Regenerarea, micropropagarea, culturile de calus și embriogeneza somatică (Salvia

officinalis L.)

INTRODUCERE

Salvia, cu aproximativ 700 de specii, este unul dintre cei mai răspândiți membri ai
familiei Lamiaceae. Salvia officinalis L., mozaicul comun este cea mai reprezentativă
specie din genul Labiatae. Planta este cea mai difuză în bazinul mediteranean, în Africa
de Sud-Est și în America Centrală și de Sud, unde este cultivată în mare măsură pentru
scopuri culinare și medicinale.
Un număr neobișnuit de mare de metaboliți secundari utili, aparținând diferitelor grupuri
chimice, cum ar fi uleiurile esențiale, compușii terpenoizi și derivații fenolici, au fost
izolați din genul, care apar în mod special în farmaciile din multe țări din întreaga lume
(Kintzios și colab. , 1999). .

Salvia officinalis este considerată a avea cea mai mare cantitate de ulei esențial
comparativ cu celelalte specii și sa demonstrat că secreția uleiului este asociată cu
prezența a patru tipuri diferite de trichomi glandulari specializați pe frunzele plantei,
studii morfologice (Bolta et al., 2000).

Multe specii de plante din genul Salvia sunt recunoscute de mult ca plante medicinale în
arta tradițională de vindecare, iar derivatele lor continuă să fie componente importante
ale produselor fitofarmaceutice contemporane (Gostin, 2008).

Există avantaje cunoscute pe care tehnicile de cultivare a celulelor și țesuturilor

vegetale le au asupra procesării întregii plante (Grzegorczyk et al., 2007), cele dintâi
fiind adoptate cu succes în producția de substanțe chimice de mare valoare, în special
atunci când manipularea materialului vegetal sursă vizează obținerea unei rate de
creștere și a ratei de acumulare a metabolitului (Bolta et al., 2000). Au fost raportate
tehnici biotehnologice care facilitează în mod semnificativ propagarea plantelor și
producerea unor compuși bioactivi importanți din genul Salvia. Cultura țesuturilor este
acum utilizată în mod obișnuit pentru propagarea lui Salvia miltiorrhiza. Au fost stabilite
calus, suspensie celulară, celule imobilizate și rădăcini păroase din S. officinalis (Falk et
al., 2007; Bolta și colab., 2000; Tawfic și colab., 1992), S. miltiorrhiza, S. canariensis și
S. sclarea și utilizată pentru producerea de metaboliți secundari, cum ar fi acid
rosmarinic, criptotansinonă, camfor, ferruginol și sclareol (Naser et al., 2004).
Salvia officinalis este considerată a avea cea mai mare cantitate de ulei esențial comparativ cu
cealaltă specie și sa demonstrat că secreția uleiului este asociată cu prezența a patru tipuri
diferite de trichomi glandulari specializați pe frunzele plantei, studii morfologice (Kintzios și
colab., 1999).

MATERIALE SI METODE

Materialul vegetal Un genotip Salvia officinalis L. dintr-o sursă comercială a fost utilizat pentru
stabilirea propagării. Semințele din același genotip au fost utilizate pentru obținerea de plantule
sterile in vitro. Caracteristicile productive și morfologice ale genotipului S. officinalis folosite în
această lucrare au fost: obiceiul de creștere a arborilor, tulpini viguroase și în poziție verticală,
frunze mari, groase și puternic parfumate, flori bilabiate aranjate în vârfuri lungi cu caliciu în
formă de clopot și corolă albastru-violet. Grădina in vivo a semințelor Semințele au fost preseau
apă distilată și inoculate în vase Petri conținând hârtie de filtrare umedă. După germinație
plantele au fost mutate în sol conținând ghivece și cultivate în sera. Grădina in vitro a semințelor
Semințele au fost presterilizate prin spălare cu soluție de hipoclorit și clătite de mai multe ori sub
jet de apă, apoi clătite o dată în apă distilată. După tratare, semințele au fost sterilizate la
suprafață timp de 30 de secunde în 70% etanol și timp de 5 minute în soluție de clorură de
mercur 0,1% (greutate / volum), apoi clătite de cinci ori în apă distilată sterilizată. După
sterilizare, semințele au fost inoculate în plăci Petri conținând medii MS0 și MS + GA3

Stabilirea culturilor de calus. Explanturile de frunze au fost prelevate din plantele tinere cultivate
in vitro și in situ (având șase până la opt frunze). Frunzele de la plantele in situ au fost sterilizate
la suprafață timp de 12 minute în soluție de clorură de mercur 0,1% (greutate / volum),
conținând 1-2% Tween-80, apoi clătite de trei ori în apă distilată sterilizată. Piesele de frunze,
de 1-2 cm lungime, au fost excizate și inoculate pe diferite medii de cultură. Toate tipurile de
medii de cultură au constat din mediu bazal Murashige și Skoog (MS) (Murashige și Skoog,
1962) solidificat cu agar de 0,7% și suplimentat cu zaharoză 3%, acid ascorbic 10 mg / l și fie
acidul 2,4-diclorfenoxiacetic , 4-D) și kinetină (Kin), acidul naftalenacetic (NAA) și 6-
benziladinina (BA) sau tidiazuronul (TDZ) ca regulatori de creștere a plantelor (PGRs) la diferite
concentrații (1,8-21 mM). Mediile au fost ajustate la pH 5,8 utilizând NaOH 1N sau HCI 1 N,
autoclavate la 121 ° C timp de 20 de minute și turnate în vase Petri din sticlă

Melele inoculate au fost sigilate cu peliculă și incubate sub o densitate a fluxului de fotoni
fotosintetic (PPFD) fie de 250 mmol m-2 s-1 (16 h / 8 h, din lămpi fluorescente albe rece) sau
50 mmol m-2 s-1 la 24 ° C. Explanturile au fost cultivate pe fiecare combinație de intensitate a
luminii. Stabilirea culturilor de celule lichide. Pentru prepararea culturilor de suspensie, baloane
Erlenmayer de 300 ml conținând 50 ml mediu lichid MS fără agar s-au inoculat fiecare cu 1,5 g
de țesut de calus și s-au incubat în intensitate scăzută a luminii la 28 ° C pe un agitator orbital
(100 rpm). Pentru studiile de timp, culturile au fost inițiate cu o alicotă de 10 ml (aproximativ 1 g)
de celule de suspensie de prim pasaj recoltate la 7 până la 10 zile (fază logaritmică precoce) și
adăugate la mediu proaspăt. Maturarea embrionului După 5 săptămâni în cultură, țesutul de
calus cu embrioni somatici în diverse stadii de dezvoltare a fost transferat în mediul de cultură
fără regulatori de creștere pentru maturizarea embrionilor.
Semințe de germinare

Pentru stabilirea capacității de germinare, semințele de la același genotip au fost germinate în

trei moduri diferite. 50 de semințe au fost spălate sub jet de apă și plantate în sol de umiditate
sterilizată, zece semințe pe fiecare vas. Alte 50 de semințe au fost sterilizate și inoculate pe
hârtie de filtru umed pe plăci Petri, după inoculare semințele au fost acoperite cu hârtie de filtru.
Vasele au fost închise și sigilate cu parafilm și plasate la germinator întunecat la 24 ° C. Pentru
stabilirea capacității de germinare in vitro, 50 de semințe sterilizate au fost inoculate pe medii de
cultură MS0 conținând feluri de mâncare Petri. Zece semințe au fost inoculate pe fiecare placă
și plasate în camera de creștere, la 24 ° C și lumină scăzută. Rezultatele privind capacitatea de
germinare a semințelor sunt prezentate în tabelul 1.

Perioada de germinare a fost considerată finalizată după un total de 20 de zile. Așa cum se
poate observa din Tabelul 1, cea mai bună capacitate de germinare a fost obținută atunci când
semințele au fost germinate. În ceea ce privește celelalte protocoale de germinare, se pare că
procesul de sterilizare a influențat cumva viabilitatea și, de asemenea, procentul de germinare a
semințelor pe mediile de cultură este mai mic. Cauza principală a fost considerată a fi lipsa unei
umidități adecvate deoarece semințele sunt acoperite cu un endosperm puternic (Fig.1).

Plantele care au devenit din semințe germinative ale solului au fost cultivate în continuare pe
soluri care conțin vase în condițiile cu efect de seră. Plantele care au devenit din semințele
sterilizate au fost transferate pe medii de cultură MS0 pentru a facilita dezvoltarea plantelor.
Calusul a fost indus din plantele care au fost cultivate in vitro și în sol conținând vase, folosind
combinația PGR descrisă în literatură ca fiind optimă pentru obținerea calusului generat de
țesutul de salvie obișnuit (Tawfik și Mohamed, 2007). Un calus verde, friabil, embriogen a fost
indus pe explante de S. officinalis (din plante tinere) la 2 săptămâni după inițierea culturii (figura
2).

Multe explante au dezvoltat zone necrotice maronii, care, în unele cazuri, au condus la declinul
și moartea explantelor. Cu toate acestea, în cazul în care rumenirea explantei nu se extindea pe
întregul țesut, se pare că nu inhiba inducerea de calus și formarea embrionului somatos. În
experimentele preliminare, practic fiecare explant cultivat pe un mediu fără acid ascorbic a
devenit maro și a murit. Adăugarea acidului ascorbic (la o concentrație optimă de 10 mg / l) la
mediul de cultură a redus foarte mult frecvența simptomelor necrotice. Efectul condițiilor de
cultură ale plantelor asupra declinului explantului, a tratamentului de reglare a creșterii, a
genotipului și a intensității luminii și a timpului de inducție a calusului este rezumat in tabelul 2

Amestecarea PGR a fost cel mai semnificativ factor care influențează dediferențiarea explantei
în cultură. Plantele cultivate in vitro au răspuns culturii mult mai bine decât plantele in situ.
Țesutul de țesut a fost format pe explante de această specie la o rată de 80-100% sub ambele
intensități luminoase scăzute și înalte (Tabelul 1). Ratele de inducție a calusului au fost obținute
pentru S. officinalis atunci când au fost utilizate concentrații auxin și citokine echimolar. Acesta
a fost cazul pentru 2,4-D și Kin și atunci când au fost utilizate NNA și BA. În contrast, atunci
când a fost utilizat TDZ, rata de inducție a calusului a fost mai mică, asociată în principal cu
pețiolul frunzelor. De asemenea, multe dintre explantele cultivate pe medii conținând TDZ au
dezvoltat rădăcini. Interacțiunile dintre compoziția medie, genotipul și intensitatea luminii au avut
un efect semnificativ asupra inducerii calusului și, de asemenea, asupra declinului explant
(tabelul 2). Aplicarea NAA și BA a generat, în general, formarea de calus, dar a favorizat și
necroza explantă. Dezvoltarea simptomelor necrotice la explante a fost corelată negativ cu
inducerea calusului(tab 2)

Suspensiile celulare au fost create pentru a testa capacitatea de producție a unei cantități mari
de metaboliți utili. Două combinații PGR au fost utilizate pentru obținerea de suspensii celulare:
medii lichide MS suplimentate cu 2,4 D și Kin în concentrații echimolare (1,8 mM) și a doua
variantă MS suplimentată cu TDZ (4,5 pM). După două săptămâni de cultură a fost obținută o
suspensie celulară foarte prolifică în primul caz. În cel de-al doilea caz, calusul înmulțit, dar
rămas compact, a dezvoltat un număr mare de rădăcini păroase care au fost în continuă
creștere după subcultură (fig.3).

Formarea și maturarea embrionilor somatici

Numeroși embrioni somatici globulari s-au format ușor pe țesutul de calus al ambelor specii
după 3 săptămâni în cultură, în cazul în care s-au utilizat concentrații de auxină și citokine.
Acestea aveau un diametru de aproximativ 6 mm, dar au devenit progresiv mai mari (> 50 mm).
După 50 de zile în cultură, jumătate din calle cu embrioni somatici globule au fost lăsați să
continue să crească pe mediul de inducție, în timp ce cealaltă jumătate au fost subcultivate pe
mediu MS fără regulatori de creștere pentru maturare. Deși inducerea embriogenezei somatice
de la explantele noastre a fost întotdeauna concomitentă cu formarea de calus, dezvoltarea
ulterioară a embrionilor proembrioși și a globulelor a avut loc numai pe anumite combinații PGR.
După o perioadă de cultură totală de 75 de zile, numai embrionii S. officinalis indus pe 10,5 mM
NAA + 10,5 mM BA au fost capabili să se dezvolte în continuare pe același mediu până când au
apărut forme de formă torpilă (cu lungimea de 1-2 mm). Spre deosebire de aceasta, embrionii
globule din ambele specii induse pe 1,8 mM 2,4-D și 1,8 mM Kin s-au dezvoltat mai departe
numai după ce au fost transferate într-un mediu fără regulatori de creștere. În fiecare caz, unu
sau doi embrioni maturi au fost numărați pe țesut de callus.

Plantele noi dezvoltate au fost transferate pentru înrădăcinare pe MS0 sau SM suplimentat cu
IBA 4,92 μM, așa cum a fost recomandat anterior de Gostin (2008). În acest experiment, cea
mai bună rată de înrădăcinare de 97% în două săptămâni a fost obținută în primul caz. În cea
de-a doua variantă, procentul de înrădăcinare este mai mic: nu are rădăcini după două
săptămâni și 48% după o lună. De asemenea, cea mai bună rată de creștere a plantelor salvie
a fost obținută atunci când plantele au fost cultivate pe medii MS0.