Los análisis de biología de sistemas basados en el proteoma de la aorta diabética del ratón revelan cambios importantes en

la biosíntesis de ácidos grasos como posible sello distintivo en la enfermedad vascular asociada a la diabetes mellitus.

Antecedentes: las complicaciones macrovasculares de la diabetes mellitus son un importante factor de riesgo de morbilidad y
mortalidad cardiovascular. Actualmente, los estudios solo describen parcialmente la fisiopatología molecular de los efectos
asociados a la diabetes mellitus en la vasculatura. Sin embargo, una mejor comprensión de los efectos sistémicos es esencial
para desentrañar los eventos moleculares clave en el tejido vascular responsable del inicio y la progresión de la enfermedad.
Métodos y resultados: nuestro objetivo general fue obtener una visión global de los cambios moleculares clave inducidos por
la diabetes mellitus en la vasculatura. Se realizó un análisis integrativo proteómico y bioinformático de los datos de los vasos
aórticos en el modelo de ratón diabético inducido por estreptozotocina a baja dosis (10 animales). Observamos desregulación
pronunciada de las moléculas implicadas en la miogénesis, la vascularización, la hipertensión, la hipertrofia (asociada con el
engrosamiento de la pared aórtica) y una reducción sustancial del almacenamiento de ácidos grasos. Un nuevo hallazgo es la
pronunciada regulación a la baja de la glucógeno sintasa quinasa-3β (Gsk3β) y la regulación positiva de las moléculas ligadas
al ciclo del ácido tricarboxílico (p. Ej., Aspartato aminotransferasa [Got2] e hidroxiácido-oxoácido transhidrogenasa [Adhfe1]).
Además, las vías que involucran alcoholes primarios y la descomposición de aminoácidos se alteran, lo que puede conducir a
la producción de cuerpos cetónicos. Varios de estos hallazgos fueron validados inmunohistoquímicamente. Colectivamente,
los datos respaldan la hipótesis de que en este modelo diabético existe una sobreproducción de cuerpos cetónicos dentro de
los vasos que utilizan una vía alternativa asociada al ciclo del ácido tricarboxílico, lo que finalmente conduce al desarrollo de
la aterosclerosis. Conclusiones: la diabetes mellitus inducida por estreptozotocina en animales conduce a una reducción de la
biosíntesis de ácidos grasos y a una regulación positiva de una vía alternativa de formación de cuerpos cetónicos. Esta hipótesis
de trabajo podría formar la base para el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas y enfoques de gestión de
enfermedades. (Circ Cardiovasc Genet. 2014; 7: 161-170.)

La diabetes mellitus se caracteriza por hiperglucemia y es reconocida como uno de los principales contribuyentes a los
problemas de salud en todo el mundo. Uno de los mayores contribuyentes a la morbilidad y la mortalidad en los diabéticos es
un aumento de 2 a 8 veces el riesgo de desarrollar enfermedad vascular. La hiperglucemia afecta tanto macrovasculares
(enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad arterial periférica y accidente cerebrovascular) como complicaciones
microvasculares (nefropatía diabética, neuropatía y retinopatía). Los vasos afectados exhiben cambios histológicos
importantes, que incluyen un mayor grosor de la íntima media, en parte como resultado de un aumento de la proliferación,
adhesión y migración de células del músculo liso vascular, así como una deposición elevada de matriz extracelular, en particular
colágeno. La sobreproducción de proteínas elevadas de la matriz extracelular y el aumento de la reticulación del colágeno
pueden conducir a la fibrosis aórtica, un componente principal de la hiperglucemia diabética.

Editorial ver p 100

Perspectiva clínica en la p. 170

Los mecanismos moleculares, como se conocen actualmente, del desarrollo de estas lesiones vasculares durante la
hiperglucemia son complejos, implicando un aumento en las señales proinflamatorias (p. Ej., Activación del factor nuclear-κB,
moléculas de adhesión, factor de necrosis tumoral-α, interleucina-1β e interleucina-6). Aguas abajo de estos factores
proinflamatorios se activan la proteína quinasa 1 regulada por señal extracelular, la cinasa 1 y 2 de c-Jun NH2-terminal y p38.
Otro sello distintivo en el desarrollo de lesiones vasculares diabéticas es la producción de especies reactivas de oxígeno, lo que
resulta en la inactivación del óxido nítrico y la aparición de productos finales de glicación avanzada, agravando aún más el daño
al tejido vascular. Se han propuesto varias proteínas como dianas para los cambios hiperglucémicos en las células del músculo
liso vascular, incluida la proteína quinasa C y los receptores de inositol trisfosfato y rianodina. Inositol 1,4,5-trisphosphate-
sensitive y tiendas sensibles a la rianodina son los principales contribuyentes a la homeostasis de Ca2 + en la célula del músculo
liso vascular. La complejidad de la respuesta vascular a la diabetes mellitus se ejemplifica con un reciente estudio proteómico,
que muestra que los cambios más importantes asociados a la diabetes mellitus estaban en proteínas relacionadas con el estrés
oxidativo y la estructura / función de miofibrillas y microfilamentos, con niveles disminuidos de glucolítico enzimas y
componentes complejos del sistema de transporte de electrones mitocondrial. Otros estudios sugieren una asociación de la
disfunción mitocondrial, el estrés oxidativo mitocondrial inducido por la hiperglucemia persistente y la disminución de la
actividad de varias enzimas antioxidantes en la hiperglucemia diabética tanto en ratas como en humanos. Esta evidencia
molecular existente, aunque dispares, sobre los efectos asociados a la diabetes mellitus en la vasculatura indica una necesidad
de un enfoque holístico, interconectando los hallazgos. Tal análisis detallado y una mayor integración de los datos en un
enfoque de medicina de sistemas se propone para proporcionar una mejor comprensión de los cambios vasculares asociados
a la diabetes mellitus y para abrir nuevas vías hacia terapias de intervención mejoradas. Un modelo bien establecido y aceptado
de hiperglucemia es la diabetes mellitus inducida por estreptozotocina en animales, que muestra muchas de las características
de la patología vascular evocada por la diabetes mellitus. En el estudio actual, utilizamos perfiles proteómicos para investigar
vasos aórticos de ratones y controles diabéticos inducidos por estreptozotocina, seguidos de análisis bioinformáticos
funcionales para investigar procesos desregulados a nivel molecular. Nuestro análisis recapitula y vincula aún más muchas de
las características moleculares conocidas de la arteriopatía diabética a nivel de vía y, además, sugiere la producción inducida
por diabetes mellitus de cuerpos cetónicos en los vasos.

MÉTODOS

Materiales

Todos los productos químicos se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Gillingham, Reino Unido) a menos que se indique lo contrario.

Modelo animal

Ratones machos C57BL / 6 de siete semanas de edad se obtuvieron de Charles River (Sulzfeld, Alemania) y se alojaron en las
instalaciones para animales de la Universidad de Saarland. Todos los animales tenían libre acceso a una dieta de laboratorio
estándar con acceso libre al agua. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices de la Federación de
Asociaciones de Ciencias Animales de Laboratorio (FELASA) y fueron aprobados por las autoridades locales. La diabetes mellitus
experimental se indujo en ratones de 8 semanas de edad con compatibilidad de peso mediante múltiples dosis bajas de
estreptozotocina. Se inyectó a los ratones por vía intraperitoneal estreptozotocina de 50 mg / kg de peso corporal (Sigma-
Aldrich) en 50 mmol / l de citrato de sodio (pH 4,5) o tampón de citrato de sodio durante 5 días consecutivos. Después de 20
semanas de hiperglucemia, los animales fueron sacrificados. Se extrajeron las aortas torácica y abdominal y se congelaron en
nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta la preparación de la muestra para espectrometría de masas (MS) o se
congelaron cuidadosamente en vapor de nitrógeno líquido para inmunohistoquímica.

Mediciones de glucosa en sangre

La glucosa en sangre se midió 20 días después de la primera inyección de estreptozotocina y mensualmente a partir de
entonces (Glucometer Elite System, Bayer, Leverkusen, Alemania). Los animales con niveles de glucosa> 12 mmol / L después
de 4 horas de ayuno se consideraron diabéticos. Se excluyeron los animales que no eran hiperglucémicos dentro de los 20 días
posteriores a la primera inyección de estreptozotocina. Los ratones no recibieron insulina. La cetonuria no ocurrió.

PREPARACIÓN DE MUESTRA Y MASA

Análisis espectrométrico

Las muestras de tejido se pesaron y extrajeron utilizando el método de preparación de muestras filtradas (ver Métodos en el
Suplemento de datos para una descripción detallada) y se analizaron en un FTMS Orbitrap-Velos (Thermo-Finnigan, Bremen,
Alemania) como se describió, 16 operado en un modo dependiente (top 40) para cambiar entre la adquisición de MS y MS /
MS, usando la disociación inducida por colisión. Los archivos de datos se buscaron en la base de datos de IPI de ratón utilizando
SEQUEST, integrado en Proteome Discoverer (Thermo Fisher Scientific, Hemel, Reino Unido), estableciendo la
carbamidometilación como oxidante fijo y de fosforilación, metionina y prolina como modificaciones variables. Se permitieron
ventanas de error masivo de 10 ppm y 0,8 Da para MS y MS / MS, respectivamente. Los datos de los péptidos se extrajeron
utilizando una alta confianza de péptidos y los primeros filtros de péptido de rango 1. El análisis del valor P estadístico de las
áreas del pico del ion precursor normalizado se realizó con la prueba de Wilcoxon y Mann-Whitney. Los archivos de datos MS
y MS / MS están disponibles en PeptideAtlas (http://www.peptideatlas.org/) con el identificador PASS00380.

Análisis bioinformático

El análisis se realizó en proteínas con valores de P ≤ 0.05 (72 proteínas). La asociación funcional se realizó utilizando el
vocabulario controlado del sistema de clasificación de proteínas Proteomics Analysis DataBase (PADB.org). El análisis de
clústeres de palabras clave Gene Ontology (GO) se realizó con el complemento CluGO CytoScape (www.cytoscape.org). El
análisis de Interactome se realizó con el complemento Michigan Interactive Molecular (mimi.ncibi.org). El análisis de
interacción de proteína condensada se realizó buscando asociaciones directas, seguido de una expansión gradual para unir
otros clústeres moleculares. Este análisis descubre nuevas vías de señalización porque las moléculas con una participación
celular similar tienden a agruparse a través de interacciones físicas, como las que se encuentran en las máquinas moleculares.
El análisis de la vía metabólica se realizó con PathVisio (www.pathvisio.org). Se obtuvieron reacciones enzimáticas adicionales
de la base de datos de enzimas BRaunschweig (BRENDA) (http://www.brendaenzymes.org/). El análisis de la enfermedad se
basa en trastornos genéticos conocidos o inferidos asociados con mutaciones de genes específicos almacenados en la base de
datos de Herencia en línea en el hombre (OMIM) utilizando los genes ortólogos humanos, respectivamente. El análisis de la
vía sucesiva se realizó con el complemento CytoScape iRefScape (irefindex.uio.no/wiki / iRefScape_1.0) mediante el mapeo de
nombres de genes y la extracción del número de acceso OMIM de las redes resultantes.

Histología e inmunohistoquímica
Las criosecciones se fijaron durante 10 minutos en acetona, seguido de la recuperación de antígeno usando 0,1 mol / l de HCl
/ KCl durante 10 minutos. Después del bloqueo en PBS que contenía 10% de suero de ternera fetal (FCS), las secciones se
incubaron con anticuerpos primarios durante la noche (miosina [Sigma], actina de músculo liso [Santa Cruz], Gsk3β, ácido graso
sintasa [Fasn; Santa Cruz], piruvato deshidrogenasa quinasa isoforma 4 [Pdk4; Abcam], mitocondrial Got2 [Abcam],
mitocondrial Adhfe1 [Proteintech]), seguido de incubación con anticuerpos secundarios conjugados Cy3 (Jackson
Laboratories). Las imágenes (× 200 y × 400 de aumento) se capturaron usando un microscopio confocal Zeiss LSM510 Meta y
un software Zeiss LSM (Zeiss, Alemania). El grosor medial se midió usando el software LSM Image (Zeiss, Alemania) de
criosecciones ciegas (n = 3). Se tomaron cuatro mediciones aleatorias por sección y se analizaron 3 secciones por animal. La
tinción con aceite rojo O se realizó con criosecciones de 10 μm fijadas en formalina al 10%. Después de la incubación en
propilenglicol, las secciones se incubaron en una solución de aceite rojo O a 60 ° C y posteriormente se diferenciaron en
propilenglicol al 85%. Después del montaje, las imágenes se capturaron utilizando un microscopio Axiophot (Zeiss) y una
cámara Axiocam (Zeiss) usando la configuración de campo claro. Los histogramas y la cuantificación de la señal de fluorescencia
para tinciones inmunohistoquímicas se generaron dividiendo los canales de color rojo-verde-azul (RGB) y calculando la relación
entre el canal rojo (sonda) y el azul (tinción nuclear) para cada panel individual usando ImageJ. El histograma Oil oil O utilizó
un cálculo del rojo versus la suma de los canales verde y azul. Esto se hizo usando secciones ciegas, y se tomaron 3 mediciones
aleatorias por sección. La significancia estadística se calculó usando la prueba t no aparejada (para una descripción detallada,
ver Métodos en el Suplemento de Datos).

RESULTADOS

Modelo animal

Los ratones se volvieron diabéticos dentro de las 2 semanas posteriores a la inyección de estreptozotocina y la hiperglucemia
persistió durante el período experimental de 19 semanas. Los niveles promedio de glucosa en sangre fueron de 395 mg / dL
en ratones diabéticos. Al final de la semana 19, el aumento de peso corporal fue del 20% en diabéticos y del 28% en animales
de control (Tabla 1). Los valores para el grosor medial fueron significativamente mayores para las aortas diabéticas (28 μm)
que para las aortas control (19 μm), lo que indica engrosamiento de la pared vascular en ratones diabéticos (Tabla 1; Figura
1). No hubo diferencias significativas en el contenido total de proteína entre los grupos de aortas diabéticas y de control.

Análisis de Espectrometría de Masas y Adquisición de Datos

Las proteínas de 5 controles aórticos y 5 muestras diabéticas aórticas se analizaron mediante cromatografía líquida en tándem
espectrometría de masas. Un total de 442725 espectros de MS / MS se combinaron con 9257 péptidos, que corresponden a
2205 proteínas únicas (Tabla I en el Suplemento de datos). La tasa de descubrimiento falso de identificación de proteínas fue
del 0,38%. Se encontró un total de 996 proteínas tanto en muestras diabéticas como de control. Un total de 600 proteínas solo
se pudo observar en muestras de control y 609 solo en aortas de ratones diabéticos. Se seleccionaron un total de 72 entradas,
de las cuales 18 solo se encontraron en 1 grupo, con diferentes probabilidades de distribución, basadas en un valor nominal
de P <0.05 (Tablas I y II en el Suplemento de datos). Los cambios más destacados fueron la regulación a la baja de las enzimas
metabólicas, tales como ATP-citrato sintasa [Acly], transcetolasa [Tkt], piruvato carboxilasa [Pc], carboxilesterasa N del hígado
[Ces1c] e isocitrato deshidrogenasa [Idh2]. El ajuste de los valores de P utilizando la corrección de Benjamini-Hochberg para
pruebas múltiples mostró una falta de potencia estadística, y ninguno de los péptidos individuales alcanzó significación
estadística después del ajuste para la prueba múltiple usando la corrección de Benjamini-Hochberg. Sin embargo, el mapeo
integral de la ruta no depende de los significados estadísticos individuales.

Tabla 1. Parámetros de animales y aortas en ratones control y diabéticos

Los valores individuales para los niveles de glucosa y el peso se midieron en la semana 19 e incluyen el SEM. El espesor de la
aorta se midió en la semana 20. Las réplicas (n) se muestran entre paréntesis.

Flujo de trabajo de análisis de datos bioinformáticos

Las proteínas que muestran claras diferencias en las distribuciones entre muestras tratadas y no tratadas (P <0,05; Tabla II en
el Suplemento de datos) se utilizaron como datos de entrada en los diferentes enfoques bioinformáticos, incluyendo GO,
interactome (Michigan Molecular Interactor) o vía metabólica (PathVisio) análisis, así como la literatura y la extracción de
bases de datos OMIM, con el objetivo de capturar la máxima información disponible e identificar vías diferencialmente
expresadas y moléculas clave en los vasos aórticos de ratones diabéticos. La Figura 2 representa el flujo de trabajo general, y
la Tabla 2 resume los resultados de los enfoques bioinformáticos realizados individualmente. Breves explicaciones sobre los
análisis bioinformáticos in silico aplicados se proporcionan en las siguientes secciones.

Análisis de GO, mapeo de Interactome y rutas metabólicas

El análisis GO se basa en pruebas estadísticas de palabras clave asociadas (recuperadas de la base de datos GO) para cada
molécula. El análisis de clúster interactome proporciona información sobre la agrupación de grupos y la vinculación física.
También utilizamos el análisis de la ruta metabólica mediante el mapeo de proteínas a las vías metabólicas y de señalización
premontadas. Se identificaron rutas significativas después del ensayo estadístico de las moléculas contenidas en cada mapa
de ruta individual de acuerdo con el software de análisis de vías respectivas. Los resultados indican una clara regulación positiva
de las vías de contracción miofibrilar / muscular involucradas en la función muscular y una regulación a la baja de las vías del
ciclo celular (con proteínas clave Gsk3β y 14-3-3), inhibidores implicados en la respuesta al estímulo (Serpins) y el grupo GO de
procesos enzimáticos implicados en la pentosa derivación de fosfato (transaldolasa [Taldo1], Tkt, descarboxilación de 6-
fosfogluconato deshidrogenasa [Pgd]) y ácidos grasos (acetil-CoA carboxilasa 1 [Acaca], Fasn, estradiol 17-β-deshidrogenasa
12 [Hsd17b12]) vías (Figuras I y IIA, IIB). También observamos una marcada regulación al alza de las proteínas asociadas con el
recambio metabólico muscular (glucólisis) junto con la pronunciada regulación a la baja del metabolismo de los ácidos grasos
(Figura 3). Además, una vía de formación de cetona-cuerpo alternativa, vinculada a los metabolitos del ciclo del ácido
tricarboxílico (TCA), parece estar regulada positivamente.

Figura 1. Evaluación inicial del modelo

animal. Medición de glucosa libre (A) y peso
corporal (B) durante el período experimental
(barras blancas, ratones de control, barras
negras, ratones diabéticos) y secciones
representativas de aortas descendentes del
control no diabético (C, izquierda) y
diabético (C, derecha), los ratones se tiñeron
contra la actina del músculo liso (rojo). Las
secciones también se usaron para medir el
grosor de los medios (flecha blanca doble,
barra de escala, 50 μm). STZ indica
estreptozotocina.

Grupos de enfermedades y literatura OMIM / minería de textos

Para explorar si las enfermedades humanas conocidas, que podrían asociarse con las condiciones diabéticas, se relacionan con
las proteínas estadísticamente significativas observadas en este estudio, examinamos las asociaciones de moléculas con las
condiciones humanas usando iRefScape y minería de datos de base de datos OMIM (Tabla III en el Suplemento de datos). Se
puede observar una alta relevancia de los cambios proteómicos observados en el ratón tratado con estreptozotocina para la
diabetes mellitus humana y las complicaciones diabéticas. Las moléculas reguladas indican un desarrollo de las fibras
musculares (miosina-2 [Myh2]), así como la regulación negativa de las proteínas que afectan al músculo involucradas en la
miopatía (filamina-A, ADP / ATP translocasa 1 [Slc25a4] y periferina [Prph]). Sorprendentemente, se observó que 1 miembro
de la familia de la miosina, Myh11, estaba regulado negativamente, mientras que todos los demás demostraron una regulación
pronunciada. Otro grupo de enfermedad pronunciado muestra una regulación a la baja orquestada de proteínas vesiculares
que producen hipertensión arterial (apolipoproteína AI [Apoa1]), aneurisma aórtico, cambios degenerativos en la pared
aórtica, aumento del diámetro de la raíz aórtica media, rigidez aórtica (Myh11), arteria coronaria enfermedad (glicoproteína 4
de las plaquetas [Cd36]) y estrechamiento de la aorta (transaldolasa). Además, las alteraciones de la ruta metabólica
mitocondrial también están indicadas (piruvato carboxilasa, proteína mitocondrial rica en leptina repetición pentatricopeptide
(PPR) que contiene el motivo [Lrpprc]). En la Tabla 3 se resume la substratificación de las proteínas de entrada usando palabras
clave integradas en la literatura MESH-terms en agrupaciones relacionadas con afecciones diabéticas. Este análisis mostró que
las proteínas involucradas en el almacenamiento de ácidos grasos, metabolismo de glucosa y apoptosis estaban todas
downregulated, mientras que las moléculas que participan en la miogénesis y la vascularización, además de estar relacionados
con la hipertensión y la hipertrofia, se aumentaron sustancialmente al alza.

Análisis Combinatorio y Vías Afectadas Intervinculadas

El ensamblaje de ruta se realizó interconectando los hallazgos y generando un ensamblaje de ruta de novo global utilizando
PathVisio. La interconexión de los análisis antes mencionados reveló una regulación negativa general, desde la glucosa hasta
los productos finales de la vía de biosíntesis de ácidos grasos, una regulación positiva del metabolismo energético clásico
basado en músculo del glucagón al lactato que implica la enzima controladora de la vía metabólica Pdk4, un mecanismo
compensatorio ) vía de alcoholes primarios tales como etanol a acetil-CoA, y mecanismos alternativos de derivación alternativa
del ciclo de TCA (Figura 3). Esta colección de enzimas asociadas con el uso de metabolitos del ciclo TCA en particular puede
formar una ruta que conduce directamente a la formación de cuerpos cetónicos mediante la incorporación de l-glutamato a
través de Got1 / 2, L-2-hidroxiglutarato deshidrogenasa mitocondrial y Adhfe1. Las primeras 2 enzimas se encontraron
reguladas positivamente en nuestro análisis proteómico, mientras que Adhfe1 no se detectó, pero se predice que producirán
el producto final. El mismo producto final también se forma por degradación y desaminación de aminoácidos, que también
implica un aumento de la regulación en el modelo de la vía de la enfermedad. Las vías de señalización sugeridas moduladas en
animales diabéticos tratados con estreptozotocina incluyen factor de necrosis tumoral-α, factor nuclear-κB y vías posteriores
a la señalización de insulina que implican Gsk3β, proteína quinasa A y proteína dependiente de calcio / calmodulina tipo II
(Figura III en el Suplemento de datos), en todos los casos se regula negativamente en los animales diabéticos frente a los
animales de control.

Figura 2. Diagrama esquemático del flujo de

trabajo general y análisis de datos. Las muestras
de 10 muestras aórticas (5 de cada grupo) se
analizaron mediante LC-MS / MS (Tabla I en el
Suplemento de Datos), resultando en 72 proteínas
estadísticamente significativas usando valores de
corte de P <0,05 y cambios de ≥ 1,4 (Tabla II en el
Suplemento de datos). El análisis aguas abajo se
realizó utilizando diversas herramientas, como el
análisis de ontología genética (GO) (Figura I en el
Suplemento de Datos), mapeo de interactoma
(Figura II en el Suplemento de Datos), análisis de
enfermedad OMIM (Tabla III en el Suplemento de
Datos), vía metabólica análisis (Figura III en el
Suplemento de Datos) y extracción de literatura y
texto (Tabla 3, Tabla IV en el Suplemento de
Datos), resultando en un modelo de vía unificada
(Figura 3), cuyos componentes clave fueron
validados por inmunohistoquímica (Figura 4).

Validación de hallazgos

Posteriormente, buscamos verificar los hallazgos

más destacados mediante inmunohistoquímica. Nuestros criterios para la selección de objetivos para una mayor validación
incluyeron la colocación de las proteínas candidatas en vías moleculares aparentemente desconectadas, en combinación con
la disponibilidad de reactivos (anticuerpos). Específicamente, se eligieron proteínas prototípicas, actina, GSK3b, miosina y Fasn.
Sobre la base de este análisis de ruta, ampliamos la validación para incluir también Pdk4, Got2 y Adhfe1. Como se muestra en
la Figura 4, la inmunohistoquímica confirmó los cambios observados en el análisis proteómico y se sugirió después del análisis
bioinformático. Los histogramas para cada tinción se muestran (Figura 4) como indicadores de cambios en la expresión de
proteínas, sin embargo, no reflejan valores absolutos. La tinción con actina de músculo liso reveló que los animales tratados
con estreptozotocina desarrollaron un grosor medial aumentado, aunque no se observó un aumento en el nivel de actina del
músculo liso (Figura 1C). Curiosamente, el músculo liso de los animales diabéticos mostró una mayor tinción de miosina (Figura
4A), lo que confirma la regulación positiva observada de las proteínas implicadas en la miogénesis y las funciones musculares.
Para corroborar el vínculo entre la diabetes mellitus y la hipertensión, se examinaron los niveles de expresión de Gsk3β (Figura
4B) y podría demostrar una regulación a la baja de esta molécula en aortas de animales tratados con estreptozotocina. Para
investigar la reducción propuesta en las rutas de biosíntesis de ácidos grasos, también se examinó la expresión de Fasn (Figura
4C). La tinción reveló una reducción significativa de la proteína en animales diabéticos. Los animales diabéticos también
revelaron una reducción de la tinción de Oil red O, lo que indica una reducción general de los depósitos de grasa en el tejido
(Figura 4D). Esto es más probable debido a una reducción en la síntesis de ácidos grasos, como lo indican la reducción de la
tinción de Fasn y el análisis proteómico y debido a la mayor muscularización de los tejidos y el cambio consiguiente en el
metabolismo.

El análisis de ruta indicó un aumento de la ruta glucolítica, en parte, comúnmente asociada con el metabolismo muscular, que
conduce a una acumulación aumentada de lactato, piruvato y acetil-CoA, que está controlada por Pdk4 al inhibir la conversión
de piruvato a acetil-CoA. Un aumento de esta cinasa, como lo sugiere nuestro análisis proteómico, se confirmó mediante
inmunohistoquímica (Figura 4E) y podría ser un mecanismo de protección de células de músculo liso vascular en condiciones
hipóxicas para evitar la activación accidental del ciclo de TCA dependiente de oxígeno. El análisis de la ruta metabólica también
indicó fuertemente un vínculo directo a la formación de cuerpos cetónicos usando una vía alternativa no convencional
vinculada al ciclo de TCA. Para fundamentar esto, se realizó tinción para Got2 como el punto de ramificación del ciclo de TCA
y podría mostrar claramente un aumento de esta molécula en aortas de animales tratados con estreptozotocina, confirmando
así los datos proteómicos de esta molécula (Figura 4F). El último paso en este proceso de formación de cuerpo de cetona
implica la deshidrogenasa alcohol dependiente de hierro Adhfe1. Aunque no pudimos detectar esta proteína en el análisis
proteómico, encontramos que está regulada positivamente en las aortas de los animales tratados con estreptozotocina por
inmunohistoquímica, en línea con nuestras predicciones (Figura 4G).

Tabla 2. Resultados resumidos de análisis de bioinformática individuales

Se muestra el resultado de los diversos enfoques de análisis, utilizando las 72 proteínas estadísticamente significativas
expresadas diferencialmente. GO indica ontología genética; NF-κB, factor nuclear-κB; OMIM, herencia mendeliana en línea en
el hombre; y TNF, factor de necrosis tumoral.

Discusión

Las complicaciones asociadas a la diabetes mellitus que afectan la macrovasculatura y la microvasculatura son las principales
causas de mortalidad y morbilidad, pero los mecanismos subyacentes siguen siendo poco conocidos. El análisis del proteoma
aórtico podría proporcionar información valiosa sobre el desarrollo de patologías macrovasculares asociadas a la diabetes
mellitus. La diabetes mellitus inducida por estreptozotocina en ratones es un modelo bien establecido para investigar procesos
que conducen a afecciones diabéticas, como cardiomiopatía, nefropatía, arteriopatía, accidente cerebrovascular y, en última
instancia, insuficiencia orgánica. Inspirado por los datos de Didangelos et al., Iniciamos un estudio proteómico exhaustivo de
aortas diabéticas en el modelo de estreptozotocina en comparación con controles no tratados, junto con una amplia
bioinformática y los sistemas en la diabetes mellitus muestran una superposición sustancial. De los hallazgos más relevantes,
el análisis de la ruta metabólica sugiere que la formación de cuerpos cetónicos está regulada positivamente a través de una
vía alternativa. La inanición y la diabetes mellitus inducen una regulación al alza de la señalización de glucocorticoides, lo que
resulta en niveles elevados de Pdk4, que también hemos observado en nuestro estudio. Pdk4 es el mediador clave en la
prevención de la conversión de piruvato en acetil-CoA mediante la inhibición del complejo piruvato deshidrogenasa C. En el
hígado, esta inhibición permite la síntesis del cuerpo cetona a partir de ácidos grasos y aminoácidos cetogénicos en lugar de 3
compuestos de carbono. para la gluconeogénesis en el hígado para mantener los niveles de glucosa en sangre.
Figura 3. Análisis de la ruta metabólica alternativa en la formación de cuerpos cetónicos. Las proteínas involucradas en las
rutas metabólicas se mapearon en vías conocidas, incluida la glucólisis, las vías de ácidos grasos, las vías de piruvato / lactato,
la vía de derivación del ciclo del ácido tricarboxílico, la descomposición de aminoácidos y la producción de cuerpos cetónicos.
Verde, downregulated; rojo, upregulated. Las proteínas validadas por inmunohistoquímica se destacan (marco azul).
Nuestros datos indican que la activación del mecanismo glucolítico y la inhibición simultánea del piruvato al paso metabólico
de la acetil CoA pueden conducir a la activación de un mecanismo de derivación de TCA alternativo que involucra Got2,
oxaloacetato y l-glutamato, lo que lleva a una producción de 2-oxoglutarato. Este paso mitocondrial puede estar respaldado
por la regulación al alza observada del transportador de glutamato / aspartato glutamato aspartato 1 (Slc25a12), que importa
glutamato a cambio de aspartato. Got2, una enzima clave para la producción endógena de sulfuro de azufre, ha sido implicada
en la lesión miocárdica inducida por isoproterenol, pero se desconoce su papel en la diabetes mellitus. La siguiente molécula
en esta ruta alternativa es la L-2-hidroxiglutarato deshidrogenasa, conocida por producir 2-hidroxiglutarato y regulada
positivamente en nuestra pantalla proteómica; sin embargo, no existe información sobre si está involucrado en la diabetes
mellitus inducida por estreptozotocina. La última enzima en esta nueva vía, Adhfe1, que forma β-hidroxibutirato, y que
postulamos para ser parte de esta vía, podría mostrarse regulada positivamente por inmunohistoquímica. Adhfe1 se expresa
en el tejido adiposo, pero no se ha descrito la participación en condiciones diabéticas. Esto, combinado con una
descomposición elevada de aminoácidos, podría conducir a la sobreproducción localizada de cuerpos cetónicos. La producción
incontrolada de cuerpos cetónicos conduce a la cetosis y, en última instancia, a la cetoacidosis, uno de los sellos de la diabetes
mellitus tipo I. Nuestros resultados sugieren que este mecanismo ocurre localmente dentro de la macrovasculatura y no es
producto de la formación clásica de cuerpos cetónicos por β-oxidación porque todas las moléculas involucradas en esta ruta
que pudimos detectar están reguladas negativamente (Figura III, recuadro en el Suplemento de datos). La contribución global
de los cuerpos cetónicos producidos localmente al conjunto total encontrado en la sangre en esta etapa no está clara; sin
embargo, se estima que tiene un efecto mínimo en tejidos distantes en sujetos con diabetes. En resumen, hemos identificado
varias proteínas y vías implicadas en la patogénesis de la arteriopatía diabética.

Los hallazgos clave incluyen la disminución de la glucólisis y el metabolismo de los ácidos grasos, un aumento pronunciado de
la vascularización, las proteínas de respuesta al estrés oxidativo, los moduladores de la apoptosis y las moléculas implicadas
en la hipertrofia y la hipertensión. Se proporcionan pruebas sólidas que respaldan la producción de cuerpos cetónicos
localmente dentro de los vasos, y se destacan las moléculas clave involucradas en este proceso. Sin embargo, todavía persisten
las limitaciones, como la transferibilidad de los resultados del modelo animal a la enfermedad humana, la evidencia estadística
subóptima debido al número relativamente bajo de muestras y la falta de información metabólica corroborativa. Sin embargo,
se recopilaron pruebas confirmatorias para justificar más estudios de validación en humanos. Además, dada la importancia de
las modificaciones postraduccionales en la función de la proteína, su investigación en relación con el desarrollo del fenotipo
está justificada. Tales enfoques dirigidos que investigan modificaciones postraduccionales y actividades de proteínas
seleccionadas, así como también proporcionar mediciones locales de metabolitos a través de técnicas avanzadas de
metabolómica, deberían aplicarse ahora. Nuestra comparación preliminar in silico de las alteraciones moleculares observadas
en el modelo de ratón frente a las alteraciones moleculares en las enfermedades humanas presentadas en este documento
apoya firmemente que tales esfuerzos estén justificados.

Tabla 3. Análisis de grupos de grupos

Se analizaron proteínas estadísticamente significativas (n = 72; P <0,05) en función de su posible participación en patologías
asociadas a diabetes mellitus o diabetes mellitus basadas en búsquedas bibliográficas, anotaciones OMIM o vías KEGG
(Enciclopedia de Kyoto de genes y genomas), y agrupadas en consecuencia. La ubicación celular se derivó de la base de datos
UniProt, y algunas proteínas se enumeran como citoplasmáticas y nucleares. Los cambios de veces promedio se calcularon al
omitir las entradas que eran únicas para 1 grupo (tratamiento o control con estreptozotocina).
 Figura 4. Análisis inmunohistoquímico de aorta
diabética de ratón. A, la aorta de animales tratados con
estreptozotocina (STZ) muestra una mayor tinción de
miosina (roja) en el medio de la pared del vaso, (B)
reducción de la tinción de glucógeno sintasa quinasa-3β
(Gsk3β) (rojo) en adventicia de ratones diabéticos, (C)
reducción de la síntesis de ácido graso (Fasn) (rojo) en
adventicia de animales tratados, (D) reducción de la
deposición de grasa en adventicia de ratones tratados
como se muestra mediante tinción con Oil red O, (E)
aumento de piruvato deshidrogenasa quinasa isoforma 4
(Pdk4) tinción (rojo), (F) aumento de la tinción con
aspartato aminotransferasa (Got2) (rojo) y (G) aumento
de la tinción con hidroxiácido-oxoácido transhidrogenasa
(Adhfe1) (rojo). DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole)
(azul) se usa para teñir núcleos. La barra de tamaño que
se muestra en la esquina inferior de A a G (izquierda) es
de 50 μm. Los histogramas muestran las proporciones
entre los canales rojo y azul de los paneles individuales,
aparte de Oil red O, que es la relación entre los canales
rojo y azul + verde. Los valores medios de 9 mediciones
cada uno (procedentes de 3 animales independientes por
categoría), incluido el SEM, el valor de P de Student y los
cambios de veces calculados del análisis de
inmunohistoquímica, así como los resultados de MS que
se muestran debajo. aPromediado en todas las isoformas
de miosina observadas, bsolo encontrado en muestras de
control, csolo encontrado en muestras tratadas con STZ, y
no encontrado por espectrometría de masas.

Colectivamente, este estudio aporta una cantidad significativa de datos de proteómica al conocimiento actual sobre el tejido
vascular y los cambios moleculares relacionados con la diabetes mellitus. Aún más, el análisis de los datos en profundidad
utilizando una combinación de herramientas bioinformáticas revela una multitud de modificaciones en muchas rutas
metabólicas y proteómicas que normalmente requerirían una variedad de técnicas de investigación para ser identificadas. Una
proporción sustancial de las enfermedades crónicas comunes, como la diabetes mellitus y sus complicaciones cardiovasculares,
renales y retinianas, enfermedad coronaria de las arterias, la hipertensión, los accidentes cerebrovasculares y la demencia
vascular, en parte se debe a enfermedades arteriales subyacentes. Sin embargo, sus aspectos comunes y la identificación de
los agentes causales aún no se han investigado en muchos casos. El análisis en profundidad presentado de alteraciones que
ocurren localmente (p. Ej., En los vasos), en este caso inducido por diabetes mellitus, es altamente relevante y fácilmente
adaptable al estudio de vasos sanguíneos de estados patológicos adicionales, abriendo así nuevas vías de investigación para
encontrar denominadores moleculares comunes de enfermedades arteriales de origen múltiple.
PERSPECTIVA CLÍNICA
La alta tasa de incidencia de la diabetes mellitus en todo el mundo es un importante problema de salud y supone una gran carga económica
para la sociedad. Asociado a la diabetes mellitus existe un riesgo elevado de desarrollar enfermedad vascular, tanto a nivel micro y
macrovascular, lo que lleva a un aumento de la morbilidad y la mortalidad. Las complicaciones macrovasculares de la diabetes mellitus
incluyen fibrosis, formación de placas y, en última instancia, daños en los órganos que conducen a eventos como el infarto de miocardio y
el accidente cerebrovascular. Las complicaciones microvasculares pueden provocar nefropatía diabética, neuropatía y retinopatía. El
tratamiento eficaz de estas afecciones requiere una comprensión de los cambios moleculares subyacentes y las vías implicadas en los
tejidos afectados, lo que permite el desarrollo de intervenciones farmacológicas más específicas y eficaces. En este estudio, investigamos
los cambios moleculares en un nivel de proteína inducido por la hiperglucemia usando un modelo de ratón diabético usando enfoques de
proteómica y biología de sistemas. Los principales hallazgos corroboran las características mundiales conocidas de la diabetes mellitus a
nivel de proteínas y vías e incluyen un aumento pronunciado de la vascularización, disminución de la glucólisis y el metabolismo de los
ácidos grasos, modulación de las proteínas oxidativas de respuesta al estrés, proteínas involucradas en procesos apoptóticos y moléculas
involucradas en hipertrofia e hipertensión. Una de las principales implicaciones es que la formación de cuerpos cetónicos y la deposición
vascular asociada en las aortas diabéticas podrían ser potencialmente un evento localizado. La identificación de las moléculas clave
involucradas se puede utilizar para dirigirlas farmacológicamente en estudios futuros específicamente, que también abordarán la
transferibilidad de los resultados a la condición humana.

MÉTODOS SUPLEMENTARIOS

Preparación de la muestra.
Los tejidos se mezclaron con un Ultra-Turrax T 25 (IKA, Staufen, Alemania) y se homogeneizaron en tampón de lisis con SDS, se incubaron
a 95ºC durante 3 minutos y se colocaron en un baño ultrasónico durante 30 minutos. Se tomó una alícuota del homogeneizado y se colocó
en un dispositivo de filtro Micron YM-30 (Millipore, Watford, Reino Unido). Dos veces, se añadió tampón de urea 8 M (UA) al
homogeneizado y se centrifugó a 14,000 g durante 15 minutos. El sedimento se mezcló durante 1 minuto con tampón de yodoacetamida
0,05 M (IAA) y se incubó durante 20 minutos. Se añadió tampón UA y se centrifugó (dos veces). Se añadió tampón de bicarbonato de
amonio (ABC) y se centrifugó (dos veces) antes de incubar durante la noche con tripsina. La digestión se centrifugó y se lavó con tampón
ABC antes de la acidificación con ácido fórmico (0,1%). Los volúmenes de muestra se ajustaron para coincidir con la concentración final de
proteína antes del análisis por LC-MS / MS.

Análisis de espectrometría de masas.

Los extractos tisulares se separaron en un sistema de flujo nano Dionex Ultimate 3000 RSLS (Dionex, Camberly UK). Se cargó una muestra
de 5 μl en ácido fórmico al 0,1% y acetonitrilo (98: 2) sobre una columna de nano trampa C18 de 5 μm de Dionex de 100 μm x 2 cm a un
caudal de 5 μl / min. La elución se realizó en una nanocolumna Acclaim PepMap C18 de 75 μm x 50 cm, 2 μm, 100 Å con un gradiente lineal
de ácido fórmico al 0,1% y acetonitrilo (98: 2) frente al disolvente B, ácido fórmico al 0,1% y acetonitrilo (20:80), comenzando en 1% B
durante 5 minutos aumentando a 30% a 400 minutos y luego a 50% B a 480 minutos. La muestra se ionizó en modo de ión positivo usando
una fuente de ESI nano-spray Proxeon (Thermo Fisher Hemel UK) y se analizó utilizando un espectrómetro de masas con transformada de
Fourier Orbitrap-Velos (Thermo-Finnigan, Bremen, Alemania). Los espectros de masas se adquirieron en un modo dependiente de datos
(top 40) para cambiar entre la adquisición de MS y MS/MS. Los iones de los padres se fragmentaron por disociación inducida por colisión
(CID).

Búsqueda de base de datos de secuencias de proteínas.

Los espectros de masas se analizaron usando el módulo SEQUEST de Proteome Discoverer (Thermo Fisher Hemel UK) y la base de datos de
secuencias de IPI de ratón (versión 3.67). La tasa de descubrimiento falso para la búsqueda de secuencias se calculó automáticamente
utilizando la referencia y las bases de datos de señuelos. Hay al menos dos formas de usar los aciertos "Señuelo" para calcular el
descubrimiento falso: el FDR global estima la tasa de error de todo el conjunto de proteínas definido por un valor umbral. Es decir, el FDR
global indica la probabilidad de error del conjunto completo de identificaciones con puntajes tan buenos o mejores que el umbral
establecido y utiliza la fórmula [100 * (2 * número de ID de base de datos de señuelo) / ID totales] para definir el FDR en cualquier puntaje
de corte elegido. Por ejemplo, si uno tiene una lista de 600 proteínas identificadas con un puntaje específico de motor de búsqueda de 137
a 15, y esta lista contiene 18 "ID" de la búsqueda en la base de datos de Decoy, entonces la estimación FDR utilizando el método Global
para el conjunto de ID con puntajes de 15 o más sería 100 * (2 * 18) / 600 = 6%. Este FDR del 6% se aplica a todo el conjunto en promedio.
Los ítems de mayor puntaje tienen un FDR <6% y los que tienen un puntaje bajo con FDR> 6%. Estas deficiencias conducen a la introducción
del FDR local, que estima la tasa de error local alrededor de una identificación dada, lo que indica la probabilidad de que la identificación
es incorrecta Hemos utilizado la estimación FDR global de 0,38% en nuestro análisis.

Cuantificación inmunohistoquímica

Las imágenes de tinción inmunohistoquímica se registraron usando el canal azul para tinción nuclear y el canal rojo para la tinción específica
(Zeiss LSM software, Zeiss, Alemania). En ImageJ (versión 1.47v), se seleccionaron áreas aleatorias y el área se dividió en sus tres
componentes de color (rojo, azul, verde) y se cuantificó en función de la imagen de escala de grises transformada. La relación de intensidad
para cada sección se calculó dividiendo el valor del canal rojo por el valor del canal azul, con la excepción de la tinción Oil red O, donde el
valor del canal rojo se dividió por la suma del canal azul y verde valores. Estas relaciones (9 mediciones por tinción por condición) se usaron
luego para calcular la significación estadística usando una prueba t de Student imparparescoheterrástica, el valor medio y el error estándar
de la media.