INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE

BIOTECNOLOGÍA

UNIDAD DE APRENDIZAJE

Laboratorio de Bioconversiones

PRACTICA 2

Determinación de actividad enzimática y efecto de la

concentración de enzima

INTEGRANTES: EQUIPO 4

I. Bermeo Fernández Luis Antonio

II. Campos Sánchez Gerardo
III. Colín Álvarez Bryan Iván
IV. Pérez Escalona Jairo Janai
V. Serrano Olvera Brenda Marie

PROFESORES

Dr. Luis Carlos Fernández Linares

Dra. María del Carmen Oliver S
Dr. Pérez Solís Erick Emmanuel

GRUPO

5BV1

FECHA DE ENTREGA
21 de marzo de 2018
 Índice

1. Introducción …………………………………….. 3

2. Objetivos …………………………………….. 4

3. Metodología ……………………………………… 4

4. Resultados y discusión………………………… 5

5. Conclusiones ……………………………………. 8

6. Referencias ……………………………………… 9

2
 Introducción
Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica cuya función biológica es catalizar
reacciones químicas. La función de un catalizador ya sea de naturaleza orgánica
(Enzimas) o inorgánico es disminuir la energía de activación necesarias para alcanzar
el estado de transición de reactivos a productos; por lo tanto, las enzimas no afectan el
equilibrio termodinámico si no que actúan sobre la velocidad acelerando las
reacciones químicas como se observa en la figura 11,3,4. A su vez, los catalizadores
biológicos resultan ser mucho más potentes que los catalizadores inorgánicos, esto se
debe a que los catalizadores orgánicos presentan mucho más afinidad por el sustrato,
son más estables, son específicos para una reacción, su función catalizadora es de
más de un tipo (por ejemplo, algunas enzimas realizan catálisis por posición e
interacción iónica del centro activo con el sustrato), entre otras2.

Figura 1: Energía potencial vs Grado de avance de reacción a) sin catalizador b) con catalizador (Chang,
2003)

. Las enzimas son de vital importancia para que exista la vida, esto debido que la
célula requiere que las reacciones se realicen a una tasa alta para obtener energía
libre suficiente que le permita realizar sus funciones y además para la síntesis de
biomoléculas que le permitan replicarse2. La forma en que las enzimas actúan sobre
los sustratos ha sido descrita de diferentes formas, por ejemplo, el sistema de llave
cerradura; sin embargo, todos coinciden como se muestra en la figura 2 que el
sustrato se une a la enzima formando el complejo enzima sustrato y posteriormente se
transforma liberándose el producto y la enzima libre.

Figura 2: Proceso de transformación enzimática E=Enzima ES=Complejo enzima sustrato

P=Productos (Referencia, año)

3
Por otro lado, la cinética enzimática estudia la velocidad de la reacción, los factores
que la alteran y el mecanismo de la misma, la actividad de una enzima se evalúa en
función de la velocidad de la reacción; dicha actividad puede ser inhibida por alguna
molécula (incluso el producto de la reacción, por ejemplo) o por factores ambientales.
Los factores fisicoquímicos que modifican la actividad de la enzima son: concentración
del sustrato, concentración de la enzima, pH, temperatura, fuerza iónica, etc.

Para poder estudiar, o emplear una enzima, es necesario conocer su concentración, y

si bien es posible conocer de manera relativamente sencilla la cantidad de proteína en
un sistema, poder determinar cuánto de esas proteínas corresponde a la enzima de
interés, o cuánta de esa enzima se encuentra en forma total o parcialmente funcional
es sumamente complicado y costoso. Por ello, para facilitar el uso de las enzimas, en
lugar de medir directamente la cantidad de enzima en el sistema, se mide la capacidad
catalítica de una preparación enzimática. A la capacidad catalítica de una preparación
de enzimas se le llama Actividad Enzimática, que se puede definir como la
concentración del sustrato transformado por min (g/ L min o moles/L min o mmoles/L
min, o µmoles/L min). Por otro lado, existen otras formas de expresar la actividad de
una enzima, por ejemplo: la comisión de enzimas (EC) de la IUPAQ, define la Unidad
Internacional de Actividad enzimática (UI) como “la cantidad de enzima necesaria para
transformar 1 micromol de sustrato en un minuto” en condiciones definidas de pH y
temperatura. Otra medida importante, es la actividad específica de una preparación,
que es el resultado de dividir las unidades de actividad enzimática del sistema entre la
cantidad de proteína (en mg) en el sistema.

Además de la definición de Unidades Internacionales, existen otras unidades para

ésta, por ejemplo, las del Sistema Internacional de Unidades. El SI emplea como
unidad de actividad enzimática el katal (kat), que se define como la cantidad de
enzima necesaria para transformar un mol de sustrato por segundo. La existencia de
estas unidades se debe a que la velocidad de catálisis de cada enzima puede variar
mucho con respecto a la de otras enzimas, siendo complicado el uso de una misma
unidad para todas las enzimas; por ejemplo, el katal es una unidad demasiado grande
para la actividad enzimática de casi todas las enzimas, siendo más común el uso de
submúltiplos, como el microkatal o nanokatal.

Objetivos
Objetivo General

 Analizar el efecto de la concentración de enzima en la actividad enzimática

Objetivos Específicos

 Determinar la actividad enzimática de la invertasa.

 Calcular las unidades de actividad enzimática.
 Determinar el efecto de la concentración

Metodología
1. Se preparó un baño maría en ebullición y un baño en hielo

4
 2. Se prepararon 36 microtubos de 1.5 ml con 0.1 ml de reactivo DNS, protegiéndolos de la
luz
3. Se preparó un microtubo de 1.5 ml con 0.1 ml de reactivo DNS y 0.1 ml del regulador de
fosfatos en que se preparó la enzima, se utilizó el tubo como blanco del ensayo. Después
se preparó otro microtubo de 1.5 ml con 0.1 ml de reactivo de DNS y 0.1 ml de la solución
de sacarosa, siendo el tubo testigo de ensayo enzimático.
4. En 9 tubos Eppendorf se agregaron 0.95 ml de la solución de sacarosa al 3%, 3 tubos para
cada concentración de enzima.
5. A 3 tubos se le añadió por intervalos de 30 segundos 0.05 ml de solución de invertasa
6. Al pasar 1 y 3 minutos se agregó 0.1 ml de la solución de reacción y se transfirió a otro
tubo con 0.1 ml de DNS por duplicado
7. Se hicieron los puntos 5 y 6 con las demás concentraciones de enzima.
8. Al terminar la cinética enzimática se trataron los microtubos junto con el blanco y el
testigo con la técnica de determinación de azucares reductores.
9. En cada una de las solcuiones enzimáticas proporcionadas por el profesor se determinó la
concentración de proteína por metodo Bardford y UV
10. Utilizando la ecuación de la curva patrón de glucosa se interpolo las absorbancias para
calcular las concentraciones de azucares reductores y las actividades enzimáticas Commented [P1]: Esta no es la forma correcta de redactar una
metodología en un trabajo, busca la practica 1 y checa como
RESULTADOS redacte la metodología y cambiala en ese forma

Primero se determinó la concentración real de la enzima ocupada en cada

experimento, esto se hizo como indica la metodología mediante la técnica de Bradford
y UV, usando las curvas tipo obtenidas en la capacitación 5, cuyas ecuaciones son
para la técnica de Bradford y UV las presentadas en las ecuaciones 1 y 2,
respectivamente.

𝐴𝑏𝑠 = 0.0064C + 0.19 … … … . [1]

𝐴𝑏𝑠 = 0.0007C − 0.05 … … … . [2]

Donde C es la concentración de enzima en (inserte unidades). A partir de las

absorbancias presentadas en la tabla 1 y las ecuaciones 1 y 2 se calculó la
concentración real de la enzima por cada técnica, el criterio para seleccionar la
concentración fue usar el valor más alto obtenido, por consiguiente, los resultados
seleccionados son los marcados en rojo en la tabla 1.

Tabla 1: Determinación de la concentración real de enzima

Absorbancia Concentración
Concentración Absobancia a 590 nm Concentración
a 280 nm real Bradford
Aparente real UV (mg/mL)
1 1 2 3 (mg/mL)
0.1 0.038 0.183 0.181 0.176 0.126 error

5
 0.3 0.115 0.549 0.542 0.528 0.236 0.054
0.5 0.192 0.915 0.903 0.880 0.345 0.110

Para calcular las diferentes unidades para medir la actividad de la enzima se

determinó primero la cantidad de producto formado a un tiempo (1 y 3 minutos), dado
que el producto de la invertasa son glucosa y fructosa (ambos azúcares reductores) se
determinó su concentración mediante la técnica de DNS para azúcares reductores, al
realizar la técnica se obtuvieron las absorbancias presentadas en tabla 2, en esta tabla
se observan los resultados para cada concentración de enzima proporcionada, así
como su concentración real determinada por la técnica de Bradford.

Tabla 2: Absorbancias a 540 nm para la determinación de azúcares reductores

Absorbancia a 540 nm
Concentración tiempo de
Desviación
real de la enzima reacción 1 2 3 4 5 6 Promedio
estándar
(mg/mL) (min)

1 1.197 1.123 1.028 0.961 0.889 1.09 1.048 0.11

0.345
3 1.046 1.231 1.261 1.13 1.044 1.476 1.198 0.16
1 0.21 0.678 0.65 0.721 0.633 0.645 0.5895 0.19
0.236
3 1.009 0.716 0.813 0.748 0.846 0.872 0.834 0.10
1 0.167 0.184 0.134 0.267 0.147 0.154 0.1755 0.05
0.126
3 0.669 0.669 0.588 0.731 0.731 0.553 0.657 0.07

A partir del promedio de las absorbancias se determinó la concentración de azucares

reductores utilizando la curva tipo de la capacitación 4, cuya ecuación es:

𝐴𝑏𝑠 = 0.1824 𝐶 − 0.053 … … … . [3]

Donde C es la concentración de azúcares reductores en g/L.

Usando la ecuación 3 se determinó la concentración de producto a cada tiempo (1 y 3

minutos), posteriormente con la relación estequiometria que 342 g de sacarosa forman
360 g de azucares reductores se determinó la cantidad de sacarosa consumida a cada
instante de tiempo como se muestra en la tabla 4, finalmente se determinó la actividad
enzimática en 2 intervalos de 0 a 1 minuto y de 1 a 3 minutos mediante la ecuación 3
tomando en cuenta que en el tiempo de 0 minutos la cantidad de sacarosa consumida
era 0.

𝐶𝑓 − 𝐶𝑖
𝐴𝐸 = … … … … … … . [3]
𝑡𝑓 − 𝑡𝑖

Donde Cf es concentración al tiempo final tf y Ci es la concentración al tiempo inicial ti

del intervalo tomado.

Por último dado que se conocida la cantidad de enzima que se adicionó se determinó
la actividad enzimática específica a partir de la cantidad de enzima real calculada
mediante la ecuación 4.

6
 𝐴𝐸
𝐴𝐸𝐸𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 = … … … … . [4]
[𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎]

Donde la concentración de enzima se debe expresar en unidades de mg/L y se refiere

a los miligramos de enzimas adicionados a un litro de mezcla de reacción.

Sustituyendo los valores en las ecuaciones 3 y 4 para cada concentración de enzima e

intervalo de tiempo se obtienen los resultados presentados en la tabla 4.

Tabla 4: AE Y AE específica

Actividad
Concentración Sacarosa Actividad
Intervalo de Promedio de las Concentración enzimática
real de la enzima Dilución consumida enzimática
reacción (min) absorbancias de AR (g/L) especifica
(mg/mL) (g/L) (g/L min)
(g/L min mg)
0-1 1.048 1 8.575 8.146 8.146 0.472
0.345
1-3 1.198 0.5 19.486 18.512 5.183 0.300
0-1 0.5895 1 5.004 4.754 4.754 0.699
0.136
1-3 0.834 0.5 13.816 13.125 4.186 0.616
0-1 0.1755 1 1.780 1.691 1.691 0.268
0.126
1-3 0.657 1 5.528 5.252 1.781 0.283
AR= Azúcares reductores

Para el cálculo de UI, Katal y Kcat se ocuparon las ecuaciones 5,6 y 7,

respectivamente. Los resultados se muestran en la tabla 5.

𝐴𝐸𝐸𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 106 𝜇𝑚𝑜𝑙

𝑈𝐼 = ∗ … … … . . [5]
𝑃𝑀𝑆𝑈𝑆𝑇𝑅𝐴𝑇𝑂 1𝑚𝑜𝑙

𝐴𝐸𝐸𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 1 𝑚𝑖𝑛
𝐾𝑎𝑡𝑎𝑙 = ∗ … … … . . [6]
𝑃𝑀𝑆𝑈𝑆𝑇𝑅𝐴𝑇𝑂 60 𝑠

𝐴𝐸𝐸𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 1 𝑚𝑖𝑛 1000 𝑚𝑔 𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎

𝐾𝑐𝑎𝑡 = ∗ ∗ ∗ 𝑃𝑀𝐸𝑁𝑍𝐼𝑀𝐴 … … … . [7]
𝑃𝑀𝑆𝑈𝑆𝑇𝑅𝐴𝑇𝑂 60 𝑠 1 𝑔 𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎

Donde PM es el peso molecular.

Tabla 5: Resultados de la actividad de la enzima

Concentración
Intervalo de UI Katal x105
real de la Kcat (1/s)
reacción (min) (μmol/L min mg) (mol/ L s mg)
enzima
0-1 1380.800 2.3 6213.60
0.345
1-3 878.520 1.5 3953.34
0-1 2044.074 3.4 9198.33
0.136
1-3 1799.899 3.0 8099.55
0-1 784.654 1.3 3530.94
0.126
1-3 826.433 1.4 3718.95

DISCUSIÓN DE RESULTADOS
7
Como se puede observar en la tabla 4 la actividad enzimática depende tanto del
intervalo donde se mida como de la concentración de enzima, la primera es debido a
que como se consume el sustrato, la concentración disminuye hasta llegar al punto
que existan enzimas que no se anclen al sustrato, es decir, se agote el estado de
saturación del sustrato como se muestra en la figura 3, disminuyendo la actividad
enzimática con respecto al tiempo. El segundo, es debido a que cuando existe mayor
cantidad de enzima para la misma concentración de sustrato se transforman un mayor
número de moléculas en un intervalo de tiempo, esto es fácil ver como ayuda del Kcat,
por cada enzima se transforman en promedio 5,700 moléculas de sustrato por
segundo, por consiguiente, al existir un mayor número de enzimas se transformará
una mayor cantidad de sustrato por segundo. Un resultado bastante interesante
también se observa en la tabla 4, con la actividad enzimática en la concentración más
baja en los dos intervalos, como se observa aquí la actividad enzimática parece no
variar mucho, esto se debe a que al existir una cantidad relativamente pequeña de
enzima el estado de saturación se mantiene por mayor tiempo y el consumo del
sustrato con respecto al tiempo varia de forma lineal, este resultado es de suma
importancia ya que si estamos seguros que ocurre esto en un intervalo de tiempo
podemos estimar AE como la pendiente de la recta.

AE

Figura 3: AE en relación al sustrato

Por otro lado, siguiendo el análisis anterior AE puede estimarse para cada punto como
la pendiente de la recta tangente a la curva del consumo de sustrato con respecto al
tiempo. A su vez, para evitar la dependencia de la concentración de la enzima es
bastante útil convertir la AE a una propiedad intensiva dividiéndola por la cantidad de
enzima usada. Sin embargo, esto no quita la dependencia de la actividad en relación
al agotamiento del sustrato en el tiempo y el perfil de la figura 3 se sigue manteniendo
como se puede comprobar en la tabla 5.

Conclusiones
 La cinética enzimática nos ayuda a entender el comportamiento de las
transformaciones biológicas.
 La concentración de sustrato en el tiempo influye en la actividad de la enzima

8
  La concentración de la enzima influye en el valor de la actividad enzimática
pero no de las otras formas de medición al tratarse de propiedades extensivas
 La mayor actividad enzimática se observó con la concentración más alta de
enzima en el intervalo de 0 a 1 minuto, su valor fue de 8.14 g sacarosa/L*min
 La actividad enzimática promedio fue de 0.44 g sacarosa/ L min mg enzima
 La UI se encuentra en promedio de 1285 μmol/L min mg
 El katal es aproximado de 2x10-5 mol/ L s mg
 El kcat promedio es de 5,700 s-1.

Referencias
1. Chang (2003), Fisicoquímica para sistemas biológicos, Editorial Mc Graw Hill.
México DF, pp 14-21
2. García González (1998) Bioquímica para ciencias de la salud, Editorial continental,
México DF, pp 254-272.
3. Lehninger. Principios de bioquímica (2006) David L. Nelson; Michael M. Cox. 4ª
Edición. Ediciones Omega.
4. Principios de Bioquímica (2001) Albert L. Lehninger, David L. Nelson; Michael M.
Cox. (2ª y 3ª edición). Ediciones Omega.

Bárzana, E. y A. López-Munguía. 1995. La tecnología enzimática. En Biotecnología

Alimentaria, pp. 103-123. Limusa, México D.F.

Christensen, H.N. y Palmer, G.A. (1980) Cinética enzimática. Ed. Reverté. Barcelona.