FACULTAD

DE
CIENCIAS LABORATORIO DE ANÁLISIS
EXACTAS Y INSTRUMENTAL
NATURALES Informe de trabajo final

DETERMINACIÓN DE RIBOFLAVINA EN LECHE Y BEBIDAS DE IMITACIÓN

DE LECHE NO LÁCTEA POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIENCIA.

LUIS FERNANDO LOZANO CORTÉS, ANDRÉS FELIPE ORTIZ ZAPATA

Fecha de presentación 09/06/2015

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RESUMEN

La riboflavina (B2) es una vitamina hidrosoluble del complejo B, cuyo aporte

nutricional es imprescindible para el buen funcionamiento del organismo. La leche
es una de las principales fuentes de riboflavina en la dieta humana, sin embargo, en
la mayoría de los alimentos se degrada durante los procesos térmicos
convencionales y en el almacenamiento. En el presente trabajo se determinó el
contenido de riboflavina en leche entera UHT y bebidas de imitación de leche no
láctea (Leche de soya). Se prepararon 5 patrones de concentración desde 0.006
mg/ml hasta 0.01 mg/ml utilizando riboflavina pura y agua tipo I. Para la preparación
de las muestras de soluciones de leche y leche de soya se vertieron 25 ml de las
bebidas de leche y de leche de soya cada una en un beaker, se realizó una solución
de acetato de plomo 10% peso/volumen, y se tituló usando ácido acético hasta
ajustar el pH a 3.2. Una porción de esta solución (5 ml) se transfirió a cada uno de
los beaker de 2.5 ml cada uno. Las muestras se llevaron a centrifugación y
posteriormente se filtraron utilizando papel filtro, las muestras se guardaron en
beaker y se taparon con papel aluminio para protegerlos frente a la luz, en la
cuantificación para la determinación de riboflavina por cromatografía líquida de alta
eficiencia (HPLC) con detección por UV-visible dando como resultado 0,0057 mg/ml
en la leche y 0.0068 mg/ml en las bebidas de imitación de leche no láctea (Leche
de soya).

Palabras Clave: riboflavina, cromatografía liquida de alta eficiencia, leche, leche de soya
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INTRODUCCIÓN
La cromatografía es un método de
separación ampliamente utilizado en
análisis químico, esta es,
probablemente, la herramienta más
potente y versátil a disposición del
analista moderno; en un solo proceso
se puede separar una mezcla en sus
componentes individuales y hidrosolubles se encuentran las
proporcionar al mismo tiempo la
estimación cuantitativa de cada
componente. Las muestras pueden
ser gaseosas, liquidas o sólidas y
puede variar en complejidad desde
una simple mezcla de dos analitos a
una mezcla de múltiples componentes
con amplia variabilidad química.
Además, el análisis puede llevarse a
cabo, en un instrumento muy costoso
y complejo, o sobre una placa de capa
fina, simple y de bajo costo (1).
La cromatografía liquida de alta
eficiencia (CLAE o HPLC) es la técnica
en la que se utiliza una fase
estacionaria sólida, la cual al
interaccionar con la fase móvil liquida,
genera diferentes fuerzas que
permiten la separación de los diversos
analitos que componen la muestra.
Con este tipo de cromatografía se
puede trabajar una gran variedad de
muestras, dado que no tiene
limitaciones por estabilidad térmica ni
volatilidad de la muestra; por tal razón,
se pueden ver aplicaciones diversas,
tales como, separaciones de:
macromoléculas, productos naturales,
carbohidratos, vitaminas, pesticidas,
contaminantes, saborizantes,
colorantes, entre muchos otros. (2)
Las vitaminas son un grupo de
compuestos orgánicos que se
encuentran en pequeñas cantidades
en muchos alimentos, las que son
esenciales para lograr un crecimiento
y funcionamiento óptimo del cuerpo
humano (3). Las funciones que
desempeñan las vitaminas son
diversas, actúan como coenzimas,
antioxidantes, en la regulación
genética y en funciones
especializadas (4). Las vitaminas se
dividen en dos grupos, hidrosolubles y
liposolubles. Dentro de las
vitaminas del complejo B formado por
la tiamina, riboflavina, niacina,
piridoxina, ácido pantoténico, biotina,
cobalamina y ácido fólico (5).
La sustancia matriz de los compuestos
de la familia de la riboflavina es la 7,8-
dimetil-10 (1 '-ribitil) isoaloxacina y a
todos los derivados se les aplica el
nombre de flavinas (FIGURA 1) (6).
Generalmente, se encuentra
fosforilada integrando las coenzimas
flavin mononucleótido y flavin adenín
dinucleótido; las cuales funcionan
como coenzimas de numerosas
enzimas flavina-dependientes que
catalizan diversos procesos de
oxidación-reducción (7). Ambas se
convierten fácilmente en riboflavina
por la acción de las fosfatasas
presentes en los alimentos y en el
aparato digestivo. Esta vitamina es
sintetizada solamente por
microorganismos y vegetales, los
animales no pueden sintetizarla. La
riboflavina es esencial para la
prevención de queilosis, dermatitis
seborreica, vascularización cornea,
entre otras.
 muy buena fuente de aminoácidos
esenciales, muy necesario para el
crecimiento y desarrollo por lo tanto
contiene una buena cantidad de
proteína superior en calidad a la
proteína animal. La diferencia es que
la proteína de soya no contiene
colesterol e inhibe el proceso de
descalcificación que provoca el azufre
que tiene la proteína animal. También
protege contra los cánceres en
especial el de mama.
Debido a las altas concentraciones de Es buena fuente de proteínas y
vitaminas del complejo B presentes en vitaminas. En el mercado
carnes y leche, estos alimentos son encontramos algunas marcas de leche
considerados como las mejores de soya que pueden o no tener azúcar
fuentes naturales de riboflavina en la y se presentan en diferentes
dieta del hombre en todo el mundo (8). sabores. (11)
Existe una amplia gama de productos
alimenticios obtenidos a partir de la
leche, algunos de ellos implican el uso
de la leche entera y otros sólo
porciones de ésta separadas
mediante distintas operaciones.
Existen muchas razas de bovino que
se destinan a la producción de leche
en todo el mundo. Las leches
disponibles en el mercado para
consumo directo pueden ser de vida
útil corta (leche pasteurizada, estable
de 3-5 días bajo refrigeración) y larga FIGURA 2: CROMATOGRÁFO HPLC
(leche ultra pasteurizada, estable THERMOSCIENTIFIC ULTIMATE
durante meses a temperatura 3000 Y MUESTRAS DE LECHE
ambiente) (9). ENTERA UHT MARCA COMERCIAL
Sin embargo, una pérdida ‘CELEMA’ Y LECHE DE SOYA UHT
considerable de riboflavina ocurre MARCA COMERCIAL ‘SOY PLUS’.
cuando el alimento es expuesto a la
luz. La foto degradación de la
riboflavina en productos lácteos
depende de diversos factores, tales
como, intensidad de la luz, tiempo de METODOLOGÍA
exposición y tipo de contenedor (10).
La leche de soya se obtiene triturando Para encontrar la determinación de
los granos de la soya. En el mercado riboflavina por cromatografía líquida
se encuentra en polvo y líquida en
envase de cartón. La leche de soya es
de alta eficiencia se realizó el proceso
que se menciona a continuación:
Para un primer método se prepararon
seis soluciones estándar de riboflavina
con diferentes concentraciones a
partir de unas soluciones madres de
riboflavina pura y agua tipo I desde
una concentración de 0.0005 mg/ml
hasta 0.005 mg/ml. Luego para la
preparación de las muestras de
soluciones de leche y leche de soya se
vertieron 25 ml de las bebidas de leche
y de leche de soya cada una en un
beaker, se realizó una solución de
acetato de plomo 10% peso/volumen,
y se tituló usando ácido acético hasta
ajustar el pH a 3.2. Una porción de
esta solución (5 ml) se transfirió a cada
uno de los beaker de 2.5 ml cada uno.
Las muestras se llevaron a que contenía las muestras y los
centrifugación y posteriormente se
filtraron utilizando papel filtro, las
muestras se guardaron en beaker y se
taparon con papel aluminio para
protegerlos frente a la luz.
Se depositaron aproximadamente
entre 10 y 15 ml de las muestras en
dos viales pequeños de vidrio,
después se filtró la muestra a través
de un filtro desechable de 0.45 µm de
poro con la finalidad de extraer
partículas sólidas en la muestra y
finalmente se guardó la muestra en un
vial específico para cromatografía
liquida de alta eficiencia (HPLC).
Antes de indicarle al equipo que
realice la separación cromatográfica
se encendió el detector de ultravioleta
visible, el inyector automático y la
bomba. Después se creó el método a
trabajar en el software cromatográfico
Chromeleon Chromatography Data
System el cual fue: COLUMNA:
Restek C18, TEMPERATURA DEL
HORNO: Temperatura ambiente,
FASE MOVIL: H2O-Ácido acético,
Metanol (70-30%), FLUJO: 1 ml/min,
TIEMPO DE CORRIDA: 20 min,
VOLUMEN DE INYECCIÓN: 10 uL,
DETECTOR DE ULTRAVIOLETA-
VISIBLE: 270 nm. Después se abrió
la válvula de purga de la bomba desde
el software y se le indicó la función de
purga, y después se limpiaron las
líneas donde trabajan los solventes
con el fin de evitar interferencias o
trazas de otros sistemas que fueron
utilizados anteriormente.
Se registró en la ventana donde se
realizó el cromatográma si el equipo
podía empezar el trabajo, se chequeó,
se creó la secuencia con el nombre de
la muestra, la posición de los viales
patrones y se le dio la orden al inyector
para que comenzara la corrida
cromatográfica.
Cómo en la corrida cromatográfica no
hubo lectura de patrones, solo se
presentaron picos de ruido
cromatográfico, se realizaron 5
nuevos patrones de concentración
para un segundo método con una
concentración más alta siguiendo los
pasos anteriores con riboflavina pura y
agua tipo I desde 0.006 mg/ml hasta
0.1 mg/ml. Se guardaron en los viales
específicos para HPLC y se realizó
una nueva corrida cromatográfica con
las especificaciones anteriores.
Después se construyó la curva de
calibración concentración VS área,
previamente analizados los patrones y
la muestras en el equipo, para así
hallar las concentraciones de
riboflavina en las muestras de leche y
leche de soya.
RESULTADOS

TABLA #1: BARRIDO ESPECTRAL PARA LA DETECCIÓN DE RIBOFLAVINA

EN ESPECTROFOTOMETRÍA DE ULTRAVIOLETA VISIBLE

LONGITUD ABSOR LONGITUD ABSORB LONGITUD ABSORB

DE ONDA BANCIA DE ONDA ANCIA DE ONDA ANCIA

190 nm 0.559 270 nm 0.235 350 nm 0.144

195 nm 0.442 275 nm 0.242 355 nm 0.162
200 nm 0.429 280 nm 0.233 360 nm 0.181
205 nm 0.347 285 nm 0.219 365 nm 0.199
210 nm 0.229 290 nm 0.199 370 nm 0.221
215 nm 0.278 295 nm 0.179 375 nm 0.204
220 nm 0.265 300 nm 0.162 380 nm 0.187
225 nm 0.244 305 nm 0.144 385 nm 0.176
230 nm 0.218 310 nm 0.130 390 nm 0.161
235 nm 0.195 315 nm 0.112 395 nm 0.143
240 nm 0.185 320 nm 0.096 400 nm 0.123
245 nm 0.177 325 nm 0.078 405 nm 0.110
250 nm 0.175 330 nm 0.095 410 nm 0.096
255 nm 0.181 335 nm 0.102 415 nm 0.081
260 nm 0.185 340 nm 0.113 420 nm 0.071
265 nm 0.216 345 nm 0.132 425 nm 0.071

TABLA #2: ÁREA DE LOS PATRONES DE CONCENTRACIÓN PARA LA

DETERMINACIÓN DE RIBOFLAVINA

PATRONES CONCENTRACIÓN ÁREA

(mg/ml)
RIBOFLAVINA 0.0005 -------------------
RIBOFLAVINA 0.001 -------------------
RIBOFLAVINA 0.002 -------------------
RIBOFLAVINA 0.003 -------------------
RIBOFLAVINA 0.004 -------------------
RIBOFLAVINA 0.005 -------------------
NOTA: Cómo los primeros patrones de concentración no mostraron lectura se
prepararon unos nuevos patrones de concentración con una concentración más
alta.

TABLA #3: ÁREA DE LOS NUEVOS PATRONES DE CONCENTRACIÓN PARA

LA DETERMINACIÓN DE RIBOFLAVINA

PATRONES CONCENTRACIÓN ÁREA TOTAL

(mg/ml) TIEMPO DE ÁREA
RETENCIÓN
2.357 min 2.453 min
RIBOFLAVINA 0.006 2.2863 2.2986 4.5849
RIBOFLAVINA 0.007 10.1495 9.4774 19.6269
RIBOFLAVINA 0.008 13.6882 12.7445 26.4327
RIBOFLAVINA 0.009 15.7172 14.9209 30.6381
RIBOFLAVINA 0.01 97.2498 105.4421 202,6919

NOTA: Se suman las áreas a los diferentes tiempos de retención ya que los picos
que arrojaba la gráfica tenían hombros que tomaban áreas en dicho tiempo de
retención por lo tanto se procede a sumarlas en dichos tiempos de retención.

TABLA #4: ÁREA DE LAS MUESTRAS PROBLEMA PARA LA

DETERMINACIÓN DE RIBOFLAVINA

MUESTRAS CONCENTRACIÓN ÁREA TOTAL

(mg/ml) TIEMPO DE RETENCIÓN ÁREA
2.357 min 2.453 min
LECHE DE CONC1 9.5985 4.3231 13.9216
SOYA UHT
LECHE CONC2 0.9045 3.0369 3.9414
ENTERA UHT

NOTA: Se suman las áreas a los diferentes tiempos de retención ya que los picos
que arrojaba la gráfica tenían hombros que tomaban áreas en dicho tiempo de
retención por lo tanto se procede a sumarlas en dichos tiempos de retención.
CURVA DE CALIBRACIÓN CONCENTRACIÓN VS ÁREA RIBOFLAVINA

AREA
35
30.6381
30
26.4327

25
19.6269
20
ÁREA

15 AREA
Linear (AREA)
10
4.5849
5

0
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01
CONCENTRACIÓN (mg/ml)

NOTA: Se realiza la curva de calibración con 4 datos ya que en el último valor el

área no es proporcional porque en el tiempo de retención el área es muy grande,
por lo tanto se decidió hacerlo con los primeros 4 datos de concentración.

CONCENTRACIÓN DE RIBOFLAVINA POR REGRESION LINEAL

TABLA #5: CONCENTRACIÓN Y ÁREA PARA DETERMINACIÓN DE

RIBOFLAVINA

CONCENTRACIÓN AREA
0.006 mg/ml 4.5849
0.007 mg/ml 19.6269
0.008 mg/ml 26.4327
0.009 mg/ml 30.6381
LECHE DE SOYA UHT 13.9216
LECHE ENTERA UHT 3.9414
R^2= 0.9597
A= 0.00529
B= 0.000108
Y= B * X + A
CONC1= [(Y – A) / B]
CONC1= [(13.9216–0.00529) / 0.000108]
CONC1= 0.0068 mg/ml
CONC2= 0.0057 mg/ml

CONCENTRACIÓN DE RIBOFLAVINA EN LECHE UHT: 0.0057 mg/ml

CONCENTRACIÓN DE RIBOFLAVINA EN LECHE DE SOYA UHT: 0.0068 mg/ml

ANÁLISIS DE RESULTADOS (tabla#2); luego se realizó una

segunda lectura en la cual si se
evidencio la presencia de la
 Se realizó un barrido espectral misma; con esto y otros análisis
para conocer la longitud de realizados anterior mente que
onda a la que se lee la dio un resultado similar, se
riboflavina. Cuando se realizó concluyó que el cromatógrafo
el análisis de este barrido se tenía problemas a la hora de
observó que no había inyectar las muestra y patrones.
estabilidad a la hora de medir la
absorbancia de los patrones, ya  Se realizó la curva de
que cuando se observó los calibración con cuatro patrones
resultados del blanco de calibración ya que en el
fotométrico (agua tipo I) daban último valor el área no es
resultados negativos proporcional porque en el
esperando que esta tiempo de retención el área es
absorbancia fuera cero. muy grande.

 Cuando se realizó una primera  En la curva de calibración

lectura en el cromatógrafo dio realizada se observó una
como resultado que no había relación lineal entre el área y la
presencia de riboflavina en los concentración con un
patrones, ni las muestras
 coeficiente de correlación (r2)
de 0.9597.
 Al analizar el área de la muestra
de leche entera UHT se
observó que este valor no
estaría dentro de la curva de
calibración, y esto pudo ocurrir
porque se pudo deteriorar la
riboflavina presente en la leche
ya que es una sustancia se
destruye con facilidad bajo la
acción de la luz.
 Con esta práctica y con la
búsqueda de bibliografía se
llegó a conocer que los
tratamientos UHT determinan
perdidas del contenido en
riboflavina inferiores al 10%. En
envases que protegen de la luz,
no se detectan perdidas
sensibles del contenido en
riboflavina en la leche UHT.(12)
 Para hallar la concentración de
la leche entera UHT se
determinó que el área de dicha
muestra no cabía en la curva de
calibración y se halló la
concentración con los datos de
la curva extrapolando dando
como resultado 0.0057 mg/ml.
Lo cual era de esperarse ya que
el contenido de riboflavina en la
leche es menor que el
contenido de riboflavina en las
leches de imitación no láctea.
CONCLUSIONES
 Se puede concluir que a la hora
de preparar las muestras que
contengan riboflavina es de
suma importancia tener el
almacenamiento adecuado y
protegerlas de la luz en su
preparación ya que al contacto
directo con la luz la riboflavina
se destruye.
 Se concluyó al trabajar en el
cromatógrafo liquido de alta
eficiencia que habían fallas en
el inyector porque a la hora de
leer el cromatográma se
observaba que la muestra no
inyectaba al principio y en la
gráfica solo había presencia de
ruido cromatográfico
 Se concluyó que la técnica
instrumental de cromatografía
liquida de alta eficiencia es muy
útil a la hora de cuantificar y
determinar vitaminas ya que las
detecta y es un método fácil de
usar e interpretar
 Para obtener los beneficios de
esta vitamina en la leche y en
las bebidas de imitación de
leche no láctea es
recomendable consumir estos
alimentos en el menor tiempo
posible ya que después de un
tiempo sus niveles se van
reduciendo.
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