UNIVERSIDAD ANDRES BELLO

CARRERA DE TECNOLOGIA MÉDICA

ESPECIALIDAD DE LABORATORIO CLINICO

MANUAL PRACTICO DE
BIOQUIMICA CLINICA I

PROF. T.M. PAULINA PEREIRA CHANDIA

PROF. T.M. CRISTIAN GUTIERREZ
UNIDAD I: PREPARACION DE REACTIVOS Y PRESENTACION DE EQUIPOS

 Fotómetro y microscopia
 Preparación de reactivos a utilizar en laboratorios

UNIDAD II: ESPECTROFOTOMETRIA

 Mediciones espectrofotométricas
 Espectrograma de absorción
 Curva de Calibración
 Rango de linealidad y Límite de dilución. Ley de Beer

UNIDAD III: CONTROL DE CALIDAD

 Precisión analítica Y Exactitud analítica

 Gráficas de control de calidad (seminarios)

UNIDAD IV: EQUILIBRIO ACIDO BASE

 Determinación de pH
 Determinación de Electrolitos Plasmáticos

UNIDAD V: PROTEINAS

 Determinación de proteínas totales y albumina. Otras técnicas

 Electroforesis de proteínas plasmáticas

UNIDAD VI: ENZIMAS

 Medición de actividad enzimática. Factores que afectan la reacción.

UNIDAD VII: LIPIDOS

 Determinación de Colesterol total y HDL

 Determinación de Triglicéridos y cálculos de CHO-LDL

UNIDAD VIII: CARBOHIDRATOS

 Determinación de Glicemia y Glucosuria.

NORMAS GENERALES
_______________________________________________________________________

PUNTUALIDAD
 No se admitirán estudiantes atrasados.

MATERIALES
 El estudiante deberá estar provisto de:
o Uniforme
o Cuaderno de protocolo
o Guía de laboratorio
o Cuadernillo de papel milimetrado

PREPARACIÓN
 El estudiante debe conocer la teoría y nomenclatura del trabajo practico a
realizar. Para esto, el estudiante deberá estudiar las materias relacionadas
usando sus apuntes de clases, guía de laboratorio y los textos listados en la
bibliografía del programa de la asignatura. Esto se verificará por medio de test
relacionado con el trabajo práctico a realizar.
 Toda experiencia se realizara previa explicación e instrucción del profesor.

REGISTRO
 Registre todos los procedimientos y protocolos de los trabajos prácticos.
 Cada observación y/o dato obtenido debe anotarse de inmediato en el
CUADERNO DE PROTOCOLO que será revisado periódicamente.
 El correcto uso de este cuaderno es uno de los factores importantes para
conseguir buenas calificaciones.

ORGANIZACIÓN
 Durante el desarrollo del trabajo práctico debe observarse la más estricta
disciplina para evitar accidente y aprovechar lo mejor posible el tiempo y
material disponible.

HÁBITOS
 El ORDEN y la LIMPIEZA del lugar de trabajo debe mantenerse
permanentemente. El éxito de las experiencias y, por lo tanto del aprendizaje,
 dependen fundamentalmente de adquirir tales HABITOS.

CUIDADOS
 Observe atentamente las etiquetas de los frascos de reactivos antes de usarlos;
luego déjelos en su lugar correspondiente.
 Todos los residuos de cada procedimiento deben ser colectados en envases
adecuados y etiquetados para su posterior tratamiento.

CALIDAD DEL TRABAJO

 Jamás devuelva reactivos (o disoluciones) a los frascos correspondientes;
NUNCA introduzca en ellos objetos, baguetas, cucharillas, pipetas, etc.

RESPONSABILIDAD
 El estudiante antes de abandonar el laboratorio debe limpiar su lugar de
trabajo y devolver conforme el material que haya recibido.

EL ESTUDIANTE QUE NO CUMPLA ALGUNA DE ESTAS NORMAS, SERA SANCIONADO

CON EL ABANDONO DEL LABORATORIO Y SERA CALIFICADO CON LA NOTA MINIMA
(1.0) EN EL TRABAJO PRACTICO RESPECTIVO.
 REACTIVOS Y SOLUCIONES
_______________________________________________________________________

En el análisis químico las distintas reacciones que tienen lugar en los

procedimientos analíticos van a ocurrir mayormente en una disolución y con la
intervención de reactivos que están disueltos en un solvente determinado. Por ello
resulta importante recordar y saber utilizar los conceptos de los que son las
disoluciones y como se forman, los factores que afectan la solubilidad y la forma de
expresar la concentración de las disoluciones.
Las soluciones reactivas son preparadas por laboratorios especializados, de
forma que en la actualidad se pueden obtener comercialmente. Sin embargo, un
profesional que se desempeñe en laboratorios de química clínica no sólo debe conocer
las propiedades y características de estas soluciones, sino que debe saber prepararlas
con precisión y exactitud, ya que muchas veces los reactivos requeridos rutinariamente
no pueden ser obtenidos comercialmente. Para preparar soluciones es necesario
dominar algunas características básicas acerca de los reactivos, tales como densidad,
pesos atómicos y moleculares, valencias y pesos equivalentes para poder obtener y
calcular las concentraciones de las soluciones deseadas.
Un reactivo es cualquier compuesto químico o solución que se emplea en
análisis clínicos. Una solución se define como una mezcla homogénea de dos o más
sustancias. En una solución de una sustancia en otra, la sustancia disuelta se denomina
soluto. La sustancia en donde se disuelve el soluto se denomina disolvente. Cuando la
cantidad relativa de una sustancia en una disolución es mucho mayor que la de otra, la
sustancia presente en mayor cantidad se considera generalmente como disolvente.
Aunque las soluciones pueden ser gaseosas, líquidas o sólidas, nos dedicaremos a
aquellas en estado líquido, que son las más usadas.

DENSIDAD: La densidad designa a la masa o cantidad de materia de una sustancia

contenida en una unidad de su volumen. Una sustancia densa es aquella que tiene una
gran cantidad de materia en un volumen pequeño.

Densidad = Masa por unidad de volumen = Masa del cuerpo

Volumen del cuerpo

La densidad de los sólidos y de los líquidos se expresa normalmente en gramos

por centímetro cúbico (g/cm3) o gramos por mililitro (g/mL o g/dL). La densidad de los
gases se expresa como g/L.

Ej: Densidad del agua a 4ºC: 1 g/mL El agua a los 4ºC tiene su densidad máxima.
PESO ESPECIFICO: El peso específico de un cuerpo es un número que designa la
relación de la masa (o el peso) de un cuerpo y la masa (o el peso) de un volumen
igual de la sustancia que se toma como patrón. Los sólidos y los líquidos se refieren
al agua como patrón, mientras que los gases se toman respecto al aire como patrón.

Peso específico = Masa de sólido o líquido

Masa de un volumen igual de agua a 4ºC.

En caso de que se utilice otra temperatura debe indicarse. La densidad del agua no
varía significativamente entre 0 y 30ºC, por lo que el valor redondeado de 1 g/mL
puede utilizarse en todo este rango.

Ej: Si una pieza de aluminio pesa 2.70 veces lo que un volumen de agua, su peso
específico es de 2.70 g/mL.

PESO ATOMICO: Se define como la masa de un átomo de un elemento dado. La masa

de los átomos individuales es muy pequeña. Incluso el átomo más pesado tiene una
masa de 5 x 10-22 g. Se consideró conveniente definir una unidad especial sin la
necesidad de expresar exponentes y se definió como unidad de masa atómica
unificada (u) y se define a “u” como 1/12 de la masa de un átomo de carbono. Por la
existencia de tantos isótopos se ha descrito la masa media que abarca toda la mezcla
de isótopos de una átomo dado. Esta masa media se llama peso atómico.

MOL (n): Se define un mol de un compuesto como el peso molecular de dicho

compuesto, que se obtiene sumando los pesos atómicos de los diferentes elementos
que lo forman.

Peso Molecular (PM) = suma de los pesos atómicos por mol de un compuesto dado

Ej.: PM de 1 mol NaCl Peso atómico del Na = 23

Peso atómico del Cl = 35.5
PM = 58.5 g

VALENCIA: La unión de dos o más elementos da origen a un compuesto químico. La

unión de una pareja de elementos puede dar origen a uno o más compuestos, por
ejemplo Cu2O, CuO, N2O, NO, NO2. Estas posibilidades se deben básicamente al tipo de
unión que se establece entre los elementos. El poder de un átomo para unirse con
otro, se denomina valencia.
La valencia describe la combinación entre las partículas con cargas opuestas o
iones. Las fuerzas que intervienen son básicamente las fuerzas eléctricas clásicas que
aparecen entre dos partículas cargadas y se manifiestan de acuerdo a la capacidad de
compartir electrones según su distribución.
PESO EQUIVALENTE: El peso equivalente es aquella fracción del peso molecular que
corresponde o se combina con una unidad definida de reacción química. El peso
equivalente de la carga total del ion positivo o valencia del elemento. Las valencias se
obtienen directamente de la fórmula del compuesto químico o de la tabla periódica.

Peq = Peso molecular

Valencia x Nº de veces que se repite

El peso equivalente se define como:

a) En la teoría de los ácidos y las bases, significa la cantidad de sustancia que
produce o consume un mol de hidrogeniones (6.02 x1023H+).
b) En la teoría de óxido-reducción se define como la cantidad de sustancia que
produce o consume un mol de electrones (6.02 x1023e).

Concentración de una solución

En una solución líquida, cada componente conserva sus características y

pueden separarse como tal, pero juntos conceden a la solución propiedades especiales
y son además una buena base para que en ella se produzcan reacciones químicas.
La relación soluto y solvente en una solución se denomina concentración de
soluto. Para describir la concentración de una solución o disolución se utilizan
principalmente, los siguientes términos: Molaridad, Normalidad, Molalidad, porcentaje
en peso y porcentaje en volumen.

1. Porcentaje peso y porcentaje volumen: Como muchas soluciones se preparan

simplemente pesando los diversos constituyentes y mezclándolos, resulta muy
sencillo calcular el porcentaje del peso total de la solución debido a cada
componente.

%p/p: gramos de soluto en 100 g de solución.

%p/v: gramos de soluto en 100 mL de solución.
%v/v: volumen de soluto en 100 mL de solución.

2. Molaridad (M): Se define como el número de moles de soluto que hay en un litro
de solución.

Ej: HCl 0.15M = 0.15 moles de HCl en un litro de solución.

M= moles de soluto
Litro de solución
3. Normalidad (N): Es similar a la Molaridad, sólo que la concentración se basa en
pesos equivalentes en vez de pesos moleculares. Se define como el número de
equivalentes -gramo de soluto existentes en un litro de solución.

N = equivalente gramo
Litro de solución

4. Molalidad (m): Se define como la solución que contiene un mol de soluto por Kg de
disolvente.
m = moles de soluto
Kg de solvente

APLICACION
Ej: ¿Cuál es la Molaridad de una solución de NaCl que contiene 87 grs por litro de
solución?

n= g = 87 = 1.49 moles
PM 58.5grs

Molar = moles = 1.49 = 1.49 M.

Litro 1

Ej: ¿Cómo se prepara 500 ml de una solución de NHO3 0.125N?

Recordemos que:

1 equivalente-gramo = g
peso equivalente

y que :

Peso equivalente = PM
valencia x Nº de veces que se repite.

PM de NHO3 = 63.02 g/mol

0.125N = 0.125 eq-g en 1 litro de solución

g = eq-g x peso eq.
g = 0.125 x 63.02
g = 7.9

7.9  1000 ml
x?  500 ml X = 3.95 g

 debemos pesar 3.95 g de NHO3 y disolver en 500 mL de agua destilada para obtener
una solución 0.125 N.

Ej: ¿Cuál es la molalidad de una solución que contiene 20 g de azúcar, C12H22O11,

disueltos en 125 g de agua?

PM: C12H22O11 342 g/mol

1 mol  342 g
x?  20 g X = 0.058 moles

0.058 moles  125 g de disolvente

x?  1000 g de disolvente x = 0.468 moles

 La molalidad de la solución equivale a 0.468 m/Kg.

Hidratos

Cuando se fabrica un compuesto químico con frecuencia quedan cantidades

variables de agua unidas al compuesto. A esto se denomina agua de hidratación. Es por
esta razón que algunos reactivos se encuentran en forma anhidra (sin agua) y en forma
de uno o más hidratos.

Ej: Un procedimiento indica que es necesario preparar una solución al 10% de CuSO 4 y
se dispone únicamente de CuSO4 x H2O.

Según la definición de %p/p

Sabemos que una solución al 10% significa 10 g de soluto (CuSO4) disueltos en 100 g de
solución, que como es agua corresponden a 100 mL.

10% = 10 g
100 mL

Es necesario saber que cantidad del monohidrato corresponden a 10 g de la forma

anhidra. El camino adecuado es comparar los pesos moleculares de ambos
compuestos para relacionarlos en proporción a lo que se necesita.
PM CuSO4 = 160 g/mol
PM CuSO4 x H2O = 178 g/mol

La diferencia en los pesos moleculares se debe al peso molecular de las moléculas de

agua presentes (178 – 160 = 18 )

160 g de la forma anhidra = 10 g del anhidro

178 g del monohidratos x g del monohidrato

x = 11.13 g

En 100 mL de solución 11.13 g del monohidratos equivalen a 10 g del anhidro sin que
esto signifique que la concentración porcentual sea diferente de 10%.

PUREZA: Con frecuencia los frascos de reactivos líquidos indican en su etiqueta la

densidad y el porcentaje de pureza.

Por ej: HNO3

Densidad = 1.42 g/mL = 1 mL de solución tiene una masa de 1.42 g
Pureza de 70% = un 70% de esta masa es puro y el resto es agua

Para obtener con exactitud cuál es la masa real de 1 mL de solución concentrada basta
con multiplicar la densidad por la pureza.

d x p = masa

1.42 g/mL x 70% = 0.994 g/mL

APLICACION

Ej: Una solución 1M de H2SO4 contiene 98.08 g de H2SO4.

Ya que el peso molecular (PM) para este ácido se define como 98.08 g/mol, es decir un
mol equivale a 98.08 g.

Si quisiéramos preparar 100 mL de una solución 0.5 M de H2SO4 el razonamiento sería

el siguiente:

Si un mol de H2SO4 contiene 98.08 g 0.5 moles ¿a cuántos gramos equivalen?

1.0  98.08
0.5  x? x = 49.04 g, pero...
Los 49.04 g se pesan para un litro de solución ¿cuánto debemos pesar para 500 mL?
49.04 g  1000 mL
x?  500 mL x = 24.5 g

NOTA:
Cuando el soluto es líquido debemos transformar primero la equivalencia en masa (g).

Recordando que:
volumen = masa
densidad

En el caso de los ácidos la concentración viene expresada en %p/p.

Existe una relación directa entre la densidad y su concentración. Por tanto, se han
confeccionado tablas que dan la densidad que le corresponde.

Ej: HCl 35%, quiere decir que por cada 100 g de solución 35 g son de HCl y el resto
corresponde a agua.

Si queremos preparar un litro de solución de HCL 0.5 M y sabemos que el ácido tiene
una densidad de 1.19 g/mL y su concentración o pureza es de 35% ¿Qué volumen de
ácido debemos tomar?

0.5 M = 0.5 moles de HCl en un litro de solución.

PM del HCL= 36.4 g/mol

1 mol de HCl contiene 36.4 g, por lo tanto 0.5 moles contienen 18.2 g.

La densidad 1.19 g/mL corresponde a un ácido 100% puro, por lo tanto debemos
calcular la densidad para el ácido de 35%.

1.19 x 35 = 0.4165 g/mL

100

Por lo tanto,

v = 18.2 = 43.7 mL
0.4165

 Por lo tanto para preparar una solución 0.5 M de HCl debemos tomar 43.7 mL de
este ácido y completar el volumen a 1000 mL con agua destilada.
Cuando el soluto es líquido o un ácido debemos obtener primero la concentración
normal del ácido
Diluciones

Una solución es la obtención de una solución más débil o menos concentrada a

partir de una concentrada. Se añade un solvente, que generalmente es agua y se
obtiene así una concentración menor. Generalmente la expresión de las diluciones se
hace en relación a la proporción de las partes con respecto a la solución original.
Por ejemplo:
 Una dilución 1:10 se prepara tomando una parte de la solución concentrada
que se diluye hasta un volumen final de partes igual a 10.
 Si se desea realizar la dilución 1:5 de un suero, correspondería tomar 1
volumen de la muestra y añadir 4 volúmenes de diluyente para completar
finalmente las 5 partes.

Cuando se desea cambiar la concentración de una solución generalmente se

aplica la fórmula:
V1 x C1 = V2 x C2

Ej. ¿ Cuál es la concentración de una solución si se diluyen 25 mL de la solución 1.5 M a

250 mL?
V1 x C1 = V2 x C2
25 ml x 1.5M = 250 ml x XM
0.15M = X

La solución resultante tendrá una concentración de 0.15 M

Ej: ¿Qué volumen de H2SO4 al 98% debo tomar para preparar 250 mL de solución a una
concentración de 0.8 N?

Concentración Normal del ácido:

Densidad = 1.84 g/mL
PM = 98.1 g/mol

eq - grs = g
peso eq.

Peso equivalente = 98.01 = 49.005

2x1

Masa = densidad x volumen

1.84 corresponde a la densidad de un ácido al 100%, por lo tanto para un ácido al 98%
la densidad es 1.80 g/mL
g = 1.80 x 1000
g = 1800

Entonces = 1800 = 36.7 N

49.005

Si aplicamos la fórmula:

V1 x C1 = V2 x C2

V1 = V2 x C2 = 250 x 0.8 = 5.4 ml.

C1 36.7

 Debo tomar 5.4 mL de ácido concentrado y completar el volumen a 250 mL con

agua destilada.

Soluciones amortiguadoras: ácidos y bases

Se puedo definir como ácido toda sustancia capaz de transferir iones H + -
protones - a una base, mientras que base será toda aquella sustancia capaz de aceptar
esos protones. Cuando un ácido libera un protón se convierte en una base conjugada,
y a la inversa, cuando una base acepta un protón se convierte en un ácido conjugado.
Hay que tener presente la existencia de sustancias capaces de comportarse como
ácido o como base, según el entorno químico en el que se encuentran.

DEFINICION DE PH
La acidez de una solución depende de la concentración de los iones hidrógeno y
se caracteriza por el valor del pH, que se define como el logaritmo negativo de base 10
de la concentración de H+ : pH= - log10 [H+]
La utilidad de la cantidad expresada de esta forma tan compleja fue propuesta por
Sorensen en 1909 cuando observó, al estudiar los efectos de la concentración de
hidrogeniones en las reacciones bioquímicas, que estas concentraciones eran
extremadamente bajas.
En esta expresión puede deducirse que la escala de valores del pH de una
solución es opuesta a sus valores de la acidez; cuanto más alta es la concentración de
H+, más bajo es el valor del pH.
Como ya se mencionó, en la mayoría de los líquidos biológicos las
concentraciones de H+ son muy bajas. Por ejemplo, en la sangre y en el líquido
extracelular es de 0,00000004 mol/L. Una acidemia intensa (pH: 6,8) puede elevar este
valor a 0,00000016 mol/L y una acalemia intensa (pH: 7,8), reducirla hasta
0,000000016 mol/L. Como se puede apreciar, éstas son cifras muy pequeñas, difíciles
de manejar como tales para comparar resultados. Por otra parte, si se usa el valor de
pH y se aprecia que la cifra es de 0,00000004 mol/L, puede sustituirse por pH 7,4, al
igual que las concentraciones citadas en el párrafo anterior. El empleo del valor de pH
simplifica mucho la expresión de la concentración de iones H+ y hace que su manejo
sea mucho mas simple.

SISTEMAS DE TAMPON O AMORTIGUADORES

Un amortiguador ácido-básico es una solución de dos o más compuestos
químicos que evita la producción de cambios intensos en la concentración de iones
hidrógeno cuando a dicha solución se le añade un ácido o una base. Un buen ejemplo
de estos sistemas es el formado por el ácido carbónico y el bicarbonato sódico cuando
ambos se encuentran en una misma solución.
Cuando a una solución que contiene bicarbonato sódico se le añade un ácido como el
clorhídrico, ocurre la siguiente reacción:

HCl + NaHCO3 à H2CO3 + NaCl

Puede observarse cómo un ácido fuerte - el clorhídrico - es convertido en otro

muy débil - el carbónico -, por lo que la adición de ese ácido fuerte sólo bajará
ligeramente el pH de la solución.
De la misma forma, si añadimos una base fuerte, como el hidróxido sódico, a
una solución que contiene ácido carbónico, tendrá lugar la siguiente reacción:

NaOH + H2CO3 à NaHCO3 + H2O

Donde observamos que el ion del hidróxido sódico se combina con el ion
hidrógeno del ácido carbónico para producir agua, formando, además, bicarbonato
sódico. El resultado neto del sistema tampón es la transformación de la base fuerte
(NaOH) por la base débil (NaHCO3 ).
Si la concentración de H+ y el pH de una solución no se ven influidos
apreciablemente por la adición de pequeñas cantidades de un ácido o de una base se
dice que la solución está tamponada, es decir su pH permanece sin cambio. Una
solución tendrá estas propiedades si tiene cantidades relativamente grandes de un
ácido y de una base débiles. Si se añade a esta solución una pequeña cantidad de un
ácido fuerte, la mayor parte del H+ se combinará con una cantidad equivalente de la
base débil; del tampón para formar el ácido conjugado de la base débil; por tanto, la
(H+) y el pH de la solución permanecen casi constantes. Si se añade una pequeña
cantidad de una base fuerte a una solución tampón, la mayor parte del OH- se
combinará con la cantidad equivalente del ácido débil del tampón para formar la
base conjugada del ácido débil. De esta forma la (H+) y el pH de la solución no se
influyen apreciablemente por la adición de pequeñas cantidades de un ácido o de una
base.
Cualquier par de ácido y base débil puede utilizarse para formar una solución
tampón en tanto cuanto cada uno de ellos pueda formar su base o ácido conjugados
en la solución acuosa.
MATERIALES DE LABORATORIO DE USO COMUN EN LA PREPARACION DE SOLUCIONES

MATRAZ AFORADO: En química, un matraz volumétrico o aforado es un recipiente

con forma de pera, fondo plano y un cuello largo y delgado. Suelen fabricarse en
materiales de vidrio.
Tiene una marca grabada
alrededor del cuello (marca de
aforo) que indica cierto el volumen
de líquido que es capaz de
contener.
La forma correcta de medir
volúmenes es llevar el líquido hasta
que la parte inferior del menisco
sea tangente a la marca. El hecho
que el cuello del matraz sea
estrecho es para aumentar la
exactitud, de esta forma un cambio
pequeño en el volumen se traduce
en un aumento considerable de la AFORO
altura del líquido.
Los matraces se presentan
en volúmenes que van de 10 ml
hasta 2 litros. Su principal utilidad
es preparar disoluciones de
concentración conocida y exacta. El
procedimiento usual de preparación
de disoluciones es pesar la cantidad
de soluto, verterlo en el matraz y agregar el disolvente hasta un volumen menor que
su capacidad. Posteriormente, se disuelve bien el soluto y se llena hasta la marca
(operación conocida como "enrasar").

MATRAZ ERLENMEYER: Consiste en un frasco

cónico de vidrio de base ancha y cuello estrecho.
Se los encuentra de diversas capacidades y con
algunas variaciones. Suelen incluir una pocas
marcas para saber “aproximadamente” el volumen
contenido. Gracias a la característica forma
troncocónica del matraz se evita en gran medida la
pérdida del líquido por agitación o por
evaporación. También es importante que al
disponer de un cuello estrecho es posible
taparlo con un tapón esmerilado, o con algodón hidrófobo.
Es empleado en lugar del clásico vaso precipitado, cuando contienen un medio
líquido que debe ser agitado constantemente, sin riesgo de que se derrame su
contenido, o cuando se debe trabajar con reacciones químicas violentas. Suele
utilizarse para calentar sustancias a temperaturas altas aunque no vigorosamente.
En microbiología se lo emplea para la preparación de medios de cultivo, entre otros
motivos, por poder taparse fácilmente con un tapón de algodón hidrófobo.

VASO PRECIPITADO: Un vaso de precipitados o

"Beaker" es un simple contenedor de líquidos,
usado muy comúnmente en el laboratorio. Son
cilíndricos, con un fondo plano; se les
encuentra de varias capacidades, desde 1 mL
hasta de varios litros. Normalmente son de
vidrio. Suelen estar graduados, pero esta
graduación es inexacta por la misma naturaleza
del artefacto; su forma regular facilita que
pequeñas variaciones en la temperatura o
incluso en el vertido pasen desapercibidas en la
graduación.
Es recomendable no utilizarlo para
medir volúmenes de sustancias, ya que es un
material que se somete a cambios bruscos de
temperatura, lo que lo descalibra y en
consecuencia nos entrega una medida errónea de la sustancia.
Su graduación es inexacta y por esta razón es comúnmente usado para disolver
sustancias y transportar líquidos hacia otro recipiente
como un probeta, matraz o a un tubo de ensayo.
También son utilizados para calentar líquidos o
soluciones debido a que son resistentes a los cambios
bruscos de temperatura.

PROBETA: Es un instrumento volumétrico que permite

medir volúmenes superiores y más rápidamente que
las pipetas aunque con menor precisión.
Está formado por un tubo generalmente
transparente de unos centímetros de diámetro, y tiene
una graduación indicando distintos volúmenes. En la
parte inferior está cerrado y posee una base que sirve
de apoyo, mientras que la superior está abierta
(permite introducir el líquido a medir) y suele tener un
pico (permite verter el líquido medido). Puede estar
constituido de vidrio (lo más común) o de plástico. Se
usan comúnmente para medir volúmenes de ácidos. Para este fin es conveniente
poner un volumen considerable de agua y sobre esta disolver el ácido correspondiente
para finalmente enrasar hasta el volumen final deseado.

TUBO DE ENSAYO: El tubo de ensayo o tubo de prueba es parte del material de vidrio
más utilizado en un laboratorio. Consiste en un pequeño tubo de vidrio con una punta
abierta (que puede poseer una tapa) y la otra cerrada y redondeada, que se utiliza en
los laboratorios para contener pequeñas muestras líquidas, realizar reacciones en
pequeña escala, etc.
Los tubos de ensayo están
disponibles en una diversidad de
longitudes y anchos para servir a
múltiples necesidades. Son utilizados
también para conservar muestras
biológicas. Para trabajar con estos
elementos se utilizan gradillas para
sostenerlos.
Es importante destacar que
los tubos deben ser revisados
periódicamente a fin de supervisar su
limpieza y trizaduras. Estos deben
estar siempre muy limpios a fin de
evitar contaminación con residuos
cuando se realizan reacciones
químicas.

PIPETA: La pipeta es un instrumento volumétrico de laboratorio que permite medir

alícuotas de líquido con bastante precisión. Suelen ser de vidrio. Está formado por un
tubo transparente que termina en una de sus puntas de forma cónica, y tiene una
graduación (una serie de marcas grabadas) indicando distintos volúmenes.
Como todo material debe estar limpio antes de ser utilizado y es
importante que mientras esté siendo usado con un reactivo o muestra se
debe dejar en un recipiente u otro lugar para evitar confundirlo con otro.

Existen sustancias que no son peligrosas para el ser humano, a

pesar de esto, todo debe ser pipeteado con propipeta y, tener especial
cuidado con aquella sustancias tóxicas o corrosivas.
Es importante destacar que la exactitud de la medición es más
exacta de aforo a aforo que desde un aforo hasta el final de la punta de la
pipeta, cuando se requiere tomar un volumen. Al tomar un volumen no
deben aspirarse burbujas de aire. Para usar la pipeta se introduce la
punta cónica en el recipiente del cual se desea sacar un volumen
determinado de muestra.
Cuando no se usa propipeta se utiliza el dedo índice para retener el volumen
aspirado. Es recomendable llenar la pipeta y luego para graduar el volumen exacto que
se quiere medir se disminuye leve y lentamente la presión ejercida por el dedo, hasta
que el líquido comience a descender. Se vuelve a presionar cuando el menisco del
líquido llegó al volumen deseado. Si el líquido descendió demasiado, se vuelve a llenar
la pipeta.

MICROPIPETA: La micropipeta es un instrumento empleado

para medir pequeños volúmenes de líquidos, idealmente
entre 1 y 1000 L (microlitros). Es de destacar que el uso de
micropipetas permite emplear distintos líquidos sin tener
que lavar el aparato: para ello, se emplean puntas
desechables, de plástico, que habitualmente son estériles.
Existen diferentes tipos de puntas, entre las que destacan las
amarillas, para pipetear volúmenes pequeños (por ejemplo,
10 μL), y las azules, para pipetear volúmenes grandes (por
ejemplo, 800 μL).
Existen micropipetas manuales, en las que el volumen
a aspirar se fija girando un botón en su parte superior que
está conectado a un sistema analógico de confirmación de
volumen, y automáticas, en las cuales dicho sistema es
digital. También existen micropipetas de volumen fijo y otras
en donde la punta no es desechable y requiere lavado entre
un volumen y otro. Hay micropipetas simples, que sólo
acogen una punta cada vez, y múltiples, que permiten
procesar filas de recipientes al mismo tiempo, puesto que se
acoplan a un número variable de puntas y absorben el
mismo volumen en todas ellas.
Las micropipetas deben ser muy bien cuidadas ya que
no deben descalibrarse. Si esto sucede se pierde la exactitud
en la medición del volumen y conduce a errores graves en el
trabajo diario. Solo la punta se debe sumergir en el líquido a
medir para evitar que se introduzca líquido al interior de la
micropipeta y esta se oxide.
 UNIDAD I: PREPARACION DE REACTIVOS
_____________________________________________
PROCEDIMIENTO Nº1:
1. Preparar diversos tipos de soluciones químicas de utilización rutinaria en los
laboratorios de Química Clínica.
2. Aplicar los conocimientos teóricos en el manejo y disolución de sustancias
químicas.
3. Aplicar los conocimientos teóricos del manejo de preparación de soluciones a

concentraciones obtenidas matemáticamente.
4. Etiquetar y almacenar adecuadamente las soluciones preparadas para su
posterior utilización en la asignatura.

PROCEDIMIENTO Nº2:
1. Identificar y conocer los distintos componentes de los equipos e instrumentos
más utilizados en el laboratorio clínico, así como los problemas más comunes
que se presentan durante su utilización.
2. Identificar con sus nombres correctos los distintos equipos e instrumentos de
uso común en un laboratorio clínico.
3. Conocer el fundamento y el funcionamiento de cada uno de los equipos e
instrumentos de uso común en un laboratorio clínico.
4. Lograr identificar posibles problemas en su funcionamiento y como
solucionarlos. Procedimiento a realizar.
5. A cada equipo en el laboratorio realizar una ficha técnica, la que debe incluir:

 NOMBRE DEL EQUIPO


 FABRICANTE

 CONSUMO DE ENERGÍA
 CAPACIDAD (en caso de ser indicado)

6. Realizar a cada equipo un diagrama de flujo operativo (que debe hacerse para
hacerlo funcionar)
7. Indicar los principales componentes de cada equipo
8. Con la ayuda del profesor, abra los equipos (aquellos en los cuales se pueda
realizar 
este procedimiento)
 Identifique las partes internas del equipo.
 Como realizar algunos procedimientos reparativos y/o de mantenimiento
en ellos.
TRABAJO DE LABORATORIO
_______________________________________________________________

Realizar la preparación de los siguientes reactivo

1. Reactivo de Biuret:
 9 gr de tartrato de sodio y potasio
 3 gr de sulfato de cobre hidratado
 5 gr de yoduro de potasio
 Suero fisiológico 0.9 %.

Nota:- Cada una de las sustancias se disuelve por separado en un vaso precipitado con
unos 100 ml de agua destilada. Si hay que calentar se deja enfriar antes de realizar el
siguiente paso. En un matraz de un litro, se ponen 200 ml de NaOH 6N y se añaden las
soluciones de los otros reactivos, terminando por la de sulfato de cobre y mezclando
bien durante cada adición. Se afora con agua destilada y se mezcla cuidadosamente. Se
pasa inmediatamente a un frasco ámbar, pues la exposición a la luz puede causar
descomposición.

2. Estándar de Glucosa 1000 mg/dl

 Glucosa Anhidra
 Agua Bidestilada

3. Suero fisiológico 0,9%

 NaCl
 Agua Bidestilada

4. AcidoSulfosalicilico al 3% (EXTON)

 AcidoSulfosalicilico
 Agua Bidestilada
 UNIDAD I: PRESENTACION DE EQUIPOS Y MICROSCOPIA
_____________________________________________

Componentes de un Espectrofotómetro

Todas las mediciones de absorbancia se realizan en instrumentos adecuados

denominados espectrofotómetros y fotómetros según su composición. Estos
instrumentos son capaces de medir la luz que transmite una solución a través de una
celda o cubeta contenedora de esta. La luz transmitida se convierte internamente
mediante cálculos y sistemas especiales en unidades de absorbancia para determinar
la concentración de sustancias.

Todos los espectrofotómetros tienen básicamente los mismos componentes, aunque

la ubicación de ellos varía según el tipo de instrumento. Los principales componentes
son:

1. Fuente luminosa

2. Selector de longitud de onda (Filtro, monocromador, prisma)

3. Cubeta o celda analítica

4. Detector

5. Registrador
1. Fuente luminosa

La función de la fuente de luz es la de proveer la energía radiante que absorberá el

compuesto a investigar. Para que la fuente de luz sea adecuada debe cumplir con los
siguientes requisitos:

Producir un haz de suficiente intensidad.

Proporcionar longitudes de onda continuas en la región espectral de interés.

Producir energía radiante lo suficientemente estable.

Las fuentes de luz usadas son lámparas o ampolletas seleccionadas según el rango de
longitudes de onda indicadas para efectuar las mediciones. Es así como las lámparas
utilizadas en espectro visible son diferentes a las usadas en la zona ultravioleta.

Fuentes luminosas utilizadas en espectrofotometría

Lámpara Zona de espectro Longitud de onda

Tungsteno o Wolframio Espectro Visible 350-2200nm

Halógeno Espectro Visible 240-2500nm

Deuterio e Hidrógeno Espectro UV 190-380nm

Xenón Espectro UV 250-600nm

Nerst Espectro IR 400-20000nm

Aleación Ni-Cr Espectro IR 750-20000nm

Cuidados de las lámparas:

Debe haber un precalentamiento de la ampolleta por lo menos de 15 min. a fin de que

ésta produzca radiaciones continúas. Para que las radiaciones sean continuas es
necesario que se conste con un estabilizador de voltaje. Si hay necesidad de apagar la
lámpara y luego volver a prenderla, se debe esperar un cierto tiempo, pues apagar y
prender casi simultáneamente a repetición, disminuye la vida media de la lámpara.

En la mayoría de los instrumentos la lámpara y su casquillo están diseñados de tal

forma que la sustitución de una lámpara fundida no plantea ningún problema, puesto
que, una vez colocada la lámpara nueva, su filamento, que es de tamaño y
forma estandarizados, queda automáticamente colocado en posición idéntica la
lámpara antigua. Si el aparato con el que se trabaja no tiene un diseño de este tipo,
debe tenerse gran cuidado al cambiar la lámpara puesto que si el nuevo filamento no
está colocado con la orientación adecuada, ello puede ser causa de importantes
errores.

Una lámpara incandescente irradia bastante calor que puede afectar a los demás
componentes del instrumento o a la muestra misma. La protección contra la emisión
de calor se consigue generalmente mediante un filtro transparente fabricado de un
vidrio especial para la absorbancia de calor.

El envejecimiento de la lámpara o el acúmulo de suciedad sobre la misma puede dar

lugar a un cambio en las lecturas de absorbancia en determinados instrumentos. 

Lámpara de Tungsteno o Wolframio

2. Selector de longitud de onda

Esta parte del instrumento permite aislar la región deseada del espectro luminoso. La
diferencia fundamental entre los distintos tipos de instrumentos radica en el proceso
utilizado para aislar la longitud de onda deseada.

Puesto que la ley de Beer se cumple para una radiación monocromática y se desvía a
medida que aumenta la policromía es importante la monocromacidad de la radiación.
El aislamiento de la banda espectral requerida puede conseguirse mediante un filtro o
monocromador.
Monocromador

Son de dos tipos en general:

Rejillas de difracción: se utiliza una red para dispersar la radiación en sus longitudes 

de onda individuales. Consisten en una superficie reflectora altamente pulida que 

tiene numerosas líneas paralelas y equidistantes.

Prismas: estos dispersan la luz policromática, lo que permite escoger el rango deseado

colocando una hendidura para seleccionar el color deseado. En la región visible se
utilizan prismas de vidrio y en la UV de cuarzo o sílice fundido, ya que el vidrio no
transmite la radiación ultravioleta.

Filtros

Los filtros son mucho más simples, y están compuestos únicamente por un material
que transmite selectivamente la banda espectral deseada, absorbiendo todas las
demás longitudes de onda.
Existen dos clases fundamentales de filtros:

Filtros de Absorción: poseen características de transmisión selectiva al absorber las

longitudes de onda no deseables. Entre ellos se incluyen filtros de vidrio coloreados y
los filtros de Wratten o de gelatina.

Filtros de interferencia: Se emplean en instrumentos que efectúan mediciones sólo a

determinadas longitudes de onda. Estos filtros poseen la característica de bloquear y
dispersar las longitudes de onda no deseadas. Consisten en una o más láminas de
vidrio coloreado.

Paso de banda 


La mayoría de los monocromadores que se emplean en los laboratorios de química

clínica, en vez de transmitir luz de una sola longitud de onda dejan pasar todo un rango
de longitudes de onda. Este se identifica como paso de banda o ancho de paso de
banda del instrumento y mide la pureza espectral del mismo. Mientras más angosto
sea el paso de banda más pura es la luz. El paso de banda se define como el rango de
longitudes de onda que un monocromador puede aislar entre dos puntos de un campo
espectral, en el cual la transmitancia equivale a la mitad de la transmitancia máxima. 

La transmitancia máxima y el paso de banda efectivo están relacionados de manera
inversa. A medida que aumenta la transmitancia máxima, se hace más angosto el paso
de banda. Es necesario emplear pasos de banda angostos para obtener picos mejor
definidos y evitar así desviaciones de la ley de Beer.
Cuidados y precauciones con el selector de longitud de onda:

Los prismas y rejillas van incluidos en forma fija en el instrumento, por lo tanto, lo
único que podemos manipular es el filtro. Para la buena conservación de estos es
indispensable manejarlos y cuidarlos correctamente, además de limpiarlos y evitar
golpes bruscos. Sólo limpiarlos con un trozo de tejido suave y blando, ya que solventes
orgánicos podrían disolverlos.

3. Cubeta o celda analítica

El receptáculo en el que se coloca la muestra para efectuar la medición fotométrica se

denomina cubeta. Las hay de múltiples tamaños y se pueden emplear de diferentes
tipos. La mayoría son de plástico o vidrio Sílice y se pueden emplear satisfactoriamente
para longitudes de onda comprendidas entre 320 y 1.000nm. Para lecturas en las zonas
UV se utilizan cubetas de cuarzo, las que también pueden ser empleadas para
longitudes de onda superiores.

Existen dos tipos generales de cubetas: con sección cuadrada o rectangular y otras
circulares. La mayor exactitud corresponde a las cubetas con sección cuadrada, ya que
las circulares pierden luz incidente por reflexión y refracción.

Precauciones en el uso de cubetas:

Se recomienda siempre limpiar la zona de lectura antes de poner la cubeta en el

portacubetas. Las cubetas deben estar limpias y libres de rayones. Además, no deben
quedar burbujas de aire en el interior de la solución en la celda.
4. Detector

Los receptores o detectores son capaces de transformar la energía luminosa en

corriente eléctrica. Mientras mayor sea la intensidad de la luz que llegue al receptor,
mayor será la señal eléctrica que transmita.

Los detectores instrumentales se dividen en: Fotoconductores (fotocélula) y

Fotoemisores (fototubo y fotomultiplicadores).

Fotoconductores:

Consisten en una placa de metal (Fe o Cu) sobre la cual ha sido depositada una delgada
capa de un semiconductor que puede ser selenio o silicona. Sobre el semiconductor se
coloca una muy delgada capa de plata.

Este tipo de detector no requiere de una fuente externa de voltaje sino que se basa en
el paso de electrones internos para producir una corriente en un círculo externo, es
decir, genera su propia fuerza electromotriz y no necesita suplemento de potencial
externo para producir una fotocorriente. Un ejemplo de fotoconductores es la
fotocélula, el funcionamiento de esta se basa en el principio de que cuando la luz
incide sobre ciertos metales o semiconductores, fluyen electrones en proporción a la
intensidad de luz incidente. Es muy importante el precalentamiento del instrumento
para el óptimo funcionamiento del detector.

Fotoemisores

Fototubo: Un fototubo de vacío contiene:

Un electrodo negativo (cátodo), a menudo en forma hemiedral y recubierto de una 


capa fotoemisora sensible a la luz, como el óxido de Cesio.

Un ánodo que puede ser un alambre axialmente centrado o un alambre rectangular

que enfoca el cátodo. Estos electrodos están sellados con una envoltura de vidrio
hecha al vacío. Cuando la energía radiante cae sobre la superficie del cátodo
fotosensible, se emiten fotoelectrones que pasan hacia el ánodo, en donde son
colectados y regresados vía circuito externo, como una corriente eléctrica. La
sensibilidad de un fototubo depende de la naturaleza que recubre al cátodo.

Fotomultiplicadores:

Amplifica en forma significativa la intensidad de una corriente, ya que es altamente

sensible y rápido. Se construye usando como cátodo un metal sensible a la luz, capaz
de absorber luz y de emitir electrones en proporción a la energía radiante que incide
en la superficie del material sensible a la luz, al igual que el fototubo. Los
electrones producidos en esta superficie pasan a otra en donde cada electrón produce
4 a 6 electrones más, pasando por alrededor de 9 a 16 superficies sucesivamente.

Tienen tiempos de respuesta rápidos, no experimentan fatiga como ocurre con otros
detectores. Se emplean en espectrofotómetros para análisis rápidos y en instrumentos
de doble haz.

5. Registrador

Después que se ha detectado la energía radiante que pasa a través de la muestra, la

corriente eléctrica resultante debe ser convertida en alguna forma numérica
aprovechable. Existen dos formas de medir la respuesta del elemento sensible a la
energía radiante:

Galvanómetro (de aguja o burbuja), empleado como amperímetro y calibrado con la

escala %T o A, o ambas.

Dispositivo para lectura digital.

 MICROSCOPIA
_______________________________________________

Parte Mecánica:

1.- Sistema de Soporte:

 Pie
 Brazo
 Tubo
 Platina
 Revolver

2.- Sistema de Ajuste:

 Macro métrico
 Micrométrico

3.- Parte Óptica:

 Fuente de Iluminación
 Condensador y diafragma
 Lentes oculares (10x y 12x)
 Objetivos (4x, 10x, 20x, 40x y 100x)
 UNIDAD II ESPECTROFOTOMETRIA
_______________________________________________

Muchas de las técnicas analíticas que se emplean en el laboratorio de

Bioquímica clínica para efectuar la cuantificación de sustancias, incorporan los
principios de instrumentación espectrofotométrica.
La espectrofotometría o absorciometría se define como la capacidad que
tienen algunos compuestos de absorber energía electromagnética en cantidad
directamente relacionada con la concentración de sustancia o analito presente en una
solución. De esta forma la principal aplicación de la absorciometría es su utilización
en el análisis cuantitativo de sustancias.

1 Ausencia de sustancia disuelta en una

solución.
La luz incidente (Ps) es igual a la luz
transmitida (Po), debido a que no
existe absorción de luz por ausencia de
sustancia capaz de absorber la
radiación.

2 Sustancia disuelta en una solución.

La luz incidente (Ps) es mayor a la luz
transmitida (Po), debido a que la
sustancia en solución absorbe parte de
la radiación.

“La cantidad de luz absorbida es

directamente proporcional a la
concentración de la sustancia en
solución”
LEY DE BEER

La ley de Lambert – Beer (Lambert, 1760 y Beer, 1850) es la ley fundamental de la

absorciometría, y relaciona la concentración de una sustancia en forma directamente
proporcional con la absorbancia y en forma inversamente proporcional con la
transmitancia.

 Absorbancia (A): Cantidad de luz absorbida por una sustancia

 Transmitancia (T): Porcentaje de luz que no es absorbida.

Los valores de transmitancia varían de 0-100%. Se interpreta de la siguiente

manera:

¿ 30%T? 30% luz transmitida

70% luz absorbida.

Cuando el valor de T= 0%, A= valor infinito

T= 100%, A= 0

Por lo tanto , A y %T están relacionados mediante la siguiente ecuación:

A= log 100 / %T
A= log100 / log%T
 A= 2 – log %T

Gráficamente la Ley de Beer se observa de la siguiente manera:

APLICACIONES DE LA LEY DE BEER

Cada vez que se quiera cuantificar una sustancia a través de un método

espectrofotométrico, es indispensable que dicho método cumpla la ley de Beer. Solo
bajo esta condición podremos asegurar que la cantidad de luz absorbida por una
sustancia o “absorbancia” es directamente proporcional a su concentración. La Ley de
Beer se comprueba a través de gráficas o curvas de calibración.

Mientras mayor es la absorbancia,

mayor es la concentración de la
sustancia en solución.

A través de esta relación lineal

es posible conocer la
concentración de un analito de
interés

Es importante destacar que la ley de Beer se cumple solo para un haz de luz
monocromático (una longitud de onda). Esta longitud de onda debe ser aquella en que
la sustancia específica de interés presente su máxima capacidad de absorción, lo cual
depende del tipo de sustancia y del color de la solución en que se encuentre disuelta.
A través del selector de longitud de onda (monocromador, filtro) presente en el
espectrofotómetro es posible obtener un haz de luz monocromático.
 MEDICIONES ESPECTROFOTOMETRICAS
_______________________________________________

Cuando realizamos mediciones espectrofotométricas para cuantificar una

sustancia de interés, es necesario que se produzca una reaccionquimica de alta
especificidad para la sustancia a cuantificar. Las reacciones más utilizadas para este fin
son las colorimétricas. La intensidad del color producido se considera proporcional a la
concentración de la sustancia en estudio y por lo tanto la absorbancia obtenida
también lo será. Para que esta condición fundamental de la absorciometría se cumpla,
es necesario reducir cualquier coloración anexa presente en el medio de solución que
produzca un falso aumento de absorbancia y consecuentemente un falso aumento en
la concentración del analito.
Generalmente los reactivos que se utilizan poseen un color propio, que a la
hora de efectuar la medición se suma al color resultante de la reacción entre sustancia
y reactivo respectivo, aumentando el valor de absorbancia arrojado por el
instrumento. Para corregir esta absorbancia es que se utilizan Blancos de lectura, cuya
finalidad es la de corregir o restar las coloraciones interferentes y así obtener lecturas
representativas de concentraciones reales.
A través de una solución blanco podemos calibrar el instrumento antes de
efectuar la medición. El objetivo de un blanco de lectura es que aún cuando los
reactivos o las muestras en solución presenten algún tipo de interferente (color o
turbidez) el instrumento pueda corregir la absorbancia final y así la lectura a obtener
sea representativa de una concentración real del analito en estudio. Esto es lo que
llamamos “llevar el instrumento a cero de absorbancia”.
Existen varios tipos de blancos de lectura, de los cuales los más frecuentemente
usados son:

 Blanco de reactivo:
Se utiliza para corregir absorbancias provenientes de reactivos coloreados. Se
preparan con todos los reactivos necesarios sin incluir la solución que contiene la
sustancia en estudio.
Con este blanco calibramos el equipo cero de absorbancia y posteriormente
efectuamos la medición.

 Blanco de muestra:
No solo el color de un reactivo puede intervenir en la medición, sino que muchas
veces cuando realizamos determinaciones en fluidos biológicos estos de por sí
presentan coloración o cierta turbidez en mayor o menor grado. Los interferentes que
más se presentan en las muestras (principalmente cuando trabajamos con suero) son
la hemólisis, lipemia, turbidez e ictericia. Para este caso se utiliza este tipo de Blanco y
de esta forma reducimos el color propio de la muestra.
 Se preparan añadiendo el volumen de muestra indicado por la técnica, pero
reemplazando el volumen de reactivo por suero fisiológico o agua destilada.
Posteriormente se lee como una muestra más, pero luego de obtener la absorbancia
se le resta al valor obtenido de la reacción de muestra y reactivo.

Por ejemplo:
Valor de la muestra: 0.625
Valor blanco de muestra: 0.036

0.625 – 0.036 = 0.589 Valor real de absorbancia de la sustancia en estudio.

De esta forma nos podemos dar cuenta que 0.036 corresponde al valor de
absorbancia que falsamente se añade al valor arrojado por la sustancia problema. Si no
se corrige, a la hora de obtener la concentración obtendremos un valor más alto de lo
que realmente corresponde.

 Blancos de agua o suero fisiológico:

Se utilizan cuando los reactivos no son coloreados y el analito o sustancia de interés se

encuentra disuelto en este medio.

 Blancos de aire:

Se utilizan en determinaciones cinéticas, en que evaluamos velocidad de reacción o

cambios de absorbancia a través del tiempo. Generalmente en este caso el color del
reactivo o de la muestra no interferirá en la reacción, aún cuando estén presentes, ya
que no es una reacción colorimétrica la que se utiliza.
 TRABAJO DE LABORATORIO
_______________________________________________
PROCEDIMIENTO Nº1:
1. Encender el instrumento por lo menos 15 minutos antes de efectuar las
mediciones. Fotómetro Humalyzer 3000. Método a utilizar por definir.

2. Preparar la batería de trabajo que a continuación se señala:

TUBO SOLUCION VOLUMEN DE SOLUCION VOLUMEN DE REACTIVO (ml)

(ml)
1 A 0.010 1.0
2 B 0.010 1.0
3 BR - 1.0

3. Dejar incubar a temperatura ambiente por 10 minutos y leer en Fotómetro

Humalyzer 3000 modo transmitancia a 546 nm, llevando a cero de
transmitancia con el tubo N°7. (Una vez terminado el procedimiento no elimine
el contenido de las cubetas)

4. Registrar los resultados en la siguiente tabla:

TUBO SOLUCION % TRANSMITANCIA ABSORBANCIA

1 A
2 B
3 BR

PROCEDIMIENTO Nº2:
1. Reconocer interferentes en muestras biológicas: Hemólisis (H), Ictericia (I),
Lipemia (L).

2. Preparar la batería de tubos que a continuación se presenta:

TUBO SOLUCION MUESTRA REACTIVO SUERO FISIOLOGICO
X (ml) (ml) (ml)
1 H 0.010 1.0 -
2 HB 0.010 - 1.0
3 I 0.010 1.0 -
4 IB 0.010 - 1.0
5 L 0.010 1.0 -
6 LB 0.010 - 1.0
7 BR - 1.0 -
8 BM - - 1.0

4. Dejar incubar a temperatura ambiente por 10 minutos y leer en Humalyzer

2000 en modo transmitancia a 546 nm. Leer los tubos 1, 3 y 5 frente al tubo 7.
Los tubos 2, 4 y 6 leerlos frente al tubo 8.

5. Registrar los resultados obtenidos en la siguiente tabla:

TUBO SOLUCION X ABSORBANCIA

1 H
2 HB
3 I
4 IB
5 T
6 TB

6. Calcule las absorbancias corregidas para cada tubo, utilizando las absorbancias
de los blancos de muestra trabajados.

TUBO SOLUCION X ABSORBANCIA CORREGIDA (X - XB)

1 H
2 I
3 T
 ESPECTROS DE ABSORCION
____________________________________________
Consiste en estudiar la absorción de la luz por una determinada sustancia en
solución a través de una región del espectro, observándose que en algunas longitudes
de onda absorbe más luz que en otras.
La forma en que se representan los datos obtenidos es una gráfica en la que se asocian
las absorbancias con las longitudes de onda, gráfica que se denomina Espectrograma o
curva de absorción.
La realización de un espectrograma permite saber cuál es la longitud de onda
adecuada que se debe seleccionar a la hora de cuantificar una sustancia. De esta
forma obtenemos el haz de luz monocromático necesario para que se cumpla la Ley de
Beer.

Peak de
absorción

Para interpretar un espectrograma, se debe considerar y observar:

1. Peak de absorción:
Como regla general la longitud de onda a escoger para las mediciones debe ser
aquella en la que el absorbente muestre su máxima absorción, lo que se obtiene tras
realizar un espectrograma. Se visualiza en la gráfica como el punto más alto en la curva
de absorción.
2. Concentraciones adecuadas para el espectrograma:
Es necesario considerar que cuando se realice el espectro de absorción para
una sustancia determinada, se debe usar una concentración de ella que esté
comprendida dentro de los valores de referencia o valores normales en nuestro
organismo. Por ejemplo: para glucosa los valores referencia van desde 70 a 110 mg/dl,
por lo tanto una concentración adecuada para realizar el espectrograma podría ser de
100mg/dl.
 TRABAJO DE LABORATORIO
______________________________________________
ESPECTRO DE ABSORCION PARA PROTEINAS TOTALES POR EL METODO DE BIURET

1.Preparar según corresponda:

TUBO MATERIAL DE REFERENCIA (ml) REACTIVO DE BIURET (ml)

1 0.010 1.0
2 BR - 1.0

2.Mezclar y dejar reposar durante 20 minutos a temperatura ambiente

3. Leer contra blanco de reactivo a las siguientes longitudes de onda: 405 – 505 – 545 –
580 – 630 – y posiciones libres nm , utilizando FotometroHumalyzer 2000:

Longitud de onda ABSORBANCIA

()

4. Graficar longitudes de onda () versus lecturas obtenidas.

5.Inferir del gráfico la longitud de onda óptima para cuantificar proteínas mediante
este método.
 CALIBRACION
______________________________________________

La calibración se define como la operación que establece la relación

matemática entre la absorbancia arrojada por el instrumento y el valor conocido de
una concentración. Esta relación matemática se representa a través de un valor
numérico denominado factor de calibración. Dicho factor es quien nos permite
obtener una concentración determinada a partir de una lectura de absorbancia.

La aplicación del factor de calibración para obtener concentraciones, es la

siguiente:

CONCENTRACION = ABSORBANCIA X Fc

* Fc: Factor de calibración

En la práctica, el factor de calibración (Fc) se determina mediante la siguiente fórmula:

Fc = Concentración
Absorbancia

Por lo tanto, cuando se desea cuantificar un analito mediante espectrofotometría,

el factor de calibración es fundamental para obtener el valor en concentración de la
sustancia de interés. Cada vez que se requiera hacer una determinación cuantitativa,
se debe realizar el procedimiento de calibración, cuya finalidad es obtener dicho
factor.

Este factor se puede obtener a partir de dos procedimientos diferentes:

a) Obtención del Factor de calibración a partir de una curva de calibración

Se debe aplicar la fórmula de cálculo del factor de calibración a cada una de las
concentraciones incorporadas en la curva con la respectiva absorbancia obtenida. y
posteriormente el promedio de estos factores es el que se aplica. Teóricamente los
valores que se obtienen en cada punto de la curva deberían ser iguales, considerando
una línea perfectamente recta, pero en la práctica por diferentes variables difícilmente
los puntos resultan colineales, por lo que se utiliza un valor promedio.
Cuando el factor se obtiene a partir de una curva de calibración, a este tipo de
calibración la denominamos calibración multipunto.
Idealmente una curva siempre debe incluir a lo menos unas 5 concentraciones, pero
también puede ser de 2, 3 o 4 puntos.

b) Obtención del Factor de calibración a partir de una solución calibradora.

Un calibrador es una solución de concentración conocida. La absorbancia que

arroja esta solución permite calcular el factor de calibración de una manera mucho
más rápida y sencilla, ya que es como si trabajáramos solo una concentración de una
curva de calibración. A este tipo de calibración la denominamos calibración de un
punto.
En la mayoría de los métodos se trabaja con este tipo de calibración, aún
cuando existen algunos métodos que requieren una calibración multipunto.

Es necesario mencionar que existen varios tipos de soluciones calibradoras y las

más comunes son:
 Estándares de calibración: Solución de concentración conocida para un analito
específico. Se les denomina más frecuentemente como estándar o calibrador y son
los más usados.
 Multicalibradores: Solución que presenta varios analitos puros de concentración
conocida.
 TRABAJO DE LABORATORIO
_______________________________________________

CONSTRUCCION DE CURVAS DE CALIBRACION

Ejercicio:
Construya una curva de calibración por un método colorimétrico que nos permita
cuantificar Proteínas Totales séricas

Método: Proteínas Totales metodo de Biuret

Fundamento: Las Proteínas totales reaccionan con el reactivo de BIURET dando un

complejo coloreado de color Azul, cuya intensidad de color es directamente
proporcional a la concentración de Proteínas Totalesen la muestra de suero.

Valores de referencia para Proteínas Totales sérica: 6.6 a 7.8 mg/dl

Técnica:

Se debe hacer reaccionar 10 l de suero con 1ml de reactivo. Esta reaccion se mezcla y
se incuba por 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente leer a 546 nm frente
a blanco de reactivo.

RECOMENDACIONES PARA CONSTRUIR LA CURVA DE CALIBRACIÓN:

 Preparar un material de referencia concentrado (MRC) de acuerdo a la

concentración más alta que incorpore en su curva de calibración.

 A partir de este MRC prepare el resto de las concentraciones que incorporará en la

curva, según fórmula de dilución.

 Una vez preparadas las diluciones, aplique la técnica para cada una de las
concentraciones.

 Una vez terminado el tiempo de incubación lea frente a blanco de reactivo y

registre sus lecturas de absorbancia

 Realice una gráfica de absorbancias v/s concentración

 TRABAJO DE LABORATORIO
_______________________________________________
PROCEDIMIENTO Nº1:
Cálculo del Factor de concentración a partir de una curva de calibración

1. Prepare la batería de tubos que a continuación se señala:

TUBO MATERIAL DE REFERENCIA REACTIVO BIURET (ml) CONCENTRACIÓN

DILUIDO (ml) FINAL (mg/dl)
1 0.01 1.0 1.0
2 0.01 1.0 2.0
3 0.01 1.0 4.0
4 0.01 1.0 6.0
5 0.01 1.0 8.0
6 - 1.0 -

2. Mezclar e incubar a temperatura ambiente por 10 min.

3. Leer frente a blanco de reactivo a 546nm.

4. Registrar las absorbancias obtenidas.

5. Graficar las absorbancias versus concentración.

6. Calcular el factor que corresponda:

TUBO CONCENTRACIÓN (g/dl) ABSORBANCIA FACTOR

1 1.0
2 2.0
3 4.0
4 6.0
5 8.0

FACTOR DE CALIBRACIÓN: _____________________

PROCEDIMIENTOI Nº2:
APLICACIÓN DEL FACTOR DE CALIBRACION

1. Prepare la siguiente batería de tubos:

TUB MUESTRA DE CONCENTRACION DESCONOCIDA REACTIVO BIURET (ml)

O (ml)

1 0.010 1.0
BR - 1.0

2.Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente y lea la reacción a 546 nm frente

a blanco de reactivo.

3. Calcule la concentración de proteínas presente en la muestra de concentración

desconocida usando el factor calculado anteriormente.

FACTOR CONCENTRACION (g/dl)

A partir de una curva de calibración
 FACTOR DE DILUCION
_______________________________________________

El factor de dilución es una cifra numérica que representa la cantidad de veces que se
ha disminuido la concentración de una sustancia, cuando se encuentra disuelta en un
volumen de disolvente mayor.

Cada vez que se diluye una muestra y posteriormente se realiza su determinación,

se debe aplicar el factor de dilución tal como si fuera un factor de concentración.

ABS. MUESTRA DILUIDA X FC X FD = CONCENTRACION

* FC: FACTOR DE CALIBRACION, * FD: FACTOR DE DILUCION

Cuando un método requiere desproteinización o cualquier procedimiento

anterior a la determinación, en donde se agregue una solución o reactivo, se realiza
una dilución de la muestra. En estos métodos siempre se debe incluir el factor de
dilución.

El factor de dilución se calcula a partir de la siguiente fórmula:

FACTOR DE DILUCION: Volumen final_ (vol. Muestra + disolvente )

Volumen incial (Vol. de muestra)

 Por ejemplo:
Las proteínas interfieren en la reacción que se produce en un método para determinar
una sustancia X. Por lo tanto antes de aplicar el método es importante eliminar o
extraer las proteínas de la muestra y asi liberar a la determinación de cualquier error
por la interferencia de las proteínas.

El procedimiento para la desproteinización es el siguiente:

A 0.5 ml de muestra agregar 1 ml de ácido tricloroacético y centrifugar 5 minutos a
3.000 rpm. Posteriormente aplicar el método al sobrenadante de esta preparación.

A través de esta desproteinización se diluyó 3 veces la concentración original de la

sustancia X.
FD: 0.5 + 1.0 = 3
0.5
Por lo tanto, este es el factor de dilución que se aplicará para obtener la concentración
final de la sustancia x.
 ESTUDIO DE LA LEY DE BEER
______________________________________________

Permite evaluar la correspondencia entre distintas concentraciones y sus

respectivas absorbancias.

En la práctica se comprueba mediante la construcción de una curva de

calibración, en que se debe obtener una relación lineal para ambos parámetros
evaluados.

CUMPLIMIENTO DE LA LEY DE BEER

Una curva de calibración se construye utilizando a lo menos unas cinco

concentraciones diferentes y crecientes, comprendidas en un rango de valores altos,
medios y bajos según los valores de referencia para la sustancia en estudio.
Posteriormente a cada concentración se le aplica un método y se lee la absorbancia
respectiva. Tras graficar concentraciones v/s absorbancias se debe observar una línea
recta que nos indica que se cumple la Ley de Beer.

Las concentraciones se pueden preparar por medio de diluciones a partir de una

solución concentrada de la sustancia de interés (material de referencia) o bien se
puede preparar cada concentración en forma separada.
 TRABAJO DE LABORATORIO
______________________________________________
COMPROBACION DE LA LEY DE BEER PARA LA DETERMINACION DE GLUCOSA POR EL
METODO COLORIMETRICO-ENZIMATICO GOD-PAP (Glucosa-oxidasa-peroxidasa)

1. A partir de una solución estándar de glucosa (material de referencia concentrado)

preparar las concentraciones que se encuentran en la tabla:

** Realice los cálculos correspondientes para la preparación de cada solución.

TUBO GLUCOSA (ml) AGUA DESTILADA CONCENTRACION
(ml) (mg/dl)
1 20
2 40
3 80
4 120
5 240
6 320
7 400
8 600
9 800
10 1000

2. Una vez obtenida cada solución preparar la batería de tubos que a continuación se
señala:
TUBO MATERIAL DE REFERENCIA REACTIVO GOD-PAP (ml) CONCENTRACIÓN
DILUIDO (ml) FINAL (mg/dl)
1 0.01 1.0 20
2 0.01 1.0 40
3 0.01 1.0 80
4 0.01 1.0 120
5 0.01 1.0 240
6 0.01 1.0 320
7 0.01 1.0 400
8 0.01 1.0 600
9 0.01 1.0 800
10 0.01 1.0 1000
3. Mezclar e incubar a temperatura ambiente por 20 min.

4. Leer frente a blanco de reactivo a 546nm.

5. Registrar las absorbancias obtenidas.

TUBO CONCENTRACIÓN (mg/dl) ABSORBANCIA
1 20
2 40
3 80
4 120
5 240
6 320
7 400
8 600
9 800
10 1000

6. Graficar las absorbancias v/s concentración.

7. Observar el gráfico y concluir si este sigue o no la ley de Beer.

 RANGO DE LINEALIDAD Y LIMITE DE DILUCION
______________________________________________

El rango de linealidad está estrechamente relacionado con el cumplimiento de la ley

de Beer.

 Rango de linealidad:
Comprende las concentraciones para las que existe una relación lineal entre
ellas y sus respectivas absorbancias, es decir, el tramo en la gráfica que sigue la ley de
Beer. El rango de linealidad es propio de cada método e idealmente debería ser lo
suficientemente amplio, de manera que incluya la mayoría de los valores que se
obtengan de una sustancia en estudio, sin necesidad de realizar diluciones.

 Límite de dilución:
Es la concentración más alta que sigue la ley de Beer. Toda muestra cuya
absorbancia supere esta concentración debe ser diluida convenientemente. Luego de
este punto se pierde la proporción entre absorbancias y sus respectivas
concentraciones, por lo tanto, cualquier valor fuera del rango de linealidad no es
representativo de una concentración real.

Limite de
dilución
Desviación de la
Ley de Beer

Rango de linealidad
 UNIDAD III CONTROL DE CALIDAD
_____________________________________________

La mayoría de las actividades que se desarrollan en un laboratorio clínico

implican diversas operaciones o pasos y cada operación o paso está sujeto a cierto
grado de imprecisión o a una cierta posibilidad de error.
Debido a esto es que es necesario contar con sistemas de control de calidad
que nos aseguren que los valores analíticos producidos en el laboratorio sean lo
suficientemente confiables para quienes los requieren.
Un programa de control de calidad es un conjunto de actividades encaminadas
a velar por el cumplimiento en todo momento de los estándares de producción que se
aceptan.
El control de calidad puede dividirse en dos tipos fundamentales:

 Control de calidad interno o intralaboratorio está enfocado a evaluar los

procedimientos y condiciones de trabajo del laboratorio y de esta forma observar,
controlar y registrar la variabilidad que existe en los procesos efectuados, por lo
tanto el objetivo principal de este tipo de control de calidad es asegurar la calidad
del funcionamiento global del laboratorio.

 Control de calidad externo o interlaboratorio está enfocado a evaluar el

desempeño de los laboratorios entre sí, demostrando la eficiencia en el trabajo de
cada laboratorio y es efectuado por un organismo externo.

CONTROL DE CALIDAD INTERNO (CCI) EN QUIMICA CLINICA

Un sistema de Control de calidad interno tiene como objetivo principal:

 Estudiar los errores que son responsabilidad del laboratorio
 Determinar los procedimientos necesarios para reconocer estos errores,
minimizarlos y evitarlos.
La implementación de un sistema de control de calidad interno (CCI) incluye la
evaluación diaria de la confiabilidad de las pruebas analíticas que se llevan a cabo en
las muestras de pacientes.

La organización de este sistema de control de calidad incluye las siguientes etapas:

1. Análisis de muestras controles o patrones de referencia
2. Recolección diaria de los valores obtenidos a partir del análisis de muestras
controles.
3. Análisis estadístico de dichos valores
4. Representación gráfica de los valores
 MUESTRA CONTROL
______________________________________________

 Es un material en el que se conocen la concentración de uno o más analitos

incluidos en él.
 Pueden ser preparados en el laboratorio o ser obtenidos en el comercio, ya que
existen empresas especializadas en la preparación y producción de este tipo de
materiales. Los dos principales tipos son los sueros congelados o pool y los sueros
liofilizados comerciales.
 Deben comportarse como muestras reales en matrices similares a las muestras que
se van a analizar, es decir, sueros u orinas.
 Se debe disponer de una cantidad suficiente para un período de análisis de por lo
menos de seis meses. En estos casos debe ser un material homogéneo proveniente
de un mismo lote o partida.
 Deben ser estables para períodos prolongados de almacenamiento.
 Es una muestra que debe ser analizada sólo con fines de control y no para
calibración.
 Se recomienda usar dos tres materiales de diferente concentración, es decir, bajo,
normal y/o alto.

a. Pool de sueros:
Se prepara a partir de los sueros excedentes del trabajo diario que estén libres de
hemólisis, ictericia y lipemia. Posterior a sus recolección se cuantifican los parámetros
que se requieran y se almacena bajo condiciones determinadas para trabajar durante
6 meses aproximadamente.

b. Sueros comerciales:
Los fabricantes de muestras de control de calidad en gran escala mantienen
estaciones de obtención de plasma sanguíneo o animal, congelando el plasma fresco
para su transporte a las plantas de fabricación. Para preparar un lote de suero control
se lavan hasta 2000L de plasma, se desfibriniza y suplementa con diversos agentes,
con el fin de obtener las concentraciones deseadas en el producto final, que se mezcla,
filtra y distribuye en viales en forma liofilizada. Se asegura que las muestras finales
presentan una variabilidad de un vial a otro de aproximadamente el 1%.
Estos sueros comerciales vienen acompañados de cartas donde se resumen la
media y desviaciones estándar utilizadas en la evaluación de los diferentes parámetros
(+/- 2 s).
 ANALISIS ESTADISTICO

Implica determinar:

 Determinación de la Precisión analítica.

 Determinación de la Exactitud analítica.

1. Determinación de la Precisión analítica:

Se define como Precisión a la reproducibilidad de lo que se

observa.Mientras menor sea la variación observada, mayor es
la precisión. Se considera preciso cuando existe un mínimo de
variación en los resultados que se obtienen de una muestra,
cuando esta es analizada repetidamente.

La precisión habitualmente se expresa en términos de medidas de dispersión como

el Coeficiente de variación.

El estudio de la precisión se puede hacer de dos maneras:

Precisión en un día o intraensayo: efectuando 20 o 30 determinaciones simultáneas

sobre una muestra única, realizando para cada determinación todas las etapas de la
técnica.

Precisión diaria o interensayo: se efectúa la determinación de precisión de una misma

muestra en días sucesivos diferentes.

El cálculo del coeficiente de variación se obtiene a partir de la siguiente fórmula y se

expresa en porcentaje:

CV = 100 x ( s / x) %
**S: Desviación estándar; X: media

NOTA: Los límites para el coeficiente de variación en la mayoría de los sustratos es de

 5% par métodos colorimétricos y para determinaciones enzimáticas de un 10%.
2. Determinación de la Exactitud analítica:

Se define como el grado en que la medida promedio se

aproxima al valor real.

Se logra comparando el valor obtenido con el valor real. El material utilizado para
este estudio es comercial: sueros, orinas u otros fluidos biológicos a los cuales se les a
determinado la concentración de los analitos en estudio. Generalmente son sueros
humanos, obtenidos de donantes voluntarios y preparados según las normas
establecidas. El valor teórico se determina como un intervalo  2 desviaciones
estándar. Son los denominados controles normales y patológicos que se presentan
como liofilizados para luego ser reconstituidos en el momento de su uso.

Los sueros comerciales se trabajan de la misma manera que cualquier otra muestra y
en el volumen que requiera la técnica. Posteriormente se compara con la tabla de
valores indicada para el suero comercial.

Por lo tanto:

Se define como Precisión la capacidad para obtener el mismo valor para mediciones
que se repiten empleando la misma muestra.

Se define como Exactitud a la capacidad para obtener el valor establecido o

"verdadero" par una muestra.

 La exactitud de la medición comprueba si el resultado es correcto, mientras

que la precisión verifica la capacidad del método para seguir siendo correcto al
efectuar mediciones repetidas y con el transcurso del tiempo.
 TRABAJO DE LABORATORIO
________________________________________________________________

PROCEDIMIENTO Nº1: DETERMINACION DE LA PRECISIONANALITICA PARA

PROTEÍNAS TOTALES POR EL MÉTODO DE BIURET.

1. Prepare un suero control normal (HUMATROL Nº lote: ) según condiciones indicadas

por el fabricante.

2. Prepare 20 veces el siguiente esquema de pipeteo:

TUB SOLUCIÓN DE PROTEINAS REACTIVO BIURET

O (ml) (ml)
6.0 g/dl
1 0.010 1.0
**No olvide incluir un blanco de reactivo y una solución estándar para la determinación.

3. Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego lea a 546 nm frente a

blanco de reactivo.

4. Registre los resultados obtenidos en la siguiente tabla:

TUBO ABSORBANCIA CONCENTRACION
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
5. Calcule la media y desviación estándar de los datos obtenidos

6. Obtenga el coeficiente de variación y concluya cuál es la precisión analítica

CV = _______% (Debe ser menor a 5%)

PROCEDIMIENTO Nº2: DETERMINACION DE LA EXACTITUD ANALITICA PARA

PROTEÍNAS TOTALES POR EL MÉTODO DE BIURET.

1. Realice la determinación de proteínas totales en el suero control normal

(HUMATROL N-20), según procedimiento el siguiente procedimiento:

TUB HUMATROL NORMAL SOLUCIÓN ESTÁNDAR REACTIVO BIURET

O (ml) (ml)
g/dl
1 0.010 - 1.0
2 0.010 1.0
BR - - 1.0

2. Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego lea a 546 nm frente a

blanco de reactivo.

3. Obtenga la concentración proteínas totales para el suero control HUMATROL N/20

4. Compare su resultado según los valores indicados proteínas totales según la carta
de referencia para el suero control

Valor obtenido: _______________

Valor esperado: x: _____ ( )

CALCULO DE VARIABLES ESTADISTICAS

Media = X = suma de valores individuales = xi

Nº de determinaciones n

Desviación estándar:

s= suma de los cuadrados de las desviaciones = (xi – x)2

nº de determinaciones –1 n-1
 GRAFICAS DE CONTROL DE CALIDAD
___________________________________________________

El empleo de gráficas de control de calidad es un procedimiento simple y eficaz

para presentar y analizar los datos obtenidos a partir de muestras controles. El uso de
ellas permite saber, de una simple ojeada cual es el estado de precisión, denunciando
la presencia de alteraciones, incluso antes de que el error llegue a ser significativo.
La gráfica de Levey-Jennings ha sido la técnica más ampliamente utilizada.
La gráfica se construye trazando una línea horizontal correspondiente al valor de la
media y líneas horizontales correspondientes a los niveles bajo y sobre ésta ( X 1s, X 
2s y X  3s).
En las abscisas se colocan los días del mes en que se hizo el análisis y en el eje de
las ordenadas las concentraciones del analito expresadas en la unidad que
corresponda. La media se representa por una línea continua y los límites de
variabilidad por líneas punteadas (desviaciones estándar,  1s,  2s y 3 s).
Se definen como límites aceptables a los valores correspondientes a 1s, límites de
precaución a los valores correspondientes a  2s y límites de alarma o acción a los
valores de  3s.
 El método habitual de interpretación de esta gráfica consiste en considerar que la
prueba está controlada cuando los correspondientes valores se encuentran dentro de
los límites y se considera fuera de control cuando un valor supera tales límites.

Con esta gráfica es posible tomar decisiones inmediatas con respecto a si los
procedimientos y resultados obtenidos para un paciente son correctos basándose en la
capacidad de los valores del control para permanecer dentro del límite preestablecido.
Si el valor de control se encuentra dentro de este límite, se supone que los resultados
de las muestras del paciente que se corrieron al mismo tiempo que el control son
valores correctos.

Examen de la gráfica de control de calidad

Para interpretar los datos representados en la gráfica de Levey-Jennings se ha

desarrollado un sistema de reglas múltiples, que definen límites específicos para los
valores de los controles.
El conjunto de reglas utilizadas corresponde al sistema de Reglas de control de
Westgard, que se utilizan cuando un valor cae sobre el límite de 2s, por lo que se debe
desencadenar la inspección de los datos de control utilizando los criterios de rechazo.
Las reglas recomendadas según Westgard (1981), comprende los siguientes términos:

REGLA 1: 2 DS
 Cuando un valor de control supera el (si esta es la única regla violada se
límite de alarma (+/- 2s), ya sea en consideran valores de control aceptables)
dirección ascendente o descendente.
REGLA 1:3 DS
 Rechazo cuando un valor de control
supera el límite de acción (+/-3s), ya sea
en dirección ascendente o descendente.

REGLA 2:2 DS
 Rechazo cuando dos valores
consecutivos superan el límite de +/- 2s
ya sea en dirección ascendente o
descendente.
REGLA R : 4 DS
 Rechazo cuando la diferencia entre dos
valores consecutivos en dirección
opuesta a la media supera 4s.

REGLA 4: 1 DS
 Rechazo cuando 4 valores consecutivos
superan el límite de +/- 1s y se
encunetran en la misma dirección con
respecto a la media.

REGLA 10 : X
 Rechazo cuando 10 valores consecutivos
caen a un lado de la media.

La mayor ventaja del sistema de Reglas de control de Westgard, es que permite

distinguir entre un error aleatorio y el sistemático.

Error aleatorio: Se produce sin seguir un patrón real y se detecta por un valor de
control que es significativamente diferente al resto de los valores. Se consideran
generalmente como acontecimiento de tipo único y es posible volver a correr las
muestras de los pacientes y los controles con éxito.

Error sistemático: Es de tipo continuo y afecta todos los resultados de igual manera.
Este tipo de error se percibe como una tendencia o desplazamiento y es necesario
investigar e identificar que los provoca.

En una gráfica de control de calidad evaluamos simultáneamente la precisión

(interensayo) y exactitud analítica.
 TRABAJO DE LABORATORIO
______________________________________________

CONFECCION DE UNA CARTA DE CONTROL DE CALIDAD PARA PROTEINAS TOTALES

POR EL METODO DE BIURET

1. Realice 20 veces la determinación de proteínas totales en un suero control

HUMATROL normal N/20, mediante el método de Biuret (ver técnica en laboratorio
anterior).
2. Una vez obtenidos los valores en concentración realice el análisis estadístico según
la siguiente tabla:

Nº de Valores individuales Desviaciones del Cuadrado de las

determinaciones xi valor medio desviaciones
n (xi – x) (xi – x)2
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Suma de los valores Suma de los cuadrados
individuales de las desviaciones

xi = (xi – x)2 =
x
3. Una vez obtenido el valor de la media y desviación estándar, calcule los límites
aceptables, de precaución y de alarma.

4. Construya una gráfica de control de calidad según el modelo de LeveyJennings.

ESTABLECIMIENTO DE LÍMITES

Límite aceptable

Superior x + 1s
Inferior x – 1s

Límite de precaución

Superior x + 2s
Inferior x – 2s

Límite de alarma o acción

Superior x + 3s
Inferior
UNIDAD IV: EQUILIBRIO ACIDO BASE
DETERMINACIÓN DE pH Y ELECTROLITOS PLASMÁTICOS
UNIDAD V: PROTEINAS SERICAS
METODOS Y FUNDAMENTOS PARA EL ESTUDIO DE PROTEINAS

Las proteínas se consideran como los constituyentes estructurales más

importantes para la célula. Las proteínas participan prácticamente en todos los
procesos que se llevan a cabo en el organismo: transporte, catálisis enzimática,
control homeostático, coagulación de la sangre, cicatrización, etc.
Las proteínas del plasma tienen su origen en diferentes fuentes, dentro
de las cuales el órgano principal para la síntesis proteica es el hígado. Por esta
razón la determinación de proteínas se utiliza preferentemente para evaluar
alteraciones de la función de síntesis que cumple el hígado.
En las diferentes patologías la concentración de proteínas se ve afectada,
y generalmente es necesario saber que fracción de proteínas se altera. Cuando
hablamos de proteínas totales nos referimos a la albúmina y las globulinas.
Métodos como el Biuret nos permiten determinar la cantidad total de
proteínas que circulan en la sangre, pero para ororientar mejor el diagnóstico de
las diferentes patologías es necesario aplicar métodos que nos permitan
determinar las proteínas en sus diferentes fracciones, es decir, Albúmina y
globulinas. La separación de las fracciones proteicas se realiza por electroforesis
y la cuantificación de alguna globulina específica por métodos nefelométricos o
inmunoensayos como inmunoturbidimetría e inmunodifusión radial.
GLOBULINAS

MIGRACION PROTEINAS
ELECTROFORETICA
-1-antitripsina
1 -1-glucoproteína ácida u orosomucoide
-1-fetoproteína
Haptoglobina
2 -2-macroglobulina
Ceruloplasmina
Transferrina
-2-microglobulina
C3 y C4
Proteína C reactiva
Ig G
Ig A
Ig M
 PROTEINAS TOTALES
______________________________________________

METODO DE DETERMINACION

Se utiliza como método preferencial el procedimiento colorimétrico de la

“Reacción del Biuret”, del cual existen cientos de modificaciones, pero cuyo
principio general es el mismo.

 Fundamento del método de Biuret

Cuando una solución de proteínas se alcaliniza fuertemente con Hidróxido
de sodio o de potasio y se agrega una solución diluida de sulfato de cobre, se
produce un color violeta, cuya intensidad depende de la concentración de
proteína utilizada.
Esta reacción, llamada reacción de Biuret, es propia de las sustancias que
contienen dos grupos carbamilos (-CONH) unidos directamente o por medio de
un átomo de carbono o de nitrógeno. Las proteínas y los péptidos (a partir de
los tripéptidos) presentan dicha estructura y por lo tanto, dan positiva esta
reacción.
El reactivo de Biuret (sulfato cúprico en medio alcalino), reacciona con
compuestos que tienen dos o más enlaces peptídicos dando coloración
característica. El color desarrollado se debe a la formación de un complejo de
coordinación entre el Cu++ y cuatro átomos de nitrógeno que provienen dos
cadenas peptídicas.

VALORES DE REFERENCIA

Suero: 6.6 - 8.7 g/dl

TRABAJO DE LABORATORIO
______________________________________________________________________

Cuantificación de proteínas totales en muestras de suero por el método de

Biuret
 CUANTIFICACION DE ALBUMINA Y GLOBULINAS
_______________________________________________
La albúmina constituye una de las proteínas más abundantes en la
sangre.
Es sintetizada en el hígado junto a otras proteínas y una de sus principales
funciones es la de transportar y almacenar una amplia variedad de sustancias de
bajo peso molecular como la bilirrubina, hormonas, ácidos grasos libres y
algunos medicamentos. Las globulinas representan el resto de las proteínas de
la sangre y se agrupan según su movilidad electroforética en alfa, beta y gama
globulinas. En cada fracción existen una gran variedad de proteínas de
importancia clínica.

METODOS DE DETERMINACION

La determinación de albúmina se realiza mediante métodos

colorimétricos como el verde de bromocresol, que consiste en la formación de
un complejo coloreado de este compuesto con la albúmina mediante enlaces
aniónicos. La intensidad del color es proporcional a la concentración de
albúmina presente.
Para el estudio de fracciones proteicas (globulinas) se requiere de
métodos como nefelometría o inmunodifusión radial y su separación se realiza
mediante electroforesis.

VALORES DE REFERENCIA

Albúmina sérica: 3.8 – 5.1 g/dl

 GLOBULINAS: Se obtienen de la diferencia entre la concentración de

proteínas totales y la albúmina, es decir:
Proteínas totales - Albúmina = Concentración de globulinas ( g/dl )

 RELACION ALBUMINA/GLOBULINAS: Es un índice que orienta acerca de la

distribución en concentración de las diferentes fracciones proteicas. Arroja
información acerca de estados de hipoalbuminemia, hiperalbuminemia,
hipogamaglobulinemia o hiperagmaglobulinemia.
Se obtiene del cociente entre la concentración de albúmina y globulinas.
 TRABAJO DE LABORATORIO
_______________________________________________________________________

1. Determinación de Albúmina por el método colorimétrico

2.Determinación de globulinas y obtención de la relación albúmina/ globulinas.

 ELECTROFORESIS DE PROTEINAS SERICAS
______________________________________________
La utilización en la práctica clínica de la separación de proteínas en el
suero por medio de electroforesis le ha convertido en un examen útil en la
detección y confirmación de enfermedades inflamatorias, infecciosas,
auotinmunes y estados de hipo e hipergammaglobulinemias.
La visualización del proteinograma o curva obtenida a partir de una
electroforesis permite orientaciones rápidas y clínicamente significantes. En
esta curva se observan bandas separadas que corresponden a las diferentes
fracciones proteicas. Aparece un gran pico alto y agudo que corresponde a la
albúmina y luego siguen varios picos que por orden se etiquetaron como alfa
1,alfa 2, beta 1, beta 2 y gamma.
El conocimiento de estas bandas características permite apreciar de
inmediato la clase de proteínas que se encuentra alterada y de esta forma
facilitar el diagnóstico de enfermedades que por medio de una simple
cuantificación en suero otorgarían escasa información.

PROTEINOGRAMA

Albúmina

Alfa 1 globulinas

Alfa 2 globulinas

Beta 1 globulinas

Beta 2 globulinas

Gamma globulinas
ELECTROFORESIS

 PRINCIPIOS TEÓRICOS:
La Electroforesis es la migración de moléculas con carga a través de un
medio de soporte bajo la influencia de un potencial eléctrico aplicado
externamente. De esta forma las moléculas son separadas de acuerdo a su
tamaño o peso molecular.
En la electroforesis, la movilidad de una partícula cargada está en función de
la magnitud de su carga, la cual varía con el pH. Si el pH de una molécula es
inferior a su Punto isoeléctrico (pI) la molécula se carga positivamente y migra
hacia el cátodo; si el pH es más alto que el pI, la molécula se carga
negativamente y migra hacia el ánodo. En base a este conocimiento es posible
la migración electroforética y la separación de moléculas.

 COMPONENTES DE UNA ELECTROFORESIS:

Fuente de poder o de alimentación: Es un sistema de rectificación de corriente

capaz de producir el rango de intensidad eléctrica necesario. La fuente de poder
permite obtener el voltaje constante para la migración electroforética.

Cámara de electroforesis: Es el recipiente en el que se desarrolla la

electroforesis. Consta de dos compartimientos para dispensar el buffer o
solución amortiguadora. Se constituyen de material no conductor y poseen una
tapa para evitar la evaporación del buffer durante la migración.

Electrodos: Son los encargados de transmitir la corriente desde la fuente de

poder a la cámara de electroforesis.
Densitómetro: Es un equipo de lectura que mide la intensidad de coloración de
las bandas. Esta intensidad se relaciona en forma proporcional a la
concentración de proteínas de cada banda.

Medio de soporte: Se refiere al gel sobre el cual se realiza la corrida

electroforética. En el caso de las proteínas el más usado es el gel de agarosa.
Este medio tiene una porosidad que depende de la concentración de agarosa y
de esta forma se obtiene la separación de las moléculas. Existen otros medios
de soporte como el acetato de celulosa y los geles de poliacrilamida.

Amortiguador o Buffer: Lafunción principal del buffer es la de mantener el pH

constante y acarrear la corriente. De esta manera se asegura que cada uno de
los componentes que se pretende separar esté dotado de una carga fija a lo
largo de toda la experiencia.

 ETAPAS DE UNA ELECTROFORESIS

Siembra de la muestra: Consiste en aplicar el volumen de suero sobre el gel. Los

volúmenes de muestra necesarios para efectuar la corrida electroforética suelen
ser pequeños. Una vez aplicado dicho volumen el gel se encuentra listo para ser
depositado en la cámara de electroforesis y efectuar la etapa de migración.

Migración: La etapa de migración se realiza en la cámara de electroforesis y

consiste en someter el gel a una corriente o voltaje constante para que se
efectúa la migración de las moléculas y puedan quedar separadas en bandas
específicas. Durante la etapa de migración la cámara de electroforesis debe
permanecer tapada para evitar la evaporación de la solución buffer.
También durante este tiempo los electrodos permencen conectados a la cámara
Las condiciones para esta etapa son el tiempo, voltaje y corriente incial
(amperaje) para la migración y dependen de la molécula separar. En el caso de
las proteínas las condiciones más adecuadas que se requieren son un tiempo
de migración de 20 minutos aprox, bajo un voltaje de 90V y una corriente inicial
de 12 mA por gel.

Fijación: Posterior a la migración los geles se sacan de la cámara y se ponen en

una solución fijadora que consta básicamente de solventes orgánicos como
etanol y ácido acético. La finalidad de esta etapa es fijar las moléculas que se
han separado al gel de agarosa.

Coloración – Decoloración: En esta etapa se tiñen las bandas con colorantes

específicos para la molécula que se ha separado. La decoloración consiste en
eliminar el colorante que se ha unido al medio de soporte y transparentarlo lo
más posible para posteriormente leer las tiras mediante densitometría.

 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ELECTROFORESIS:

VOLTAJE: el voltaje al que se somete el soporte actúa como una resistencia

eléctrica y por lo tanto se calienta. Si el soporte no es capaz de disipar
eficientemente el calor, se corre el riesgo de denaturar las sustancias a separar y
alterar así sus migraciones. Bajos voltajes producen bandas difusas, mientras
que altos voltajes producen bandas superpuestas.
BUFFER:
1.Carga iónica:
Buffer concentrado: Posee alta carga iónica. Las bandas logran quedar
separadas y definidas, pero la distancia de migración entre una y otra tienden a
acortarse y las fracciones quedarán pobremente separadas.
Buffer diluido: Posee baja carga iónica que repercute en una disminución de la
velocidad de migración, obteniendo bandas muy difusas y mal separadas.
2.Temperatura del Buffer: Es necesario mantener la solución amortiguadora a
temperatura ambiente, considerando que Tº mayores a 30ºC, producen una
alteración de la corrida electroforética.
3.Volumen del Buffer: El buffer actúa como conductor de la corriente eléctrica y
debe estar en cantidad exacta para cubrir los extremos del gel al interior de la
cámara. De no mantener el volumen adecuado se afectará la migración y las
bandas no quedarán bien separadas.
4.pH del Buffer:El pH determina la carga de la molécula de proteína. Una buffer
alcalino permitirá que las proteínas se carguen negativamente y migrén hacia el
ánodo, mientras que un buffer ácido cargará positivamente las proteínas,
haciéndolas migrar hacia el cátodo.
5.Preparación del Buffer: Mantención del pH adecuado y con un diluyente
(agua destilada) que no afecte su ionicidad.
6.Flujo de electroendosmosis: Se denomina así al efecto de flujo de buffer,
debido a que el medio de soporte tiene cargas negativas y hace que el
amortiguador fluya hacia el cátodo cuando se expone a un campo eléctrico. La
tasa de flujo del amortiguador varía con los diferentes medios de soporte.
Cuando un medio de soporte electroforético tiene carga negativa, la fuerza
electromotriz a la cual está sujeto tiende a desplazarlo hacia el ánodo (polo
positivo). Sin embargo, como el medio soporte sólido está fijo y no puede
desplazarse, hay en vez de ello, un flujo compensador de tampón hacia el
cátodo, que acarrea con el las sustancias a separar.

MUESTRAS:
Es necesario utilizar sueros frescos, sin diluir y libre de hemólisis.
Cuando se usa plasma, el fibrinógeno presnete en la muestra produce una
banda similar una inmunoglobulina monoclonal y por esta razón se prefiere usar
suero.
La Hemólisis favorece un aumento en la banda alfa 1 y beta.
En el caso de sueros conservados se puede producir una disminución de la
banda beta 2 debido a que el complemeto C3 desaparece en 3 días. También se
puede producir un desplazamiento anódico de la banda Beta hacia la banda Alfa
cuando los sueros sin antiguos o han permanecido por mucho tiempo
conservados.
En caso de sueros conservados se recomienda un plazo no mayor a una semana
a una temperatura de 2-8ºC

GELES:
El almacenamiento de los geles debe ser en forma horizontal y de preferencia a
una temperatura de 2 a 8 ºC.Se recomienda evitar las variaciones de
temperatura durante el tiempo de almacenamiento.
No se deben usar geles deshidratados o contaminados con crecimiento
bacteriano o fúngico.
Durante la migración electroforética los geles deben permanecer en parte
sumergidos en la solución buffer para conducir de manera eficiente la corriente
eléctrica.
La aplicación de las muestras sobre el gel debe ser en la posición y cantidad
correcta
La posición del gel en la cámara debe ser con la cara superior invertida, para
evitar la deshidratación del gel por la producción de calor durante la migración.
 INMUNODIFUSION RADIAL
_________________________________________________
Es una técnica de inmunoanálisis de precipitación en fase sólida que
permite aislar las fracciones proteicas que no pueden ser separadas por
electroforesis.
Se utiliza una matriz semisólida, como un gel agar, impregnado
uniformemente de un anticuerpo específico para la proteína que buscamos. El gel
contiene diferentes cavidades u orificios cilíndricos para depositar la muestra. Al
depositar el suero, el antígeno (proteína de interés) difundirá en el agar,
encontrándose con el anticuerpo respectivo y formando un complejo que
precipitará en forma de anillo alrededor de la cavidad.
Generalmente se utilizan placas que contienen alrededor de 10 cavidades y
se mantienen refrigeradas de 2 a 8ºC. No se deben usar placas deshidratadas.

INTERPETACION DE LA PRUEBA

La evaluación de los resultados puede efectuarse utilizando el método cinético o

de punto final.
 Método cinético:
Para utilizar este método es necesario trazar una curva de calibración con los
estándares apropiados.
1. Medir los diámetros a las 18 a 20 horas de efectuada la aplicación de la
muestra.
2. Utilizando un papel logarítmico, graficar el diámetro de los estándares en
función de la concentración de los mismos.
3. Hallar los valores de las muestras interpolando los correspondientes diámetros
en la curva de calibración.

 Método de punto final:

Medir los diámetros una vez finalizada la difusión (48 a 72 horas). Para obtener
resultados pueden obtenerse los siguientes procedimientos alternativos:
a) Con curva de calibración: Utilizando un papel milimetrado que acompaña a
cada placa, graficar la concentración de los estándares en el eje X contra
diámetro al cuadrado de los mismos en el eje Y. Luego interpolar los valores de
las muestras desconocidas utilizando el cuadrado de los respectivos diámetros.
b) Con curva de referencia: Interpolar el diámetro de las muestras en la tabla de
valores correspondiente a cada lote.
 TECNICAS DE AGLUTINACION
________________________________________________
Las pruebas de aglutinación son reacciones inmunoquímicas que producen
la agregación de partículas o células recubiertas de antígeno o de anticuerpo.
La reacción de aglutinación se divide en dos fases:
 Contacto antígeno-anticuerpo: se produce sobre la superficie de la partícula (o
célula ) empleada.
 Agregación de las partículas: posterior a esto se visualiza la aglutinación.

Las reacciones de aglutinación por interacción antígeno-anticuerpo tienen

una gran variedad de aplicaciones. Es así como se pueden utilizar en el laboratorio
para la determinación semicuantitativa de algunas proteínas.
En el laboratorio, las reacciones de aglutinación se pueden realizar en tubos
o tarjetas. Generalmente se realiza sobre tarjetas que contienen pocillos
delimitados par realizar la reacción. Los reactivos que se utilizan en su mayoría
contienen partículas de látex recubiertas de antígeno o anticuerpo según lo que se
quiere determinar. De esta forma , es común referirse a este tipo de test
serológicos, como “pruebas de aglutinación con látex”
Es importante considerar que para una correcta interpretación de las
pruebas, siempre es necesario incorporar sueros controles positivos y negativos
para chequear la confiabilidad de los reactivos. De esta manera ejecutamos el
control de calidad en este tipo de test.

 REACTANTES DE FASE AGUDA

En nuestro organismo existen muchas proteínas que comparten la

propiedad de mostrar elevaciones en sus concentraciones en respuestas a estados
inflamatorios producidos por infecciones, heridas, cirugías, traumatismos u otras
necrosis de los tejidos. Incluyen la 1-antitripsina, glucoproteína ácida,
haptoglobina, ceruloplasmina, fibrinógeno y proteína C reactiva. A este grupo de
proteínas se les denomina “reactantes de fase aguda”.
La inflamación hace que los leucocitos liberen enzimas proteolíticas en los
tejidos que deben ser neutralizadas por inhibidores de enzimas para limitar la
extensión de la destrucción, las proteínas denominadas "reactantes de fase aguda"
ayudan a recoger y transportar los restos celulares y los productos de
desdoblamiento de las células fagocitarias para eliminar los restos de su actividad y
rescatar las materias reutilizables.
Estas proteínas proporcionan información cuantitativa de bastante
utilidad para vigilar el curso de un paciente, mediante determinaciones
seriadas. El de mayor utilidad y que más se utiliza actualmente en el laboratorio de
rutina es la proteína C reactiva.
El método más sencillo y rápido para detectar semicuantitativamente la
elevación de alguna de estas proteínas es un test de aglutinación, sin embargo se
puede realizar su medición aplicando algún método más específico y que no
entregará una concentración más precisa. Entre los métodos cuantitativos que se
pueden utilizar están la inmunoturbidimetría y nefelometría.

PROTEINA C REACTIVA ( PCR )

Se denomina de este modo porque reacciona con el polisacárido C de la

pared celular de los neumococos. Se sintetiza en el hígado y es un marcador
bastante inespecífico que se eleva durante la respuesta inmune a las infecciones,
daños a los tejidos o necrosis celular asociada con infarto al miocardio y
enfermedades malignas. Las mediciones repetitivas son útiles para valorar el curso
de una enfermedad.
La proteína C reactiva participa en el sistema inmunitario y desempeña una
función en la activación de complementos, fagocitosis y liberación de linfocinas. Los
niveles de Proteína C reactiva se miden mediante aglutinación con látex, ensayo
inmunoenzimátcio o nefelometría.
La mayoría de los métodos estipula que la concentración normal es menor a
5 mg/L.

SEROLOGIA REUMATICA: FACTOR REUMATOIDEO ( FR )

Bajo el término de reumatismo se agrupa un gran número de enfermedades

que afectan el sistema muscular y esquelético. Los tres grupos más grandes de
enfermedades reumáticas son las afecciones de las articulaciones, de la columna
vertebral y afecciones del cartílago y de los huesos. Se pueden dividir en:
Inflamatorias, Degenerativas y extra-articulares.
Para el diagnóstico de las enfermedades reumáticas se sigue una serie de
criterios, tanto clínicos como serológicos. Dentro de estas pruebas serológicas se
encuentran los ensayos inmunológicos, entre los que destacan el Factor
reumatoideo (FR) y la Anti-estreptolisina O (ASO).
Los factores reumatoideos son anticuerpos de tipo Ig M, que reaccionan con
el fragmento Fc de las Ig G de varias especies. Se detectan "in vitro" por su
capacidad de aglutinar partículas de látex.
Aproximadamente el 80% de los pacientes con artritis reumatoidea
presentan factor positivo.
 Los métodos más utilizados son los de aglutinación con látex que suelen
detectar niveles de Factor reumatoideo por sobre los 8 UI/ml.
 TURBIDIMETRIA
________________________________________________

Las proteínas pueden ser cuantificadas, no sólo por métodos colorimétricos,

sino también turbidimétricos. El método de Exton es uno de las más utilizados para
cuantificar proteínas urinarias y en otros líquidos biológicos como el
cefalorraquídeo, ascítico, articular, etc.

METODO DE EXTON

Se fundamenta en que el ácido sulfosalicílico precipita parcialmente las

proteínas produciendo una turbidez que es proporcional a la concentración de
proteínas presente en la muestra. Esta turbidez se mide espectrofotométricamente
a 660 nm.

NOTA: Por la turbidez que algunas muestras puedan presentar se recomienda

trabajar este método con blanco de muestra.
 TRABAJO DE LABORATORIO
________________________________________________________________________

1. Prepare una curva de calibración para proteínas por el método de Exton y

obtenga el factor de calibración para obtener concentraciones de proteínas a partir
de este método.

2. Posterior a este procedimiento, preparar la batería de tubos que a continuación

se señala:

TUBOS MUESTRA SUERO FISIOLOGICO REACTIVO

(ml) (ml) (ml)
1 0.2 - 1.0
2 - - 1.0
3 0.2 1.0 -
4 - 1.0 -

3. Mezclar y dejar reposar durante 5 minutos.

4. Leer tubo 1 frente a tubo 2 (blanco de reactivo) a 660nm

5. Leer tubo 3 frente a tubo 4 y corregir absorbancia (blanco de muestra)

UNIDAD VI: ENZIMAS
_________________________________________________
Una enzima cataliza una reacción química disminuyendo la energía de
activación. El estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por una enzima
se denomina cinética enzimática.

VELOCIDAD DE UNA REACCION ENZIMATICA EN FUNCION DEL TIEMPO

La reacción química catalizada por una enzima progresa a medida que pasa el
tiempo, hasta alcanzar su equilibrio. Esto se puede estudiar determinando la
concentración que alcanza uno de los productos a medida que transcurre la
reacción. Se observará que la concentración del producto aumenta en todo
momento, hasta llegar al equilibrio de la reacción, en que su concentración no
aumenta más. A su vez, como el producto formado proviene del sustrato de la
reacción, a medida que transcurre el tiempo la concentración de sustrato
disminuye.
Si la observación anterior se expresa en una gráfica como cantidad de producto
formado en función del tiempo, se encuentra que hay una relación directamente
proporcional durante el tiempo en que el sustrato es saturante y que la curva
tiende a aplanarse transcurrido un cierto tiempo, para hacerse completamente
plana, cuando la reacción ha alcanzado su equilibrio.
 TRABAJO DE LABORATORIO
____________________________________________________

INTERPRETACION DE RESULTADOS

La gráfica obtenida corresponde a la curva del progreso de la reacción. La parte

que más nos concierne es la parte linear temprana o cuando la reacción es de
primer orden (antes de que comiencen a estabilizarse las lecturas).
La velocidad de la reacción con que se forma el producto está dada por la
pendiente de la curva. Realice este cálculo según los valores obtenidos en su
gráfica ( Abs/ Tiempo).
 CINETICA ENZIMATICA
_______________________________________________________

Si en una reacción enzimática se mantiene el pH, el tiempo de incubación, la

concentración de enzima, la concentración de activadores y se utiliza como única
variable, la concentración de sustrato, entonces la velocidad de reacción
dependerá solamente de esta última. Así, si la concentración es muy pequeña, la
velocidad será proporcional a ésta, pero si se alcanza una concentración tal que
mantenga saturada a la enzima, la velocidad alcanza un valor máximo y constante
(velocidad máxima).
Gráficamente el fenómeno puede representarse así:

Del análisis de esta curva resulta que su primera porción es una línea recta
ascendente y dependiente, por lo tanto, de la concentración de sustrato. Su
expresión será:

Velocidad = k (E) (S) (primer orden)

Al aumentar la concentración de sustrato se llega finalmente casi a una

meseta, en que la velocidad de la reacción, ya no es afectada y se hace
independiente de la concentración de sustrato. Su expresión analítica será:

Vi= k (E) (orden cero)

En estas condiciones se dice que la enzima está saturada con sustrato.

Matemáticamente la curva total tiene la siguiente expresión: (ecuación
de Michaelis)
 Vi = Vmáx x S En que: Vi = velocidad inicial
Vmáx= velocidad máxima
Km + S S = Concentración de sustrato
Km = constante de Michaelis

Si se desea obtener el valor de la constante de Michaelis para una determinada

enzima, debe calcularse la concentración de sustrato con lo cual se logra la mitad
de la velocidad máxima. Este cálculo da solo una buena aproximación del valor real.
Es importante señalar que la constante de Michaelis es un valor que corresponde a
condiciones perfectamente definidas del sistema en el que ocurre la reacción
enzimática, ya que variaciones del medio ocasionan cambios en el Km como
sucede por ejemplo, con la presencia de inhibidores o activadores.
Para determinar Km se precisa conocer la velocidad máxima, la que no
siempre es fácil de determinar por el método anterior. Por esta razón se han
buscado otros métodos más adecuados para determinar estas constantes cinéticas
(Vmáx y Km).
Lineweaver y Burk propusieron un método en el cual se emplean los valores
recíprocos de Vi y (S). De este modo, la ecuación general quedaría así:

1 = Km x 1 + 1_
Vi Vm S Vm
  De la intersección de la recta con
la coordenada se obtiene el valor
1/ Vmáx, cuyo valor recíproco es
Vmáx.

 De la intersección de la recta con

la abscisa - 1/Km, desde donde
obtenemos el Km.

 La pendiente de la línea
corresponde a Km/V.

La constante de Michaelis es un elemento de juicio importante para

caracterizar una enzima y se expresa en términos de concentración de sustrato.
Así, por ejemplo, si la constante es 10-4M, quiere decir exactamente que a esa
concentración de sustrato se obtiene la mitad de la velocidad máxima.
 TRABAJO DE LABORATORIO
_______________________________________________________
ENZIMOLOGÍA CLÍNICA
Objetivo General.

Evidenciar como las variaciones de temperatura y/o volumen de muestra afectan

las determinaciones enzimaticas.

Objetivo Específico.

 Realizar determinaciones de punto final de fundamento enzimático en

diversas condiciones.
 Realizar determinaciones de punto final con fundamento químico en
diversas condiciones..

Procedimiento.
 Realizar la determinación de GOD-PAP variando los volúmenes de muestra
(1, 5, 10, 20 y 50 ul)
 Para cada variación de volumen realizar tres variaciones de temperatura
(T.A, 37 y 56°C)
 Grafique y Explique en base a sus conocimientos, los resultados.
FACTORES INFLUYENTES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
TEMPERATURA La Temperatura óptima de una enzima
es aquella que le permite llevar a cabo la
catálisis en las mejores condiciones de
afinidad y velocidad de reacción con el
sustrato. La temperatura óptima permite
a la enzima adquirir su mejor
conformación para desarrollar su
actividad máxima.
Pasado cierto límite de temperatura, las
enzimas corren el riesgo de denaturarse,
lo que depende del tiempo de
incubación o exposición.
pH El pH interviene controlando las
interacciones de la enzima con el
substrato, sus moduladores, los pasos
catalíticos de la secuencia de reacciones
destinadas a formar producto y las
transiciones estructurales que
acompañan la modulación de la enzima
y su catálisis.
La solubilidad de una enzima depende
del pH, ya que según este la enzima será
capaz de donar o aceptar protones del
medio.
CONCENTRACION DE ENZIMA La velocidad de una reacción enzimática
depende de la cantidad de enzima activa
presente en la reacción. Cuando la
concentración de sustrato es saturante,
la totalidad de la enzima se encuentra
como complejo enzima-sustrato y
entonces la velocidad de la reacción
(velocidad máxima) es directamente
proporcional a la concentración de
enzima, manteniendo todos los demás
parámetros, como pH, temperatura,
constantes.
EFECTO DE INHIBIDORES Ciertos inhibidores pueden unirse
firmemente a la enzima modificando
algunos grupos necesarios para que se
fije el sustrato o para que se realice otra
etapa de la reacción enzimática. Se
denominan inhibidores no competitivos
porque su acción sobre la velocidad no
depende de la concentración de
sustrato. Los inhibidores no competitivos
no afectan el Km.
EFECTO DE ACTIVADORES La presencia de activadores favorece la
velocidad de reacción enzimática,
mientras que en ausencia de ellos la
actividad enzimática puede estar
disminuida.

.
 USO DIAGNOSTICO DE LAS ENZIMAS
________________________________________________

Los niveles sanguíneos de enzimas pueden verse alterados frente a diferentes

enfermedades, aumentando o disminuyendo sus concentraciones séricas.
De esta forma el uso de las enzimas en la evaluación de patologías presta gran
utilidad no sólo en su diagnóstico, sino también en la valoración de su gravedad y
en el pronóstico de la enfermedad.

La elevación de los niveles séricos de enzimas puede ser producida por:

 Un aumento en la liberación desde su fuente de origen tisular, es decir, que
cuando el tejido u órgano donde se localiza se dañe, se producirá la salida de la
enzima desde este tejido hacia el plasma, reflejándose en niveles séricos
aumentados.
 Un aumento en la permeabilidad celular producida por procesos inflamatorios,
también favorece la salida tisular de las enzimas hacia el torrente sanguíneo.
 Un aumento en la masa muscular también se traduce en un aumento de los
niveles enzimáticos.
 Un aumento en la síntesis enzimática

La disminución de los niveles enzimáticos puede afectarse por:

 Baja producción o síntesis de una enzima, que generalmente es por causas
primarias o genéticas, o bien puede disminuir su síntesis frente al daño del
órgano en el cual se sintetiza.
 Inhibición de la actividad enzimática
 Déficit de cofactores enzimáticos
Existen muchos marcadores enzimáticos que permiten evaluar funciones del
organismo. Los órganos más estudiados a través de marcadores enzimáticos por el
laboratorio son:
 Función Hepática: Transaminasas, fosfatasa alcalina,colinesterasa,
gammaglutamiltransferasas.
 Función Cardíaca:Creatinquinasas, lactato deshidrogensasa.
 Función Pancreática: Amilasa y Lipasa.
La determinación de isoenzimas puede ser útil en el diagnóstico diferencial de
algunas patologías, debido a que prestan mayor especificidad.
Las isoenzimas pueden ser estudiadas a través de métodos cinéticos
inmunológicos, en donde solo se selecciona por medio de una anticuerpo
específico la isoenzima que se quiere estudiar y también por métodos de
separación como la electroforesis
 UNIDAD V: EVALUACION DEL METABOLISMO DE LIPIDOS
______________________________________________
METODOS Y FUNDAMENTOS PARA EL ESTUDIO DE LIPIDOS

Los lípidos sanguíneos de máximo interés a la hora del diagnóstico y

tratamiento de dislipidemias son el colesterol y los triglicéridos. Las
concentraciones de lípidos sanguíneos se correlacionan con el riesgo de
enfermedades cardiovasculares y por lo tanto la principal utilidad clínica del
estudio de un perfil lipídico es establecer la presencia de una dislipidemia y
contribuir con esta información a la prevención de un incremento en el riesgo
cardiovascular.
El análisis de un perfil lipídico incluye la cuantificación de colesterol total,
triglicéridos y el colesterol de lipoproteínas como las HDL y LDL.

METODOS DE DETERMINACION

Actualmente los métodos de determinación de lípidos sanguíneos se basan

en sistemas de reacciones enzimáticas acopladas que se revelan a través de una
reacción colorimétrica.
La cuantificación de colesterol de lipoproteínas requiere una separación
previa de la lipoproteínas correspondiente (HDL y LDL) y posteriormente se aplica
el mismo método colorimétrico para la determinación de colesterol total.
La determinación de colestreol LDL puede obtenerse también a partir de una
fórmula matemática denominada fórmula de Friedwald.

MUESTRAS

Las determinaciones pueden ser en suero o plasma. Para las últimas se

considera como anticoagulante de elección EDTA, ya que otros anticoagulantes
como la heparina pueden alterar la movilidad electroforética de las lipoproteínas.
El EDTA retarda ciertas alteraciones oxidativas y enzimáticas sobre las lipoproteínas
durante su almacenamiento. De preferencia se utliza suero.

PREPARACION DEL PACIENTE

Se pide al paciente que permanezca en ayunas durante 12 horas

aproximadamente antes de la punción venosa. En el plasma post-prandial hay
habitualmente presentes quilomicrones, y según el tipo y cantidad de alimento
ingerido puede aumentar marcadamente la concentración de TG en plasma. En un
período de 12 horas los quilomicrones son eliminados. Se considera que el ayuno
tiene poco efecto sobre el colesterol total.
 COLESTEROL TOTAL
_______________________________________________
La determinación de colesterol total implica la cuantificación de colesterol
contenido en todas las lipoproteínas plasmáticas.

METODO DE DETERMINACION

Se basan en una serie de reacciones acopladas en que los ésteres de

colesterol (CHO) son hidrolizados, se oxida el grupo 3-OH del colesterol y el
peróxido de hidrógeno formado participa en la oxidación de un colorante que se
mide espectrofotométricamente:

Ester de CHO+ H2O  CHO +ác. Graso

Colesterol hidrolasa

CHO + O 2 Colest-4-en-3-ona+ H2O2

Colesterol Oxidasa

H2 O 2 + 4-Aa  Quinoneimina + 2H2O

Peroxidasa

La absorbancia de la quinoneimina formada (Colorante reducido) será proporcional

a la cantidad de colesterol en la muestra.

INTERPRETACION DE LA PRUEBA

CHO-Total  200 mg/dl

TRABAJO DE LABORATORIO
______________________________________________________________________

Determinación de colesterol Total en muestras séricas por método enzimático

colorimétrico (CHOD-PAP)
 TRIGLICERIDOS
_______________________________________________

Se basan principalmente en la hidrólisis de los triglicéridos (TG) y la posterior

determinación del glicerol liberado en la reacción.

METODO DE DETERMINACION

Se basan en una serie de reacciones acopladas en que sucede la liberación

del glicerol a partir de triglicéridos y la posterior fosforilación de glicerol para
formar glicerol-3 fosfato. Este producto se oxida y forma peróxido de hidrógeno
que participa en la oxidación de un colorante que se mide
espectrofotométricamente:

TG + Lipasa  Glicerol + Ac.grasos

Glicerol + ATP  Glicerol-3-fosfato + ADP

Glicerokinasa

Glicerol-3-P + O2 Dihidroxiacetona P + H 2O 2
GlicerolOxidasa

H2 O 2 + 4-Aa Quinoneimina + HCl + H2O

Peroxidasa

La absorbancia de la quinoneimina formada (Colorante reducido) será proporcional

a la cantidad de triglicéridos en la muestra.

VALORES DE REFERENCIA

Triglicéridos  150 mg/dl

 TRABAJO DE LABORATORIO
_______________________________________________________________________

Determinación de Triglicéridos en muestras séricas por método enzimático

colorimétrico (TGO-PAP)
 COLESTEROL HDL y LDL
_______________________________________________

Las lipoproteínas que más se cuantifican en el laboratorio son las HDL y LDL,
debido a la gran importancia clínica que ellas poseen. Su valoración contribuye
enormemente al estudio de y medición del riesgo potencial de alguna enfermedad
cardiovascular, ya que niveles elevados de CHO-LDL se correlacionan positivamente
con enfermedades cardiovasculares, mientras que con el CHO-HDL existe una
relación inversa.

METODOS DE DETERMINACION

 Determinación de colesterol HDL: El método requiere de una fase de

precipitación, en donde se van a separara las HDL del resto de las lipoproteínas.
En los métodos más empleados habitualmente las lipoproteínas que contienen
apoB( Quilomicrones, VLDL, IDL, LDL, Lp(a)) son eliminadas mediante
precipitación polianiónica y de cationes divalentes, analizándose el colesterol de
las HDL en el sobrenadante, por medio de una reacción colorimétrica.

 Determinación de colesterol LDL: Al igual que el colesterol HDL se puede

determinar por reacciones colorimétricas, sin embargo el procedimiento más
utilizado es determinar sus niveles a partir de la siguiente fórmula de Friedwald:

CHO-LDL= CHO-Total - CHO-HDL - TG en plasma

5

Se puede estimar la concentración de VLDL mediante la siguiente relación que

se expresa en la fórmula anterior:

CHO-VLDL= Triglicéridos
5
Esta relación se establece debido a que la mayoría de los triglicéridos del
plasma son transportados en las VLDL y un quinto de su contenido corresponde a
colesterol. La relación TG/CHO de las VLDL permanece siempre invariable y es por
eso que siempre se utiliza esta proporción en la determinación.
VALORES DE REFERENCIA

CHO-LDL  130 mg/dl

CHO-HDL  35 mg/dl

PERFIL LIPIDICO COMPLETO

Colesterol total Menor a 200 mg/dl

Triglicéridos Menor a 150 mg/dl
Colesterol HDL Mayor a 35 mg/dl
Colesterol LDL Menor a 130 mg/dl

A partir de estas determinaciones se pueden establecer índices de riesgo coronario

o cardiovascular tales como:

 RELACION CHO-Total /HDL: Mientras mayor sea la relación, mayor será el

riesgo de sufrir una enfermedad ateroesclerótica.

 RELACION LDL/HDL: Mientras mayor sea la relación, mayor también es el riesgo

cardiovascular.

VALORES DE REFERENCIA

Hombres Mujeres
CHO-T/ HDL Menor a 4.97 Menor a 4.44
LDL/ HDL Menor a 3.55 Menor a 3.22

TRABAJO DE LABORATORIO
_______________________________________________________________________
1. Determinación de Colesterol HDL en muestras séricas por método enzimático
colorimétrico.
2. Obtención de perfil lipídico completo, con cálculo de colesterol LD
3. Determinación del cociente colesterol/HDL y cociente LDL/HDL
 UNIDAD IV: EVALUACION DEL METABOLISMO DE
CARBOHIDRATOS
_______________________________________________
METODOS Y FUNDAMENTOS PARA LA MEDICION DE GLUCOSA

Se denomina glicemia al nivel de glucosa en la sangre. La utilidad de evaluar

la glicemia es determinar estados de hiperglicemia o hipoglicemia.
Los valores de referencia para la glucosa sanguínea van desde 70 a 110
mg/dl.

METODOS DE DETERMINACION

Muchos de los métodos que antiguamente se utilizaban para cuantificar

azúcares se basaban en el poder reductor de éstos, sin embargo hoy en día existen
métodos mucho más específicos.
La prueba que más se utiliza para determinar los niveles de glucosa
sanguínea se basa en un ensayo enzimático-colorimétrico en que se utilizan dos
enzimas en un sistema acoplado de reacciones.
La enzima glucosa-oxidasa es capaz de oxidar a la glucosa presente en una
muestra sérica dando como productos una gluconolactona y peróxido de
hidrógeno. Luego la enzima peroxidasa actúa sobre un colorante reducido en
presencia de este peróxido, dando como producto un compuesto coloreado, cuya
intensidad es proporcional a la cantidad de glucosa presente en la muestra.

Glucosa+ O2  Acido glucónico + H2O2

Glucosaoxidasa

H2O2 + Colorante reducido Colorante oxidado

Peroxidasa

MUESTRAS

Las determinaciones de glucosa pueden realizarse en sangre total, suero o

plasma y la condición del paciente puede ser en ayunas, estado postprandial o en
conjunción con pruebas de tolerancia a la glucosa.
 Determinación en Sangre total y/o plasma:
El anticoagulante utilizado será Fluoruro de Sodio (NaF) en proporción de 10
mg/ml. La acción del Fluoruro de Sodio es doble: Inhibe el proceso de coagulación,
reaccionando con el Calcio y formando Fluoruro de Calcio insoluble y anula el
proceso de glicólisis por los glóbulos rojos, inhibiendo las enzimas de este ciclo
metabólico (fundamentalmente LDH), manteniendo de esta manera constante el
contenido de glucosa por muchas horas.
La muestra tomada con anticoagulante permanece estable por 24 horas a
temperatura ambiente.

 Determinación en suero:
El suero debe separarse de los componentes celulares dentro de media hora
después de extraída la sangre, ya que se ha comprobado que la disminución media
de la glucosa en suero es de 7% en una hora.

PREPARACION DEL PACIENTE

 AYUNO: La prueba se efectúa en la mañana temprano. El paciente debe

abstenerse de ingerir alimentos por un período de tiempo aproximado de 12
horas pudiendo beber agua. El paciente permanecerá en reposo durante la
prueba y se abstendrá de fumar y de comer.

NOTA: Muchas veces las muestras de sangre provienen de los servicios de

urgencias, en donde generalmente se administran sueros por vía venosa a los
pacientes. En estas circunstancias a la hora de encontrar valores elevados, es
importante antes de entregar el informe asegurarse de que la muestra no fue
obtenida de la misma vía de administración del suero cuando este es glucosado.

INTERPRETACION DE RESULTADOS
Glicemia en ayunas
70-110 mg/dl Normal
111-126mg/dl Glicemia en ayunas alterada (requiere estudio posterior,
idealmente prueba de tolerancia)
>126 mg/dl Diabetes

Cuando la glicemia se realiza a cualquier hora del día, sin ayuno previo los
niveles aceptables son menores de 200 mg/dl, Si la glicemia es mayor a este valor
se diagnostica diabetes.
 TRABAJO DE LABORATORIO
_______________________________________________________________________

Se realizará la determinación de Glicemia en ayunas en muestras séricas por el

Método enzimático- colorimétrico GOD-PAP (kit comercial)
 GLUCOSA EN ORINA
_______________________________________________
Se denomina glucosuria a la determinación de glucosa en orina.
Normalmente no existe excreción renal de glucosa, ya que esta es reabsorbida
totalmente a nivel tubular. Sólo cuando los niveles de glucosa sanguínea
sobrepasan los 180 mg/dl (umbral renal) la glucosa puede ser excretada por la
orina.
En enfermedades como la diabetes, en donde los niveles sanguíneos de
glucosa se encuentran elevados, ocurre este hecho y de ahí la importancia de
valorar los estados de glucosuria en el paciente diabético.

Se utilizan los mismos métodos que para la determinación de glucosa en

sangre. En orina la concentración de glucosa puede ser muy superior a los niveles
sanguíneos, por lo que es conveniente diluir la muestra para respetar el rango de
linealidad establecido para el método.
La concentración de glucosa en orina se expresa generalmente en gr/L. Se
puede determinar en muestras de orina aislada (una muestra de orina del día) o en
muestras de orian de 24 horas, donde es necesario obtener toda la orina del
paciente recolectada en ese período de tiempo.

NOTA: En orinas de mujeres embrazadas es frecuente encontrar glucosuria debido

a que en esta condición disminuye la reabsorción tubular de glucosa y de esta
manera se excreta por la orina.

TRABAJO DE LABORATORIO
_______________________________________________________________________

Se realizará la determinación de Glucosa en muestras de orina por el Método

enzimático- colorimétrico GOD-PAP (kit comercial)

** No olvide realizar una dilución de la muestra antes de aplicar la técnica.

Expresión de resultados

 Transformación a g/l : mg/dl * 0.01 = g/l

 Transformación a g/24 horas: g/l * Diuresis del paciente (l) = g/24 hora

PRUEBAS DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA

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La Intolerancia a la glucosa se define como la elevación post-prandial de la

glicemia, es decir, la glicemia se eleva tras la ingestión de alimentos, existiendo una
ineficacia de los mecanismos regulatorios para regresar los niveles de glucosa a
niveles normales. Se considera que un gran porcentaje de los pacientes con
intolerancia a la glucosa progresan a diabetes tipo II.
La indicación de una prueba de tolerancia la glucosa oral (PTGO) en clínica es
restringida y tiene por objetivo diagnosticar intolerancia a la glucosa frente a
situaciones dudosas, principalmente cuando se obtiene una glicemia en ayunas
alterada o se sospecha de una diabetes leve, en donde el paciente puede tener
niveles de glucosa normales en ayunas. No se recomienda indicar esta prueba en
un caso de diabetes confirmada.

PRUEBA ORAL DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA (PTGO):

Consiste en evaluar el comportamiento normal de los niveles de glucosa por

acción de la Insulina, después de ingerirla por vía bucal. Para ello es imprescindible
conocer primero el nivel basal de glucosa del paciente, por lo que se debe tomar
una muestra de sangre en ayunas y posteriormente ingerir una dosis de glucosa
estándar.
La dosis para los adultos es de 75g de glucosa (disueltos en 200ml de agua,
dándole sabor a la solución con jugo de limón) y para niños de 1.75 g por Kg. de
peso. Luego se recogen muestras de sangre del paciente al transcurrir 1/2, 1, 2 y 3
horas después de la ingesta de glucosa.
Es importante registrar la presencia de factores que puedan influir en la
interpretación de la prueba, tales como medicamentos (diuréticos, corticoides,
salicilatos, ácido nicotínico), los que deberán suspenderse durante 5 días antes de
realizar la prueba.

 Fundamento de la prueba: Cuando se administra por vía bucal una dosis

estándar de glucosa, ocurre absorción rápidamente y aumenta la concentración en
la sangre. Esto estimula al páncreas a producir más insulina con la consecuente
disminución de los niveles de glucosa en sangre. Como en este momento existe
más insulina de la necesaria, la glucosa en sangre tiende a bajar por debajo del
nivel en ayunas, para volver a niveles normales alrededor de las 2 a 3 horas.
En una respuesta normal la concentración pico se alcanza hacia los 30 a 60
minutos y no pasa de 170mg/dl; y el nivel de glucosa a las hora puede descender
por debajo de 120mg/dl, para alcanzar nuevamente los valores normales alrededor
de las 2 a 3 horas.

CURVA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA

 Interpretación de la prueba: (Glicemia a las dos horas)

Tolerancia normal a la glucosa: Menor a 140 mg/dl

Intolerancia a la glucosa: 140 – 200 mg/dl
Diabetes: Mayor a 200 mg/dl

NOTA: A través de una prueba a o curva de tolerancia a la glucosa se pueden

evidenciar otras condiciones del paciente tales como retardo de la respuesta
insulínica o hiperinsulinismo.

GLUCOSA POSTPRANDIAL (2 Horas):

Como la muestra tomada a las dos horas tiene la máxima importancia en la

evaluación de diabetes, se puede abreviar la prueba de tolerancia a la glucosa en
una sola determinación.
La prueba de glucosa posprandial de 2 horas es una prueba de carga sencilla,
en la cual se mide la glicemia del paciente luego de dos horas de haber
consumido algún alimento que contenga aproximadamente 100 g de
carbohidratos mezclado con otras sustancias. El paciente consume su desayuno o
almuerzo y dos horas después de la comida, se le toma una muestra de sangre.
Actualmente se ha estandarizado la prueba postprandial con una carga oral de
glucosa equivalente a la PTGO. La ventaja de realizar esta prueba con una dosis fija
de glucosa la hace más precisa, ya que se evitan las variables introducidas por los
alimentos que se pueden consumir. Los criterios de interpretación de la prueba
son idénticos a los de la PTGO.

DIAGNOSTICO DE DIABETES GESTACIONAL

Durante el embarazo, generalmente durante la segunda mitad del período

gestacional existe un incremento en la secreción de hormonas placentarias
(lactógeno placentario) que son antagonistas de la insulina y por lo tanto los
niveles de glucosa se elevan. En condiciones normales este estado puede ser
contrarrestado aumentando la secreción de insulina por el páncreas, sin embargo,
en aquellas mujeres que no existe una respuesta pancreática adecuada frente a la
elevación de la glicemia se desarrolla un estado diabético durante el embarazo,
denominado diabetes gestacional. Esta Diabetes puede desaparecer luego del
embarazo o bien permanecer en el tiempo como diabetes tipo II. Las mujeres en
mayor riesgo son aquellas con antecedentes familiares directos de Diabetes tipo II.
La implicancia clínica de la Diabetes gestacional radica en que se constituye una
de las causas de pérdida de embarazo y es por eso que se debe monitorear
obligatoriamente en todas las mujeres embarazadas alrededor del sexto mes de
gestación.
La forma más eficaz de diagnosticar una diabetes gestacional es a través de
pruebas de tolerancia oral a la glucosa. Se realiza con una prueba postprandial con
dosis oral de 75g de glucosa. La prueba se interpreta igual que en cualquier
adulto no gestante.

Se considera como diabetes gestacional cuando dos o más valores en la PTGO

son superiores a los indicados y específicamente cuando la glicemia a las dos horas
está por sobre los 140 mg/dl.

TRABAJO DE LABORATORIO
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REALIZACIÓN DE LA PRUEBA DE TOLERANCIA ORAL A LA GLUCOSA (CURVA DE

TOLERANCIA )
a) Determinar los niveles de glucosa sanguínea del paciente en una muestra
tomada en estado de ayuno. Esta medición se considera como glicemia basal.

b) Si los resultados de la glicemia basal están dentro de los valores de referencia,

se procede a preparar la dosis oral de glucosa.

c) Se disuelven 75 grs de glucosa en 200 ml de agua tibia. Se puede dar un poco de

sabor agregando jugo de limón. Luego de que el paciente ingiera la carga oral
debe permanecer en absoluto reposo hasta el final de la prueba.

d) Se deben tomar muestras de sangre a los siguientes tiempos luego de ingerida

la dosis:
Media hora
1 hora
1 hora 30 minutos
2 horas

e) Una vez obtenidas todas las muestras debidamente rotuladas con el tiempo de
extracción, se centrifugan para obtener los sueros.

f) La determinación de glucosa se realiza por el método GOD-PAP.

g) Los resultados obtenidos se evalúan mediante una gráfica, para una mejor
interpretación

NOTA: Para una prueba post-prandial se realiza el mismo procedimiento con la

excepción que tras la carga oral de glucosa se tomará solo una muestra a las dos
horas
 PRUEBAS DE CONTROL PARA EL PACIENTE DIABETICO:
HEMOGLOBINA GLICOSILADA
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La hemoglobina glicosilada es un producto formado por la adición de glucosa
o de los productos derivados de la glucosa a la hemoglobina adulta normal. La
hemoglobina glicosilada se denomina HbA1.
El conocimiento de los valores de la HbA1 tiene el potencial de ofrecer un
criterio adicional para evaluar el estado metabólico de la glucosa en individuos
normales y diabéticos. En una sola determinación reemplaza varias
determinaciones de glucosa en distintos tiempos.
La velocidad de formación de la HbA1c es directamente proporcional a la
concentración de glucosa en la sangre, por lo que frente a estados de
hiperglicemia la velocidad de formación de HbA1 es mayor. La hemoglobina
glicosilada está constituida por tres fracciones:HbA1a, HbA1b y HbA1c. De estas
tres, la fracción HbA1c es la de mayor concentración y la más estable.
Como los eritrocitos son fácilmente permeables a la glucosa, el nivel de la
HbA1c en una muestra de sangre facilita la historia glucémica de los 120 días
anteriores a la toma de muestra, lo que equivale al tiempo de vida media de estas
células. En particular, la HbA1c refleja de una forma bastante exacta la glucemia en
los 2-3 meses anteriores al análisis, es decir nos permite evaluar en forma
retrospectiva el metabolismo glucídico de una persona.
En la actualidad existen métodos que permiten cuantificar la hemoglobina
glicosilada total (las tres fracciones: HbA1a, HbA1b y HbA1c) y métodos que
cuantifican la fraciión más estables, es decir la HbA1c.
El valor de la HbA1 ha mostrado su utilidad para predecir el riesgo del
desarrollo de muchas de las complicaciones crónicas de la diabetes, lo que le ha
convertido en uno de los exámenes de control a largo plazo del paciente diabético
más usado en los laboratorios clínicos.

 Fundamento de la prueba:

La hemoglobina glicosilada se forma por una reacción no enzimática, que se

denomina glucación, entre la glucosa y el aminoácido N- terminal, valina, de cada
cadena  de hemoglobina A para formar una base de Shiff lábil. A medida que el
eritrocito circula, parte la base de shiff experimenta un reordenamiento de
Amadori lento e irreversible y produce finalmente una cetoamina estable.
La cantidad de proteínas glicosiladas depende fundamentalmente de los
niveles de glucosa sanguínea. Por ello la glicación o glicosilación no
enzimática irreversible es función directa de la intensidad y duración de la
hiperglicemia y sirve así para controlar a largo plazo al paciente diabético.
METODOS PARA LA DETERMINACION DE HEMOGLOBINA GLICOSILADA

 Métodos cromatográficos por resinas de intercambio iónico en columna

(HbA1 total)

Consiste en la utilización de una resina de intercambio iónico para separar la

fracción de hemoglobina glicosilada. Por intercambio catiónico se forman enlaces
débiles entre la resina y la HbA1. Posteriormente a través de una separador de
resina, se separa esta resina del líquido sobrenadante que contiene la
glicohemoglobina para leerlo espectrofotométricamente. El porcentaje de
hemoglobina glicosilada se saca en relación a la cantidad de hemoglobina total.

 Métodos inmunológicos para la determinación de HbA1c

Son mucho más específicos y sensibles que utilizan un anticuerpo específico

contra la secuencia de aminoácidos de la fracción HbA1c.

La determinación de Hemoglobina glicosilada debe ser realizada

rutinariamente en todos los pacientes con diabetes, en primer lugar para
documentar el grado de control glicémico al inicio del tratamiento y luego como
parte del mismo.
Dado que la HbA1 refleja la glicemia media de los últimos tres meses, se deben
hacer determinaciones trimestrales de este parámetro para determinar si el
control metabólico del paciente se encuentra dentro de los límites aceptables. De
esta manera las medidas regulares de HbA1c permiten detectar si hay alguna
desviación en el tiempo.