Sunteți pe pagina 1din 10

1. Biotehnologiile: Istoric.Procese si produse biotehnologice.

Definiţ ia biotehnologiei; evoluţ ia


î n timp a biotehnologiei ca ştiinţ ă tehnică

Descoperirile spectaculoase din domeniile biologiei, biochimiei, microbiologiei, geneticii,


enzimologiei, precum ş i necesitatea aplicării acestor cunoş tinţ e î n practică au condus la apariţ ia unei
noi ş tiinţ e denumită generic “biotehnologie”. Caracterul interdisciplinar al biotehnologiei a creat î ncă
de la î nceput probleme privind definirea ş i localizarea ei ca ş tiinţ ă de sine stătătoare.

Orice manipulare a viului î n folosul societăţ ii, î nseamnă biotehnologie. Indiferent dacă aceasta se
realizează la nivel laborator avănd un caracter de cercetare fundamentală sau se realizează la nivel
industrial având un caracter aplicativ, scopul final ş i î n general tehnicile sunt asemănătoare ş i incluse
î n aceeaş i sferă largă a biotehnologiei.

Dintre toate definiţ iile aceea dată biotehnologiei de către Federaţ ia Europeană de Biologie (1978),
pare a fi satisfăcătoare: "Utilizarea integrată a biochimiei, microbiologiei ş i ingineriei î n scopul
obţ inerii unei aplicaţ ii tehnologice (industriale), cu ajutorul microorganismelor, culturilor de
celule ş i a părţ ilor componente a acestora". Simplificând, se poate spune că biotehnologia
presupune "utilizarea organismelor sau a produselor derivate de la acestea î n scopuri
comerciale."

In esenţ ă, principalul scop al biotehnologiei este obţ inerea de produse sau servicii utile activităţ ii
umane, cu ajutorul organismelor vii. Procesul de bază î n biotehnologie este “proces biologic”, după
cum procesul de bază î n tehnologia chimică este “procesul chimic”.

2. Dezvoltarea industriei biotehnologice; rolul cercetării fundamentale î n biotehnologie

Ingineria genetică este considerată a fi tehnica ideală capabilă să amelioreze cantitativ ş i calitativ
capacitatea de biosinteză a celulelor de microorganisme, animale sau vegetale, î n scopul obţ inerii
unor produse utile. Natura interdisciplinară a biotehnologiei este evidentă dacă se ţ ine seama de
etapele unui proces biotehnologic complet. Dacă se ia ca exemplu obţ inerea unui produs nou prin
tehnologia ADN-recombinant, cum ar fi insulina, hormonul de creş tere sau interferonul se parcurg o
serie î ntreagă de faze care implică cunoş tinţ e aparţ inând unor domenii ş tiinţ ifice foarte diferite.

Prima treaptă de dezvoltare a bioprocesului se referă la manipularea genetică a organismului gazdă;


î n acest caz, gena de interes este clonată î ntr-o gazdă specifică (de ex. Escherichia coli) ș i se
stabiliesc o serie de parametrii, cum ar fi stabilitatea tulpinii recombinate ş i nivelul de expresie al
produsului dorit. După clonare, caracteristicile de creş tere ş i producţ ie a celulelor trebuie măsurate î n
funcţ ie de condiţ iile de cultivare, ceea ce necesită aplicarea tehnicilor de cultivare obiş nuite î n
microbiologie î n vederea stabilirii parametrilor optimi: compoziţ ia mediului, pH, temperatură,
concentraţ ie de oxigen dizolvat astfel î ncî t productivitatea î n produsul urmărit să fie maximă. Se
porneş te prin cultivarea microorganismului la scara mică, î n flacoane agitate de 250 ml până la un
litru capacitate. Performanţ ele organismului sunt descrise prin calcularea ratei de creş tere,
productivitatea specifică, randamentul î n produs finit.
După cunoaş terea condiţ iilor de cultivare î n laborator se porneş te procesul de ridicare la scară pilot ş i
industrial.

1. Prima treaptă poate fi un bioreactor de 1, 2 sau 5 l echipat cu instrumente de măsură ş i


control al temperaturii, pH, concentraţ ie oxigen dizolvat, viteză de agitare. Culturile pot fi
monitorizate mai bine î n bioreactor decât î n flacoane agitate. Se pot culege mult mai multe
informaţ ii referitoare la necesarul de oxigen al microorganismului sau la caracteristicile de
spumare ale mediului sau alţ i parametrii. De asemenea pot fi identificate limitările impuse de
tipul bioreactorului.De exemplu, dacă acesta nu poate asigura necesarul de oxigen, celulele sunt
î nfometate. În mod similar, dacă agitarea mediului de cultură nu este adecvată, aceasta poate
conduce la spargerea celulelor ş i devierea procesului de cultivare.
2. Următoarea treaptă de ridicare la scară este aceea de bioreactor pilot. În această fază se
implică specialistii instruiţ i î n ingineria bioproceselor ş i î n ridicarea la scară industrială a
acestora. In prezent se construiesc vase de 100-1000 l după specificaţ iile prototipului de
laborator. Scopul fazei pilot este acela de a examina raspunsul celulelor cultivate la o scară mai
mare. În această treaptă de operare, rezultatele pot fi mai bune sau mai scăzute faţ ă de cele
obţ inute î n bioreactorul laborator. În funcţ ie de aceste rezultate se hotărăş te dacă se trece la
producţ ia industrială sau nu.
3. O parte importantă a unui proces biotehnologic o constituie faza de recuperare a produsului
din mediul de producţ ie ş i anume izolarea si purificarea acestuia pâna la produsul finit. Această
fază este adesea foarte dificilă pentru produsele rezultate prin tehnologia ADN recombinant,
astfel î ncât costurile reprezintă 80-90% din costul total al bioprocesului. Procedeul aplicat
pentru izolare ş i purificare depinde de natura produsului ş i cuprinde metode fizice, chimice,
biologice. Procedeele elaborate includ: filtrări ,centrifugări pentru separarea celulelor de lichid,
metode mecanice de distrugere a membranei celulare, dacă produsul este intracelular, extracţ ii
cu solventi, metode cromatografice, separări prin membrane, cristalizări ş i uscări.Toate aceste
procedee sunt testate mai î ntâi la scara mică ş i apoi la scară pilot ş i industrial.

Dupa ce produsul a fost purificat până la standardele cerute de normele internaţ ionale, acesta poate fi
ambalat ş i vândut. In cazul produselor farmaceutice noi este necesară ş i testarea eficacităţ ii acestora,
mai î ntâi pe animale ş i apoi pe oameni. Pentru produsele uz alimentar sunt cerute alte teste specifice.

Pentru toate produsele obţ inute pe cale biotehnologică se cer avize oficiale conforme cu standardele
existente pentru fiecare tip de produs.

3. Aplicaţ ii ale biotehnologiei î n medicină, agricultură, industria alimentară, industria


farmaceutică

Principalele direcţ ii de dezvoltare a biotehnologiilor moderne sunt determinate î n primul rând de


descoperirile recente din domeniul biologiei moleculare dar ş i de cerinţ ele societăţ ii faţ ă de anumite
aspecte cu care se confruntă î n prezent: criza energetică, epuizarea rezervelor de hrană de pe planetă,
probleme ecologice şi de bioremediere.

1. În funcţ ie de tipul de celule cu care se lucrează, deosebim biotehnologii : microbiene, vegetale ş i
animale.

2. În funcţ ie de domeniul î n care î ş i găsesc aplicaţ ii produsele obţ inute pe cale biotehnologică
deosebim:
 Biotehnologii industriale (farmaceutice, alimentare ş i biotehnologii de depoluare).
 Biotehnologii agricole (biotehnologii vegetale ş i biotehnologii î n zootehnie);
 Biotehnologii medical-veterinare

1.Biomedicină şi farmacologie - se obţin vaccinuri pentru unele maladii virale (hepatita A şi B,
herpes, poliomielită), a interferonului, a hormonilor de creştere umană, a enzimelor, a unor proteine
specifice, a unor noi tipuri de antibiotice, de vitamine şi unele medicamente.
Se prevăd următoarele direcţii de cercetare ştiinţifică:
 Clarificarea funcţiilor şi mecanismelor de acţiune a regulatorilor imunologici;
 Investigaţii cu peptide neuroactive, trombolitice şi fibrinolitice;
 Clarificarea mecanismelor imunităţii;
 Înţelegerea fiziologiei şi aspectelor genetice ale cancerului.

2.Agricultură şi industria alimentară - se urmăreşte obţinerea unor hibrizi şi soiuri mai productive
şi mai rezistente la boli. Se urmăreşte de asemenea procesul biologic de fixare a azotului din atmosferă
şi procedee de manipulare genetică cum este transferul embrionar şi tehnica ADN-recombinant pentru
obţinerea unor rase de animale şi de păsări. Se urmăreşte de asemenea producţia de enzime, de AA,
antioxidanţi, obţinerea de noi pesticide, de medicamente de uz veterinar, de obţinerea unor compuşi
aromatici, precum şi de agenţi de diagnostic.

3.Producţia de energie - Se urmăreşte producţia biocombustibililor gazoşi, lichizi, a biocarburanţilor


din fitomasă, precum şi posibilitatea fabricării hidrogenului pe cale biologică sau creşterea capacităţii
de extracţie a zăcămintelor de petrol prin metode biotehnologice.

4.Producţia de materii prime - se preconizează utilizarea biomasei reziduale, conversia biomasei


reziduale în materii prime ce pot fi utilizate în continuare în industria chimică. În acelaşi timp se va
urmări producţia de proteine, lipide şi zaharide, de acizi organici, AA, glicerol, precum şi
transformarea şi obţinerea gazului metan din deşeuri vegetale, dejecţii animale şi din apele menajere
orăşeneşti şi industriale.

5.Extracţia materiilor prime minerale şi protecţia mediului înconjurător - În acest scop se vor
folosi tehnologiile microbiologice de extracţie a unor metale şi metaloizi din minereuri sărace, precum
şi descompunerea biologică şi combaterea unor poluanţi ai mediului înconjurător.

4. Etapele unui process biotehnologic. Faza de laborator

Elaborarea ş i industrializarea unei tehnologii de biosinteză presupune parcurgerea mai multor faze ce
pornesc de la cercetările la nivel de laborator, urmate apoi de cele de la nivelul pilotului ș i, î n final,
la nivel industrial. Aceste cercetări permit transpunerea procedeului de biosinteză de la o fază la alta,
cu optimizarea factorilor implicaț i î n derularea fiecărei faze î n parte.

Cercetările de obţ inere a unui produs prin biosinteză î ncep cu lucrări de laborator care constau î n:
izolarea ș i selecț ia oragismelor de interes; î ntreț ierea tulpinilor cu proprietăț ile dorite; realizarea
culturilor inocul.

Izolarea şi selecţ ia unui mare număr de microorganisme ca producători ai compusului ce urmează a
fi biosintetizat. Tehnicile utilizate î n acest scop sunt specifice pentru fiecare microorganism, cele mai
multe referindu-se la tehnica diluţ iilor ş i tehnica granulelor de sol.

Microorganismele sunt preluate din diferite habitate cultivate pe medii solide sau lichide, astfel î ncât
să fie posibilă punerea î n evidenţ ă a unor caracteristici fiziologice. În prima etapă se urmăreş te
realizarea unei culturi pure prin tehnici microbiologice specifice (epuizarea ansei, diluţ ii succesive),
după care se stabileş te o metodă de triere (screening) adecvată scopului urmărit.

Microorganismele sunt cultivate pe plăci Petri, pe medii solidificate cu agar- agar. In cazul î n care se
urmăreș te selectarea unor microorganisme producătoare a unui anumit tip de enzimă se realizează
teste de identificare care pot fi calitative sau cantitative. După dezvoltarea coloniilor izolate,
enzimele difuzează î n gelul de agar-agar. Produsele respective sunt prelucrate î n scopul dozării
cantitative prin metode spectrofotometrice, fluorescenţ ă, titrimetrice, polarimetrice. În urma acestor
teste se reţ in numai câteva tulpini care au dat cele mai bune rezultate î n ceea ce priveş te biosinteza
enzimei.

Întreţ inerea tulpinilor producătoare. După faza de izolare ş i selecţ ie, tulpinile producătoare se
supun unor teste de caracterizare după criterii morfologice, biochimice, fiziologice, imunologice sau
toxicologice; Tulpina astfel caracterizată se î nregistrează î ntr-o colecţ ie de microorganisme, î n
vederea protejării sale ș i a utilizării ulterioare.

Tinând cont că scopul este de a obț ine un anumit produs la nivel industrial este necesar ca nivelul
biosintezei să fie ridicat; de aceea se optimizează parametrii de biosinteză sau tulpina microbiană de
interes este supusă unor teste de ameliorare prin metode clasice sau moleculare

Conservarea microorganismelor de interes, atât tulpinile parentale, cât ş i tulpinile modificate genetic
se face prin metode speciale, aș a cum sunt liofilizarea ş i conservarea î n azot lichid. Tulpinile din
colecţ ie utilizate î n lucrările de biosinteză curente se păstrează sub forma de “cultură stoc” de la
care se porneş te procesul de biosinteza, păstrată la frigider, pe mediu agarizat, î n tuburi.

Cultura inocul. Inoculul reprezintă o cultură microbiană î n curs de multiplicare pe un substrat


nutritiv corespunzător ş i î n anumite condiţ ii de dezvoltare (pH, temperatură, agitare, aerare)
specifice. Inoculul constituie materialul de î nsămânţ are al mediului de biosinteză propriu zis, din
etapa următoare. Transferul culturii inocul î n mediul de biosinteză se realizează î n condiţ ii aseptice,
după o perioadă de dezvoltare bine stabilită (vârstă, cantitate, aspect microscopic).

5. Etapele unui process biotehnologic. Faza de staţ ie pilot

Elaborarea ş i industrializarea unei tehnologii de biosinteză presupune parcurgerea mai multor faze ce
pornesc de la cercetările la nivel de laborator, urmate apoi de cele de la nivelul pilotului ș i, î n final,
la nivel industrial. Aceste cercetări permit transpunerea procedeului de biosinteză de la o fază la alta,
cu optimizarea factorilor implicaț i î n derularea fiecărei faze î n parte.

Cercetările de obţ inere a unui produs prin biosinteză î ncep cu lucrări de laborator care constau î n:
izolarea ș i selecț ia oragismelor de interes; î ntreț ierea tulpinilor cu proprietăț ile dorite; realizarea
culturilor inocul.

Faza de biosinteză propriu-zisă se realizează î n echipamente speciale, numite bioreactoare, care pot
avea diferite capacitate, (101, 1001, 1 , 10 , 100) alegerea unuia sau altuia depinzând de scopul
cercetărilor. Faza de biosinteză este precedată de operaţ ii de sterilizare a aparaturii utilizate ş i a
mediului de cultură stabilit ca fiind optim la nivel de laborator. Începutul fazei de biosinteză este
considerat momentul transferului culturii inocul î n mediul de cultură sterilizat ş i răcit la temperatura
de cultivare a microorganismului producător. Când raportul î ntre capacitatea de inocul ş i cantitatea
de mediu de fermentaţ ie (numit raport de inoculare) nu permite pregătirea culturii inocul î n laborator
este necesară introducerea unei trepte intermediare de cultivare, numite “cultura intermediar”.

In conditiile cresterii culturii in bioreactor parametrii sunt usor modificati dar monitorizarealor este
mai eficientă putind să monitorizezeși alți marametri care nu fac obiectul creșterii în flacoane de
cultură (caracteristici de spumare a mediului).
- Se identifică limitarile impuse bioreactorului. Dacă bioreactorul nu este aerat, celule mor prin
infometare, daca viteza de agitare nu este optima celulele se pot sparge, creșterea realizindu-
se prin alte căi metabolice.
- Se decide modul de cultivare cel mai avantajoz: sistemul Batch discontinuu sau continuu.
- Se realizeaza un calcul economic de fezabilitate
- Aici se pot stabili si preturile de cost orientativ al produsului.

În faza de staţ ie pilot tehnologia elaborată la nivel de laborator este verificată ş i optimizată pe
instalaţ ii de biosinteză de capacitate medie (pilot). Pe baza datelor de cercetare obţ inute la nivel pilot
se elaborează aş a numitul “proces tehnologic pilot” după care urmează o fază de experimentare
industrială ş i apoi producţ ia propriu –zisă produsului urmărit (enzimă, antibiotic etc). Datele
furnizate de tehnologia pilot elaborată, constituie elemente de proiectare pentru instalaţ iile
industriale.

6. Medii de cultură utilizate î n procesele biotehnologice

În procesele biotehnologice, mediile de cultură sunt constituite din suporturi nutritive sterilizate care
permit dezvoltarea ş i studiul unui microorganism î n afara niş ei ecologice naturale. Compoziţ ia
mediilor de cultură are o mare importanţ ă asupra reproductibilităţ ii ş i eficienţ ei tehnologiei
respective.

În funcţ ie de consistenţ ă, compoziţ ie, scopul utilizării, mediile de cultură se clasifică astfel: 

1. după consistenţ ă:


 medii lichide
 medii solide
 medii semisolide;

2. după compoziţ ie:


 medii naturale, care conţ in elemente nutritive, de origine vegetălă sau animală;
 medii sintetice ce conţ in doar compuş i cu str. chimică cunoscută ce pot fi dozaţ i;

3. după tipul respirator al microorganismelor cultivate se deosebesc:


 medii pentru microorganisme aerobe;
 medii pentru microorganisme anaerobe;

4. după scopul ş i frecvenţ a î ntrebuinţ ării deosebim:


 medii de uz curent;
 medii speciale utilizate î n general î n studiile de izolare a m/o la nivel de laborator.
Acestea pot fi: elective, selective, de î mbogăţ ire, de conservare, de identificare;

5. după faza de biosinteză la care este utilizat mediul de cultură poate fi mediu laborator, pilot
sau mediu de cultură industrial;

6. după destinaţ ia finală a culturii dezvoltate mediile pot fi:


 medii pentru cultura inocul;
 medii pentru cultura de regim numite ş i medii de fermentaţ ie sau medii de biosinteză.
În biotehnologie se utilizează î n mod curent mediile naturale având la bază subproduse
agroalimentare, cumr ar fi: ş rot de floarea soarelui, de soia, făină de porumb, tărâţ e de grâu, extractul
de porumb. Aceste medii conţ in î n general elemente nutritive necesare dezvoltării
microorganismelor, la care se adaugă de obicei cantităţ i mici de săruri minerale.

Mediile naturale sunt î n general mai ieftine dar prezintă dezavantajul variabilităţ ii compoziţ iei. Spre
deosebire de mediile naturale, mediile sintetice sunt perfect reproductibile la scară industrială.

Un mediu de cultură utilizat pentru dezvoltarea microorganismelor trebuie să conţ ină î ntodeauna:

 sursa de carbon (î n general glucide: glucoză,amidon, lactoză, zaharoză, etc.)


 sursa de azot care poate fi organic (aminoacizi, proteine,uree), sau anorganic (NH3, (NH4)2SO4,
etc. )
 sursa de fosfor (H3PO4, (NH4)3PO4, KH2PO4 , etc)
 oligoelemente: K (din KCl sau K2HPO4); Mg ( din MgSO4); Fe (din FeCl3)
 factori de creş tere: aminoacizi, proteine, vitamine, coenzime, tiamina, biotina

În procesele de biosinteză, sursa principală de energie o constituie sursa de carbon, respectiv
glucidele. Sursa de carbon furnizează de asemenea necesarul de oxigen ş i hidrogen necesar
dezvoltării microorganismului. Sursa de carbon: melasa de sfeclă sau de trestie este folosită î n multe
cazuri drept sursă de zaharoză. Alte surse de carbon utilizate î n producţ ia de enzime: siropul de
glucoză, amidonul de porumb sau de cartofi, hidrolizatul de amidon de cereale (grâu, orez, porumb)
sunt î n mod frecvent folosite ca surse de glucoză, zerul ca sursă de lactoză.

Sursa de azot poate fi reprezentată î n diferite forme de surse anorganice, cum ar fi: amoniacul,
sărurile de amoniu sau amestecuri complexe de tipul extractului de drojdie, a celui de porumb,
peptonă, făină de soia sau distilate solubile.

7. Influenţ a factorilor de mediu asupra cresterii microorganismelor

Creş terea microorganismelor î ntr-un bioreactor este influenţ ată de o serie de factori de mediu, dintre
care cei mai importanţ i sunt:
 concentraţ ia substratului
 calitatea ş i cantitatea inoculului
 temperatura
 pH-ul mediului de biosinteză
 agitarea
 concentraţ ia O2-ului dizolvat

Influenţ a concentraţ iei substratului asupra procesului de biosinteză

Celula microbiană, datorită volumului ei redus, este extrem de sensibilă la variaţ iile parametrilor
procesului de biosinteză, î n special la variaţ iile concentraţ iei de substrat. Mărirea concentraţ iei de
substrat î n mediul de cultură poate conduce la sporirea numărului de celule microbiene, dar numai
până la anumite limite, multiplicarea acestora fiind î ncetinită, de procese de inhibiţ ie care au loc la
nivelul celulei.
Concentraţ iile mari de substrat inhibă dezvoltarea microorganismelor î ntr-un anumit grad ajungând
chiar la inhibiţ ie totală, motiv pentru care, pentru un sistem de biosinteză se stabileş te concentraţ ia
optimă a substratului atât î n momentul iniţ ial cât ş i pe parcurs.

Influenţ a dimensiunii inoculului

Calitatea ş i cantitatea inoculului joacă un rol important pentru obţ inerea unor metaboliţ i cu
randamente dorite de biosinteză. Cel mai adesea se utilizează o cantitate mare de inocul pentru a
determina o declanş are rapidă a dezvoltării culturii concomitent cu reducerea riscului de
contaminare. In majoritatea cazurilor este necesar ca dimensiunea inoculului să se situeze î ntre 3–
10% din volumul total al culturii. Pentru fiecare tehnologie î n parte se stabileş te aş a numitul “raport
optim de inoculare” care defineş te dimensiunile optime ale inoculului. De exemplu, la bacterii,
mărimea inoculului la bacterii are influenţ ă pronunţ ată asupra stadiilor ulterioare ale culturii. În cazul
levurilor cantitatea de inocul poate influenţ a de asemenea durata fazei de lag sau stadiile ulterioare
de dezvoltare. În cazul fungilor pentru obţ inerea unui ritm rapid de dezvoltare este necesar să se
utilizeze un inocul sub formă de suspensie de spori.

Efectul temperaturii asupra creşterii microorganismelor producătoare de enzime

Temperatura este un factor care acţ ionează î n mod direct asupra microorganismelor, diferenţ a î ntre
temperatura mediului î nconjurător ş i cea din interiorul celulei trebuind să fie nulă. Variaţ iile
temperaturii au efect asupra randamentului de transformare a substratului î n produsul dorit, asupra
cerinţ elor nutritive ale microorganismului ş i compoziţ iei biomasei obţ inute precum ş i asupra vitezei
de creş tere microbiană. În funcţ ie de domeniul de temperatură î n care microorganismele, ating viteza
maximă de creş tere, acestea se clasifică î n : criofile, mezofile ş i termofile. Microorganismele
industriale sunt î n general mezofile, astfel î ncât acest domeniu este plasat î n intervalul 25 – 35C.

Efectul pH-ului asupra creşterii microorganismelor

In general microorganismele au un domeniu optim de pH pentru dezvoltare, î n care viteza specifică


de creş tere atinge valoarea maximă. De exemplu, pentru anumite specii de drojdii domeniul optim de
pH se situează î ntre valorile de pH 4 ş i 5. Există î nsă ş i specii de drojdii care cresc la valori de pH î n
jur de 2 sau, dimpotrivă, la valori ridicate ale pH- ului î n jur de 8. Cultivarea microorganismelor la
valori scăzute ale pH-ului (pH 3 – 4) prezintă avantajul unui risc mai scăzut de contaminare.
Deviaţ iile pH-ului de la valoarea optimă pot avea urmări nedorite asupra procesului de biosinteză.
Pentru corectarea pH-ului se adaugă diverse substanţ e chimice (acizi sau baze).

Concentraţ ia de oxigen dizolvat

În culturile aerobe, este esenţ ial să se realizeze dizolvarea î n mediu a î ntregii cantităţ i de oxigen
necesare microorganismului î n orice moment al fermentaţ iei. De aceea se urmăreş te î n general
obţ inerea unor aerări cât mai eficiente, transferul de oxigen din faza gazoasă î n faza lichidă având loc
cu viteze mari. În cazul î n care procesul de biosinteză se desfăş oară î n laborator la flacoane agitate,
aerarea depinde de următorii parametrii: viteza de rotaţ ie sau translaţ ie a agitatorului, mărimea
flacoanelor Erlenmayer, volumul de mediu de cultură din flacon, creş terea turbulenţ ei prin ş icane.

8. Prelucrarea mediilor de cultura in scopul izolarii si purificarii produselor de biosinteza


Înainte de a fi purificate, substanţ ele organice obţ inute pe cale biotehnologică sunt izolate din
lichidul de cultură sau din biomasă î ntr-o formă parţ ial purificată aplicî nd metode de separare
general valabile pentru toate produsele de biosinteză.

Prelucrarea primară a mediilor de biosinteză cuprinde o serie de operaţ ii cum ar fi: filtrarea,
centrifugarea, decantarea, concentrarea fazei lichide, dezagregarea celulelor, extracţ ia, uscarea,
atomizarea, precum ș i procese mai specifice de tipul precipitării cu solvenţ i sau cu săruri anorganice,
purificării ş i concentrării prin ultrafiltrare.

Echipamentele industriale implicate sunt complexe ş i specifice. Schema de flux variază de la un


preparat la altul, î n funcţ ie de tehnologie.

Separarea produselor din lichidul rezultat din fermentaţ ie, constituie o problemă dificilă, indiferent
de procedeul aplicat. Dificultăţ ile provin din faptul că produsele biologic active obţ inute î n general
prin biosinteză sunt substanţ e termolabile, ceea ce impune evitarea degradării sau modificării
chimice a acestora. Pentru a alege cea mai adecvată metodă de separare a produselor biosintetizate,
este necesar să se cunoască proprietăţ ile fizico – chimice a acestora ş i anume:

1. Solubilitatea :
 î n apă sau î n soluţ ii diluate de săruri ;
 î n solvenţ i polari (metanol, etanol, acetonă) ;
 î n solvenţ i slab – polari (cloroform, hidrocarburi) ;

2. Stabilitatea î n soluţ ie :
 î n funcţ ie de pH;
 efectul temperaturii ;
 efectul soluţ iilor tampon ;
 efectul solvenţ ilor organici ;

3. Stabilitatea î n stare solidă î n funcţ ie de temperatură precum ş i efectul umidităţ ii asupra


produsului ;

4. Proprietăţ i fizice :
 dializabilitate prin membrane ; o adsorbţ ia pe suprafeţ e solide ;
 migrarea î n câmp electric ;
 sedimentarea î n ultracentrifuge ;

5. Proprietăţ i chimice :
 stabilitatea faţ ă de diverse enzime ;
 stabilitatea la acţ iunea unor agenţ i chimici.

Pentru separarea produsului din mediile de biosinteză se aplică î n general următoarele metode:
extracţ ia cu solvenţ i organici; separarea pe schimbători de ioni; cromatografie; adsorbţ ia.

9. Filtrarea mediilor de biosinteză

Faţ ă de filtrarea substanţ elor chimice, filtrarea mediilor de biosinteză ridică adesea probleme datorită
compoziţ iei chimice deosebit de complexe a mediilor ş i apariţ ia materialului biologic (bacterii,
fungi) care complică fenomenul. Operaţ ia de filtrare a mediilor de biosinteză este adeseori uş urată
prin utilizarea adjuvanţ ilor de filtrare care formează î n cursul operaţ iei straturi microporoase
micş orî nd diametrul aparent al porilor ş i implicit mărind eficienţ a de colectare prin reţ inerea unor
particule de diametru mai scăzut. Utilizarea lor industrială conduce la mărirea vitezei de filtrare ş i
reducerea consumurilor de materiale.

O variantă a operaţ iei de filtrare mult utilizată î n biotehnologie este filtrarea sterilizantă. La
prelucrarea suspensiilor se execută î ntâi o prefiltrare grosieră, urmată de filtrarea sterilizantă propriu
zisă. Pentru filtrarea sterilizantă se montează î n filtru plăcile (din acetat de celuloză, azbest sau
polimeri sintetici) cu diametru redus al porilor, executând apoi î n mod normal operaţ ia de filtrare.

10. Dezagregarea celulelor de microorganisme

Când substanţ ele biologic active care interesează ş i care s-au format î n cursul procesului de
biosinteză sunt intracelulare este necesară distrugerea membranei celulare semipermeabile ş i a
peretelui protector î n vederea recuperării componentelor respective. Această operaţ ie se realizează
prin procedee de dezagregare. După natura agentului de dezagregare utilizat, procedeele de
dezagregare ale celulelor microbiene se clasifică î n :
 procedee mecanice
 procedee fizice nemecanice
 procedee chimice
 procedee enzimatice.

Procedeele mecanice cuprind dezagregarea celulelor î n mori coloidale sau î n mori vibratoare,
menţ inând un anumit raport de recirculare, până la dezagregarea totală a celulelor microbiene; î n
timpul operaţ iilor de dezagregare mecanică are loc o creş tere a temperaturii materialului biologic.
Evitarea acestui fenomen ş i menţ inerea sistemului la o temperatură acceptabilă se efectuează prin
circulaţ ia unui agent de răcire prin mantaua aparatului.

Procedee fizice nemecanice se poate efectua prin decomprimare rapidă, prin î ngheţ are lentă sau prin
ş oc osmotic. Un procedeu deosebit de eficace este aplicarea de vibraţ ii ultrasonice suspensiei de
celule. Vibraţ iile cu frecvenţ e de cca. 20.000 Hz determină dezintegrarea celulelor microbiene.

Procedee chimice cuprinde distrugerea componentelor lipoproteice ale membranei celulare prin
acţ iunea detergenţ ilor cationici sau anionici sau a solvenţ ilor organici, determinând trecerea î n faza
lichidă a unora din componentele biologic active.

Tratarea cu diferite preparate enzimatice - liza celulelor bacteriene poate fi indusă prin atacul
enzimatic specific al legăturilor α-1,4 dintre moleculele de N-acetilglucozamină ş i acidul N-
acetilmuramic.

Dezintegrarea biologică enzimatică este una din cele mai vechi metode de obţ inere a omogenatelor
celulare. Cel mai cunoscut exemplu este cel al descompunerii autolitice a drojdiei de bere uscată la
30C, timp de 2–3 zile. Dezintegrarea celulelor de Micrococcus lysodeikticus poate fi realizată cu
suc pancreatic; distrugerea ţ esutului muscular poate fi produsă cu enzyme proteolitice izolate din
Bacillus subtilis, iar dezintegrarea biologică a E.coli poate fi realizată cu bacteriofagi litici.

11. Concentrarea mediilor de biosinteză a enzimelor


Mediile de biosinteză se concentrează prin operaţ ii specifice industriei chimice, cu deosebirea că este
necesară protejarea lichidelor biologice datorită permeabilităţ ii acestora. Se utilizează adeseori
evaporarea î n vacuum care permite efectuarea operaţ iei la temperaturi relativ scăzute (25 – 50C).
In ultimul timp se practică cu succes procedeele de concentrare atermică, ultrafiltrarea ş i osmoza
inversă.

Concentrarea prin ultrafiltrare. Ultrafiltrarea reprezintă procesul de separare a componentelor


unei soluţ ii datorită diferenţ elor de volum molecular cu ajutorul unei membrane. Ultrafiltrarea este
un procedeu de separare ş i purificare a substanţ elor biologic active, având următoarele avantaje:
 permite efectuarea concentrării la temperaturi scăzute micş orând fenomenele de autodigerare
ş i pierderile î n activitate prin denaturarea termică.
 nu necesită modificări de fază (evaporări, condensări).
 nu utilizează substanţ e chimice.
 permite purificarea soluţ iilor biologic active prin î ndepărtarea unor componente cu volum
molecular inferior.

Cercetările privind introducerea proceselor cu membrane, urmăresc î n general, stabilirea


posibilităţ ilor de utilizare eficientă a unor tipuri de membrane la concentrarea ş i purificarea
produselor biologic active, î n cadrul elaborării tehnologiilor de obţ inere a acestora. Dintre aplicaţ iile
ultrafiltrării, cele din domeniul biotehnologiei ocupă un loc major, metoda fiind utilizată ades la
concentrarea ş i purificarea enzimelor de origine microbiană.

De exemplu, î n procesul de izolare ş i purificare a enzimelor, una din etape o constituie


demineralizarea soluţ iei enzimatice; această operaţ ie are loc î n paralel cu concentrarea prin
ultrafiltrare î ntrucî t ionii anorganici avî nd volum mic trec prin membrana de ultrafiltrare; astfel,
aplicarea metodei de concentrare prin ultrafiltrare a soluţ iilor enzimatice conduce la eliminarea
operaţ iei de dializă, efectuată î n mod obiş nuit î ntr-un flux de purificare.

Uscarea prin atomizare a mediilor de fermentaţ ie cu activitate enzimatică. Uscarea prin


pulverizare se foloseş te pentru materialele care î n faza iniţ ială sunt lichide (soluţ ii, suspensii, paste
subţ iri). Acestea, î n vederea uscării sunt pulverizate î n particule de dimensiuni mici. Prin pulverizare
la dimensiuni mici se î nţ elege obţ inerea unei suspensii de lichid constituită din particule de
dimensiuni î ntre 2 ş i 200 m.

Dat fiind dimensiunile particulelor, operaţ ia a fost denumită ş i atomizare; î n uscătoarele cu


pulverizare, uscarea are loc foarte repede, astfel î ncât, materialul nu are timp să se î ncălzească peste
limita admisibilă ş i temperatura lui este apropiată de temperatura de evaporare a lichidului.
Materialul uscat se obţ ine sub formă de pulbere ş i nu este necesară o mărunţ ire ulterioară. Metoda
este aplicată î n general î n condiţ ionarea enzimelor de mare tonaj, utilizate î n hrana animalelor ca
aditivi furajeri (proteaze, amilaze, celulaze) ş i se realizează prin atomizarea integrală a mediului de
cultură fără o altă purificare.

S-ar putea să vă placă și