acesti ioni,
care formeaza cu matricea legaturi slabe sunt numiti ioni mobili de schimb.

In general schimbatorii de ioni sunt polimeri insolubili in apa ce contin grupari


functionale incarcate negative sau pozitiv. Cationitii au in general grupari functionale de tipul: -
SO , -OPO si –COO-. Majoritatea anionitilor contin grupari amoniu tertiare sau cuaternare: -

NHR si -NR .

Cateva exemple de astfel de rasini sunt prezentate in tabelul..

Table..

Exemple de rasini schimbatoare de ioni

Gruparea functionala

Schimbatori anionici

Dietilaminoetil (DEAE) O-CH2-CH2-N+H(CH2CH3)2

Cuaternar aminoetil (QAE) O-CH2-CH2-N+(C2H5)2(CH2-CHOH-CH3)

Amoniu cuaternar (Q) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3

Schimbatori cationici

Carboximetil (CM) -O-CH2-COO-

Sulfopropil (SP)
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO

Metilsulfonat (S)
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH- CH2SO

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 44/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Comportarea proteinelor intr-o coloana cu schimbatori de ioni se modifica datorita


incarcarii electrice a schimbatorilor dar si a propriei sarcini nete. pH-ul solutiei, valoarea pK a
fiecarei catene laterale si mediul inconjurator influenteaza sarcina fiecarei catene laterale si
apoi a intregii proteine. Relatia dintre pH, pK si sarcina fiecarui aminoacid poate fi descrisa prin
relatia lui Henderson-Hasselbach.

In general, daca pH-ul solutiei creste are loc o deprotonare a gruparilor acide si bazice
din proteine. Astfel gruparea carboxil este convertita la anioni carboxilat (R-COOH →R-COO-)
iar gruparile amoniu la grupari amino (R-NH3+ → RH2).

pI este valoarea de pH la care proteinei este neutra. Cand pH>pI proteina are o sarcina
neta negativa, cand pH<pI proteina are o sarcina neta pozitiva.

In etapa de separare trebuie sa se tina cont de incarcarea cu sarcini a compusului ce


urmeaza a fi purificat. De exemplu sarcina proteinelor este dependenta de structura lor
primara adica de compozitia in aminoacizi. Astfel daca sarcina neta a unei proteine este
pozitiva, la o valoare de pH = 7 a eluentului, proteina se va lega de sarcinile negative ale fazei
stationare, ca de exemplu gruparile carboxil.

Astfel daca o solutie bruta de proteine este trecuta printr-o coloana care atasate covalent
grupari functionale incarcate de exemplu negativ, proteinele cu sarcini opuse se vor lega de
aceste grupari in timp ce proteinele cu aceiasi sarcina vor fi eluate. Proteina legata va fi apoi
eluata fie prin adaugarea de saruri fie prin schimbarea valorii de pH. Ionii din sare vor

neutraliza sarcinile proteinei si ea va fi eluata din coloana.

In general un proces ce utilizeaza cromatografia de schimb ionic pentru purificarea unor


molecule decurge in 5 etape (fig…):

o Echilibrarea coloanei cromatografice;

o Aplicarea probei;

o Adsorbtia moleculelor din proba;

o Elutia

o Regenerarea coloanei.

Echilibrarea coloanei reprezinta etapa in care se stabilizeaza conditiile necesare pornirii


unui proces de separare. In aceasta etapa se aplica tamponul dorit si toate gruparile incarcate
electric din faza stationara se asociaza cu ioni de semn contrar. Cand procesul este complet se
obtine starea de echilibru. Cand valoarea pH a picaturilor de solutie ce ies din coloana este
aceiasi cu valoarea tamponului utilizat pentru echilibrare, coloana poate fi considerata
echilibrata.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 45/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Aplicarea probei in coloana se realizeaza prin plasarea solutiei proteice in partea


superioara a coloanei, deasupra patului cromatografic.

Adsorbtia moleculelor din proba. In aceasta etapa proteinele care au sarcini electrice
opuse fazei stationare se vor lega de aceasta in timp ce acelea cu aceiasi sarcina sau neutra nu
se vor lega si vor fi eluate in aceasta etapa. De asemenea in aceasta etapa se elueaza si ionii
mobili care au contribuit la echilibrarea coloanei cromatografice inainte de pornirea procesului
de separare. Pentru a trece la etapa urmatoare se verifica lipsa proteinelor nelegate in
tamponul de spalare, numai atunci se aplica gradientul de strat, tamponul de start al elutiei.

Elutia reprezinta separarea moleculelor prin desorbtia lor la timpi diferiti reprezinta
procesul de elutie si este prezentat in schema generala a procesului prin doua etape principale:
inceperea desorbtiei si sfarsitul desorbtiei.

Elutia proteinelor poate fi efectuata prin mai multe cai. Optiunea cea mai utilizata este
modificarea pH-ului solutiei tampon. Cand pH-ul solutiei ajunge la valoarea pI al unei proteine,
sarcina neta a acesteia este zero si este eliberata de pe schimbator si eluata.

O alta cale utilizata este modificarea tariei ionice a solutiei tampon utilizata pentru
eluare. Cresterea concentratiei de ioni, prin adaugarea de saruri, duce la inlocuirea proteinei
legata de schimbatorul de ioni. Proteinele cu slabe interactiuni ionice vor fi eluate la
concentratii scazute de sare. Proteinele care au incarcari ionice puternice vor avea o mai mare
afinitate fata de schimbator si vor ramane legate de rasina mai mult timp fiind eluate doar la
tarii ionice ridicate.

Procesul de elutie poate fi: isocratic, in trepte sau in gradient.

Daca in procesul de elutie se utilizeaza acelasi tampon care a fost utilizat la aplicarea
probei elutia este denumita isocratica.

Daca elutia se realizeaza prin schimbarea tamponului la diferite perioade procesul este
numit elutie in trepte.

Cele mai bune rezultate se obtin cand compozitia tamponului de elutie se schimba in
progres continu. In general se porneste de la tampoane mai diluate la tampoane concentrate in
cazul utilizarii modificarea tariei ionice, iar pentru modificarea pH-ului de la pH alcalin la pH
acid sau invers in functie de natura schimbatorului utilizat si a proteinelor ce se separa. Acest
tip de elutie se numeste gradient de elutie si duce in general la rezultate mult mai bune.

Probele eluate se verifica regulat urmarindu-se absorbanta la 280nm.

Regenerarea implica indepartarea tuturor ionilor care au contribuit la elutia proteinelor


astfel incat coloana va fi gata pentru un nou proces. Se considera coloana gata pentru o noua
echilibrare cand valoarea absorbantei este mai mica de 0,05.

Modificarea valorilor de pH permite un control mai fin al procesului de eluare a


proteinelor dintr-o solutie complexa, luandu-se in calcul valorile izoelectrice (valori de pH – pI
– la care proteinele sunt neutre). Cu cat valoarea pH-ului scade, proteinele devin tot mai
http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 46/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

pozitive datorita cresterii concentratiei de H+ din mediu. Astfel daca avem o proteina incarcata
negativ legata de sarcinile pozitive ale fazei stationare la o valoare de pH = 7, scaderea valorii
de pH la 5 va determina elutia tuturor proteinelor cu valori de pI cuprinse intre 5 si 7 (Fig….).
Acele proteine care au pI mai mari de 7, au sarcina pozitiva in momentul cand sunt introduse
in coloana si vor fi eluate imediat in timp ce cele cu valori ale pI mai scazute decat 5 vor avea
o sarcina negativa si la pH = 5 si vor ramane legate de coloana. Prin scaderea valorii de pH in
mod lent folosind diferite tampoane, este posibil sa se separe fractii proteice cu valori de pI
scazand progresiv. La o schimbare brusca de pH se vor elibera mai multe proteine in acelasi
timp si se vor obtine probe mai putin pure.

Din acest motiv si pentru a realiza rezolutii inalte adeseori se pastreaza valoarea pH-ului
constanta, enzimele fiind eluate prin cresterea tariei ionice.

Explicatiile prezentate sugereaza ca pe baza pI al unei proteine se poate prevedea


comportarea ei, si in consecinta alegerea schimbatorului adecvat. In practica insa conditiile de
separare se determina prin experimentare si evaluarea erorilor deoarece proteinele prin
caracterul lor amfoter deviaza gradientul de pH ce se aplica si de aici modificarea
comportamentului preconizat. In fapt la alegerea schimbatorului trebuie sa se tina cont si de
niste limite de eroare de o parte si alta a pI moleculei de interes.

Cromatofocusarea

Cromatofocusarea este o tehnica derivata din cromatografia de schimb ionic si a


focusarii izoelectrice (dezvoltata in perioada 1977 – 1981).

In tehnica de cromatofocusare proteinele sunt adsorbite pe schimbatorul de ioni la limita


superioara a domeniului de pH aplicat si apoi se aplica un gradient de pH descrescator prin
adaugarea de acid tamponului amfolit, un tampon special format dintr-un amestec de de
substante amfolite (electroliti amfoterici) cum sunt poliaminoacizii, care au diferite sarcini si
deci diferite puncte isoelectrice (fig…). Echilibrarea coloanei cu un astfel de tampon duce in
mod automat la formarea unui gradient interior de pH pe coloana de schimbator.

Fig…Formula generala a substantelor amfolite

Proteinele sunt eluate din coloana in ordinea valorii lor de pI. De exemplu pe un
schimbator anionic cand pH-ul este mai mic decat pI al proteinei, aceasta va migra si in acest
http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 47/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

proces pH-ul din jurul proteinei creste cu distanta fata de varful coloanei. Cand a parcurs o
distanta suficienta, incat pH-ul sa devina mai mare decat pI, proteina devine incarcata negativ
si se leaga de schimbator. Prin dezvoltarea gradientului tamponului de elutie, pH-ul va scadea
din nou sub valoarea pI si proteina se va desprinde alunecand in coloana pana cand pH-ul este
din nou mai mare de pI proteinei, ceea ce va duce la o noua legare a sa de schimbator.

In acest proces apare, datorita rezistentei opuse de faza stationara la schimbarea valorii
de pH prin tamponul de elutie, o legare repetitiva a proteinei de schimbator. Acest fenomen si
prezenta gradientului interior de pH permite separarea chiar a unor proteine cu aceiasi sarcina
electrica neta dar cu o distributie diferita a sarcinilor la exteriorul proteinei.

Factorii ce influenteaza separarile prin cromatofocusare sunt in principal: sarcinile


electrice de la suprafata proteinelor, natura fazei stationare, capacitatea de legare a proteinelor
la gruparile incarcate electric din structura fazei stationare , capacitatea de tamponare a fazei
mobile si formarea gradientului de pH.

Cromatofocusarea are o rezolutie foarte inalta putand separa proteine a caror pI difera
doar cu 0,02 unitati. Din cauza, insa, a costurilor ridicate aceasta tehnica se utilizeaza in
general la scara mica si in ultimele etape de purificare.

Electroforeza

Electroforeza reprezinta migrarea cu diferite viteze a bioprodusilor (proteine, acizi


nucleici,) sub influenta unui camp electric. Aceasta migrare are loc datorita incarcarii diferite,
dimensiunii, formei si a coeficientilor de difuzie a substantelor dizolvate.

Primele experimentari de electroforeza au fost raportate la inceputul secolului 19 (in


1809) de catre omul de stiinta rus Ruess care a observat migrarea unor particule de argila sub
influenta unui camp electric. A trebuit sa treaca mai mult de un secol (in 1933) pentru ca o
aplicatie concreta de electroforeza sa fie dezvoltata si sa fie brevetata de catre Harsanyi. Totusi
primele studii teoretice asupra fenomenului de electroforeza au fost efectuate abia in 1940 si
raportate in 1944 (Hamaker si Verwey).

Marea flexibilitate a tehnicii electroforetice a facut ca aceasta sa se dezvolte prin


utilizarea a diferite materiale ca mediu electroforetic (ceramici, metale, polimeri), numeroase
tehnici si posibilitatea de separare a numeroase categorii de compusi.

Aplicatiile electroforezei la nivel industrial datorita productivitatii ridicate, pretului scazut


si posibilitatea de automatizare, se realizeaza in special pentru acoperirea cu metale, vopsire
(in industria automobilelor, nichelare, ..), emailare si fabricarea de produse sanitare.

In ceea ce priveste insa caracterizarea, separarea, purificarea biomoleculelor, procesele


de electroforeza sunt utilizate, mai ales la nivel de laborator. Astfel separarea si purificarea
proteinelor, se realizeaza folosind mici cantitati de probe, iar proteinele se comporta in functie
de greutatea lor moleculara si a incarcarii electrice. Electroforeza permite de asemenea
masurarea greutatilor moleculare prin compararea cu proteine marker.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 48/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Mecanismele prin care au loc procesele electroforetice au fost studiate si explicate prin
numeroase teorii care se aplica in general sistemelor coloidale.

O problema majora care face ca aceasta metoda sa nu fie inca utilizata la nivel pilot sau
industrial este fenomenul de incalzire care apare ca urmare a trecerii curentului electric.
Cantitatea de caldura eliberata este proportionala cu patratul curentului. Daca se lucreaza cu
valori mici de curent, incalzirile sunt mici si separarile sunt foarte lente. Efectul acestor incalziri
se poate corela cu numarul lui Rayleigh :

Ra =

unde l este lungimea caracteristica, g este acceleratia datorata gravitatiei, μ este vascozitatea,
α este difuzia termica si ∆ρ/∆z este variatia densitatii per lungime determinata de incalzire.
Pentru a avea o electroforeza convenabila este necesar ca Ra sa aibe o valoare mica. In
laborator acest lucru se obtine prin efectuarea electroforezei in gel. Acesta are o vascozitate
ridicata si elimina curentii de convectie care determina incalzirea si cel mai

utilizat gel este cel de poliacrilamida (PAGE). Pentru ca proteinele sa migreze prin gel ele
trebuie intai sa fie denaturate si incarcate cu sarcini negative. Pentru gelurile PAGE proteinele
sunt tratate cu SDS (sodium dodecyl sulphate), un detergent anionic puternic denaturant.
Adaugarea SDS are rolul de a distruge stuctura tertiara prin ruperea legaturilor de hidrogen si
Van der Waals, astfel incit proteina devine o polipeptida liniara cu o incarcare negativa suficient
de mare atat prin sarcinile sale negative proprii cat si datorita legarii SDS de proteina. Numarul
de molecule de SDS care se leaga de proteina depinde numai de dimensiunea proteinei.

Un aparat de electroforeza este relativ simplu (fig…).

Probele proteice sunt amplasate in godeuri in varful gelului de poliacrilamida


(electroforeza verticala) care se afla prins intre doua placi de sticla ca un sandvici. Intr-unul
dintre godeuri se pune o proba marker sau martor. Gelul este apoi suspendat intr-un tampon
adecvat si se aplica la fiecare capat cate un electrod – sus catodul (―) si jos anodul (+).
Tensiunea care se aplica este de obicei de 200 V. Proteinele incarcate negativ vor migra prin gel
in functie de greutatea lor moleculara. Deoarece proteinele mai mari leaga mai mult SDS, deci
vor avea o incarcare negativa mult mai mare, ne asteptam sa migreze mai repede decat cele
mici, mai putin incarcate, dar de fapt nu este asa deoarece poliacrilamida functioneaza ca o
sita moleculara ce impiedica migrarea proteinelor mari, totusi sarcina foarte mare ajuta la o
migrare mai rapida decat daca moleculele ar avea o sarcina mai mica (fig…).

Dupa electroforeza, diferitele componente din proba pot fi separate prin decuparea
portiunilor corespunzatoare de gel si prelucrate mai departe.

Aceasta tehnica este insa dificila si scumpa pentru ridicarea la scara. Modalitatea de a
obtine o valoare Ra scazuta la nivel pilot sau industrial este utilizarea de membrane. Membrane
cu pori mici dau valori Ra mici. Totusi rezultatele obtinute pana acum in acest mod nu sunt
satisfacatoare. Pentru imbunatatirea rezultatelor se pare ca utilizarea curgerii in contracurent

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 49/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

fata de miscarea electroforetica ar putea rezolva problema dar deocamdata mai sunt necesare
studii de punere la punct a unor astfel de tehnologii.

Electroforeza capilara (CE) este o tehnica electroforetica care se realizeaza, nu pe


placi de electroforeza ci in tuburi capilare foarte inguste, in general cu diametru intern de 25
pana la 100 μm, umplute cu tampon. Instrumentatia pentru CE este extrem de simpla (fig…).

Capetele capilarului sunt plasate in rezervoare separate fiecare fiind conectat la un


furnizor de energie de voltaj inalt, capabil sa furnizeze pana la 30 kV.

Proba este introdusa in capilar prin inlocuirea temporara a unuia dintre rezervoarele cu
solutii tampon, de obicei cel al anodului, si aplicarea pentru cateva secunde a unui potential
electric sau a unei presiuni externe. Apoi se pune din nou rezervorul cu tampon, se aplica
potentialul electric dorit si se porneste separarea. In vecinatatea celuilalt electrod (normal
catodul) se afla un detector (UV-Vizibil sau fluorimetric) pentru evaluarea substantelor
separate direct prin peretele capilarului.

CE este usor de automatizat si in ultimii ani se acorda o atentie deosebita utilizarii


acestei tehnici pentru separarea si caracterizarea biomoleculelor.

Focusarea isoelectrica

Focusarea isoelectrica (IEF) se bazeaza nu pe viteza la care moleculele incarcate electric


se misca intr-un camp electric ci mai degraba pe pozitia lor de echilibru intr-un gradient de pH.
Gradientul de pH este realizat prin aplicarea unei diferente de potential pe un gel imbibat cu un
amestec de amfoliti. La aplicarea diferentei de potential moleculele tamponului se vor misca in
directiile potrivite pana cand sunt neutralizate de moleculele intalnite in timpul miscarii. In
acest fel moleculele de amfoliti se vor aranja ele insele in gel in asa fel incat vor determina o
crestere gradate a valorii de pH de la anod la catod.

O enzima aplicata in acest gel va migra pana in pozitia in care valoarea de pH este egala
cu pH-ul sau izoelectric (pI). Spre deosebire de electroforeza conventionala, in care proteinele
se misca in aceiasi directie pana cand este echilibrata sarcina electrica a proteinei cu campul
electric, in separarea prin foscusare isoelectrica proteinele se misca din orice pozitie din gelul
electrophoretic spre zona cu pI corespunzator. Astfel in aceasta tehnica pozitia de aplicare a
probei este arbitrara putand fii oriunde pe sistemul de separare (fig…).

Fig. …Focusarea izoelectrica. Proteinele se misca in gradientul de pH si sub influenta


campului electric spre punctul izoelectric corespunzator fiecareia.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 50/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Succesul focusarii izoelectrice este determinat in mare masura de realizarea unor


gradienti liniari de pH stabili. In acest sens este esentiala alegerea unor amfoliti
corespunzatori. Acestia au masele moleculare in jur de 300-1000 Da cu mai multe sarcini
electrice deci cu mai multe valori de pI apropiate si inalta conductivitate. Panta gradientului de
pH obtinut este dependenta de intervalul de pH acoperit de tamponul amfolit utilizat si de
distanta dintre electrozi. In cazurile in care gelul utilizat este format din poliacrilamida, cele
mai convenabile tipuri de tampoane sunt cele formate din acrilamida si derivatii ei. Structura
generala a acestora este CH2═CH-CO-NH-R unde R este fie o grupare carboxyl (-COOH) fie o
amina tertiara (exemplu –N(CH2CH3)2. Aceste tampoane se incorporeaza foarte usor in
matricea de poliacrilamida si acopera un larg domeniu de valori de pK. Cele mai utilizate sunt
cele care au pK la valori de pH de: 1; 3,6; 4,6; 6,2; 7,0; 8,5; 9,3; 10,3; si >12.

Rezolutia IEF este determinata de gradientul de pH si campul electric aplicat. Teoria


confirmata de experimentari, arata ca diferenta dintre valorile pI ale doua proteine adiacente
(ΔpI) este direct proportionala cu radacina patrata gradientului voltajului (tensiunea campului
electric masurata in volti): ΔpI = [(gradient de pH)/(gradient de voltaj)]1/2.

Prin aceasta metoda este posibil sa se separe enzime a caror pI sunt diferite doar prin
0,01 pH unitati deci cu o rezolutie superioara. De asemenea prin IEF procesul de separare are
loc intr-un timp mai scurt. Campurile electrice folosite se situeaza in general la valori de ordinal
100 v/cm. O limitare a acestui proces este tendinta de precipitare a proteinelor la valoarea de
pI. Pentru a se evita acest lucru se adauga in mediu detergenti nonionici sau uree.

Astfel focusarea izoelectrica poate fi considerata o valoroasa tehnica de purificare.


Metoda se utilizeaza mai ales la scara mica dar poate fi utilizata si la nivel pilot.

Cromatografia hidrofoba

In solutii apoase hidrocarburile hidrofobe, molecule nepolare, tind sa se asocieze intre


ele formand agregate care precipita. In cazul proteinelor caracterul hidrofob este determinat de
portiunile nepolare din molecule cum sunt de exemplu catenele laterale formate din aminoacizi
ca valina, leucina izoleucina, fenil-alanina si triptofanul. In mod obisnuit acesti aminoacizi se
orienteaza spre interiorul moleculei de proteina participand la plierea acestora.

Interactiile hidrofobe au o importanta majora in sistemele biologice. Ele sunt implicate


nu numai in procesele de pliere ale proteinelor globulare dar si in asocierea subunitatilor
proteice, in legarea unor molecule mici la proteine, in procesele de reglare si transport prin
membrane. Prezenta catenelor laterale hidrofobe permit proteinelor sa se lege de molecule
non-polare. Aceste proprietati sunt utilizate pentru separarea proteinelor prin cromatografie
hidrofoba (HIC = Hydrophobic Interaction Chromatography).

In aceasta tehnica
proteinele sunt adsorbite pe matrici in mod obisnuit in medii cu inalte tarii ionice in care
interactiile hidrofobice sunt puternice. Obtinerea fazelor stationare pentru HIC se realizeaza

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 51/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

prin legarea unor grupari hidrofobe cum sunt octil- sau fenil- pentru matrici puternic hidrofobe
de polimeri specifici, in timp ce pentru matricile mai slab hidrofobe se uilizeaza grupari eterice,
butil sau izopropil:.

Octil-: Matrice – (CH2)7 – CH3 Fenil-:Matrice –

Butil- : Matrice – (CH2)3 – CH3 Izopropil- : Matrice – CH(CH3)2

In procesul de cromatografie hidrofoba proteinele se ataseaza de ligandul hidrofob prin


mai multe puncte de contact procesul avand loc in mai multe etape. Limitarea vitezei legarii nu
este datorata coliziunii dintre proteina si gelul amfifilic ci datorita unei modificari
conformationale slabe in structura proteinei. Taria interactiilor dintre gelul HIC si proteina este
determinata nu numai de proportia nepolara dar si de distributia partii nepolare pe suprafata
proteinei. De asemenea un rol important in taria legaturilor hidrofobe este ocupat de natura si
concentratia sarurilor din mediu.

In procesele de cromatografie hidrofoba se aplica de la inceput un tamon cu o tarie


ionica puternica, cel mai adesea sulfat de amoniu. Sarurile din tampon reduc capacitatea de
solvare a proteinelor, zonele hidrofobe sunt puse in evidenta si se pot lega usor de faza
stationara hidrofoba. Desorbtia proteinei se realizeaza prin descresterea tariei ionice si daca
este necesar prin adaugarea unui solvent nepolar sau a unui detergent neionic care slabesc
interactiile hidrofobe dintre proteina si gel.

Cromatografia prin interactii hidrofobe este in general o metoda de purificare blanda,


sarurile utilizate avand efect stabilizant asupra proteinelor. In multe cazuri gradul de
recuparare a proteinelor este ridicat dar in cazul proteinelor labile interactiile hidrofobe pot
determina modificari la nivelul structurii acestora. Datorita proprietatilor sale HIC este cel mai
adesea utilizata in faze de purificare intermediare.

Cromatografia hidrofoba este adeseori inclusa in categoria tehnicilor de cromatografie


de afinitate deoarece principiul de functionare este similar. Diferenta este chiar utilizarea
interactiilor hidrofobe si nu liganzi specifici enzimelor de interes cum sunt substratul sau
inhibitorii competitivi.

4. Interactia specifica cu alte biomolecule prin situsuri specifice de


legare sau trasaturi structurale

Cromatografia de afinitate

Prima utilizare a unei tehnici cromatografice de afinitate dateaza din 1910 dar cea care a
devenit metoda moderna de azi a fost publicata pentru prima data in 1967 de catre Axen si
colaboratorii. Inceputul metodei instrumentale se situeaza in 1978 cand Ohlson a demonstrat
pentru prima oara posibilitatea utilizarii ca suport a unor microparticule rigide.

Cromatografia de afinitate acopera o larga varietate de metode de purificare a enzimelor.


Factorul comun al acestor metode este interactia, mai mult sau mai putin specifica, dintre

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 52/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

enzima si un ligand imobilizat.

Ligandul imobilizat este reprezentat de efectori biospecifici pentru izolarea si/sau


purificarea de molecule complementare printr-un proces inalt selectiv de adsorbtie si desorbtie.
Acestia sunt in mod obisnuit substratul sau inhibitorul competitiv al enzimei de interes.

Efectorul numit si ligand este


legat covalent prin intermediul unui distantier (spacer = leaga ligandul de matrice) de un
suport, matrice, care reprezinta faza stationara a coloanei cromatografice.

Liganzii se pot imparti in doua mari categorii: specifici care leaga doar o specie (de
exemplu anticorp/antigen) si generali care leaga un grup specific de molecule. In acord cu
aceasta, o sistematizare dupa tipurile de liganzi este prezentata in tabelul…

Tabel…

Liganzi specifici pentru diferite categorii de biomolecule

Molecule Liganzi

Enzime Substrat, inhibitor, cofactor

Anticorpi Antigen, virus, celula

Lectina Polizaharid, glicoproteina, receptor celular

Acizi nucleici Secventa de baza complementara, histona, acid nucleic, polimeraza,


proteina legata

Hormoni Receptor, proteina transportoare

Cand intr-o coloana de cromatografie de afinitate se introduce un amestec


multicomponent, de ligandul imobilizat se va lega numai molecula complementara. De exemplu
daca ligandul este substratul sau inhibitorul unei enzime de interes, numai acea enzima se va
lega de acesta, celelalte substante fiind indepartate prin procesul de elutie. Compusul de
interes legat se poate recupera prin schimbarea conditiilor de elutie astfel incat legaturile
formate sunt desfacute si bioprodusul eluat. Eluarea compusului de interes se poate realiza in
general prin:

Ø Elutia cu un compus catre care substanta ce se purifica are o afinitate mai mare
decat fata de ligand;

Ø Cu o solutie cu o inalta tarie ionica;

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 53/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Ø Prin schimbarea valorii de pH;

Ø Prin schimbarea temperaturii.

Astfel aceasta metoda este utilizata in special pentru obtinerea unor compusi de inalta
puritate. Este utilizata in completare cu alte metode cand in mod special se doreste sa se
separe proteine care au aceiasi specificitate dar incarcare electrica net diferita sau greutati
moleculare diferite.

Principul general al cromatografiei de afinitate este prezentat in figura… Solutia bruta de


proteine este trecuta printr-o coloana ce contine un suport care are atasate, prin legaturi
covalente, molecule ligand specifice pentru proteina de interes. Proteinele care recunosc
ligandul se leaga de acesta, iar celelelte sunt eluate. Cand toate proteinele nelegate sunt
eluate, proteina legata poate fi eluata de exemplu prin adaugarea unei solutii ce contine ligand
liber. Acesta va intra in competitie cu substratul de care este legata proteina si o va elibera.

Aceasta metoda este utilizata nu numai la separarea unor enzime apropiate ca masa
moleculara si activitate dar si pentru purificarea unor antibiotice, vitamine, celule specifice etc.

O forma a cromatografiei de afinitate, larg utilizata astazi, este cromatografia de


imunoafinitate. In aceasta metoda antigenele sau anticorpii sunt imobilitzati pe un suport solid
pentru purificarea de anticorpi respectiv antigene. Acest tip de cromatografie de afinitate insa
este foarte scumpa si nu poate fi folosita pe scara mare. In plus adesea performantele nu sunt
foarte bune datorita efectelor de legare non-specifice. Totusi cromatografia de imunoafinitate
este la baza a numeroase teste medicale cum sunt de exemplu testele de glicemie sau
detectarea alergenilor in mediu sau alimente.

Elutia de afinitate

Elutia de afinitate este o metoda complementara a cromatografiei de afinitate. In


aceasta tehnica enzima de interes este adsorbita pe o coloana schimbatoare de ioni si apoi este
eluata specific cu ajutorul unui substrat adecvat. Avantajul acestei metode fata de
cromatografia de afinitate este in principal din punct de vedere practic si anume:

? Nu este necesara faza complexa de legare a ligandului potrivit la matrice, si

? Coloanele de mare capacitate sunt mult mai accesibile deoarece schimbatorii de


ioni sunt mult mai ieftini comparativ cu matricele de afinitate.

Prima data elutia de afinitate a fost utilizata in 1960 pentru purificarea fructoz-
bisfosfatazei din ficat de iepure si a fost apoi larg dezvoltata pentru separarea tuturor
enzimelor implicate in calea glicolitica intr-o singura schema de separare cu multiple operatii.
Un proces similar a fost dezvoltat pentru purificarea enzimelor din ciclul acizilor tricarboxilici
din inima de vita.

Cromatografia cu liganzi colorati

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 54/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

In anii 1970 s-a observat ca un colorant Cibacron-Blue F3G-A, utilizat in special pentru
calibrare in procesele de gel-filtrare poate lega un numar de enzime in special kinaze si
dehidrogenaze. Aceste enzime au o trasatura comuna si anume o trasatura structurala
comuna, cunoscuta ca domeniul de legare a nucleotidelor. Desi, inca nu se stie foarte clar baza
moleculara a acestei specificitati aparente acest tip de interactie s-a dovedit utila pentru
purificarea proteinelor. Acest colorant poate fi usor cuplat la o matrice de agaroza, prin
intermediul unei grupari clorura de triazil, si proteinele pot fi eluate printr-un substrat sau
ligand potrivit, sau chiar prin cresterea tariei ionice.

In prezent numarul de coloranti utilizati in acest scop, majoritatea fiind coloranti


triazinici, a crescut si este important de notat ca acesti coloranti actioneaza in anumite conditii
ca si schimbatori cationici. Pentru minimalizarea acestor efecte se recomanda ca operatiile sa
se realizeze la o tarie ionica mai mare sau egala cu 0,1 (³0,1)si la pH³7.

Imunnoadsorbtia

Specificitatea inalta a interactiilor anticorp/antigen ofera in anumite conditii o modalitate


potrivita pentru purificarea proteinelor. Daca o cantitate mica (circa 0,1 mg) de enzima pura
dintr-o specie este disponibila, aceasta poate fi utilizata pentru dezvoltarea de anticorpi intr-o
alta specie, de obicei iepuri, capre sau soareci. Vor fi produsi diferiti anticorpi deoarece acestia
recunosc diferite trassaturi structurale ale proteinei numite epitopi. Anticorpii produsi, dupa
purificare, se pot lega de o matrice si apoi sistemul este utilizat pentru separarea enzimei
antigen dintr-un amestec complex. Desorbtia se poate realiza prin schimbarea pH-ului,
cresterea tariei ionice sau alte tratamente care slabesc legatura anticorp-antigen. Aceasta
etapa poate fi cea mai dificila parte a intregului proces deoarece activitatea enzimei poate fi
distrusa datorita conditiilor dure utilizate in majoritatea cazurilor in procesul de desorbtie.

Utilizarea anticorpilor monoclonali in aceste purificari a permis rezolvarea unor probleme


insurmontabile anterior. Problema este, ca obtinerea anticorpilor monoclonali este inca destul
de scumpa si de aceea majoritatea proceselor utilizeaza anticorpi policlonali, care pot da uneori
raspunsuri mai mult sau mai putin eronate datorita fenomenelor de reactie incrucisata (cross-
reaction) cu enzime care au epitopi similari. De exemplu la purificarea alergenilor din arahide,
in prezenta unor urme de soia, se vor obtine cantitati mai mari de proteine datorita interventiei
celor apartinand soiei.

Cromatografia covalenta

Cromatografia covalenta utilizeaza interactiile dintre grupe functionale specifice. Metoda se


aplica in special pentru purificarea proteinelor si peptidelor care contin resturi de cisteina si/sau
metionina. Gruparile tiol, unele dintre cele mai reactive grupari din proteine, pot participa la un numar
mare de reactii. Procesul redox prin care gruparile tiol trec reversibil in grupari disulfidice sta la baza
purificarii proteinelor prin reactii covalente. Interactiile dintre compusii de separat si faza stationara
sunt de tip covalent.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 55/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Un material cromatografic utilizat frecvent in aceasta metoda este Tiol-Sepharose 4B care are
atasat la matricea de agaroza grupari de tip tiopiridil prin intermediul glutationului in calitate de
grupare de distantare:

Resturile de cisteina din proteina reactioneaza, in prima etapa, cu gruparea tiopiridil formand o
disulfura mixta. In etapa a doua, la tamponul de elutie se adauga un agent tiolic in stare redusa ca de
exemplu 2-mercaptoetanolul sau ditioeritriolul :

HS-CH2-CH2-OH HSCH2-HCOH-HCOH-CH2SH

2 – mercaptoetanol 1,4-ditioeritritol (DTE)

Aceasta metoda a fost utilizata in special pentru purificarea papainei si ureazei (fig….).

Evaluarea proceselor de separare

Bioprodusii obtinuti cu ajutorul unui agent biologic, microorganisme, celule animale,


plante, celule vegetale, organe animale, enzime etc. sunt supusi unor procese de izolare,
purificare si concentrare specifice fiecarui bioprodus in parte. Alegerea etapelor individuale de
prelucrare a produsului brut, pentru obtinerea preparatului final dorit, este guvernata atat de
proprietatile produsului de interes dar si de proprietatile compusilor existenti in mediul de
cultura, compusi care acompaniaza produsul de interes si care in cele mai multe cazuri trebuie
indepartati. Pentru evaluarea unui proces complex de separare, purificare sau/si concentrare,
principalii parametri utilizati, pentru fiecare nivel de productie (micropilot, pilot, industrial la
diferite niveluri) al etapei, sunt :

Productia etapei:

Productia unei etape se exprima in cantitati (de exemplu g sau kg) sau unitati (de
exemplu unitati de activitate) obtinute in functie de conditiile de lucru si documentele care
permit sa se concluzioneze asupra procesului si echipamentului utilizat.

Cuantificarea productiei se exprima prin valori procentuale conform ecuatiei:

P%= • 100

Proces = purificare, separare, extractie, cncentrare, etc.

Prin calcularea productiei se realizeaza si evaluarea pierderilor de bioprodus in timpul


etapei respective.

Puritatea bioprodusului de interes dupa purificare, imbogatire sau concentrare se


calculeaza prin ecuatii de forma :

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 56/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

; ; etc.

Factorul de imbogatire este definit, dupa determinarea puritatii bioprodusului,


conform relatiei:

In mod obisnuit, evaluarea factorului de imbogatire si a productiei procentuale pentru


o etapa de prelucrare permit stabilirea eficientei tehnologiei utilizate in etapa respectiva.
Produsul dintre factorul de imbogatire si productia procentuala pentru o etapa reprezinta
eficienta etapei respective.

Parametrii tehnici si stiintifici nu sunt suficienti pentru evaluarea unei etape, este
nevoie sa se ia in considerare si aspectele economice implicate, in special costurile de
manopera, de realizare a bioprodusului. In acest sens este necesar ca pentru pretul de
productie a unui bioprodus sa fie luate in calcul: costurile materialelor brute si auxiliare,
costurile de personal, costurile de energie, costurile de reparatii, deprecierile, pierderile,
costurile pentru tratamentul deseurilor si cheltuieli de regie. Toate aceste costuri trebuie
adunate si raportate la valoarea de productie a etapei. Astfel preturile de productie pot fi
calculate, integrand parametrii tehnici si economici ai unei etape, prin relatii de forma:

sau

Evaluarea intregului proces de prelucrare si conditionare a unui bioprodus se obtine din


evaluarile etapelor individuale. Astfel productia procentuala totala se obtine prin multiplicarea
productiilor procentuale per etape, iar pretul total de cost al bioprodusului final se afla prin
insumarea tuturor tipurilor de costuri si raportarea sumei la productia totala.

Evaluarea tehnica si economica a unui proces pe etape permite nu numai optimizarea


procesului dar si o adaptare imediata prin interventie adecvata in etapele de prelucrare
corespunzatoare.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 57/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Start Download - View PDF


Merge & Convert Files into PDFs w/ EasyPDFCombine
- Free!

Learn more
Anunț EasyPDFCombine

Modalitati de verificare a puritatii preparatelor proteice

Puritatea preparatelor proteice poate fi verificata cu ajutorul unor teste specifice. Unele
dintre metodele de purificare pot fi utilizate la scara analitica pentru a verifica daca un preparat
proteic este omogen. Testele analitice pot fi utilizate pentru a demonstra prezenta unei
impuritati, fara a dovedi absenta acestora. Cateva dintre testele de puritate cele mai utilizate
sunt: ultracentrifugarea, electroforeza si focusarea izoelectrica, analiza aminoacizilor de la
extremitatea N-terminala, curbele de solubilitate si cristalizarea.

Ultracentrifugarea

Proba de proteina este introdusa in eprubetele unei ultracentrifugi, eprubete gradate


care sunt prevazute cu un sistem optic care urmareste variatia indicelui de refractie din timp in
timp. In cazul proteinelor pure curbele de variatie a indicelui de refractie pe parcursul
ultracentrifugarii prezinta un singur pic. Curbe de sedimentare cu mai multe picuri apar in cazul
proteinelor impure. Ultracentrifugarea nu este un criteriu satisfacator de puritate in detectarea
unor cantitati mici de proteine, de impuritati sub 5%. Testul nu reprezinta un criteriu absolut
de puritate deoarece intr-un pic pot sedimenta doua sau mai multe proteine care au mase
moleculare foarte apropiate. De asemenea ultracentrifugarea nu poate fi utilizata in aprecierea
puritatii enzimelor care sufera fenomene de asociere-disociere. Astfel o enzima care sufera
acest gen de fenomene de agregare are cele doua forme in echilibru conform reactiei:

nA D An

Molecula stabila de enzima poate fi un monomer, dimer, trimer etc,(A), iar procesul de
agregare va duce, in functie de marimea proteinei, la forme agregate foarte mari.

Un exemplu in acest sens este glutamat dehidrogenaza din ficat bovin. Enzima este alcatuita
din sase catene polipeptidice, cu masa moleculara a hexamerului de 336000 Da. Agregatul pe
care il formeaza va avea masa moleculara mai mare ca 2x106.

Deplasarea echilibrului sistemului depinde de concentratia enzimei, agregarea fiind


favorizata la concentratii mari ale acesteia. La orice concentratie de enzima, coexista cele doua

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 58/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

specii ale enzimei, astfel incat la ultracentrifugare se obtin doua maxime corespunzatoare celor
doua forme cu mase moleculare diferite.

Electroforeza

Electroforeza nativa poate fi utilizata pe tot parcursul procedeelor de purificare pentru


a se urmari indepartarea proteinelor contaminante. Pentru evaluarea puritatii unei proteine
metoda trebuie aplicata la diferite valori de pH. Obtinerea cate unei singure benzi proteice la
un pH acid si la unul bazic este un indiciu pentru omogenitatea proteinei.

Electroforeza in conditii denaturante (SDS-PAGE) este o metoda eficienta in decelarea


impuritatilor care difera putin, din punct de vedere al masei moleculare de proteina purificata.

Metoda este foarte utilizata in determinarea gradului de proteoliza a preparatelor


purificate. Rezultate neconcludente apar in cazul proteinelor alcatuite din subunitati diferite,
care conduc la obtinerea mai multor benzi.

Focusarea izoelectrica este o metoda mai sensibila de decelare a impuritatilor decat


electroforeza.

Analiza aminoacizilor de la extremitatea N-terminala

Analiza naturii resturilor de aminoacizi de la extremitatea N-terminala poate fi de


asemenea utilizata ca test de puritate. Rezultate neconcludente se obtin in cazul enzimelor
alcatuite din mai multe subunitati diferite, caz in care se obtin mai multe benzi.

Curbele de solubilitate

In astfel de teste, cantitati diferite de proteina purificata se dizolva in acelasi volum


mic de solvent si dupa centrifugare se determina concentratia proteica din supernatante.
Curbele de solubilitate se obtin prin reprezetarea concentratiei de proteina determinata
experimental in functie de cantitatea de proteina solida care a fost adaugata in fiecare proba.
Alura curbelor de solubilitate pentru preparatele pure difera de cea a preparatelor impure. In
cazul proteinelor pure, curba de solubilitate se aplatizeaza atunci cand se atinge maximul de
solubilitate al proteinei in solvent (fig..).

Punctele de inflexiune care apar pentru proteine impure reflecta solubilitatile diferite ale
componentelor din amestec.

Pentru siguranta rezultatelor se recomanda realizarea curbelor cu solubilitate in diferiti


solventi. Sunt foarte rare cazurile in care doua proteine au aceiasi solubilitate in acelasi
solvent, si foarte putin probabil ca doua proteine sa aiba solubilitati identice in doi solventi
diferiti.

Contaminarea preparatelor proteice cu diferite impuritati poate fi demonstrata si prin


teste functionale prin care pot fi decelate cantitati mici de substante contaminante in cazul in
care acestea au proprietati biologice specifice.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 59/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Cristalizarea.

Cristalizare proteinelor a fost considerata multa vreme ca fiind un criteriu absolut de


puritate. In prezent, cristalizarea nu mai este considerata un criteriu absolut de puritate pentru
ca in multe cazuri cristalele formate s-au dovedit ca apartineau mai multor proteine unele fiind
proteinele contaminante. Pe de alta parte, exista tehnici de purificare, cum ar fi cele bazate pe
afinitate sau imunoadsorbtie, care conduc la obtinerea de proteine pure, fara ca acestea sa se
obtina in stare cristalina.

Cand preparatele enzimatice au atins un anumit grad de puritate exista posibilitatea


cristalizarii lor. Forma cristalelor pentru o anumita enzima depinde de sursa de izolare, de
procedeul de purificare, de agentul folosit pentru cristalizare si de pH-ul folosit pentru
realizarea cristalizarii. Aparitia unor cristale in solutia proteica nu este un indiciu al cristalizarii
enzimei de interes. Daca, prin recristalizari repetate, activitatea enzimatica ramane constanta,
inseamna ca enzima de interes a cristalizat si e pura. Daca insa se inregistreaza o scadere a
activitatii enzimatice cristalele obtinute apartin si unor proteine contaminante.

Cel mai utilizat agent de cristalizare a enzimelor este sulfatul de amoniu care se poate
utiliza in stare solida sau ca solutie saturata. Cristalizarea enzimelor este un procedeu lent,
care se realizeaza in perioade mari de timp, sub agitare lenta, la o temperatura de 40C.
Formarea si cresterea cristalelor este urmarita la microscop.

Alti agenti de cristalizare sunt solventii organici, caz in care cristalizarea trebuie realizata
la temperaturi sub 00C, pentru a se minimaliza efectul denaturant al acestora si procesul de
evaporare.

Nici una dintre metodele prezentate nu reprezinta un criteriu absolut de puritate. De aceea se
recomanda utilizarea a cel putin doua metode pentru a se putea trage concluzii referitoare la
puritatea unui preparat proteic.

Imobilizarea enzimelor

Izolarea si purificarea enzimelor, in particular a celor intracelulare, este relativ destul de scumpa. De
aceea s-a cautat ca pierderea lor prin utilizarea in procese batch sa fie inlocuita prin identificarea
posibilitatilor pentru utilizarea lor repetata sau chiar in sistem continuu. Realizarea acestor cerinte se poate
efectua prin „imobilizarea enzimelor”. Retinerea enzimelor intr-o faza insolubila a determinat realizarea a
numeroase cercetari deoarece prin apropierea starii de existenta a enzimelor cu cea din celule permite o mai
buna cunoastere a comportarii lor reale „in vivo”. Astazi se stie ca cele mai multe dintre enzime in stare
naturala, „in vivo”, nu se afla in stare libera ci legate la nivelul membranelor celulare sau a organitelor din
celule. De asemenea in sol, enzimele eliberate de catre microorganisme actioneaza legate de compusii
argilosi sau humici. Astfel daca din punct de vedere biochimic putem caracteriza si intelege functionarea
enzimelor in solutie nu inseamna ca vom sti in mod clar si comportamentul lor in situ.

Din punct de vedere practic, imobilizarea enzimelor ofera o serie de posibilitati. Astfel dezvoltarea
realizarii de enzime imobilizate a condus si la realizarea de tehnici de imobilizare a celulelor si/sau

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 60/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

microorganismelor, realizari deosebit de importante pentru biotehnologie deoarece acestea au aplicatii


diverse. Cateva aplicatii principale ale tehnicilor de imobilizare sunt:

F Enzime imobilizate: izomerizarea glucozei, producerea de acid 6-aminopenicilanic, hidroliza


lactozei, sinteza unor aminoacizi (lizina, alanina), separarea formelor D si L ale aminoacizilor,
hidroliza proteinelor si poliglucidelor, producerea de acrilamida, analiza unor
componenti/contaminanti ca de exemplu alergenii;

F Microorganisme imobilizate: tratamentul apelor si efluentilor (filtre bacteriene, denitrificare,


metanizare), sinteza de aminoacizi (acid aspartic, alanina, fenilalanina, triptofan), producerea de
etanol, sinteza hidroxifenilglicina, izomerizarea glucozei;

F Celule animale imobilizate: producerea de vaccinuri, producerea de anticorpi monoclonali,


producerea de hormoni.

In ultimele decenii au fost puse la punct o serie de metode de imobilizare.

Prin imobilizarea enzimei se intelege limitarea gradului de „libertate” al moleculei proteice


datorita legarii sale de un suport prin intermediul altor functii decat cele care fac parte din situsul
activ al enzimei.

Enzimele imobilizate prezinta o serie de avantaje care permit utilizarea lor in biotehnologiile actuale:
separarea usoara din amestecul de reactie, reciclarea catalizatorului, stabilitatea lui, conducerea in sistem
continuu a unui proces, reglarea vitezei de reactie, modificarea controlata a proprietatilor si chiar a
specificitatii enzimelor, obtinerea unui bioprodus de puritate avansata, posibilitatea de studiu a aspectelor
fundamentale a enzimologiei si biologiei moleculare.

Desi exista si o serie de dezavantaje (sterilizarea reactoarelor, limitari difuzionale, modificarea


proprietatilor enzimatice, colmatarea de suporturi si reactoare), avantajele le compenseaza si determina
utilizarea lor la nivel industrial.

Principalele cai de imobilizare sunt de includere sau de legare a enzimelor in diferite suporturi
insolubile sau care devin insolubile dupa ce se combina cu enzima. Aceste cai pot fi de: adsorbtie,
incluziune si legare covalenta.

Indiferent de modul prin care se realizeaza imobilizarea trebuie sa se asigure conditii in care
stabilitatea conformatiei native a enzimei (temperaturi scazute, pH optim de actiune etc.) sa fie mentinuta si
suportul trebuie sa: nu denatureze enzima, sa fie el insusi rezistent la modificarile de pH sau temperatura si
sa posede proprietati hidrofile.

Pana acum nu exista inca procedee si conditii standard care sa poata fi aplicate tuturor enzimelor
tocmai datorita caracterului personal al fiecareia, astfel incat modul in care trebuie sa se realizeze
imobilizarea pentru o enzima data se stabileste in mare masura empiric.

1. Adsorbtia este un procedeu de legare reversibila a enzimei pe un suport insolubil, realizandu-


se conform principiilor cromatografiei de acest tip. Enzimele pot fi adsorbite ca rezultat al interactiilor, de tip
http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 61/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

secundar, fizice si ionice, intre grupari functionale ale enzimelor si ale suportului.

In acest caz este vorba de un fenomen de repartitie a moleculelor de enzime intre faza solida si cea
lichida, un fenomen care se afla si la baza fractionarii enzimelor prin cromatografie de repartitie.

Metoda de imobilizare a proteinelor prin adsorbtie este prima metoda utilizata in acest scop de catre
Nelson si Griffin, in 1916, care au adsorbit invertaza pe carbune activ si gel de hidroxid de aluminiu. Acest
model de adsorbtie este utilizat mai ales in studii de laborator ca model al functionarii biocatalizatorilor din
sol.

Tipuri de interactii in procesul de adsorbtie.

Interactiile enzima – suport implica, intr-un mod mai mult sau mai putin complex legaturi cu nivel
energetic scazut. Aceste interactii pot fi :

Ø Interactii Van der Waals care sunt interactii electrostatice intre atomi sau molecule, datorita
densitatilor electronice diferite de pe orbitali. Energia unei legaturi de acest tip este de 1 - 2 kcal/mol. Ea
creste cu marimea atomului/moleculei si cu temperatura.

Ø Interactiile hidrofobe sunt un caz particular al interactiilor Van der Waals, in care forta de legare este
crescuta datorita rupturii localizate la structura suport/apa, si care este acompaniata de o diminuare a
entropiei sistemului.

Ø Legatura de hidrogen rezulta din polarizarea legaturilor stabilite intre atomul de hidrogen si un atom
electronegativ. Energia acestui tip de legatura poate varia de la 0,5 la 15 kcal/mol.

Ø Legaturi ionice. Resturile de aminoacizi sunt, bazice sau acide, si sunt ionizate, negativ sau pozitiv,
de obicei in jurul valorii de pH = 7. Acest fapt face posibila schimbarea incarcarii ionice. Aceste interactii sunt
foarte sensibile in functie de valorile de pH si de forta ionica si se bazeaza pe caracterul polielectrolitic si
amfoter al proteinelor.

Ø Transferul de sarcini se refera la interactiile care au loc intre substantele nucleofile si electrofile si
care au loc prin transferul mai mult sau mai putin marcat de dubleti de electroni sau aparitia unor forme
rezonante.

Ø Schimb de liganzi cind are loc substituirea la nivelul moleculei adsorbite a unuia sau a mai multor
molecule de liganzi ai adsorbantului (apa in particular).

Ø Chemisorbtie. Este vorba de formarea unei legaturi chimice adsorbant – adsorbat.

Parametrii principali.

Principalii parametrii care influenteaza eficacitatea imobilizarii sunt :

Ø Concentratia enzimei. Masa de enzima adsorbita pe o cantitate determinata de suport creste cu


concentratia enzimei pana cand adsorbantul devine saturat. Aceasta operatie se efectueaza in general la

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 62/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

temperatura constanta, astfel incat se obtin curbe izoterme de adsorbtie ce pot fi descrise cel mai adesea de
ecuatiile lui Freundlich si Langmuir:

Izoterma lui Freundlich : m = k1C

Izoterma lui Langmuir : m=

unde m = masa de enzima adsorbita, C = concentratia de enzima la echilibru, iar k1 si k2 sunt constante.

Ø Timpul de contact depinde de viteza de adsorbtie care este functie de caracteristicile fizico-chimice
ale adsorbantului si enzimei. Ea depinde de marimea particulelor de suport si creste cu cat acestea sunt mai
mici, suprafata de adsorbtie fiind in acest caz mult mai mare pentru aceiasi masa de suport.

Ø pH-ul intervine cu atat mai evident cu cat preponderenta interactiilor ionice este mai mare in
fenomenul de adsorbtie. Zona de pH utilizata este impusa de natura enzimei si de sarcinile electrice,
eventual existente pe suport. In plus, se observa in general ca adsorbtia este maxima in vecinatatea
punctului izoelectric al enzimei fapt ce este explicabil datorita scaderii repulsiei dintre molecule, la aceste
valori sarcina lor fiind aproape nula.

Ø Compozitia mediului. Adsorbtia fiind un fenomen de partitie intre faza solida si cea lichida, adaugarea
de compusi care sa diminueze solubilitatea enzimei in faza apoasa va favoriza adsorbtia. Apar in acest caz
fenomene intalnite la purificarea proteinelor prin precipitari fractionate. Astfel adaugarea de solventi miscibili
cu apa (alcool, acetona) sau de concentratii ridicate de saruri (fenomenul de „salting out” ) au efecte pozitive
in procesul de adsorbtie. In sens contrar concentratii scazute de saruri favorizeaza fenomenul de desorbtie
(„salting in”).

Ø Temperatura, pe langa efectul sau pozitiv asupra vitezei de adsorbtie, ca urmare a cresterii difuziei,
ea va determina o crestere a adsorbtiei prin efectul sau de depliere partiala a structurii tertiare a moleculei
enzimatice. Aceasta schimbare favorizeaza efectul de stabilire a interactiilor enzima-suport.

Principalele tipuri de suporti.

Ca suporti adsorbanti de enzime, poate fi utilizat un numar foarte mare de compusi. Ei pot fi suporti
minerali sau organici.

i. Suporti minerali.

v Argile: alumino-silicatii de tip bentonita a caror forma de foite permit adsorbtia


interlamelara a enzimelor. Schimbarea in reteaua cristalina a ionilor de Al3+ cu cationi divalenti (Mn2+,
Mg2+,..) determina incarcarea negativa a adsorbantului fapt ce permite o interactie ionica intre foliile de
adosrbant si enzime. Capacitatea de adsorbtie a argilelor este foarte mare dar utilizarea lor este limitata de
starea lor de neuniformitate.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 63/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

v Sticla poroasa, silice poroasa: ofera capacitatea unei bune retentii aliata cu excelente
proprietati mecanice. De asemenea este posibila optimizarea porozitatii in raport cu marimea proteinei. S-a
aratat ca diametrul optim al porilor este aproximativ egal cu dublul lungimii celei mai mari axe a moleculei de
enzima. Sticlele poroase sunt diponibile cu suprafete de adsorbtie de la 0,2 m2/g la 450 m2/g, ceea ce
corespunde la diametre de pori variind de la 5000 nm la 7 nm.

Interactia enzima/sticla poroasa se efectueaza prin legaturi ionice intre sarcinile negative ale
gruparilor silanol (Si – OH) disociate ( fapt ce determina caracterul acid al acestui tip de suprafata) si
sarcinile pozitive ale proteinei. De asemenea sunt posibile legaturi prin punti de hidrogen cu gruparile silanol
nedisociate cum se arata in figura:

Alte materiale cum sunt materiale ceramice, hidroxilapatita, oxizi si hidroxizi ai metalelor, cuartul, etc.,
sunt de asemenea utilizate ca adsorbati pentru enzime.

ii. Suporti organici

v Schimbatorii de ioni utilizati pentru purificarea de enzime pot fi folositi si pentru


imobilizarea acestora. In scopul imobilizarii se folosesc atat schimbatori anionici (DEAE-celuloza, Dowex-2,
Amberlite IRA 93, Amberlite IRA 900), cat si schimbatori cationici (CM-celuloza, fosfo-celuloza, citrat-
celuloza, Dowex-50 Amberlite IRC 50). Alegerea suportului este functie de pH-ul la care se efectueaza
reactia si de punctul izoelectric al enzimei. Pentru evitarea denaturarii enzimei se prefera suporturi cu grupari
schimbatoare slabe. Cele tari pot determina valori de pH extrem in micro-mediul din jurul gruparilor
functionale. Acest tip de suporturi se gasesc disponibile pe piata in mari cantitati ceea ce face posibila
ridicare la scara a metodei.

v Colagenul. Proprietatile adsorbante ale acestei proteine au permis punerea la punct a


diferite metode de imobilizare prin adsorbtie pe colagen de enzime.

v Alti suporti pot fi celuloza, amidonul , taninurile, poliuretanul etc.

iii. Imobilizarea prin punti metalice se poate aplica atat suportilor anorganici cat si organici. In
aceste metode suportilor utilizati (argile sau organici cum este celuloza) li se adauga pentru activare unele
saruri metalice care vor stabili cu enzima punti metalice sau chelati. Sarurile metalice utilizate pot fi TiCl4,
TiCl3, SnCl4, SnCl2, ZrCl4, VCl3, FeCl2, si FeCl3. Suportul solid este mentinu timp de 5 – 10 minute in solutia

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 64/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

sarii metalice si apoi uscat la 450C. Sarea care nu a reactionat este eliminata prin spalare. Enzima este apoi
imobilizata prin simpla punere in contact cu suportul astfel activat.

Simplitatea acestei metode si varietatea de suporturi utilizabile permit usoara sa extrapolare. O


problema de care trebuie insa sa se tina cont este aciditatea puternica a solutiilor de cloruri, in special a celei
de titan, care pot provoca degradarea suportilor si a enzimei.

Avantaje si dezavantaje

Avantaje

a) Este extrem de usor de aplicat fiind suficient a se pune enzima in contact cu suportul. Nu are loc nici
o reactie chimica, cu exceptia legaturilor prin punti metalice

b) Este posibila regenerarea complexelor enzime – suporturi. Daca enzima isi pierde activitatea in
timpul functionarii, este posibil sa fie desorbite si inlocuite printr-un preparat activ. Astfel, desi pretul
suportului este neglijabil comparativ cu al enzimei, el poate fi redus mai departe prin posibilitatea de
reutilizare a sa. Un acelasi suport poate fi utilizat in practica chiar mai mult de 5 ani.

Dezavantaje

a) fenomenele de partitie fiind prin excelenta reversibile riscul aparitiei procesului de desorbtie poate
oricand apare si este foarte variabil in functie de afinitatea enzimei fata de suport. Astfel in unele
cazuri doar adaugarea de suport poate determina desorbtia in timp ce in altele chiar spalarea
repetata cu solutii acide nu solubilizeaza proteina.

b) Afinitatea unei enzime pentru un suport dat, depinde de repartitia grupelor functionale pe suprafata sa
si deci de structura sa tridimensionala, fiind dificil de stabilit a priori eficacitatea unei adsorbtii. Acest
lucru se realizeaza doar prin experimentari repetate si sistematice.

c) Enzima fiind imobilizata prin legatura directa pe suprafata unui suport, accesibilitatea la situsul activ
poate fi dificila in conformitate cu orientarea moleculei de enzima. Problemele sterice pot deveni
preponderente atunci cand este vorba de substraturi cu molecula mare.

d) Capacitatea de adsorbtie este direct determinata de suprafata disponibila, adsorbantii prezentandu-


se adesea sub forme extrem de variate. Acest lucru poate ridica probleme daca se doreste realizarea
unui reactor continuu (pierderi de incarcatura, colmataj etc.).

Prin acest procedeu s-a aplicat la scara industriala adsorbtia acilazei, pe DEAE-Sephadex si a fost
utilizata pentru separarea amestecului racemic DL de metionina de catre firma Tanabe Seiyaku, Japonia.
Procedeul a condus la un castig economic de 40% in raport cu utilizarea enzimei libere.

2 Incluziunea consta in includerea mecanica, de obicei ireversibila, a moleculelor de enzima intr-


o matrice insolubila. Modalitatile prin care este inclusa enzima intr-un suport insolubil pot fi grupate in doua
categorii principale : includerea in reteaua tridimensionala a suportului sau delimitarea, printr-o membrana

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 65/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

semipermeabila, enzimei in interiorul unui volum. Prima categorie este cunoscuta ca polimerizarea enzimei,
iar cea de-a doua incapsularea enzimei.

2.1 Imobilizarea prin polimerizare.

In aceasta metoda preparatul enzimatic este dispersat in solutia de monomeri pentru a forma un
amestec omogen (solutie sau emulsie). Polimerizarea monomerilor conduce la formarea unor retele in
interiorul carora este prinsa enzima.

Prin procese de polimerizare si/sau copolimerizare se pot obtine produsi cu forme geometrice diferite a
purtatorului: granule mici de genul unor bile poroase, tuburi, fibre, filtre poroase, membrane semipermeabile
etc. ( fig.).

Polimerizarea moleculelor de enzima, in prezenta unui agent corespunzator, permite obtinerea unui
produs cu masa moleculara mare si solubilitate mica. De exemplu Sumner a obtinut ureaza insolubilizata
prin adaugarea unor cantitati mici de NaCl la o solutie de enzima in alcool 30% si mentinerea amestecului la
00C timp de 1 – 2 zile. S-a aratat ca preparatul rezultat contine un numar de punti disulfurice intermoleculare.

Una dintre cele mai cunoscute metode de obtinere a unei enzime incluse prin polimerizare intr-o
retea tridimensionala este cea de copolimerizare a acrilamidei cu N,N-metilen-bis-acrilamida, ultima servind
ca agent de inretelare (fig. ) realizandu-se asa numitul proces de reticulare a polimerului.

In acest caz reactia de polimerizare, care se realizeaza prin intermediul radicalilor, este initiata prin
aditia de persulfat de potasiu (K2S2O8), riboflavina, radiatii ultraviolete, radiatii X sau gama si accelerata prin
adaugarea de N,N,N’,N’ – tetrametiletilendiamina (TEMED). Pentru limitarea denaturarilor este bine ca
aceasta reactie sa se realizeze in absenta oxigenului si la temperaturi scazute (00 – 250C). Porozitatea si
proprietatile mecanice ale pot fi controlate prin varierea concentratiilor de bisacrilamida.

Adeseori proteina, pentru copolimerizare cu acrilamida si N,N-metilen-bis-acrilamida, este


functionalizata adica este activata prin adaugarea in structura ei a unor functiuni cu capacitate ridicata de a
copolimeriza. De exemplu, in molecula enzimei pot fi introduse duble legaturi prin acilare cu clorura de
acriloil (CH2=CH–CO–Cl), iar preparatul obtinut este introdus in amestecul de copolimerizare.

Metoda conduce la un gel activ enzimatic, a carui activitate creste cu scaderea dimensiunilor
particulelor de gel datorita cresterii suprafetei de contact.

Aceasta metoda este larg utilizata in analiza biochimica si anume pentru prepararea fazei stationare
pentru fractionarea biomoleculelor prin electroforeza.

Pe langa gelul foarte cunoscut de poliacrilamida se utilizeaza numeroase alte reactii de polimerizare
cu formare de geluri cum sunt:

Ø Gelurile de hidroxietil – 2 metacrilat reticulate cu etilenglicol dimetacrilat (EGDMA). Se obtine si in


acest caz un polimer vinilic in conditii asemanatoare celor utilizate pentru gelurile poliacrilamidice;

Ø Gelurile poli – alcool vinilice, realizate prin expunerea alcoolului vinilic unor radiatii gamma;
http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 66/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Ø Gelurile de amidon realizate prin dizolvarea la cald de amidon si adaugarea preparatului enzimatic in
timpul racirii pentru a se evita denaturarea termica. Deoarece stabilitatea acestor preparate este
destul de scazuta, proprietatile mecanice ale acestor geluri pot fi imbunatatite prin depunerea lor pe
suporturi mai rezistente asa cum sunt buretii poliuretanici;

Ø Gelurile de caraghenan si alginat sunt utilizate, in mod particular, datorita proprietatilor gelifiante ale
acestor polimeri naturali in conditii de lucru blande, atat pentru realizarea de preparate cu enzime
incluse dar si pentru includerea de celule intregi. Este suficient ca o solutie formata din enzima/celula
si poliglucida sa se introduca picatura cu picatura intr-o solutie salina (clorura de potasiu pentru
caraghenan si clorura de calciu pentru alginat) pentru a se obtine bile de gel cu proprietati mecanice
satisfacatoare. Alginatii sunt preferati fata de caraghenan deoarece ofera avantajul obtinerii
enzimei/celulei imobilizate mult mai usor si in plus gelificarea are loc la temperaturi mai scazute decat
pentru caraghenan. De asemenea acesti polioli se obtin la nivel industrial.

Ø Tehnica de realizare a fibrelor de poliacetat de celuloza a fost inspirata de tehnica utilizata in industria
textila pentru obtinerea fibrelor de celuloza si a fost dezvoltata la nivel industrial pentru obtinerea de
fibre de celuloza de catre firma italiana SNAM Progetti. Principiul de lucru este de a se realiza o
solutie de triacetat de celuloza in clorura de metilen la care se adauga sub agitare solutia enzimatica,
in apa sau un tampon ce contine glicerol, la rece pentru obtinerea unei emulsii omogene. Aceasta
emulsie este extrudata sub presiune cu azot intr-o baie de coagulare ce contine toluen. Fibrele
obtinute sunt uscate sub vid pentru eliminarea solventilor si conservate la 50C (fig).

In mod similar se pot include enzime, celule, si in alti polimeri cum sunt diacetatul de celuloza, etil –
celuloza, poliacrilonitrilul, polibutadiena, polistirenul, policlorura de vinil sau poli – γ – metil – glutamat.

Acest procedeu de incluziune a fost aplicat pentru numeroase enzime la nivel pilot sau chiar industrial
cum sunt : aminoacilaza, triptofan sintetaza, β – galactozidaza, amiloglucozidaza, glucoz – izomeraza,
invertaza, penicilin acilaza etc.

In particular, metoda imobilizarii bazata pe incorporarea enzimei in complexe polielectrolitice permite


ca prin modificarea pH-ului sau a tariei ionice a solutiei sa aiba loc transformarea complexului suport-enzima
dintr-o forma insolubila intr-una acvo-solubila si invers.

2.2. Incapsularea consta in captarea solutiei de enzima intr-un compartiment limitat de o membrana
selectiva care nu lasa sa treaca decat moleculele mici.

Incapsularea consta fie prin formarea unei membrane in jurul unei micropicaturi de emulsie ce
contine enzima conducand la realizarea unei microcapsule (fig. ) fie prin

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 67/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

retinerea moleculelor de enzima intr-un macrovolum separat de mediul inconjurator de membrana


semipermeabila (fig. – A si B).

Procedura de realizare a microcapsulelor consta in copolimerizarea unui monomer hidrofob cu un


monomer hidrofil. Monomerul hidrofil este dizolvat impreuna cu enzima intr-o faza apoasa care se afla in
emulsie intr-o faza organica. Adaugarea monomerului hidrofob in faza organica determina copolimerizarea la
interfata prinzand enzima in interiorul microcapsulei ce se formeaza.

De exemplu o solutie apoasa ce contine o enzima si un monomer hidrofil (1,6 – diaminohexan) este
emulsionata, in prezenta unui agent tensioactiv cu rol de stabilizator, cu o solutie organica formata din
cloroform si ciclohexan. La adaugarea monomerului hidrofob (clorura de sebacoil) are loc reactia de
copolimerizare la interfata ce conduce la formarea unei membrane polimerice de nylon dupa reactia :

NH2 – (CH2)6 – NH2 + Cl – CO – (CH2)8 – CO – Cl

1,6 – diaminohexan clorura de sebacoil

- NH – (CH2)6 – NH – CO – (CH2)8 – CO – NH – (CH2)6 – NH – CO – (CH2)8 – CO –.

Microcapsulele formate sunt recuperate prin centrifugare. Diametrul lor depinde de finetea emulsiei si
poate varia de la cativa microni la sute de microni.

Aceasta tehnica a fost larg dezvoltata in special pentru rezolvarea unor necesitati medicale adica
realizarea unor enzime imobilizate care sa poata fi injectate, administrate, fara a crea probleme de natura
imunitara (respingere) si de distrugere a enzimelor de interes de catre enzimele proteolitice din mediu.
Necesitatile terapeutice au condus astfel si la utilizarea a numeroase alte tipuri de membrane pentru
formarea de microcapsule cum sunt poliuretanii, poliureea, poliesterii etc. sau molecule amfifile ca de
exemplu lecitinele sau lipozomii. Astazi nanotehnologiile utilizeaza astfel de tehnici pentru a se realiza
microcapsule sau alte tipuri de compusi terapeutici a caror membrane sunt realizate din substante
biodegradabile (carbon de exemplu) care nu determina nici un fel de reactii secundare.

Realizarea de macrovolume separate de mediul inconjurator de membrane semipermeabile poate


asigura retinerea enzimei intr-un volum determinat (fig) in vederea utilizarii sale intr-unproces continuu. Astfel
de sisteme sunt in mod particular interesante pentru realizarea de biosenzori enzimatici (membranele plane)
sau de reactoare enzimatice (fibre tubulare). Astfel de sisteme sunt deosebit de utile pentru hidroliza unor
macromelecule (amidon, celuloza, proteine) deoarece produsii de hidroliza sunt suficienti de mici pentru a
trece prin membrana semipermeabila si sunt recuperati in efluenti. In plus produsii de reactie fiind indepartati
din mediu nu determina inhibarea enzimei.

Astazi numeroase firme utilizeaza aceste procedee pentru realizarea de sisteme utilizate in procese
enzimatice, ultrafiltrare etc. Dintre cele mai cunoscute firme care utilizeaza aceste procedee pentru a realiza
produsi de interes putem aminti: Millipore, Rhône-Poulenc, Sartorius, Amicon, BioRad, Bioengineering etc.
http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 68/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Avantaje si dezavantaje

Avantaje

Ø Reactiile de polimerizare sau de gelificare sunt reactii bine stapanite cu mecanisme de reactie
cunoscute. Reactivii implicati sunt reactivi de uzanta clasica atat la nivel de laborator cat si industrial
astfel incat extrapolarea aestor metode nu intampina nici o dificultate din punct de vedere al
disponibilitatilor de materiale.

Ø Procesul de includere permite imobilizarea completa a enzimei de interes intr-o singura etapa.
Deoarece nu este implicata nici o legatura intre enzima de interes si polimer, riscurile de denaturare
sunt limitate.

Ø Reactiile de incluziune nu prezinta nici un caracter de specificitate si pot fi astfel aplicabile oricarui tip
de enzima, indiferent de structura sa primara sau tridimensionala. Aceasta metoda este de interes
particular pentru enzimele cu structuri oligomerice si a sistemelor multienzimatice, functionarea lor
fiind imbunatatita prin aducerea lor impreuna intr-un volum limitat.

Dezavantaje

Ø Conditiile de polimerizare, mai ales in cazul polimerilor vinilici, pot afecta enzima prin procese de
denaturare datorate interventiei radicalilor liberi (persulfat de potasiu) sau valori de pH ridicate
(sinteza nylonului).

Ø Pentru compensarea exotermicitatii unor reactii este necesar sa se lucreze la temperaturi joase.

Ø Localizarea enzimei intr-o microcapsula sau un volum limitat de o membrana semipermeabila implica
obligatoriu transferuri de masa, a substratului la enzima si apoi a produsilor in solutie. Fenomenele de
difuzie in interiorul si exteriorul particulelor limiteaza capacitatea de actiune a enzimelor. Rezistenta
difuzionala poate fi insa redusa, mai ales in cazul gelurilor, prin macinarea acestora dupa uscare.

Ø Pe langa fenomenele de difuzie un rol important este ocupat de fenomenele de limitare sterica. Astfel
porozitatea membranelor formate trebuie sa asigure mentinerea enzimelor in interior (deci porii sa fie
mai mici decat talia enzimei) dar suficienti de mari pentru a permite accesul substratului la enzima.
Mai ales pentru cazurile in care moleculele substratului sunt mari pentru evitarea pierderii de enzima,
dupa realizarea procesului de incluziune enzima este supusa unui proces de reticulare prin
intermediul unui agent polifunctional ca de exemplu glutaraldehida, adica se realizeaza si o
imobilizare prin legare covalenta a enzimei.

Ø Uneori proprietatile mecanice ale gelurilor obtinute nu sunt suficient de satisfacatoare pentru ca
enzima imobilizata sa poata fi utilizata la nivel pilot sau industrial. De exemplu intr-un reactor cu pat
fix.

3 Legarea covalenta consta intr-o reactie chimica care are loc intre grupari reactive ale
suportului cu unele ale enzimei, conducand la imobilizarea ireversibila a enzimei. Un interes deosebit il
reprezinta metodele chimice care permit legarea enzimelor prin intermediul unor grupari functionale din
http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 69/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

structura enzimei, neimplicate in cataliza: amino (α sau ε), imido (de la triptofan), amido (de la asparagina,
glutamina), hidroxil (de la serina, treonina), carboxil (α, β sau γ), tiol (de la cisteina), metiltiol (de la
metionina), guanidil (de la arginina), imidazol (de la histidina) etc.

Metodele de imobilizare prin legare covalenta pot fi grupate in doua categorii principale: metode care
implica un suport (insolubil sau nu) si metode care realizeaza imobilizarea prin reticularea enzimei.

3.1 Imobilizarea enzimelor prin legare covalenta de un suport.

In acest caz se urmareste stabilirea modalitatilor de legare covalenta prin intermediul unor grupari
functionale ale enzimei de unele grupari functionale ale suportului astfel incat activitatea catalitica a enzimei
sa fie conservata.

Gruparile functionale enzimatice sunt destul de putin reactive, fapt ce determina necesitatea
existentei unor grupari functionale suficient de active pe suport astfel incat legarea sa se faca in conditii
blande pentru enzima.

Exista posibilitatea de activare a gruparilor functionale ale enzimelor, dar aceste studii au avut loc mai
ales la nivel de laborator ca cercetari stiintifice si nu au fost aplicate la scara deoarece in general conditiile de
activare sunt putin compatibile cu conservarea activitatii enzimatice.

Astfel exista unele cercetari originale care utilizeaza activarea gruparilor functionale ale enzimelor. De
exemplu Zaborsky (Zaborsky O.R., 1974, Immobilized enzymes., C.R.C. Press, new York) a efectuat
experimentari de legare a glucoz-oxidazei, a carei fractie glucidica reprezinta 16 % din masa enzimei, pe
diferite suporturi aminate (p-amino-stiren, amino-etil-celuloza, sticla aminata, carboximetil-celuloza activata
cu hidrazida)

Se poate de asemenea sa se mareasca densitatea de grupari reactive pe molecula prin grefarea pe


acestea de lanturi de politirozina sau de polilizina sau, de a se introduce grupari vinilice in molecula enzimei,
prin alchilarea functiilor aminice, dupa care enzima este copolimerizata prin intermediul gruparilor vinilice cu
acrilamida si bisacrilamida.

In marea majoritate a cazurilor insa, nu enzima se activeaza ci suprafata suportului.

Metode principale de activare

Pentru stabilirea metodei de activare se iau in consideratie pe de o parte gruparile functionale care
participa la legatura covalenta din partea enzimei, iar pe de alta gruparile functionale implicate in legatura din
partea suportului. In acest context principalele metode de activare sunt:

Grupa functionala Metoda de activare

enzima suport

―NH2 ―NH2 Glutaraldehida

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 70/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

―NH2 ―OH Bromcian

Triazine

―NH2 ―COOH Azotura

Carbodiimida

―COOH ―NH2 Carbodiimida

Sare de diazoniu

―SH ―SH Punti disulfurice

O imagine sintetica de imobilizare a enzimelor prin legare covalenta este prezentata inb fig

Activarea cu ajutorul glutaraldehidei este una dintre cele mai utilizate metode atat pentru legarea
unei enzime de un suport cat si pentru reticularea moleculelor unei enzime sau a unor celule intregi.
Glutaraldehida nu reactioneaza sub forma sa de dialdehida cu functiunile aminice ale suportului sau enzimei,
ci sub forma de polimer rezultat in urma condensarii aldolice a moleculelor de reactiv. Cu cat valoarea de pH
este mai ridicata polimerizarea este mai mare. Astfel la pH mai mare de 10,5 are loc precipitarea polimerilor
de glutaraldehida care au functiuni aldehidice α, β – nesaturate. Aceste functiuni reactioneaza cu gruparile
aminice ale suportului/enzimei conducand la formarea unor legaturi iminice care se stabilizeaza prin
rezonanta cu legaturile etilenice prezente (legaturi duble conjugate). Aceste structuri explica stabilitatea
derivatilor obtinuti prin activare cu glutaraldehida. Astfel acesti compusi rezista, de exemplu, la atacul unei
solutii de acid clorhidric 6N la temperatura de 1100C timp de 24 de ore.

La modul general imobilizarea unei enzime pe un suport activat cu glutaraldehida are loc in doua
etape. In prima etapa suportul aminat este activat prin punerea in contact cu o solutie de glutaraldehida (1%
- 5%) la un pH cuprins intre 7,0 si 8,6 si temparatura ambianta. Dupa spalarea cu un tampon corespunzator
pentru indepartarea excesului de glutaraldehida enzima este mentinuta in contact cu suportul la temperatura
de 40C. Deci conditiile de imobilizare ale enzimei sunt blande. Mecanismul de activare cu glutaraldehida
este:

(n+2) OHC―(CH2)3―CHO

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 71/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

R―NH2

Glutaraldehida, utilizata de asemenea ca agent de fixare in histochimie sau pentru ameliorarea


proprietatilor mecanice ale pieilor in tabacarii, ofera avantajul de a fi un produs disponibil la nivel industrial.

Bromcianul este utilizat pentru activarea suporturilor care au grupari de tipul α-glicolice cum sunt
suporturile de natura poliozidica ( dextran, agaroza, celuloza, amidon). Tratarea acestor suporturi cu
bromcian conduce la obtinerea de imidocarbonati care vor reactiona cu gruparile aminice ale proteinelor
pentru a da izo-uree N- substituita.

Aceasta metoda este una dintre cele mai utilizate la nivel de laborator pentru imobilizarea enzimelor
sau a moleculelor aminate (de exemplu in cromatografia de afinitate). In acest context suporturi preactivate
cu bromcian sunt disponibile pe piata.

Triazinele sunt utilizate pentru activarea suporturilor care au grupari functionale hidroxil (fig..). Cele
mai utilizate triazine sunt : 2,4,6 – tricloro – S – triazina (clorura de cianuril), 2-amino- 4,6-dicloro – S –
triazina, colorantii Procion M etc. Triazinele fiind produse industriale este convenabil a fi utilizate pentru
prepararea de cantitati importante de suporturi active in special de celuloza activa.

Azotura permite activarea eficace a suportilor ce poseda grupari de acizi carboxilici. Metoda de
activare cu azotura are loc in cateva etape: esterificarea gruparilor carboxilice cu metanol in mediu acid,
reactia esterilor formati cu hidrazina rezultand hidrazide, tratarea acestora cu azotit de sodiu pentru a rezulta
azotura si apoi prin reactia compusului format cu gruparile aminice ale enzimei se obtine imobilizarea
enzimei prin legare covalenta de tip amidic. Succesiunea reactiilor chimice implicate in acest proces este
prezentata in fig

R―COOH R―COO―CH3 R―CO―NH―NH2

R―CO―NH―E R―CO―N═ ═

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 72/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Fig. Metoda de imobilizare dupa activarea suportului cu azotura

Carbodiimida este de asemenea un reactiv utilizat pentru imobilizarea unor enzime prin legarea
gruparilor aminice de o grupare carboxil activata de pe suport. Modul de imobilizare este similar cu cel
aplicat pentru sinteza legaturilor peptidice intre aminoacizi in prezenta carbodiimidei (fig. ). Aceasta reactie
decurge in mediu acid . Daca se doreste a se opera in mediu bazic se poate folosi reactivul K al lui
Woodward (N – etilfenil – 5 – izoxazoliu – 3’ sulfat).

Sarurile de diazoniu se pot obtine usor la suporturile care au grupari functionale amine aromatice
prin adaugarea de azotit de sodiu in mediu acid (fig..). Sarurile de diazoniu care se obtin pot reactiona cu
nucleul fenolic al restului tirozinic sau cu imidazolul din restul histidinic pentru a forma legaturi de tip azoic

Punti disulfurice se pot stabili intre gruparile tiol ale suportului si gruparile tiol din resturile de cisteina
ale enzimei. Pentru aceste cazuri suportul, este cel mai adesea activat, prin intermediul reactiilor cu dipiridil –
2,2’ – disulfura dupa care este pus in contact cu enzima de interes (fig..).

Aceasta metoda reprezinta una dintre putinele metode de imobilizare prin legare covalenta care ofera
posibilitatea de regenerare a enzimei dupa dezactivarea sa. Astfel este suficient ca puntile disulfurice sa fie
reduse, de exemplu cu ajutorul cisteinei, pentru regenerarea gruparilor tiol ale suportului si ale enzimei, dupa
care se poate din nou proceda la imobilizare.

Suporturi principale

Legarea se poate realiza pe suporturi anorganice (sticla poroasa, materiale ceramice), pe suporturi
organice naturale (celuloza, chitina, dextran, agaroza) sau polimeri sintetici (nailon, polistiren, poliacrilamida),
prin intermediul unor grupari imidocarbonat, oxiran, azida, diazo, izotiocianat, triazinil etc. Suporturile
organice prezinta fata de cele anorganice o densitate mai mare de grupari functionale in timp ce cele
anorganice au mai bune proprietati mecanice.

Principalele suporturi organice sunt :

Compusi naturali Polimeri sintetici

Suport Grupare functionala Suport Grupare functionala

Poliozide Poliacrilamida ―CO―NH2

Dextran ―OH Poliacrilati diversa

Agaroza ―OH Polimetacrilati diversa

Celuloza ―OH Copolimer etilena – anhidrida Anhidrida acida


maleica
Carboxi-metil-celuloza ―COOH

Amino-etil-celuloza Polistiren diversa


http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 73/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

―NH2

p-aminobenzil celuloza Poliamide ―CO―NH―

Proteine

Colagen ―COOH

Dextranul si Agaroza: Dextranul este un homoplimer ramificat format din unitati de D – glucoza si este
sintetizat de catre diferite bacterii (in special de Leuconostoc mesenteroides) pornind de la zaharoza.
Agaroza este un polimer natural ce se extrage din alge. Aceste doua poliozide sunt utilizate in mod curent in
biochimia analitica in diferite scopuri, cele mai obisnuite fiind de cernere moleculara, determinari de greutati
moleculare, cromatografii de exemplu de excludere. Datorita utilizarilor multiple acesti compusi sunt
disponibili pe piata in diferite forme active sau nu: Sephadex, Sepharose, Bio-Gel, Ultrogel etc.

Cea mai utilizata forma de activare a poliolilor este cea cu BrCN dar prezenta gruparilor hidroxil pe
aceste suporturi permite de asemenea si activarea cu alti agenti cum sunt de exemplu triazinele.

Proprietatile mecanice ale acestor geluri pot fi imbunatatite prin asocierea cu polimeri sintetici, de
exemplu agaroza cu acrilamida sau glutaraldehida.

Celuloza si derivatii sai (Carboxi-metil-celuloza, Amino-etil-celuloza, p-aminobenzil celuloza).


Celuloza este un homopolimer liniar format din unitati de D-glucoza si este utilizata in mod obisnuit in
domeniul analitic sub diferite forme. Acest suport natural cu o larga raspandire si disponibilitate, pe langa
utilitatea sa pentru diferite industrii (hartie, vata) este si obiectul a numeroase studii chimice si structurale
astfel incat se cunosc numeroase modalitati de activare a celulozei. In plus exista in prezent numerosi
derivati ai celulozei disponibili in mari cantitati si care permit utilizare a variate metode de activare, asa cum
sunt cei mentionati anterior.

Gruparile hidrtoxilice ale celulozei pot fi activate foarte usor prin halogenare, in particular cu ajutorul
unor agenti de clorurare cum sunt clorura de tionil (SOCl2) sau clorura de sulfuril (SO2Cl2). De asemenea
activari eficace se pot realiza atat a celulozei cat si a derivatilor sai cu triazine. Exista de altfel numerosi
compusi activi gata preparati de catre firme recunoscute. De exemplu Grupul Lilly activeaza si vinde diferite
tipuri de DEAE-celuloza activata.In plus celuloza poate fi activata atat sub forma de hartie (reactivi analitici)
cat si de particlule (celuloza micro-cristalina). Este de asemenea posibil sa fie activata si celuloza prezenta in
derivatii naturali sub forma de complecsi ligno-celulozici, compusi care prezinta proprietati mecanice net
superioare celulozei pure. De exemplu resturile celulozice de porum constituie excelente suporturi pentru
imobilizarea de enzime.

Colagenul, o proteina care joaca un rol structural foarte important in tesutul conjuntiv, este un
subprodus abundent in abatoare si poate fi obtinut sub forma de fibre sau membrane. Continutul bogat in
aminoacizii aminati (acidul glutamic si acidul aspartic) permite activarea colagenului prin metoda cu azotura.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 74/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Membranele activate astfel sunt utilizate pentru imobilizarea de enzime care apoi sunt folosite pentru
realizarea de electrozi specifici.

Polimerii acrilici (Poliacrilamida, Poliacrilati Polimetacrilati) sunt derivati care se produc adesea la
scara industriala prin polimerizarea acidului acrilic, acidului metacrilic, acidului cloroacrilic si derivatii lor. Sa
luam de exemplu cazul poliacrilamidei pentru a sublinia varietatea de metode de modificare chimica si
activare care pot fi puse in lucru in cazul acestor tipuri de polimeri (fig) si a caror structura generala este
urmatoarea:

Pe baza acestor proprietati au fost dezvoltati numerosi copolimeri ai acrilamidei, ai N,N’- metilen
bisacrilamidei si derivatilor acestora cu o mare varietate de functiuni reactive. Cativa din numerosii compusi
Enzacryl sunt :

Enzacryl Grupa functionala Metoda de activare

AA Diazotare

AH Azotura

Politiolactona Reactie directa

Politiol Punte disulfurica

Poliacetal Acid diluata

Copolimerul etilena – anhidrida maleica (EMA) prezinta avantajul ca este un reactiv direct datorita
functiilor sale anhidridice. Reactia cu enzima conduce la un derivat cu incarcatura negativa (fig.) care poate fi
neutralizata prin reactia cu 1,6-diamino-etan sau 1,6-diamino-hexan. Condensarea acestor molecule
bifunctionaleconduce printre altele si la o ameliorare a proprietatilor mecanice a suportului.

Polistiren : copolimerii stiren – divinil benzen cu structura de baza :


http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 75/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

sunt baza a numeroase preparate ca rasini schimbatoare de ioni obtinute prin modificari chimice ale acestor
polimeri, in vederea introducerii de grupe schimbatoare de ioni. De exemplu se poate nitra polistirenul prin
actiunea acidului azotic in prezenta acidului sulfuric si apoi reducerea functiilor nitro cu ajutorul hidrosulfitului
de sodiu obtinandu-se astfel functii amino-aromatice care pot fi activate prin diazotare.

Poliamidele sunt preparate prin polimerizarea fie a acizilor dicarboxilici si diaminelor alifatice, fie a
aminoacizilor sau a lactamelor lor. Una dintre cele mai cunoscute poliamide este nylonul. Acesti polimeri au
grupari amidice a caror hidroliza acida partiala permit eliberarea simultana a unei grupari functionale aminice
si a unei grupari carboxilice:

R1―CO―NH―R2 R1―COOH + R2―NH2

Gruparile astfel eliberate pot fi activate prin una dintre metodele deja prezentate.

Principalele suporturi minerale.

Silice si sticla poroasa, suporturi disponibile cu o mare varietate granulometrica si porozitate, cu


suprafete de legare variind de la 10 m2/g la 400 m2/g care au porozitatile corespunzatoare de la 300 nm la 8
nm. In plus este foarte usor sa se grefeze aproape orice grupare chimica pe aceste suporturi prin
condensare cu silani. Silanii sunt utilizati industrial ca promotori de adeziune.

(RO)3Si―R

Silan R A

γ-aminopropil trietoxi silan ―C2H5 ―(CH2)3―NH2

N―β―amino etil―γ―amino etil trimetoxi silan ―CH3 ―(CH2)3―NH―(CH2)2―NH2

β―(Clorometilfenil)etiltrimetoxi silan ―CH3

γ―Cloropropiltrietoxi silan ―C2H5 ―(CH2)3―Cl

γ―glicidoxipropil trimetoxi silan ―CH3

γ―mercaptopropil trimetoxi silan ―CH3 ―(CH2)3―SH

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 76/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

γ―metacriloxipropil trimetoxi silan ―CH3

In functie de gruparea functionala enzimele pot fi imobilizate direct sau dupa activarea suportului.
Metoda cea mai utilizata este de a se grefa grupari amino alifatice prin condensarea γ-aminopropil trietoxi
silan pe suport apoi activarea acestor grupari prin actiunea glutaraldehidei (Fig).

In cazul sticlei poroase proprietatile derivatilor obtinuti pot fi ameliorate folosindu-se sticla a carei pori
sunt captusiti cu zirconiu (oxid de zirconiu). Acest tip de suport a fost si este utilizat la nivel pilot si industrial
pentru imobilizarea a diferite enzime cum sunt : glucoz izomeraza, amiloglucozidaza, lactaza etc.

Oxizii metalici se functionalizeaza chimic prin aceleasi metode care se aplica silicei sau sticlei. Am
exemplificat cazul captusirii cu oxid de zirconiu dar putem exemplifica si cu oxid de titan, de nichel, de fier, de
aluminiu (alumina).

Diferite tipuri de ceramica pot fi activate prin introducerea de grupari chimice reactive sau activabile
prin metoda silanarii.

In prezent tehnica de imobilizare prin legare covalenta a enzimelor este una dintre cele mai utilizate si
nu prezinta dezavantajele tehnicilor anterioare.

3.2 Imobilizarea enzimelor prin reticulare.

Imobilizarea enzimei se poate realiza si fara a se utiliza suporturi prin efectuarea de punti covalente
cu ajutorul unor reactivi polifunctionali. Se obtin astfel structuri cu inalta masa moleculara care devin
insolubile. Pentru realizarea unei astfel de reactii se pot folosi numerosi reactivi, dintre care cei mai utilizati
sunt:

Principalii reactivi polifunctionali

Nume Structura

Glutaraldehida

Acid bis-diazobenzidin-2,2’-disulfonic

Acid difenil-4,4’-diizotiocianat-2,2’-disulfonic

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 77/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

3-metoxi-4,4’-difenil diizocianat-metan

1,5-difluoro-2,4-dinitro-benzen

De departe glutaraldehida este reactivul cel mai utilizat nu numai pentru a se reticula enzimele ci si
pentru realizarea asa numitii imuno-adsorbanti.

In acest proces enzima este diluata cu o proteina inerta, cum este albumina, pentru a se limita
fenomenele de denaturare si a creste eficacitatea metodei de imobilizare.

Pentru obtinerea unor derivati cu o structura foarte poroasa asemanatoare buretilor, amestecul de
enzima, albumina si glutaraldehida este congelat rapid dupa care temperatura este crescuta in mod lent
pana la 40C.

Derivatii rezultati pot fi si sub forma de membrane. Observatii la microscopul electronic au permis
precizarea structurii fine a acestor tipuri de derivati.

Un astfel de proces de reticulare se poate aplica nu numai enzimelor ci si celulelor intregi. Acestea
prezinta avantajul, mai ales in cazul in care celula contine o enzima usor accesibila (cum este cazul
enzimelor periplasmatice), ca permit utilizarea activitatii catalitice fara a se efectua procesele de extractie si
purificare consumatoare de energie, timp si bani. In acest caz putem spune ca celula este suportul. De
asemenea se evita eliberarea sistemelor care determina autodegradarea celulara printr-o incalzire a
sistemului timp scurt la o temperatura de 700- 800C. In plus acest procedeu permite scaderea importanta a
costului enzimei imobilizate si este utilizat pe larg pentru imobilizarea glucoz izomerazei folosita pentru
producerea de izoglucoza, una dintre cele mai importante aplicatii industriale de enzime imobilizata.

De exemplu cu glutaraldehida firma NOVO a reticulat Bacillus coagulans, iar GIST-BROCADES


micelii de Actinoplanes missouriensis.

Avantaje si dezavantaje

Avantaje

Ø Soliditatea legaturii enzima – suport care permite obtinerea de compusi rezistenti la diferite variatii
importante ale conditiilor de mediu (pH, tarie ionica) si, in particular, la spalari repetate cu solutii
concentrate de clorura de sodiu.

Ø Exista o foarte mare varietate de suporturi si metode de activare, desi este aproape imposibil de a
prevedea a priori eficacitatea unei metode de imobilizare, este intotdeauna posibil sa se gaseasca
pentru o enzima data o metoda care sa dea un randament de imobilizare bun.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 78/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Ø Stabilitatea legaturilor covalente intre enzima si suport se poate traduce si prin rigidificarea structurii
tridimensionale a enzimei. Din aceasta rezulta noi proprietati, in special printr-o crestere generala a
rezistentei la factorii de denaturare (temperatura, pH, agenti denaturanti). Este semnificativ ca foarte
multe enzime imobilizate prezinta o temperatura optima de activitate mai mare decat a enzimei libere
fapt deosebit de important pentru utilizarea enzimei in flux continuu. Pentru ca rigidificarea enzimei sa
nu fie totala, fiind necesara o anumita elasticitate, este obligatoriu sa se stabileasca conditiile optime
de imobilizare pentru fiecare enzima in parte si pentru fiecare procedura de imobilizare.

Dezavantaje

Ø Imobilizarea prin legare covalenta este mult mai complexa decat prin incluziune sau adsorbtie.
Chimia heterogena aplicata pentru a se ajunge la imobilizare nu duce intotdeauna la rezultatele
asteptate considerand reactiile care au loc in fazele omogene ca urmare a fenomenelor de
interferenta din micromediul inconjurator prezent in sistemele heterogene.

Ø Formarea legaturilor covalente intre diferitele grupari functionale ale enzimei si suportului conduce la
o importanta modificare a structurii enzimei, care desi este benefica in ceea ce priveste ameliorarea
rezistentei la factori de denaturare, provoaca totusi o denaturare a structurii moleculei enzimei. De
aceea randamentul de imobilizare exprimat in functie de activitatea enzimatica reziduala poate avea
valori procentuale de la cateva unitati la mai mult de 90%. De exemplu este suficient ca la legatura sa
participe si grupari din situsul catalitic al enzimei ca activitatea sa sa fie perturbata. De asemenea pot
fi amintite si efectele de stanjenire sterica si de schimbare a sensibilitatii enzimei la variatii de pH saiu
chiar la modificarea valorii optime de pH.

Ø Este practic imposibil de a se prevedea, chiar daca structura enzimei este cunoscuta si reactia de
cuplare perfect stapanita, care va fi randamentul de imobilizare covalenta cu o metoda sau alta, fiind
variabil de la o enzima la alta pentru aceiasi metoda si pentru o enzima data diferit pentru diferite
metode.

Ø Cantitatea de enzima imobilizata per g de suport este in general mai mica decat in caz de incluziune
sau adsorbtie.

Ø Suporturile organice au adesea inconvenientul ca prezinta proprietati mecanice necorespunzatoare si


sunt sensibile la atacul microorganismelor. Suporturile minerale nu prezinta acest dezavantaj dar
capacitatea lor de cuplare este mai redus.

In prezent tehnica de imobilizare prin legare covalenta a enzimelor este una dintre cele mai utilizate si
nu prezinta dezavantajele tehnicilor anterioare.

BIOSENZORI

Un biosenzor este un instrument analitic care transforma un raspuns biologic intr-un semnal
electric.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 79/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Termenul de „biosenzor“ este adesea utilizat pentru a ingloba dispozitivele utilizate in scopul
determinarii concentratiilor unor substante sau a altor parametri de interes biologic, chiar daca acestea nu
utilizeaza un sistem biologic in mod direct. Aceasta definitie este in mod larg utilizata de unele reviste
stiintifice (de exemplu Biosensors, Elsevier Applied Science). Aceste dispozitive nu se vor discuta in acest
curs nefiind de fapt ceea ce inseamna un bisenzor.

Schema generala a unui biosenzor este reprezentata in figura :

Materialul biologic responsabil pentru realizarea biosenzorilor este reprezentat de celule intregi,
celule microbiene, enzime, etc. Accentul in acest curs insa se pune pe biosenzorii realizati prin utilizarea de
enzime ca material biologic.

Producerea de Biosenzori reprezinta, in prezent, un domeniu cu o extindere rapida, a carei viteza de


crestere anuala a fost estimata la 60%. Impulsul major provine din industria producatoare de dispozitive
pentru sanatate (de exemplu 6% din populatia Europei de vest este diabetica si trebuie sa beneficieze de
disponibilitatea unor biosenzori rapizi, exacti si simpli pentru determinarea glucozei) dar si alte domenii
solicita astfel de instrumente, asa cum sunt aprecierea calitatii alimentelor sau monitorizarea mediului
inconjurator.

Se estimeaza ca piata mondiala a instrumentelor analitice este in jur de 15.000.000.000 € pe an, din
care 30% reprezinta domeniul sanatatii. Este clar ca exista un vast potential al expansiunii acestei piete si
din aceasta cel putin 0,1% este reprezentata de biosenzori.

Cercetarile si dezvoltarile din acest domeniu sunt vaste si multidisciplinare cuprinzand fizica, chimia,
electrochimia, biochimia, stiinta bioreactoarelor, nanotehnologia, electronica si ingineria de programare
(software).

Cele mai multe dintre incercarile/realizarile curente se refera la biosenzori potentiometrici,


amperometrici si benzi de hartie cu enzime imobilizate. Totusi, in prezent si in viitorul apropiat , se
preconizeza studierea intensa a tuturor tipurilor de traductori principali, astfel incat sa se largeasca utilizarea
de biosenzori cat mai rapid in urmatorii ani.

Un biosenzor adecvat trebuie sa posede cel putin urmatoarele caracteristici:

· Biocatalizatorul trebuie sa fie inalt specific pentru scopul analizei;

· sa fie stabil in conditii de depozitare normale si, cu exceptia benzilor enzimatice de hartie si dipsticks
(a se vedea mai tarziu), sa prezinte o buna stabilitate pentru un numar larg de determinari (de exemplu
mai mult de 100);

· Reactia nu trebuie sa fie afectata de parametri fizici cum sunt agitarea, pH sau temperatura. Aceasta
ar permite analiza probelor cu un minim de pre-tratament.

· Daca reactia implica cofactori sau coenzime, acestea ar trebui, in mod preferabil, sa fie co-imobilizati
cu enzima;

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 80/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

· Raspunsul trebuie sa fie exact, précis, reproductibil si liniar pe domeniul analitic utilizat, fara dilutie sau
concentrare.

· Trebuie de asemenea sa fie liber de zgomot electric;

· In functie de domeniul de utilizare biosenzorul trebuie sa indeplineasca cerinte specific. De exemplu


pentru monitorizarea sistemelor invazive in situatii clinice, trebuie sa micut si biocompatibil, sa nu
determine efecte antigenice sau toxice, iar pentru bioreactoare trebuie sa fie sterilizabil. Sterilizarea se
realizeaza preferabil prin autoclavare dar nici un biosenzor cu enzime nu poate rezista unui asemenea
tratament termic-umed drastic. In ambele cazuri, biosenzorul nu trebuie sa fie predispus spre viciere
sau proteoliza;

· Biosenzorul complet trebuie sa fie ieftin, mic, portabil si capabil de a fi utilizat chiar de operatori ce au
urmat doar o scoala tehnica;

· Trebuie sa existe o piata pentru biosenzor. Este clar ca exista o sansa mica sa se dezvolte un
biosenzor daca alti factori (de exemplu subventii guvernamentale, angajarea continua a unor analisti
dotati, sau slaba perceptie a consumatorilor) incurajeaza utilizarea metodelor traditionale si
descurajeaza descentralizarea laboratoarelor de testare.

Raspunsul biologic al biosenzorului este determinat de membrane biocatalitice care realizeaza


conversia reactantului in produs. Enzimele imobilizate prezinta un numar de caracteristici avantajoase care
le fac, in mod particular, aplicabile in astfel de sisteme. Ele pot fi re-utilizate, ceea ce inseamna ca aceiasi
activitate catalitica este disponibila pentru o serie de analize. Acesta este un factor important in asigurarea
unor rezultate reproductibile si evitarea capcanelor associate cu reproducerea pipetarii enzimei libere
necesara in protocoalele analitice.

Multe enzime sunt intrinsec stabilizate prin procesul de imobilizare, dar chiar acolo unde aceasta nu
se intampla, exista in mod obisnuit o stabilizare aparenta considerabila. Chiar daca apare o oarecare
inactivare a enzimei imobilizate dupa o anumita perioada de timp, aceasta inactivare este in mod obisnuit
stationara si previzibila. Orice scadere a activitatii este usor incorporata in schema analitica prin interpolarea
regulata a standardelor, intre analizele probelor necunoscute. Din aceste motive, multe dintre asemenea
enzime imobilizate sunt re-utilizabile pana la 10.000 ori pe o perioada de cateva luni. In mod clar aceasta
conduce la o considerabila economie in raport cu costul enzimelor fata de utilizarea analitica a enzimelor
libere solubile.

Piesa cheie a biosenzorului este traductorul care face posibila o inregistrare a unei schimbari fizice
care acompaniaza reactia. Acesta poate fi:

1. schimbari in distributia sarcinilor electrice, fapt ce determina producerea unui potential electric
(biosenzori potentiometrici);
2. miscarea electronilor produsi intr-o reactie redox (biosenzori amperometrici);
3. producerea de lumina sau a unei diferente de absorbanta a luminii intre reactanti si produsi in timpul
reactiei (biosenzori optici, imunosenzori);
4. caldura rezultata sau absorbita prin reactie (biosenzor calorimetric); sau
http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 81/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

5. efecte datorate masei de reactanti sau produsi (biosenzori piezo-electrici).

Din punct de vedere al semnalului inregistrat de traductori, exista asa numitele “generatii” de
biosenzori:

prima generatie la care produsul normal al reactiei difuzeaza spre traductor si determina un
raspuns electric;
a doua generatie sunt biosenzorii care implica “mediatori” specifici intre reactie si traductor in
scopul de a genera raspunsul ce se valorifica;
a treia generatie de biosenzori unde reactia insasi determina raspunsul si nu este implicat in
mod direct nici un produs sau mediator.

Semnalul electric de la traductor este adesea slab si suprapus pe fondul relativ inalt si zgomotos al
traductorului (de exemplu fie datorita unui component cu semnal de frecventa inalta aparent de natura
intamplatoare, fie datorita interferentei electrice sau generate in interiorul componentelor electronice ale
traductorului).

Prelucrarea semnalului implica eliminarea semnalului de fond, de “referinta”, din semnalul probei.
Acesta se obtine dintr-un traductor similar dar fara nici o membrana biocatalitica. Semnalul rezultat din
diferenta dintre proba si referinta, este filtrat in mod electronic (netezire) eliminandu-se astfel semnalele
zgomotoase nedorite. Semnalul rezultat este apoi amplificat. Natura relativ lenta a raspunsului biosenzorului,
usureaza considerabil problema filtrarii zgomotului electric. Semnalul produs in aceasta etapa poat fi
prezentat direct dar de obicei este convertit intr-un semnal digital si trecut spre un microprocesor unde datele
sunt procesate, convertite in unitati de concentratie si prezentate pe un sistem de etalare sau intr-un depozit
de date.

Biosenzori Potentiometrici

Biosenzorii potentiometrici utilizeaza electrozi ion-selectivi pentru transformarea semnalului biologic in


semnal electric. In cea mai simpla reprezentare, ei sunt constituiti dintr-o membrana ce contine enzima
imobilizata si care inconjoara membrana de sticla semi-permeabila a unui electrod de pH. Reactiile catalizate
de enzima imobilizata genereaza sau absorb ioni de hidrogen. Aceste reactii care au loc langa membrana
subtire de sticla a electrodului vor permite inregistrarea schimbarii valorii de pH ce se va afisa direct pe
ecranul pH-metrului. Avantajul acestor electrozi este ca potentialul electric determinat este generat cu o
viteza lenta comparativ cu a reactiei enzimatice, ceea ce face sa nu apara nici o interferenta cu reactia
enzimatica.

Exista trei tipuri de electrozi ion-selectivi care sunt utilizati ca biosenzori:

1. Electrozi de sticla pentru cationi (de exemplu electrozii normali de pH) in care elementul sensibil este
o membrana de sticla hidratata foarte subtire care permite generarea unui potential electric
transversal datorat competitiei, dependente de concentratie, dintre cationii ce se leaga la situsurile
specifice enzimei imobilizate. Selectivitatea acestei membrane este determinata de compozitia sticlei.
Senzitivitatea fata de H+ este mai mare decat fata de cea realizata pentru NH ;

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 82/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

2. Electrozi de pH de sticla inveliti cu o membrane selective pentru gaze, CO2, NH3 sau H2S. Difuzia
gazului prin membrana determina o schimbare in pH-ul solutiei sensibile aflata intre membrana
selectiva pentru gaze si electrod, si care este apoi determinat;

3. Electrozi la care membrana de sticla este inlocuita printr-o membrana subtire a unui ion conductor
specific, de exemplu realizata dintr-un amestec de sulfura de argint si o halogenura de argint
(Ag2S/AgX). Astfel electrodul iodura este utilizat pentru determinarea I- intr-o reactie catalizata de
peroxidaza sau cel cianura intr-una catalizata de β- glucozidaza raspunzand prezentei ionilor de
cianura.

Exemple de reactii implicand eliberarea sau absorbtia unor ioni care permit utilizarea unor biosenzori
potentiometrici:

(a) H+ cation,

glucoz oxidza H2O


D-glucoza + O2 D-glucono-1,5-lactona + H2O2 D-gluconat + H+

penicilinaza
penicilina acid peniciloic + H+

lipaza
lipide neutre + H2O glycerol + acizi grasi + H+

ureaza (pH 6.0)a


H2NCONH2 + H2O + 2H+ 2NH4+ + CO2

ureaza (pH 9.5)b


H2NCONH2 + 2H2O 2NH3 + HCO3- + H+

(b) NH4+ cation,

ureaza (pH 7.5)


H2NCONH2 + 2H2O + H+ 2NH4++ HCO

L-amino acid oxidaza


L-amino acid + O2 + H2O ceto acid + NH4+ + H2O2

asparaginaza `
L-asparagina + H2O L-aspartat + NH4+

(c) I- anion,

peroxidaza
H2O2 + 2H+ + 2I- I2 + 2H2O

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 83/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

(d) CN-anion,

β-glucozidaza
amigdalina + 2H2O 2glucoza + benzaldehida + H+ + CN-

(a) poate fi deasemenea utilizata in biosenzorii potentiometrici NH si CO2 (gaz).

(b) poate fi deasemenea utilizata intr-un biosenzor potentiometric cu NH3 (gaz).

Raspunsul unui electrod ion-selectiv este reprezentat de relatia:

unde E este potentialul masurat (in volti), E0 este o constanta caracteristica pentru sistemul ion-
selectiv/electrod extern cunoscuta si ca potentialul standard al sistemului respectiv, R este constanta gazelor,
T este temperatura absoluta (K), z este sarcina ionica, F este constanta Faraday si [i] este concentratia
speciilor ionice necomplexate, libere (in mod strict [i] ar trebui sa fie activitatea ionului dar la concentratiile
normal intalnite in biosenzori, aceasta este efectiv egala cu concentratia). Aceasta inseamna, de exemplu,
ca pentru fiecare decada de crestere in concentratia H+ la 250C exista o crestere in potentialul electric de 59
mV. Dependenta logaritmica a potentialului de concentratia ionica este responsabila atat pentru domeniu
analitic larg dar si pentru exactitatea si precizia scazuta a acestor senzori. Domeniul lor normal de detectie
este 10-4 – 10-2 M, desi exista cativa care sunt de 10 ori mai sensibili. Timpul necesar pentru un raspuns
tipic este intre 1 si 5 minute permitand pana la 30 de analize per ora.

Biosenzorii care implica utilizarea sau eliberarea de H+ necesita utilizarea unor solutii tampon foarte
diluate (de ex. < 5mM) pentru a se putea determina schimbari semnificative de potential. Relatia dintre
modificarea de pH si concentratia substratului este complexa, incluzand unele efecte non-lineare ca variatia
activitatii de pH si efectul de tamponare a proteinelor. Insa, adesea conditiile pentru care exista o relatie
lineara intre schimbarea aparenta de pH si concentratia substratului, pot fi stabilite.

Desi s-a obtinut un important progres in realizarea de biosenzori, exista inca o serie de probleme
care trebuie rezolvate. Una dintre cele mai mari probleme este faptul ca performantele biosenzorului variaza
sau se degradeaza in timp relativ scurt, adesea prin forme, modalitati neasteptate. Acest fenomen impune
calibrarea lor regulata sau mai bine de fiecare data inainte de utilizare pentru o noua serie de analize.

Necesitatea de a rezolva astfel de probleme a condus la realizarea unor biosenzori cu electrozi ion-
selectivi care contin si tranzistori cu efect intr-un camp ion-selectiv (ISFET = Ion Selective Field). Cand contin
si enzima imobilizata cuplata cu campul in care transistorul actioneaza se numesc Enzyme Field Effect
Transistor (ENFET) (fig…).

Principalul avantaj al acestor sisteme este dimensiunea lor extrem de mica (<<0,1 mm2) ceea ce
permite producerea ieftina industriala a acestora folosindu-se tehnologia circuitelor integrate. In plus sunt
mult mai stabile decat cele fara tranzistori.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 84/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

De exemplu un astfel de sistem construit pentru determinarea la ureei, continand ureaza legata si un
electrod de referinta continand glicina legata, a aratat doar o variatie de 15% in raspunsul fata de uree (0,05
– 10,0 mg/ml) pe o perioada de activitate de o luna.

Au fost realizati diferiti biosenzori miniaturizati continand dispozitive ISFET si ENFET pentru
determinarea unor analiti. Senzitivitatea sistemelor FET poate fi insa afectata de compozitie, tarie ionica si
concentratiile solutiilor analizate.

Biosenzori Amperometrici

Biosenzorii amperometrici functioneaza prin producerea unui curent electric cand se aplica un
potential intre 2 electrozi. Acestia au in general timpi de raspuns, domenii dinamice si senzitivitati similare
biosenzorilor potentiometrici.

Cel mai simplu biosenzor amperometric aflat pe piata implica un electrod de oxigen Clark. Acesta
consta dintr-un catod de platina la care este redus oxigenul si un electrod de referinta argint/clorura de
argint. In mod normal ambii electrozi sunt scufundati intr-o solutie de clorura de potasiu saturata si separati
de masa de solutie in care se afla analitul printr-o membrana de plastic permeabila la oxigen (de exemplu
Teflon, politetrafluoroetilena).

Cand un potential de 0,6 V, corespunzator electrodului de Ag/AgCl, se aplica la catodul de platina, se


produce un curent proportional cu concentratia de oxygen si la electrozi au loc urmatoarele reactii:

anod de Ag: 4Ag0 + 4Cl- 4AgCl + 4e-

catod de Pt: O2 + 4H+ + 4e- 2H2O

Prin aplicarea unui potential de +0,68 V la electrodul de platina, reciproc fata de Ag/AgCl, se obtinan
reactii in sens contrar:

Pt anod: H2O2 O2 + 2H+ + 2e-

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 85/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Ag catod: 2AgCl + 2e- 2Ag0 + 2Cl-

Reducerea eficienta a oxigenului la suprafata catodului determina scaderea concentratiei la electrod


chiar pana la zero. De aceea viteza reducerii electrochimice depinde de viteza de difuzie a oxigenului din
masa solutiei, si care este la randul ei dependenta de gradientul de concentratie si deci de concentratia
oxigenului din masa de solutie. Este clar ca o mica, dar semnificativa, proportie de oxigen prezent in solutie
prin dizolvarea oxigenului din aer este consumata prin acest proces impreuna cu cel eliberat prin reactia
enzimatica. Acest lucru determina ca electrodul de oxigen sa fie mult mai sensibil la schimbarile de
temperatura comparative cu senzorii potentiometrici. De aceea consumul de oxigen in lipsa enzimei, in
conditiile de lucru de referinta, se stabileste pentru diferite temperaturi.

O aplicatie obisnuita pentru acest tip de biosenzor este determinarea concentratiilor de glucoza prin
utilizarea unei membrane cu glucoz oxidaza imobilizata. Alte oxidaze pot fi utilizate intr-o maniera similara
pentru analiza substratelor lor (de exemplu alcool oxidaza, D- si L – amino acid oxidaze, cholesterol oxidaza,
galactoz oxidaza si urat oxidaza).

Problema majora cu acesti biosenzori este dependenta lor de concentratia oxigenului dizolvat. Una
dintre metodele de rezolvare a acestei probleme este utilizatrea unor “mediatori” care transfera electronii in
mod direct la electrod ocolind procesul de reducere a co-substratului oxigen. Pentru a fi aplicabili, acesti
mediatori trebuie sa posede o serie de proprietati:

Ø Trebuie sa reactioneze rapid cu forma redusa a enzimei.

Ø Trebuie sa fie suficient de solubili, atat in forma redusa cat si cea oxidata; Aceasta solubilitate, nu ar
trebui sa fie, insa, prea mare incat sa favorizeze pierderi semnificative a mediatorului de la micro
mediului ce inconjoara membrana biocatalitica, in masa solutiei;

Ø Mediatorul solubil nu trebuie sa fie in mod general toxic.

Ø Sa fie capabili sa difuzeze rapid intre situsul activ al enzimei si suprafata electrodului.

Ø Potentialul suplimentar pentru regenerarea mediatorului oxidat, la electrod, ar trebui sa fie scazut si
independent de pH.

Ø Forma redusa a mediatorului nu ar trebui sa reactioneze rapid cu oxigenul.

O familie de compusi utilizati in mod obisnuit ca mediatori este cea a ferocenilor. Ferocenul care
reprezinta originea numerosilor derivati este fier ε5-bis-ciclopentadienil:

Un exemplu al reactiilor ce implica feroceni este:

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 86/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Nu au fost realizati electrozi care sa ia electronii direct de la enzimele reduse fara sa fie nevoie de
astfel de mediatori.

O alta posibilitate este utilizarea unor saruri organice conducatoare de electricitate ca invelis al
membranelor cu biocatalizator sau chiar inclusi in membrane impreuna cu biocatalizatorul respectiv. Astfel
de compusi sunt cationul N-metilfenazin (NMP+, fig..a) si radicalul anionic tetracianoquinodimetan (TCNQ,
fig…b).

Multe flavo-enzime sunt puternic adsorbite de asemenea conductori organici datorita formarii unor
legaturi saline, prin intermediul unor sarcini alternative pozitive si negative, in interiorul mediului lor
hidrofobic.

Asemenea electrozi enzimatici pot fi preparati prin simpla scufundare a electrodului intr-o solutie de
enzima. Chiar daca modul de preparare pare relative simpla, acestia pot ramane stabili timp de cateva luni.

Acesti electrozi pot fi de asemenea utilizati pentru reactii implicand dehidrogenaze NAD(P)+-
dependente care permit de asemenea oxidarea electrochimica a formelor reduse a acestor coenzime.

Cele trei tipuri de biosenzori amperometrici, folosind produsul, mediatorul sau conductorii organici
reprezinta trei generatii de dezvoltare a acestora (fig…).

In cei trei biosenzori, la enzima are loc urmatoarea reactie:

Substrat(2H) + FAD-oxidaza Produs + FADH2-oxidaza

Aceasta este urmata de procesele:

(a)
biocatalizator

FADH2-oxidaza + O2 FAD-oxidaza + H2O2

electrod

H2O2 O2 + 2H+ + 2e-

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 87/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

(b)
biocatalizator

FADH2-oxidaza + 2 Ferociniu+ FAD-oxidaza + 2 Ferocen + 2H+

electrod

2 Ferocen 2 Ferociniu+ + 2e-

(c)
biocatalizator/electrod

FADH2-oxidaza FAD-oxidaza + 2H+ + 2e-

Curentul (i) produs prin asemenea biosenzori amperometrici este legat de viteza de reactie (vA) prin
expresia:

i = nFAvA

unde n reprezinta numarul de electroni transferati, A este aria electrodului, si F este numarul lui Faraday. In
mod obisnuit viteza de reactie este influentata mai ales de capacitatea de difuzie a substraturilor dar si de a
produsilor de reactie respectivi. In aceste conditii curentul electric produs este proportional cu concentratia
analitului si independent atat de cinetica enzimatica cat si electrochimica.

Biosenzori Optici
Exista 2 domenii principale de dezvoltare a biosenzorilor optici. Acestea implica determinarea
schimbarilor in absorbtia luminii dintre reactantii si produsii unei reactii, sau masurarea luminii
rezultate printr-un proces luminescent. Primul domeniu implica larga tehnica, stabilita deja de cateva
decenii, de utilizare a benzilor test coloriometrice, folosindu-se o tehnologie destul de simpla. Aceste
benzi sunt benzi de celuloza impregnate cu enzima si reactivi si sunt de unica folosinta. Cel mai
utilizat domeniu al acestei tehnologii este monitorizarea sangelui pentru controlul diabetului. In acest
caz, benzile contin glucoz oxidaza, peroxidaza din hrean (EC 1.11.1.7) si un cromogen (de exemplu o-
toluidina sau 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina). Peroxidul de hidrogen, produs prin oxidarea aeroba a
glucozei:

b-D-glucoza + oxigen D-glucono-1,5-lactona + peroxid de hidrogen

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 88/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

oxideaza cromogenul slab colorant conducand la unul puternic colorat:


peroxidaza
cromogen(2H) + H2O2 colorant + 2H2O

Evaluarea benzilor colorate este cel mai bine realizata prin utilizarea unui aparat de reflexie
portabil. Adesea, insa, este utilizata compararea vizuala cu o diagrama colorata.
In prezent este disponibila o larga gama de benzi test cu diferite enzime.
Cel mai reusit biosenzor optic, pana in prezent, este cel care utilizeaza luciferaza produsa de
licurici (Photinus-luciferin 4-monooxigenaza (ATP-hidrolizare)), (EC 1.13.12.7), pentru a detecta
prezenta unor bacterii in alimente sau in probe clinice. Bacteriile sunt lizate in mod specific si ATP
eliberat (aproximativ proportional cu numarul de bacteria prezent) reactioneaza cu D-luciferina si cu
oxigen printr-o reactie care produce o cantitate mare de lumina galbena:
Luciferaza
ATP + D-luciferina + O2 oxyluciferina + AMP + pirofosfat + CO2 + lumina (562 nm)

Lumina produsa poate fi detectata fotometric prin utilizarea unor tuburi fotoamplificatoare
scumpe cu voltaj inalt dar este posibila si utilizarea unor sisteme fotodiodice ieftine de voltaj scazut.
Senzitivitatea sistemelor continand fotoamplificatori este, cel putin pana in present, oarecum mai mare
(< 104 cells ml-1, < 10-12 M ATP) fata de fotodetectorii mai simpli care utilizeaza fotodiode. Luciferaza
de la licurici este insa o enzima foarte scumpa, obtinandu-se numai din partile din spate ale licuricilor
salbatici. Utilizarea luciferazei imobilizate reduce in mare parte costul acestor analize.

Immunosenzori

Dezvoltarea evaluarilor a diferitilor analiti utilizand determinarea imunosorbtiei unor enzime legate,
asa numitul sistem ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) a dus si la dezvoltarea de biosenzori ce
includ ELISA. Principiul general al tehnicilor ELISA se bazeaza pe imobilizarea antigenului pe un support
solid, adaugarea apoi a anticorpilor conjugati cu enzima, incubarea acestora, adaugarea substratului si
cromoforului si dezvoltarea culorii. Metodele ELISA sunt directe, indirecte si sandwich. Toate pot fi
competitive sau de inhibitie. Cea mai simpla reprezentare a unui procedeu ELISA direct este prezentat in
figura….

ELISA este utilizata pentru a detecta si amplifica o reactive antigen-antiocorp;

Cantitatea de enzima legata de anticorp se leaga de antigenul imobilizat care este apoi determinat prin
comparare cu concentratia unor probe etalon si cuantificat prin viteza reactiei enzimatice. Enzimele cu un
numar mare de cicluri sunt utilizate pentru obtinerea de raspunsuri rapide. Cele mai utilizate enzime in
metodele ELISA sun peroxidaza si alcalin fosfataza. Senzitivitatea unor asemenea evaluari poate fi mult
imbunatatita prin utilizarea reactiilor catalizate de enzime care dau in mod intrinsec un raspuns mai mare, de
exemplu, acelea care conduc la cresterea culorii, fluorescentei sau bioluminiscentei produsilor.

Kit-uri de analiza folosind aceasta tehnica sunt in prezent disponibile pentru o gama larga de analize.
http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 89/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Pentru a le creste domeniul de analiza, viteza si sensibilitatea, recent, tehnicile ELISA au fost
combinate cu cele al biosenzorilor conducand la obtinerea de immunosenzori. Cel mai simplu
immunosenzor este realizat prin invelirea unui traductor cu complexul anticorp – enzima conjugata si
introdus in tubul cu antigenul imobilizat. Dupa timpul necesar echilibrarii si legarii, materialul nelegat este
spalat si aruncat. Cantitatea de antigen-enzima conjugata legata este determinata in mod direct din semnalul
traductorului.

Dezvoltarea impetuoasa a tehnicilor la care asistam in present vor conduce curand la dezvoltarea
unor imunosenzori mult mai avansati care se vor baza pe detectia directa a antigenului legat de anticorpul
care inveleste suprafata biosenzorului.

In mod particular biosenzorii piezoelectrici si cei FET se considera a fi foarte potriviti pentru astfel de
aplicatii.

Biosenzori Calorimetrici
Multe reactii catalizate de enzime sunt exoterme, generand caldura (table…). Aceasta poate fi
utilizata ca baza pentru masurarea vitezei de reactie si astfel concentratia analitului. Aceasta reprezinta tipul
de biosenzor cel mai aplicabil la modul general. Schimbarile de temperatura se determina, in mod obisnuit,
prin intermediul termistorilor la intrarea si la iesirea dintr-o mica coloana ce contine un pat cromatografic
realizat cu enzima imobilizata si care se afla intr-un mediu cu temperatura constanta (fig…).

In asemenea conditii, precis controlate, pana la 80% din caldura generata in reactie poate fi
inregistrata ca o schimbare de temperatura in procesul de curgere a probei prin coloana. Schimbarea de
temperatura poate fi usor calculata din modificarea entalpiei si cantitatea care a reactionat. Daca 1 mM
reactant este complet convertit in produs, intr-o reactie care genereaza 100 kJ/mol atunci fiecare ml de
solutie genereaza 0,1 J de caldura. La o eficienta de 80%, aceasta va determina o schimbare in temperatura
solutiei cu aproximativ 0,020C. Aceasta este in general schimbarea de temperatura intalnita procesele
enzimatice si pentru ca biosenzorul sa fie utilizabil, acesta trebuie sa aibe o rezolutie a temperaturii de
0,00010C.

Tabel…

Productia de caldura (entalpii molare) a reactiilor catalizate de enzime

Caldura produsa
Reactant Enzima
-DH (kJ mol-1)

Cholesterol Cholesterol oxidase 53

Esteri Chymotrypsin 4 - 16

Glucoza Glucose oxidase 80

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 90/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Hydrogen peroxid Catalase 100

Penicillina G Penicillinase 67

Peptide Trypsin 10 - 30

Amidon Amylase 8

Sucrosa Invertase 20

Urea Urease 61

Acid uric Uricase 49

Termistorii, utilizati sa detecteze schimbul de temperatura, functioneaza prin modificarea rezistentelor


lor electrice cu temperatura, si asculta de relatia:

(2)

sau:

(3)

unde R1 si R2 sunt rezistentele termistorilor la temperaturile absolute T1 si T2 respectiv, iar B este o


caracteristica constanta de temperatura pentru termistor.

Cand schimbul de temperatura este foarte mic, ca in cazul prezent, valoarea B(1/T1)-(1/T2) este mult

mai mica decat unu si relatia (3) poate fi substantial simplificata folosind aproximatia, cand x<<1 atunci ex» 1
+ x [am notat aici x = B(1/T1)-(1/T2)]. Relatia (3) devine:

(4)

Deoarece T1 » T2 acestea pot fi inlocuite la numitor prin T1

(5)

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 91/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Descresterea relativa in rezistenta electrica (ΔR/R) a termistorului este proportionala cu cresterea


temperaturii (ΔT). O constanta de proportionalitate tipica (-B/T12) este de

- 4%0C-1. Modificarea rezistentei este convertita intr-o schimbare proportionala de voltaj, folosindu-se o
punte Wheatstone balansata, ce incorporeaza un rezistor de precizie, inainte de amplificare.

In cazul acestor biosenzori presupunerea ca exista o corelatie liniara intre raspuns si activitatea
enzimatica a fost confirmata in practica.

O problema majora cu acest tip de biosenzori, este dificultatea de a se gasi o potrivire cat mai
stransa intre constantele de temperatura a termistorilor de masurare si a celor de referinta. O schimbare
termica egala cu numai 10C in temperatura de fundal, a mediului inconjurator a ambilor termistori cauzeaza
in mod obisnuit o modificare aparenta in rezistentele relative ale termistorilor, echivalenta cu 0,010C. Aceasta
valoare este de multe ori egala cu intreaga scala de schimb datorata reactiei. Este in mod clar, de mare
importanta ca o asemenea schimbare a temperaturii mediului inconjurator sa fie evitata. Aceasta a condus la
includerea unui bloc de aluminiu bine izolat in proiectul biosenzorului.

Senzitivitatea (10-4M) si domeniul (10-4 – 10-2 M) a biosenzorilor cu termistori sunt ambele destul de
scazute pentru majoritatea aplicatiilor, desi senzitivitati mai mari sunt posibile prin folosirea unor reactii mai
exoterme (de exemplu catalaza). Slaba senzitivitate a sistemului poate fi crescuta substantial prin cresterea
caldurii de reactie. In cel mai simplu caz aceasta se poate realiza prin cumularea mai multor reactii, intr-o
cale complexa de reactii, toate contribuind la producerea de caldura. Astfel senzitivitatea analizei glucozei
folosind glucoz-oxidaza poate mai mult decat dublata prin co-imobilizarea cu catalaza in coloana reactorului
in scopul de a descompune peroxidul de hidrogen produs. Un model de astfel de amplificare este prezentat
in ciclul schemei de detectie a ADP:

ADP este analitul ce se determina si se adauga in sistem la un exces de glucoza, fosfoenol piruvat,
NADH si oxigen pentru a se asigura maximum de reactie. Patru enzime (hexokinaza, piruvat kinaza, lactate
dehidrogenaza si lactate oxidaza) sunt co-imobilizate in patul cromatografic al reactorului. In ciuda unei
entalpii pozitive a reactiei piruvat kinazei, procesul global conduce la o crestere de 1000 de ori in
senzitivitate, in primul rand datorita ciclului dintre piruvat si lactat.

Limitarea reactiei datorata scazutei solubilitati a oxigenului, poate fi depsita prin inlocuirea lui cu
benzochinona, care este redusa la hidrochinona de catre flavo-enzime.

Asemenea sisteme de reactii, insa, au serioase dezavantaje prin faptul ca ele cresc probabilitatea
existentei unor interferente in determinarea analitului de interes.

Reactiile implicand generarea de ioni de hidrogen pot fi facute mult mai sensibile prin includerea unei
baze care degaja multa caldura la protonare. De exmplu, caldura produsa prin reactia penicilinazei poate fi
aprope dublata prin utilizarea Tris(tris-(hidroximetil)aminometan) ca tampon.

In concluzie, principalele abantaje ale biosenzorilor cu termistori sunt aplicabilitatea generala si


posibilitatea utilizarii lor in solutii tulburi sau puternic colorate. Cel mai important dezavantaj este dificultatea

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 92/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

de a se asigura ca temperatura curentului de proba sa ramana constanta (± 0,010C).

Biosenzori Piezo-electrici
Cristalele piezo-electrice (de exemplu cuartul) vibreaza sub influenta unui camp electric. Frecventa
acestor oscilatii (f) depinde de grosimea si modul in care este taiat cristalul, fiecare cristal avand o frecventa
rezonanta caracteristica. Aceasta frecventa de rezonanta se schimba cand se absorb sau desorb molecule
pe suprafata cristalului, conform relatiei:

unde ∆f este schimbarea in frecventa de rezonanta (Hz), ∆m este schimbarea de masa absorbita (g), K este
o constanta pentu fiecare cristal depinzand de factori ca densitatea si modul de taiere a cristalului, si A este
aria de suprafata care absoarbe (cm2). Pentru orice cristal piezo-electric, schimbarea in frecventa merge
pana la 2% si este proportionala cu masa materialului absorbit. Aceasta schimbare de frecventa este usor
detectata utilizandu-se circuite electronice relativ nesofisticate. O utilizare simpla a unui astfel de traductor
este utilizarea biosenzorului pentru formaldehida. Acesta foloseste formaldehid dehidrogenaza imobilizata
care inevelste un cristal de cuart si care este sensibil la formaldehida gazoasa.
Deficienta majora a acestor sisteme este interferenta cu umiditatea atmosferica si dificultatea de
utilizare a lor pentru determinarea unui material aflat in solutie. Ele sunt, insa, ieftine, mici, robuste si
capabile sa dea un raspuns rapid.

Reactii Enzimatice in Sisteme Lichide Bifazice

Adeseori ne-ar ajuta, ar fi util, daca am putea opera cu reactii catalizate enzimatic in alti solventi
decat apa. Desi apa este solventul major in viata de pe pamant pentru majoritatea reactiilor in care sunt
implicati compusi organici, nu este mediul cel mai potrivit. Realizarea unor reactii catalizate enzimatic in
medii formate din solventi organici prezinta o serie de avantaje:

? Numerosi reactanti cum sunt oxigenul molecular, lipidele sau steroizii, sunt mult mai solubili in
solventi organici decat in apa.

? De asemenea o serie de produsi sunt mai labili in apa decat in unii solventi organici.

? Realizarea unor astfel de reactii, ca de exemplu oxidarea aeroba a oestrogenilor prin cataliza cu
lacaza fungica, in medii ne-apoase permite obtinerea unei activitati mult crescute.

? Pe de alta parte contaminarea microbiana este in astfel de solventi o problema mult mai mica, iar
ca o consecinta, absenta proteazelor microbiene poate conduce la o stabilitate aparenta crescuta a
biocatalizatorului.

? Unele reactii de polimerizare, cum sunt cele de polimerizare a fenolilor catalizate de peroxidaze,
conduc la produsi cu o greutate moleculara mare care precipita in solutiile apoase, mult mai apte sa dizolve
produsii formati in primele etape ale reactiei cum sunt oligomerii.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 93/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

? In conditiile fiziologice normale, enzimele hidrolitice catalizeaza degradarea polimerilor, astfel


hidrolazele si transferazele scindeaza in mod normal polimerii transferand una din parti la acceptorul care
este apa. In astfel de reactii apa este prezenta intr-un exces molecular larg, comparativ cu alti potentiali
acceptori ai moleculelor scindate. In plus, “concentratia” normala a apei (in jur de 55,5 M) este mult mai mare
decat valoarea sa Km tipica (in jur de 50 mM) astfel incat viteza sa de hidroliza nu afecteaza reactiile
enzimatice de hidroliza. Daca se reduce foarte mult activitatea apei in aceste sisteme se poate realiza
transferul moleculelor scindate catre alti acceptori. Exemple pentru astfel de fenomene sunt reactiile de
transesterificare ale esterazelor si lipazelor sau chiar formarea nedorita a izomaltozei din glucoza, reactie
catalizata de glucoamilaza.

? Indepartarea enzimei din faza organica care contine produsii rezultati, se realizeaza in mod
efectiv prin imobilizarea sa si apoi separarea sa directa, folosind tehnicile simple ale separatorilor utilizati
normal in industria chimica;

? Unul dintre avantajele majore este stabilitatea enzimelor in aceste sisteme;

Principalul beneficiu al acestor sisteme este insa abilitatea lor de a modifica echilibrul termodinamic al
acestor reactii. Asa cum se stie, enzimele nu isi schimba constantele de echilibru (Eeq) ale reactiilor atunci
cand intervin schimbari ale conditiilor fizice ca temperatura, pH sau presiunea. Totusi intervin, in aceste
situatii, usoare schimbari ale stabilitatii enzimei. Utilizarea insa a sistemelor bifazice apa-solvent organic,
poate conduce la schimbari esentiale in utilizarea practica a constantei “aparente” de echilibru (Eeq).

Stabilitatea si integritatea activitatii enzimelor hidrofile este dependenta de prezenta cel putin a unui
strat subtire de apa, de cateva molecule grosime, in micromediul ce inconjoara enzima. Aceasta cantitate de
apa este in fapt minuscula, intre 50 si 500 molecule de apa pentru fiecare molecula de enzima, astfel se
poate aprecia ca enzimele au capacitatea de a actiona aproape in stare anhidra. Unele lipaze hidrofobice isi
pastreaza activitatea chiar daca ii raman doar foarte putine molecule de apa, probabil doar cele absolut
necesare pentru stabilizarea conformatiei/structurii situsului activ.

Astfel la alegerea sistemelor bifazice trebuie sa se aibe in vedere caracterul polar sau non-polar al
enzimelor deoarece enzimele hidrofile sunt mult mai solubile in apa si cele majoritar hidrofobe, adesea
asociate cu lipide si membrane cum sunt de exemplu lipazele, care sunt mai solubile in solventi organici.

Utilizarea enzimelor in solventi organici conduce in mod normal la un sistem cu 2 faze. In general
enzimele sunt solubile in apa si contin ele insele o cantitate semnificativa de apa puternic legata, chiar daca
ele sunt intr-o stare aparent uscata. In figura de mai jos sunt reprezentate schematic configuratiile unei
enzime intr-un solvent organic: a – numai solventul organic; b – solvent organic plus surfactant si uneori plus
de asemenea un cosurfactant (surfactant/cosurfactant = agent superficial activ = specie activa la interfata
dintre 2 faze; surfactantul/cosurfactantul se acumuleaza la interfata si ii modifica tensiunea superficiala).

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 94/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Figura 1 Diagrama schematica a unei enzime intr-un solvent organic. (a) enzima aproape anhidra este suspendata in
solventul organic. Enzima (E) este inconjurata printr-un strat subtire, interfata, format din molecule de apa sau apa plus
suportul de imobilizare. (b) enzima este dizolvata intr-un mediu micelar inversat. Micelele care se formeaza prin
intermediul surfactantului si in unele cazuri si cosurfactantului permit o solubilizare a enzimei in solventul organic.
Surfactantul se gaseste numai la interfata in timp ce cosurfactantul, nemiscibil cu apa, adera in proportii variate la interfata.
El este in general mai putin polar si mult mai solubil in faza organica continua. Ambele sisteme, (a) si (b), formeaza solutii
transparente din punct de vedere optic.

Este imposibil de masurat sau controlat in mod direct pH-ul unui astfel de fond minuscul de apa care
nu contine nici un ion de hidrogen liber. Se pare insa ca enzima “tine minte” valoarea de pH a ultimei sale
solutii apoase si functioneaza ca si cum ar avea acel pH. Daca apa legata de enzima este indepartata sau
diluata prin utilizarea unor solventi organici in care apa este solubila sau miscibila, atunci este in mod
obisnuit inactivata.

De asemenea, cantitatea limitata de apa disponibila, si reducerea activitatii apei, asociata cu aceasta,
determina o considerabila reducere a vitezei de termoinactivare si ca urmare un efect de stabilizare pentru
cele mai multe dintre enzime. De exemplu lipaza pancreatica porcina are timpul de injumatatire a activitatii
enzimatice la 1000C mai mare de 12 ore cand se afla intr-o solutie de 0,02% apa in tributirina, in timp ce
acest timp scade la 12 minute la o concentratie de apa de 0,8% si inactivarea sa este practic instantanee la
o concentratie de 100% apa. In plus in astfel de sisteme punctul de inghetare al apei scade fapt ce face
posibila utilizarea unor enzime labile termic la temperaturi foarte scazute.

Scaderea activitatii apei tinde sa conduca la molecule enzimatice mult mai rigide, ceea ce poate
afecta atat Km sa cat si vmax, iar in cazuri extreme aceasta poate conduce la schimbari in proprietatile
catalitice. Lipaza pancreatica porcina demonstreaza acest efect deoarece in sisteme bifazice cu o activitate
scazuta a apei, nu mai catalizeaza reactiile de transesterificare ce implica alcoolii tertiari din solutie.

In stabilirea sistemelor bifazice, cel mai important factor in balanta stabilitate si inactivare, ce trebuie
luat in calcul datorita fazei organice, este polaritatea solventului. Solventii cu polaritate mai scazuta (de
exemplu cu hidrofobicitate mai mare) sunt mai putin capabili sa rupa moleculele de apa strans legate de
structura enzimei. Polaritatea poate fi cel mai bine masurata prin logaritmul coeficientului de partitie (logP) a
solventului organic intre n-octanol si apa.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 95/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

logP = log10 (1)

Cu cat logP este mai mare, cu atat mai non-polar, hidrofobic este solventul.

In tabelul de mai jos sunt prezentate cateva valori logP pentru solventii cei mai utilizati.

Tabel…

Valorile logP pentru cei mai utilizati solventi organici.

Solvent LogP Solvent LogP

Butanona 0.3 1,1,1-tricloroetan 2.8

Etil acetat 0.7 tetraclorura de Carbon 2.8

Butanol 0.8 Dibutil eter 2.9

Dietil eter 0.8 Ciclohexan 3.1

Clorura de Metilen 1.4 Hexan 3.5

Butil acetat 1.7 eter de petrol (60-80) 3.5

Di-isopropil eter 2.0 eter de petrol (80-100) 3.8

Benzen 2.0 Dipentil eter 3.9

Cloroform 2.2 Heptan 4.0

Tetracloroetilen 2.3 eter de petrol (100-120) 4.3

Toluen 2.7 Hexadecan 8.7

Valorile logP cresc cu aproximativ 0,52 pentru fiecare grupare metilen (-CH2-) adaugata

intr-o serie omoloaga. Astfel logP a hexanolului este valoarea butanolului de 0,8 plus 2x0,52 deci
aproximativ 1,8.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 96/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Alegerea fazei organice depinde de asemenea de factori suplimentari cum sunt costul, capacitatea de
recuperare, riscul de incendiu sau evaporare precum si unele efecte inhibitoare specifice.

O modalitate simpla de a realiza stabilitatea enzimelor in solventi organici este de a impregna perle
de polimer hidrofilic (ex. Sephadex, agaroza) cu enzima si apoi de suspendare a patului umed direct in faza
organica. Aceste operatii sunt foarte importante si determina in mare parte alegerea celei mai potrivite faze
organice. De asemenea astfel de paturi impregnate au si urmatoarele avantaje suplimentare:

v Protejeaza enzima pe care o contin fata de denaturarea de la interfata lichid-lichid la viteze de


agitare mai ridicate;

v Usureaza foarte mult recuperarea biocatalizatorului;

v Pot utiliza coenzime hidrofilice cu greutate moleculara mica (exemplu NAD(P)+) sprijinind
procesul de regenerare a coenzimei, aceasta fiind efectiv imobilizata in fondul apos; si

v Permit utilizarea continua si eficienta a PBRs (reactoarelor enzimatice) bifazic atata timp cat
faza organica mobila ramane saturata cu apa (PBR = Packed Bed Reactors).

Sistemele bifazice pot fi in plus stabilizate prin utilizarea apei deuterate (D2O). Aceasta reduce viteza
inactivarii termice desi determina o cresterea a pKa a grupelor ce se pot ioniza cu circa 0,4 precum si
schimbari asociate ale relatiei dintre activitatea si stabilitatea pH-ului. Costul ridicat al apei deuterate este
intr-o oarecare masura compensat de cantitatile mici necesare in aceste sisteme si usurinta cu care aceasta
poate fi recuperata la sfarsitul procesului catalitic.

Un exemplu practic de proces enzimatic in sistem bifazic este cel de obtinere a siropului bogat in
fructoza. Pentru realizarea siropului de porumb bogat in fructoza, glucoz-izomeraza se afla in solutie apa-
etanol. Astfel in solutii cu 80% v/v etanol, fractia de fructoza poate fi ridicata cu 10% pana la 55% la 300.
Acest proces este foarte avantajos din punct de vedere economic chiar daca activitatea enzimatica scade cu
circa 10% comparativ cu cea existenta in absenta etanolului.

Echilibre in Sisteme Bifazice Apa-Solvent Organic

Cea mai mare parte a teoriei asupra ecilibrului aparent in sistemele bifazice a fost elaborata de Karel
Martinek si colaboratorii sai de la Universitatea de Stat Lomonosov din Moscova.

Echilibre in sisteme bifazice apa-solvent organic cu un substrat.

Daca consideram o simpla reactie ce implica un echilibru intre un reactant A si un produs B, Kw


reprezinta constanta de echilibru (Keq) a acestei reactii in apa:

(I)

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 97/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Daca aceasta reactie are loc intr-un sistem bifazic constand dintr-un amestec de apa si un solvent
organic, atat substratul A cat si produsul B vor fi repartizati intre cei doi solventi, avand coeficientii de partitie
PA respective PB si o diferita constanta de echilibru ce se stabileste intre A si B pentru faza organica (Korg).

(II)

unde

(2)

(3)

(4)

(5)

Datorita naturii ciclice a acestui echilibru numai trei din acesti parametri sunt variabile independente si
anume Kw PA si PB in timp ce Korg depinde de acestia. De aceea in discutarea echilibrului bifazic vom lua in
calcul in special parametrii Kw PA si PB, desi in anumite conditii de concentratie foarte scazuta a apei se vor
folosi mai degraba parametrii Korg, PA si PB. Constanta generala de echilibru a acestui sistem (Kbifazic) poate
fi definita ca:

Kbifazic = (6)

unde t se refera la total, adica la solutia totala formata din apa si solventul organic, substratul total respectiv
produsul total din cele doua faze. Daca notam cu V volumele implicate atunci vom avea:

[At]Vt = [Aw]Vw + [Aorg]Vorg (7)

[Bt]Vt = [Bw]Vw + [Borg]Vorg (8)

Vt = Vw + Vorg (9)

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 98/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Substituind din ecuatiile 7 si 8 in 6 obtinem:

Kbifazic = = (10)

Kbifazic = = (11)

Substituind coeficientii de partitie din ecuatiile 4 si 5 se obtine relatia simplificata:

Kbifazic = Kw (12)

unde a este raportul volumelor de faza organica si faza apoasa:

a= (13)

Constanta generala, globala, de echilibru (Kbifazic) variaza cu volumele relative ale fazelor organice si
apoase si evident cu coeficientii de partitie respectivi; creste cand substratul este partitionat mai eficient in
faza apoasa in comparatie cu comportarea produsului (PA<PB) si descreste cand are loc fenomenul in sens
invers. Daca exista diferente suficiente intre coeficientii de partitie, si atat substratul cat si produsul sunt
relativ non-polari, atunci au loc importante deplasari in echilibru chiar la continuturi relativ inalte de apa. O
crestere importanta a constantei de echilibru se poate obtine cand atat substratul cat si produsul au
coeficienti de partitie mai mici decat 1 si raportul dintre acestia este potrivit.

In mod evident daca a este foarte mic, Kbifazic tinde spre valoarea constantei de echilibru in solutie
apoasa Kw. Insa, daca a este suficient de mare ecuatia 12 se simplifica la:

Kbifazic = Kw (14)

In consecinta substituind din ecuatiile 2 – 5, vaorile coeficientilor de partitie, se obtine:

Kbifazic = = Korg (15)

Prin urmare Kbifazic tinde spre valoarea Korg, constanta de echilibru a reactiei in lichidul organic pur.

Echilibre in sisteme bifazice apa-solvent organic cu doua substraturi.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 99/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Multe reactii enzimatice sunt bimoleculare, fiind de aceea in mai mare masura influentate de
sistemele bifazice. Procesele pot fi reprezentate intr-o maniera similara celei utilizate pentru sistemele
monomoleculare:

(III)

Folosind acelasi rationament ca in cazul reactiilor monomoleculare, din constantele de echilibru se


obtine ecuatia:

Kbifazic = Kw (16)

Ca si in cazul reactiilor monomoleculare, cand constanta corespunzatoare pentru apa este foarte
mica (de ex. a este foarte mare) constanta echilibrului tinde spre valoarea constantei in solventul organic
Korg. Insa, ecuatia 16 contine valoarea a de patru ori si la valori intermediare poate produce o valoare
maxima sau minima a constantei de echilibru care este diferita atat fata de Kw cat si Korg de cateva zeci de
ori. De exemplu constanta generala de echilibru poate fi mai mare decat constanta de echilibru al aceleiasi
reactii in una din fazele pure. In unele circumstante aceasta poate determina ca productivitatea reactiei in
sistemul bifazic sa fie mai mare decat cea atinsa in oricare din fazele pure.

Cazul hidrolazelor.

Un caz special si important al sistemelor bimoleculare este cel in care unul dintre reactanti este apa
(de exemplu cazul hidrolazelor). Schema acestor reactii poate fi scrisa in mod similar cu schema (III):

(IV)

Directia normala pentru reactia in solutia apoasa procesul hidrolitic de la dreapta la stanga. Insa,
constanta generala de echilibru poate fi deplasata in solutiile bifazice, asa cum am aratat mai sus, si poate
permite hidrolazei sa actioneze mai degraba intr-o maniera sintetica decat hidrolitica (de exemplu de la
stanga la dreapta in schema IV). Asemenea reactii des intalnite in procesele tehnologice care utilizeaza
enzime, ca si reactiile sintetice sunt, in general, mult mai dificil a se realiza in bune conditii prin chimia

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 100/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

organica clasica decat reactiile hidrolitice. In mod particular cand este solicitata o regiospecificitate pentru
gruparile reactive ale substratelor. Doi factori pot afecta, in asemenea reactii produsul C: 1 – deplasarea
constantei aparente de echilibru (Kbifazic); si 2 – concentratia apei ([(H2O)t]). Ca unul din reactantii
participanti [(H2O)t] poate fi obtinuta din balanta materialelor:

[(H2O)t](Vw + Vorg) = [(H2O)w]Vw + [(H2O)org]Vorg (17)

unde [(H2O)w] este concentratia molara a apei pure ( = 1000/18 = 55,5 M). Substituind Pw pentru [(H2O)org]/
[(H2O)w], obtinem:

[(H2O)t] = (18)

Kbifazic = (19)

Substituind Kbifazic cu valorile din ecuatia 16 (inlocuind PD cu Pw) si rearanjand termenii se obtine:

[Ct] = Kw (20)

Aceasta reprezinta o relatie foarte complexa dar pot fi facute cateva generalizari. Daca produsul C
este mai putin polar decat oricare dintre reactanti (A si B) atunci productia creste in general cu concentratia
corespunzatoare a fazei organice (a) pana la atingerea unei valori constante, un platou. Daca are loc
fenomenul invers atunci la valori a inalte va fi o productie scazuta in diagarma a - productie. In functie de
parametrii de lucru se pot obtine atat valori maxime cat si minime.

In vederea obtinerii unor conversii inalte, apa produsa trebuie indepartata din sistemul bifazic. Daca
nu este indepartata, atunci apare o continua scadere in valoarea a care va determina scaderea intinderii
echilibrului favorabil procesului. Nu exista nici o modalitate simpla de indepartare a apei dar reactoare care
permit adaugarea constanta de catalizator proaspat si faza organica reduce dimensiunea problemei.

Cazul acizilor si bazelor

Folosirea sistemelor bifazice influenteaza de asemenea procesul de ionizare a gruparilor acide si


bazice. Considerand ionizarea unui acid HA, cand numai formele neionizate ale acidului sunt solubile in faza
organica in timp ce speciile ionice sunt solubile numai in faza apoasa:

(V)

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 101/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Ka,w = (21)

pKa,w = pH + log10 (22)

Concentratia ionului de hidrogen, asa cum se stie, este caracteristica fazei apoase:

pKa,bifazic = pH + log10 (23)

Evaluarea balantelor de masa pentru A- si HA conduce la:

[A ]Vt = [A ]Vw (24)

[HAt]Vt = [HAw]Vw + [HAorg]Vorg (25)

inlocuind valoarea de pH din ecuatia 22 in ecuatia 23 se obtine:

pKa,bifazic = pKa,w + log10 (26)

Substituind din ecuatiile 24 si 25 relatia de mai sus se simplifica obtinandu-se:

pKa,bifazic = pKa,w + log10(1 + aPHA) (27)

In mod similar se pot obtine ecuatiile pentru protonarea unei baze:

(VI)

pKb,bifazic = p Kb,w - log10(1 + aPBaza) (28)

O evaluare calitativa a schemelor de reactie V si VI arata ca cresterea coeficientului de partitie pentru


acid sau baza neutra va determina impingerea reactiei departe de formarea de specii ionice. Din ecuatiile 27
si 28 reiese ca valorile pK pentru acizi cresc in sistemele bifazice in timp ce acelea ale bazelor descresc.
Aceste schimbari pot fi foarte bine cateva unitati de pH, depinzand de coeficientii de partitie si fractia de
solvent organic prezenta. Modificari de crestere ale valorilor pKa apar in plus si datorita scaderii constantelor
dielectrice ale fazelor apoase in prezenta unor solventi organici. Aceasta este in mod particular relevanta in
conditiile de stare aproape anhidre (de exemplu cand a este mare) care tind sa “inghete” ionii de hidrogen

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 102/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

scazand activitatea lor. Utilitatea unei deplasari in valorile pKa pot fi aratate folosind de exemplu sinteza unui
ester catalizata de catre a-chimotripsina:

(VII)

unde RCOOH si RCOO- reprezinta formele neionizate si ionizate ale N-benzoil-L-fenilalanina,


RCOOR' reprezinta esterul N-benzoil-L-fenilalanin etil si R'OH reprezinta etanolul. Desi reactia
non-ionica din solutia apoasa este chiar balansata (Knonionic,w= 7), reactia globala decurge
spre stanga, in apa la pH neutru, datorita impingerii de catre ionizarea acidului (pKa = 3,4). In
sistemul bifazic cloroform-apa (a = 20, PHA = 100), Ka se deplaseaza cu trei unitati pentru a
da un pKa aproape de 7. Aceasta, impreuna cu o deplasare a constantei de echilibru datorata
efectelor de partitie, produce o deplasare globala a constantei de echilibru la pH-ul optim al
enzimei (pH = 7,5)(figura …). Utilizarea unui sistem bifazic permite ca reactiile sa aibe loc la un
pH care este favorabil atat din punct de vedere termodinamic pentru orientarea reactiei in
directia dorita cat si pentru o eficienta catalitica optima a enzimei.

Incotro tehnologia enzimelor?

Exista numeroase directii in care se aplica astazi tehnologii enzimatice si care ocupa primul loc in
cercetarea si dezvoltarea biotehnologiilor. In fapt, astazi doar relativ putine enzime sunt disponibile pe scara
mare (cantitati mai mari de kg) si adecvate pentru aplicatii industriale. Exista astfel o serie de cai prin care se
pot aborda aceste deficient. Cele mai larg utilizate sunt:

1. Noi enzime sa fie gandite in mediul natural si prin selectia de tulpini microbiene potrivite;
2. Sa fie utilizate sisteme enzimatice mult mai complexe.
3. Enzimele industriale a caror tehnologie de obtinere a fost déjà stabilita sa poata fi utilizate prin
conceperea unui larg numar de modalitati;
4. Noi enzime sa fie proiectate si produse prin inginerie genetica; si
5. Sa fie proiectati si sintetizati noi catalizatori organici prin utilizarea ‘knowhow’-ului stabilit in
enzimologie;

Fiecare dintre aceste domenii are o larga si in continua extindere literatura de specialitate. Unele
dintre progresele din ultima perioada se pot considera ca apartin probabil mai degraba altor domenii ale
stiintei. Astfel, dezvoltarea imbunatatirii prin genetica a enzimelor este in general realizata de specialistii in
biologie moleculara in timp ce proiectarea si sinteza unor catalizatori similari enzimelor este alocata

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 103/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

chimistilor organicieni. Insa, ambele grupuri de cercetatori mentionati, au ca baza stiinta furnizata lor de catre
tehnologiile in enzimologie.

Unele aspecte ale problemelor mentionate aici se discuta in continuare.

Utilizarea unor substraturi ‘nenaturale’.

Multe enzime sunt total nespecifice pentru substraturile lor naturale. S-a demonstrat ca unele enzime
pot cataliza reactii complet diferite fata de cele considerate ca reactiile lor normale si reflectate in denumirea
si numarul lor dat de EC (Enzymology Commission). Uneori este necesar ca enzima sa fie plasata intr-un
mediu neobisnuit pentru ca ea sa-si etaleze noi activitati. Astfel, lipazele actioneaza ca transesteraze in
medii ne-apoase. In unele cazuri, aceste schimbari de mediu nu sunt necesare pentru a se descoperi noi
proprietati.

Cateva exemple a unor astfel de situatii:

Glucoz-oxidaza (EC 3.2.1.20) este specifica pentru substratul sau D-glucoza, dar foarte nespecific
fata de oxidant, care este in mod normal oxigenul molecular. De exemplu a fost stabilit ca benzochinona este
de asemenea un eficace substrat acceptor de electroni pentru aceasta enzima:

Β-Dglucoza + benzochinona D-glucono-1,5-lactona


+ hidrochinona

Utilizarea benzochinonei ca substrat acceptor de electroni ofera cateva avantaje:

? Produsul acestei reactii, hidrochinona, este un compus organic folositor, fiind utilizat industria
fotografica si ca oxidant;

? Reactia conduce practic la o productie de 100%, deoarece nu se produce peroxid de oxigen, care
rezulta atunci cand se utilizeaza oxigenul molecular si induce inactivarea enzimei;

? Datorita solubilitati ceva mai mari a benzochinonei comparativ cu cea foarte scazuta a oxigenului
molecular, reactia de mai sus poate avea o viteza de productie de cateva ori mai mare decat cea a
reactiei ‘naturale’.

Acetilcolinesteraza (EC 3.1.1.7) catalizeaza in mod normal hidroliza acetilcolinei,


neurotransmitatorul excitator in junctiiunile sinaptice ale vertebratelor:

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 104/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

acetilcolina + apa
colina + acid acetic

S-a gasit ca acetilcolinesteraza tiparului electric are o capacitate suplimentara si anume de a cataliza
hidroliza stereospecifica a acetil-D-carnitina dar nu si a acetil-L-carnitinei.

acetil-D-carnitina + apa
D-carnitina + acid acetic

Desi reactia specifica implicand acetil-D-carnitina are o viteza de ordinul doi, iar constanta este de
patru ordine de marime mai mica decat cea utilizand acetilcolina, la concentratii inalte de substrat
productivitatile sunt comparabile. Acest fenomen se datoreaza faptului ca substratul natural ‘acetilcolina’
determina o pronuntata inhibitie de substrat fenomen care nu apare in cazul acetil-D-carnitinei. Reactia
‘nenaturala’ este utila deoarece poate fi utilizata la prepararea L-carnitinei, una dintre vitaminele cu
numeroase aplicatii terapeutice, izomerul D- fiind inactiv din punct de vedere biologic.

Aceasta enzima poate fi utilizata intr-o maniera similara modului in care aminoacilaza este utilizata
pentru separarea aminoacizilor racemici. DL-carnitina racemica sintetizata chimic poate fi acetilata, folosind
clorura de acetil si se obtine acetil-DL-carnitina. Apoi acetilcolinesteraza poate fi utilizata pentru a poduce un
amestec de acetil-L-carnitina si D-carnitina care se pot apoi separa usor prin cromatografie de schimb ionic.
Acetil-L-carnitina este biologic activa ca si L-carnitina si poate fi utilizata ca atare.

Ingineria enzimelor

Unul dintre cele mai atractive domenii de dezvoltare a enzimologiei care a luat amploare doar in
ultimii ani este aplicarea tehnicilor de inginerie genetica la tehnologia enzimelor. Aceasta ramura a
enzimologiei are in prezent o infloritoare dezvoltare.

In principal se utilizeaza doua cai de aplicare a ingineriei asupra enzimelor:

? de inginerie genetica prin procedee de clonare; si


http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 105/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

? de ingineria proteinelor prin mutageneza in situsuri convenabile ale enzimelor.

In ambele cazuri circuitul general de urmat pentru a se ajunge la produsul dorit poate fi reprezentat ca
in figura 1.

Figura.1 Ciclu de inginerie proteica. Procesul incepe cu izolarea si caracterizarea enzimei cerute. Aceasta
informatie este analizata impreuna cu baza de date cunoscuta referitoare la efectele structurale ale substitutiei
de aminoacizi pentru a se realiza o structura posibil imbunatatita. Aceasta enzima artificiala este construita prin
mutageneza directa a situsului dorit, izolata si caracterizata. Rezultatele, cu success sau nu, se adauga la baza
de date, si procesul se repeat pana cand se obtine rezultatul dorit.

Ingineria genetica.

Exista o serie de proprietati care pot fi modificate, imbunatatite sau alterate, prin inginerie genetica
cum sunt productia si cineticile enzimatice, facilitatea de prelucrare a produsilor obtinuti precum si diferite
aspecte de securitate. Enzimele obtinute cu ajutorul unor microorganisme periculoase sau neaprobate din
diferite motive, din plante cu dezvoltare lenta sau limitata, sau din tesuturi animale, pot fi clonate in
microorganisme sigure si inalt productive. In viitorul apropiat, enzimele pot fi reproiectate astfel incat sa fie
mult mai adecvate proceselor industriale. De exemplu sa se faca glucozizomeraza mult mai putin
susceptibila inhibitiilor cu Ca2+ prezent in fluxul procesului de zaharificare a amidonului.

Cantitatea de enzima produsa de catre un microorganism poate fi crescuta prin cresterea numarului
de gene care codifica enzima respectiva.

Acest principiu este utilizat pentru cresterea activitatii penicillin-G-amidazei din Escherichia coli. ADN-
ul celular dintr-o tulpina producatoatre este selectiv clivat prin utilizarea endonucleazei de restrictie HindIII.
Aceasta hidrolizeaza ADN-ul la situsurile relativ rare care contin secventa bazica 5’-AAGCTT-3’pentru a da
fragmente dispuse identic in zigzag.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 106/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

ADN intact ADN


clivat

ADN-ul total este clivat in circa 10.000 de fragmente din care numai unul contine informatia genetica
necesara. Aceste fragmente sunt clonate individual intr-un vector cosmid si apoi reintroduse in E.coli.
Coloniile continand gena activa sunt identificate prin actiunea lor inhibitoare asupra unui organism sensibil la
acid 6-amino-penicilanic. Aceste colonii sunt izolate si gena penicillin-G-amidaza este transferata pe o
plasmida pBR322 si reclonata in E.coli. Celulele modificate prin aceasta inginerie, determina amplificarea
plasmidelor la circa 50 de copii per celula, produc penicillin-G-amidaza in mod constitutiv si in cantitati mult
superioare fata de tulpina parentala. Asemenea productii crescute sunt de mare relevanta economica nu
numai datorita productivitatii volumetrice dar si datorita faptului ca reduce costurile de prelucrare dupa
procesul de biosinteza, enzima bruta rezultata fiind mult mai pura.

Ingineria proteinelor

Un alt domeniu extrem de promitator al ingineriei genetice este ingineria proteinelor. Noi structuri
enzimatice pot fi proiectate si produse in scopul imbunatatirii enzimelor existente sau crearea unor noi
activitati.

Asemenea tip de enzime ‚artificiale’ sunt produse prin mutageneza directa a unor situsuri (fig.2).

Asa cum s-a aratat prin metoda utilizata la mutageneza directa in situsul dorit (fig.2), calea preferata pentru
crearea de noi enzime este de substitutie in trepte doar a unuia sau a doi aminoacizi din structura totala a
proteinei. Desi este disponibila o baza de date foarte mare privind corelatiile structura-secventa, si care
creste rapid o data cu programele de calculator ce apar, in prezent nu exista o posibilitatea de a se
preconiza foarte bine schimbarile tridimensionale care rezulta ca urmare a unor astfel de substitutii.

Principalele probleme sunt in evaluarea efectelor de lungime si a interactiilor cu solventul, a noii


structuri. Asa cum multe rezultate atesta, stiinta este intr-o etapa in care poate explica consecintele
structurale ale substitutiilor aminoacizilor dupa obtinerea proteinei modificate dar nu se pot prevedea cu
exactitate inainte de obtinerea acesteia.

De aceea, ingineria proteinelor este in prezent mai degraba o tinta de atins sau un proces lipsa care
poate fi utilizat cu o foarte mica probabilitate reala de succes imediat. In mod aparent chiar mici schimbari de
secventa pot conduce la modificari conformationale largi si chiar pot afecta etapa determinatoare de viteza in
cataliza enzimatica. Insa, este rezonabil sa presupunem ca, utilizarea unei baze de date suficient de
detailata si un program (software) potrivit, probabilitatea relativa a unui succes va creste in urmatori ani si
produsii ingineriei proteinelor vor avea un major impact asupra tehnologiei enzimelor.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 107/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Exemple de enzime asupra carora s-a actionat prin mutageneza sunt:

Subtilizina (din Bacillus amyloliquefaciens), este un exemplu de enzima asupra careia s-a lucrat
intens in ultimii ani prin mutageneza si a suferit o serie de inginerii proteice. Ea reprezinta principala enzima
din preparatele enzimatice pentru detergenti. Scopul actiunilor asupra acestei enzime a fost de a se
imbunatati activitatea sa in detergent, prin stabilizarea sa chiar la temperaturi inalte, pH si oxidanti puternici.
Cele mai multe dintre imbunatatirile asteptate au privit modificari la:

1. fisura P1, care contine aminoacidul pe partea carbonil a legaturii peptidice tinta;
2. gaura oxianionica (in mod special Asn155), care stabilizeaza intermediarul tetraedric
3. vecinatatea unui rest histidil catalitic (His64) care are in general un rol de baza; si
4. restul metioninic (Met222) care determina labilitatea subtilizinei la oxidare.

S-a gasit ca efectul substitutiei in fisura P1 asupra activitatii specifice relative fata de substraturi poate
fi destul de exact prevazut, chiar daca prevederile efectelor absolute a unor asemenea schimbari au avut mai
putin succes. S-a aratat ca diferite substitutii, in particular pentru resturile de glicina din partea inferioara a
fisurii P1(Gly166), determina cresterea specificitatii enzimei pentru anumite legaturi peptidice specifice in timp
ce se reduce pentru altele. Aceste efecte se obtin in principal prin schimbari corespunzatoare mai degraba
ale Km decat ale vmax. Cresterile in specificitatea relativa poate fi utila pentru unele aplicatii.

Inactivarea subtilizinei in solutii decolorante coincide cu conversia Met222 la sulfoxidul sau, cresterea
importanta in volum absorbind gaura oxanionica. Substitutia acestei metionine prin serina sau alanina
produce mutanti care sunt relative stabili, desi poseda oarecare activitate reducatoare.

Tripsina. Un exemplu al naturii imprevizibile a ingineriei proteice este dat de tripsina, care are un
situs activ foarte asemanator cu cel al subtilizinei.

Substitutia restului de acid aspartic incarcat negativ, care este utilizat pentru legarea lanturilor bazice
de lizina sau arginina, din partea inferioara a fisurii sale P1 (Asp189), cu lizina incarcata pozitiv, conduce la un
rezultat previzibil de abolire a activitatii fata de substraturile sale normale dar imprevizibil de lipsa a oricarei
activitati fata de substraturile in care aceste resturi bazice sunt inlocuite prin acid aspartic sau acid glutamic.

Enzime termofile. Un efort considerabil se consuma si s-a consumat privind ingineria enzimelor
termofile. S-a gasit ca enzimele termofile sunt numai cu 20-30kJ mai stabile decat perechile lor mezofile.
Aceasta se poate realiza prin aditia doar a unui numar foarte redus de legaturi de hidrogen, o legatura salina
interna sau resturi hidrofobice interne suplimentare, care conduc la un miez usor mai hidrofobic. Toate
aceste schimbari sunt destul de mici pentru a fi obtinute prin inginerie proteica. Pentru a se asigura un
rezultat mult mai practic, structura secundara a enzimei trebuie sa fie conservata si acest lucru restrange
posibilitatile de schimbare la suprafata externa a enzimei. Astfel a fost stabilit ca pentru a creste
termostabilitatea substitutiile exterioare cele mai potrivite sunt:

AspartatgGlutamat, LizinagGlutamina,

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 108/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

ValinagTreonina, SerinagAsparagina,

IzoleucinagTreonina, AsparaginagAspartat si

LizinagArginina.

Asemenea substitutii au o probabilitate favorabila de succes. Cand este posibil, mici cresteri de
hidrofobicitate in interior, de exemplu prin substitutia in interioar de resturi de glicina sau serina cu alanina,
pot de asemenea creste termostabilitatea. Trebuie insa recunoscut ca obtinerea unei enzime mai
termostabila reduce flexibilitatea sa globala si, ca urmare, este probabil ca enzima modificata obtinuta va
avea o eficienta catalitica redusa.

Din nefericire din punct de vedere practic, cea mai mare parte din eforturile de cercetare in ingineria
proteica sunt canalizate spre studii privind structura si activitatea enzimelor alese pentru importanta lor
teoretica sau usurinta de obtinere decat spre importanta, relevanta lor pentru industrie. Aceasta insa, in mod
sigur, se va schimba in viitorul apropiat.

Enzime artificiale

Exista astazi o serie de posibilitati pentru constructia unei enzime artificiale.

Acestea sunt in mod general polimeri sau oligomeri naturali (modificati) sau sintetici cu activitati
asemanatoare enzimelor, fiind cunoscute in general ca sinzime.

Aceste sinzime sunt construite astfel incat pot poseda doua entitati structurale, un situs pentru
substrat si un situs cu activitate catalitica efectiva. Experientele au aratat ca producerea situsului pentru
legarea substratului este relativ simpla in timp ce situsurile catalitice sunt oarecum mult mai dificil de realizat.
Ambele situsuri pot fi proiectate separate. Totusi se pare ca, daca sinzima poate fi construita cu un situs
pentru starea de tranzitie a reactiei, acesta poate realiza adeseori ambele functii.

Majoritatea sinzimelor asculta de cineticile de saturatie Michaelis-Menten. Pentru o reactie cu un


substrat secventa reactiilor va fi:

sinzima + S D (complex sinzima-S) gsinzima + P

Unele sinzime sunt simple proteine derivatizate. (Enzimele imobilizate covalent nu intra in aceasta
categorie.) Un exemplu este derivatizarea mioglobinei, transportorul de oxigen din muschi, prin atasarea
ionului (Ru(NH3)5)3+ la trei resturi histidinice de pe suprafata proteinei. Acest proces converteste mioglobina
de la transportor de oxigen la o oxidaza, care catalizeaza oxidarea acidul ascorbic folosind ca oxidant
oxigenul molecular. Aceasta sinzima este aproape la fel de eficace ca si ascorbat oxidazele naturale.

Este imposibil sa se proiecteze protein-sinzime pornind de la zero, adica direct din aminoacizi liberi,
cu oarece probabilitate de succes, intrucat in prezent doar din structura lor primara nu pot fi prezise
conformatiile lor. In plus, asemenea proteine vor avea in plus si neajunsurile enzimelor naturale, fiind
sensibile la denaturare, oxidare si hidroliza.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 109/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

De exemplu polilizina leaga coloranti anionici ca si albumina serica, dar numai 10% sunt la fel de
puternic legati ca in cazul proteinei naturale, in ciuda faptului ca exista multe sarcini si lanturi laterale
incarcate pozitiv.

Acidul poliglutamic insa arata proprietati sinzimice mult mai apropiate de a unei enzime naturale.
Acesta actioneaza ca o esteraza, in mare masura ca si proteazele acide. De exemplu pentru hidroliza
acetatului 4-nitrofenil, prezinta o frumoasa curba pentru relatia pH-activitate cu o activitate optima la circa pH
= 5,3 si cinetici Michaelis-Menten cu o Km de 2mm si vmax de 10-4 la 10-5 s-1.

Polilizina acid poliglutamic

Ciclodextrinele (dextrinele Schardinger) sunt in mod natural molecule toroidale formate din sase,
sapte, opt, noua sau zece unitati de D-glucoza legate a-1,4 si unite cap-coada intr-un cerc [a-, β-, g-, d- si ε-
ciclodextrine respectiv: ele pot fi sintetizate din amidon prin intermediul ciclomaltodextrin glucanotransferaza
(EC 2.4.1.19) obtinuta din Bacillus macerans]. Ciclodextrinele difera in diametre si cavitati (ce au valori in jur
de 0,5 – 1 nm) dar toate au in jur de 0,7 nm adancime.

Acestea formeaza buzunare hidrofobice datorita atomilor de oxigen glicozidici si gruparilor C-H
indreptate spre fata interioara. Toate gruparile C-6 hidroxil se proiecteza spre unul din capete si toate
gruparile hidroxil C-2 si C-3 spre celalalt. Prin numarul mare de grupari hidroxil caracteristica lor globala este
hidrofilica, fiind solubile in apa, dar prezenta buzunarului lor hidrofobic le permite sa lege molecule
hidrofobice de marimi corespunzatoare.

Ciclodextrinele sinzimice sunt in mod obisnuit derivatizate in scopul de a se introduce grupari


eficiente din punct de vedere catalitic. Au fost analizati numerosi astfel de derivati. De exemplu, o β-
ciclodextrina a fost derivatizata prin legarea covalenta a piridoxal coenzimei activate de o grupare hidroxil C-
6. Sinzima rezultata nu numai ca actioneaza ca o transaminaza (schema de reactie I) dar arata de
asemenea si o stereoselectivitate pentru L-aminoacizi. Totusi nu a fost la fel de activa ca si transaminazele
naturale.

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 110/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

Polietilenimina este formata prin polimerizarea etileniminei pentru a forma o matrice tridimensionala
inalt ramificata. Circa 25% dintre aminele rezultate sunt primare, 50% secundare si 25% tertiare.

Aminele primare pot fi alchilate rezultand o serie de derivati. Daca 40% din aceste sunt alchilate cu 1-
iodododecan pentru a da situsuri legate hidrofobic si restul sunt alchilate cu 4(5)-clorometilimidazol pentru a
da situsuri catalitice, in general acido-bazice, sinzima rezultata are 27% din activitatea a-chimotripsinei fata
de esterii 4-nitrofenil. Asa cum s-a putut astepta din structura sa aparent intamplatoare, ea are o foarte
scazuta specificitate esterazica. Alte sinzime pot fi create in maniere similare.

Anticorpii aflati in starea de tranzitie ceruta de reactia lor specifica, pot actiona ca sinzime. De
exemplu, esterii fosfonati cu formula generala (R-PO2-OR’)- sunt analogi stabili ce apar in starea de tranzitie
a hidrolizei esterilor carboxilici. Astfel anticorpii monoclonali dezvoltati pentru imunizarea proteinelor
conjugate, au atasati covalent acesti esteri fosfonati, actioneaza ca esteraze. Specificitatile acestor anticorpi
catalitici (de asemenea numiti abzime) depind de structura lanturilor laterale [de exemplu R si R’ din (R-PO2-

OR’)-] a antigenilor. Valorile Km si vmax sunt in general destul de joase. Astfel Km sunt majoritar in regiunea

micromoleculara, iar vmax sunt mai mici de 1 s-1, fiind totusi de 1000 de ori mai mari comparativ cu vitezele
de hidroliza determinate doar prin ionii hidroxil neesterificati din mediu.

O strategie similara poate fi utilizata pentru producerea de sinzime prin ‘imprimarea’ moleculara a
polimerilor, folosind prezenta unei stari de tranzitie analoaga formei de polimerizare a rasinilor sau a proteinei
non-enzima inactivata in timpul denaturarii termice.

Sisteme de Regenerare a Coenzimelor

Multe oxidoreductaze si toate ligazele utilizeaza coenzime (de exemplu NAD+, NADP+, NADH,
NADPH, ATP), care trebuie regenerate cu fiecare molecula de produs ce se formeaza. Desi coenzimele sunt
necesare pentru o serie de enzime utilizabile, aplicatia lor este in prezent limitata in mod sever pe de o parte
de inaltul cost al coenzimelor si pe de alta de dificultatile de regenerare a acestora. Aceste doua probleme ar
putea fi insa depasite daca coenzima este imobilizata impreuna cu enzima si regenerate in situ.

O metoda simpla de imobilizare/regenerare a coenzimelor ar fi de utilizare a

intregului sistem celular fapt ce va conduce binenteles la o mai larga utilitate. Insa, asa cum se cunoaste,
imobilizarea coenzimelor impreuna cu enzimele conduce in general la o eficienta si flexibilitate mai scazuta
decat in cazul doar a sistemelor enzimatice imobilizate.

O solutie convenabila de imobilizare si a coenzimelor impreuna cu enzimele lor ar fi reactoarele


membranare. Acestea insa trebuie sa aibe dimensiunea porilor mai mica decat diametrul coenzimelor
corespunzatoare, fapt ce este extrem de restrictiv.

Pentru o imobilizare si regenerare adecvata coenzimele trebuie derivatizate. Cand acest proces se
poate aplica cu succes, coenzimele se ataseaza de suport fara ca functiile lor biologice sa fie intr-un fel

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 111/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

afectate. Calea sintetica cea mai larg aplicata implica alchilarea azotului aminic exociclic N6- al adeninei
prezenta in coenzimele NAD+, NADP+, NADH, NADPH, ATP si coenzima A.

In unele aplicatii, asa cum sunt cele ce utilizeaza reactoare membranare, este necesar doar ca
dimensiuna coenzimei sa fie suficient de mare pentru a fi retinuta in interiorul sistemului.

Derivatii cu greutate moleculara mare si solubili in apa, sunt mult mai utilizabili deoarece ei depun o
rezistenta difuzionala mult mai mica decat matricile insolubile.

Matricile insolubile larg folosite in aceste scopuri sunt dextranii, polietilenimina si polietilen glicolii.
Pentru a se permite o libertate de miscare suficienta si a se evita pe cat posibil efectele inhibitoare, se
considera ca trebuie atasate cantitati mici de coenzime la acesti suporti.

Proprietatile cinetice ale coenzimelor derivate variaza, depinzand de sistem, dar in general
constantele Michaelis sunt mai mari si vitezele maxime mai mici decat ale coenzimelor native.

Coenzimele imobilizate pe suporti insolubili au cinetici oarecum mai putin favorabile chiar si atunci
cand sunt co-imobilizate aproape de situsul activ al enzimelor ce le utilizeaza. Aceasta situatie se asteapta
sa se imbunatateasca o data cu cresterea informnatiei asupra conformatiei partii proteice ce inconjoara
situsurile active ale enzimelor si metodele de imobilizare vor deveni mai sofisticate. Insa costul unor
asemenea derivati ramane totusi ridicat asa incat acestia vor deveni viabili din punct de vedere economic
doar pentru productia unor produsi cu o valoare foarta inalta.

In present au fost totusi realizate cateva sisteme disponibile pentru regenerarea coenzimelor
derivatizate prin metode chimice, electrochimice sau enzimatice.

Regenerarea enzimatica este avantajoasa datorita inaltei sale specificitati. Totusi pentru regenerarea
dinucleotidelor oxidoreductazelor s-au dovedit competitive si procedurile electrochimice.

Procesele enzimatice in care regenerarea coenzimelor poate fi realizata, trebuie sa utilizeze


substraturi ieftine, enzime usor disponibile si sa dea produsi usor de separat si care nu interfera cu procesul
de regenerare. Exemple a unor astfel de procese sunt reprezentate de cele care utilizeaza format
dehidrogenaza si acetat kinaza, desi pana acum, aceste preparate enzimatice comerciale au o activitate
scazuta:

III

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 112/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

IV

Tehnologia enzimelor este in prezent intr-o faza de maturare si evolutie.

Maturarea este aratata prin dezvoltarea teoriilor privind functionarea enzimelor si acestea sunt legate
de structura lor primara prin intermediul carora se configureaza structura lor secundara si respective tertiara.

Evolutia se manifesta prin marirea tot mai mult a domeniului de utilizare.

Exista totusi o serie de domenii de dezvoltare si procesare utila a materialelor, descoperirilor care
sunt inca destul de greu de inteles.

In orice caz este clar ca enzimele vor fi mult mai larg utilizate in viitor si aceasta se va reflecta prin
numarul mai mare de enzime disponibile pe plan industrial dar si pentru cercetare, varietatea reactiilor
catalizate si domeniul conditiilor de mediu in care acestea vor lucra. Enzimele ce se obtin déjà in mod
industrial vor fi utilizate in noi domenii.

De asemenea vor fi obtinute noi enzime, descoperite in nisele lor biologice sau produse prin ingineria
enzimelor, vor fi exploatate pentru catalize in reactii neexploatate pana acum.

Se considera ca acum suntem tocmai in procesul de inceput a erei tehnologiei enzimatice.

Tematica examen Enzimologie speciala – an III – 2008-2009


1. Strategia de alegere a sursei enzimatice

2. Schema generala a etapelor de extractie si purificare a enzimelor din diferite surse.

3. Separarea organitelor celulare (centrifugare diferentiata, centrifugare izopicnica).

4. Factori ce influenteaza extractia (Tampoane utilizate).

5. Factori ce influenteaza extractia (Prezenta enzimelor proteolitice).

6. Separarea prin membrane (Dializa).

7. Separarea prin membrane (Ultrafiltrarea).

8. Separarea prin membrane (Osmoza


Osmoza inversa).

9. Gel filtrarea.

10. Cromatografia de schimb ionic.


http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 113/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

11. Electroforeza.

12. Focusarea izoelectrica. Cromatofocusarea.

13. Cromatografia hidrofoba

14. Cromatografia de afinitate. Elutia de afinitate.

15. Cromatografia covalenta.

16. Evaluarea proceselor de separare.

17. Imobilizarea enzimelor prin adsorbtie (tipuri de interactii, parametrii principali).

18. Imobilizarea prin incluziune (polimerizarea).

19. Imobilizarea prin incluziune (incapsulare).

20. Imobilizarea prin legare covalenta. Metode de activare( glutaraldehida, punti disulfurice).

21. Imobilizarea prin legare covalenta. Metode de activare(bromcian, triazine).

22. Imobilizarea prin legare covalenta (azotura, carbodiimida).

23. Biosenzori potentiometrici.

24. Biosenzori amperometrici.

25. Biosenzori optici.

26. Imunosenzori.

27. Reactii enzimatice in sisteme lichide bifazice - generalitati.

28. Echilibre in sisteme bifazice apa-solvent organic cu un substrat.

29. Echilibre in sisteme bifazice apa-solvent organic cu doua substraturi. (Cazul hidrolazelor).

30. Echilibre in sisteme bifazice apa-solvent organic cu doua substraturi. (Cazul acizilor si bazelor).

31. Utilizarea unor substraturi ‚nenaturale’.

32. Ingineria enzimelor.

33. Enzime artificiale.

loading...

31% 13% 20% 20% 19%

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 114/115
3/24/2018 EXTRACTIA ENZIMELOR

31% 13% 20% 20% 19%

Document Info
Accesari: 13861
Apreciat:

Comenteaza documentul:
Nu esti inregistrat
Trebuie sa fii utilizator inregistrat pentru a putea comenta

Creaza cont nou

A fost util?
Daca documentul a fost util si crezi ca merita
sa adaugi un link catre el la tine in site

Copiaza codul
in pagina web a site-ului tau.

<a href="http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-
ENZIMELOR32652.php" target="_blank"
title="EXTRACTIA ENZIMELOR -
// C

Copyright © Contact (SCRIGROUP Int. 2018 )

http://www.scritub.com/biologie/EXTRACTIA-ENZIMELOR32652.php 115/115