Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Orice manipulare a viului î n folosul societăţ ii, î nseamnă biotehnologie. Indiferent dacă aceasta se
realizează la nivel laborator avănd un caracter de cercetare fundamentală sau se realizează la nivel
industrial având un caracter aplicativ, scopul final ş i î n general tehnicile sunt asemănătoare ş i incluse
î n aceeaş i sferă largă a biotehnologiei.
Dintre toate definiţ iile aceea dată biotehnologiei de către Federaţ ia Europeană de Biologie (1978),
pare a fi satisfăcătoare: "Utilizarea integrată a biochimiei, microbiologiei ş i ingineriei î n scopul
obţ inerii unei aplicaţ ii tehnologice (industriale), cu ajutorul microorganismelor, culturilor de
celule ş i a părţ ilor componente a acestora". Simplificând, se poate spune că biotehnologia
presupune "utilizarea organismelor sau a produselor derivate de la acestea î n scopuri
comerciale."
In esenţ ă, principalul scop al biotehnologiei este obţ inerea de produse sau servicii utile activităţ ii
umane, cu ajutorul organismelor vii. Procesul de bază î n biotehnologie este “proces biologic”, după
cum procesul de bază î n tehnologia chimică este “procesul chimic”.
Ingineria genetică este considerată a fi tehnica ideală capabilă să amelioreze cantitativ ş i calitativ
capacitatea de biosinteză a celulelor de microorganisme, animale sau vegetale, î n scopul obţ inerii
unor produse utile. Natura interdisciplinară a biotehnologiei este evidentă dacă se ţ ine seama de
etapele unui proces biotehnologic complet. Dacă se ia ca exemplu obţ inerea unui produs nou prin
tehnologia ADN-recombinant, cum ar fi insulina, hormonul de creş tere sau interferonul se parcurg o
serie î ntreagă de faze care implică cunoş tinţ e aparţ inând unor domenii ş tiinţ ifice foarte diferite.
Dupa ce produsul a fost purificat până la standardele cerute de normele internaţ ionale, acesta poate fi
ambalat ş i vândut. In cazul produselor farmaceutice noi este necesară ş i testarea eficacităţ ii acestora,
mai î ntâi pe animale ş i apoi pe oameni. Pentru produsele uz alimentar sunt cerute alte teste specifice.
Pentru toate produsele obţ inute pe cale biotehnologică se cer avize oficiale conforme cu standardele
existente pentru fiecare tip de produs.
1. În funcţ ie de tipul de celule cu care se lucrează, deosebim biotehnologii : microbiene, vegetale ş i
animale.
2. În funcţ ie de domeniul î n care î ş i găsesc aplicaţ ii produsele obţ inute pe cale biotehnologică
deosebim:
Biotehnologii industriale (farmaceutice, alimentare ş i biotehnologii de depoluare).
Biotehnologii agricole (biotehnologii vegetale ş i biotehnologii î n zootehnie);
Biotehnologii medical-veterinare
1.Biomedicină şi farmacologie - se obţin vaccinuri pentru unele maladii virale (hepatita A şi B,
herpes, poliomielită), a interferonului, a hormonilor de creştere umană, a enzimelor, a unor proteine
specifice, a unor noi tipuri de antibiotice, de vitamine şi unele medicamente.
Se prevăd următoarele direcţii de cercetare ştiinţifică:
Clarificarea funcţiilor şi mecanismelor de acţiune a regulatorilor imunologici;
Investigaţii cu peptide neuroactive, trombolitice şi fibrinolitice;
Clarificarea mecanismelor imunităţii;
Înţelegerea fiziologiei şi aspectelor genetice ale cancerului.
2.Agricultură şi industria alimentară - se urmăreşte obţinerea unor hibrizi şi soiuri mai productive
şi mai rezistente la boli. Se urmăreşte de asemenea procesul biologic de fixare a azotului din atmosferă
şi procedee de manipulare genetică cum este transferul embrionar şi tehnica ADN-recombinant pentru
obţinerea unor rase de animale şi de păsări. Se urmăreşte de asemenea producţia de enzime, de AA,
antioxidanţi, obţinerea de noi pesticide, de medicamente de uz veterinar, de obţinerea unor compuşi
aromatici, precum şi de agenţi de diagnostic.
5.Extracţia materiilor prime minerale şi protecţia mediului înconjurător - În acest scop se vor
folosi tehnologiile microbiologice de extracţie a unor metale şi metaloizi din minereuri sărace, precum
şi descompunerea biologică şi combaterea unor poluanţi ai mediului înconjurător.
Elaborarea ş i industrializarea unei tehnologii de biosinteză presupune parcurgerea mai multor faze ce
pornesc de la cercetările la nivel de laborator, urmate apoi de cele de la nivelul pilotului ș i, î n final,
la nivel industrial. Aceste cercetări permit transpunerea procedeului de biosinteză de la o fază la alta,
cu optimizarea factorilor implicaț i î n derularea fiecărei faze î n parte.
Cercetările de obţ inere a unui produs prin biosinteză î ncep cu lucrări de laborator care constau î n:
izolarea ș i selecț ia oragismelor de interes; î ntreț ierea tulpinilor cu proprietăț ile dorite; realizarea
culturilor inocul.
Izolarea şi selecţ ia unui mare număr de microorganisme ca producători ai compusului ce urmează a
fi biosintetizat. Tehnicile utilizate î n acest scop sunt specifice pentru fiecare microorganism, cele mai
multe referindu-se la tehnica diluţ iilor ş i tehnica granulelor de sol.
Microorganismele sunt preluate din diferite habitate cultivate pe medii solide sau lichide, astfel î ncât
să fie posibilă punerea î n evidenţ ă a unor caracteristici fiziologice. În prima etapă se urmăreş te
realizarea unei culturi pure prin tehnici microbiologice specifice (epuizarea ansei, diluţ ii succesive),
după care se stabileş te o metodă de triere (screening) adecvată scopului urmărit.
Microorganismele sunt cultivate pe plăci Petri, pe medii solidificate cu agar- agar. In cazul î n care se
urmăreș te selectarea unor microorganisme producătoare a unui anumit tip de enzimă se realizează
teste de identificare care pot fi calitative sau cantitative. După dezvoltarea coloniilor izolate,
enzimele difuzează î n gelul de agar-agar. Produsele respective sunt prelucrate î n scopul dozării
cantitative prin metode spectrofotometrice, fluorescenţ ă, titrimetrice, polarimetrice. În urma acestor
teste se reţ in numai câteva tulpini care au dat cele mai bune rezultate î n ceea ce priveş te biosinteza
enzimei.
Întreţ inerea tulpinilor producătoare. După faza de izolare ş i selecţ ie, tulpinile producătoare se
supun unor teste de caracterizare după criterii morfologice, biochimice, fiziologice, imunologice sau
toxicologice; Tulpina astfel caracterizată se î nregistrează î ntr-o colecţ ie de microorganisme, î n
vederea protejării sale ș i a utilizării ulterioare.
Tinând cont că scopul este de a obț ine un anumit produs la nivel industrial este necesar ca nivelul
biosintezei să fie ridicat; de aceea se optimizează parametrii de biosinteză sau tulpina microbiană de
interes este supusă unor teste de ameliorare prin metode clasice sau moleculare
Conservarea microorganismelor de interes, atât tulpinile parentale, cât ş i tulpinile modificate genetic
se face prin metode speciale, aș a cum sunt liofilizarea ş i conservarea î n azot lichid. Tulpinile din
colecţ ie utilizate î n lucrările de biosinteză curente se păstrează sub forma de “cultură stoc” de la
care se porneş te procesul de biosinteza, păstrată la frigider, pe mediu agarizat, î n tuburi.
Elaborarea ş i industrializarea unei tehnologii de biosinteză presupune parcurgerea mai multor faze ce
pornesc de la cercetările la nivel de laborator, urmate apoi de cele de la nivelul pilotului ș i, î n final,
la nivel industrial. Aceste cercetări permit transpunerea procedeului de biosinteză de la o fază la alta,
cu optimizarea factorilor implicaț i î n derularea fiecărei faze î n parte.
Cercetările de obţ inere a unui produs prin biosinteză î ncep cu lucrări de laborator care constau î n:
izolarea ș i selecț ia oragismelor de interes; î ntreț ierea tulpinilor cu proprietăț ile dorite; realizarea
culturilor inocul.
Faza de biosinteză propriu-zisă se realizează î n echipamente speciale, numite bioreactoare, care pot
avea diferite capacitate, (101, 1001, 1 , 10 , 100) alegerea unuia sau altuia depinzând de scopul
cercetărilor. Faza de biosinteză este precedată de operaţ ii de sterilizare a aparaturii utilizate ş i a
mediului de cultură stabilit ca fiind optim la nivel de laborator. Începutul fazei de biosinteză este
considerat momentul transferului culturii inocul î n mediul de cultură sterilizat ş i răcit la temperatura
de cultivare a microorganismului producător. Când raportul î ntre capacitatea de inocul ş i cantitatea
de mediu de fermentaţ ie (numit raport de inoculare) nu permite pregătirea culturii inocul î n laborator
este necesară introducerea unei trepte intermediare de cultivare, numite “cultura intermediar”.
In conditiile cresterii culturii in bioreactor parametrii sunt usor modificati dar monitorizarealor este
mai eficientă putind să monitorizezeși alți marametri care nu fac obiectul creșterii în flacoane de
cultură (caracteristici de spumare a mediului).
- Se identifică limitarile impuse bioreactorului. Dacă bioreactorul nu este aerat, celule mor prin
infometare, daca viteza de agitare nu este optima celulele se pot sparge, creșterea realizindu-
se prin alte căi metabolice.
- Se decide modul de cultivare cel mai avantajoz: sistemul Batch discontinuu sau continuu.
- Se realizeaza un calcul economic de fezabilitate
- Aici se pot stabili si preturile de cost orientativ al produsului.
În faza de staţ ie pilot tehnologia elaborată la nivel de laborator este verificată ş i optimizată pe
instalaţ ii de biosinteză de capacitate medie (pilot). Pe baza datelor de cercetare obţ inute la nivel pilot
se elaborează aş a numitul “proces tehnologic pilot” după care urmează o fază de experimentare
industrială ş i apoi producţ ia propriu –zisă produsului urmărit (enzimă, antibiotic etc). Datele
furnizate de tehnologia pilot elaborată, constituie elemente de proiectare pentru instalaţ iile
industriale.
În procesele biotehnologice, mediile de cultură sunt constituite din suporturi nutritive sterilizate care
permit dezvoltarea ş i studiul unui microorganism î n afara niş ei ecologice naturale. Compoziţ ia
mediilor de cultură are o mare importanţ ă asupra reproductibilităţ ii ş i eficienţ ei tehnologiei
respective.
În funcţ ie de consistenţ ă, compoziţ ie, scopul utilizării, mediile de cultură se clasifică astfel:
5. după faza de biosinteză la care este utilizat mediul de cultură poate fi mediu laborator, pilot
sau mediu de cultură industrial;
Mediile naturale sunt î n general mai ieftine dar prezintă dezavantajul variabilităţ ii compoziţ iei. Spre
deosebire de mediile naturale, mediile sintetice sunt perfect reproductibile la scară industrială.
Un mediu de cultură utilizat pentru dezvoltarea microorganismelor trebuie să conţ ină î ntodeauna:
În procesele de biosinteză, sursa principală de energie o constituie sursa de carbon, respectiv
glucidele. Sursa de carbon furnizează de asemenea necesarul de oxigen ş i hidrogen necesar
dezvoltării microorganismului. Sursa de carbon: melasa de sfeclă sau de trestie este folosită î n multe
cazuri drept sursă de zaharoză. Alte surse de carbon utilizate î n producţ ia de enzime: siropul de
glucoză, amidonul de porumb sau de cartofi, hidrolizatul de amidon de cereale (grâu, orez, porumb)
sunt î n mod frecvent folosite ca surse de glucoză, zerul ca sursă de lactoză.
Sursa de azot poate fi reprezentată î n diferite forme de surse anorganice, cum ar fi: amoniacul,
sărurile de amoniu sau amestecuri complexe de tipul extractului de drojdie, a celui de porumb,
peptonă, făină de soia sau distilate solubile.
Creş terea microorganismelor î ntr-un bioreactor este influenţ ată de o serie de factori de mediu, dintre
care cei mai importanţ i sunt:
concentraţ ia substratului
calitatea ş i cantitatea inoculului
temperatura
pH-ul mediului de biosinteză
agitarea
concentraţ ia O2-ului dizolvat
Celula microbiană, datorită volumului ei redus, este extrem de sensibilă la variaţ iile parametrilor
procesului de biosinteză, î n special la variaţ iile concentraţ iei de substrat. Mărirea concentraţ iei de
substrat î n mediul de cultură poate conduce la sporirea numărului de celule microbiene, dar numai
până la anumite limite, multiplicarea acestora fiind î ncetinită, de procese de inhibiţ ie care au loc la
nivelul celulei.
Concentraţ iile mari de substrat inhibă dezvoltarea microorganismelor î ntr-un anumit grad ajungând
chiar la inhibiţ ie totală, motiv pentru care, pentru un sistem de biosinteză se stabileş te concentraţ ia
optimă a substratului atât î n momentul iniţ ial cât ş i pe parcurs.
Calitatea ş i cantitatea inoculului joacă un rol important pentru obţ inerea unor metaboliţ i cu
randamente dorite de biosinteză. Cel mai adesea se utilizează o cantitate mare de inocul pentru a
determina o declanş are rapidă a dezvoltării culturii concomitent cu reducerea riscului de
contaminare. In majoritatea cazurilor este necesar ca dimensiunea inoculului să se situeze î ntre 3–
10% din volumul total al culturii. Pentru fiecare tehnologie î n parte se stabileş te aş a numitul “raport
optim de inoculare” care defineş te dimensiunile optime ale inoculului. De exemplu, la bacterii,
mărimea inoculului la bacterii are influenţ ă pronunţ ată asupra stadiilor ulterioare ale culturii. În cazul
levurilor cantitatea de inocul poate influenţ a de asemenea durata fazei de lag sau stadiile ulterioare
de dezvoltare. În cazul fungilor pentru obţ inerea unui ritm rapid de dezvoltare este necesar să se
utilizeze un inocul sub formă de suspensie de spori.
Temperatura este un factor care acţ ionează î n mod direct asupra microorganismelor, diferenţ a î ntre
temperatura mediului î nconjurător ş i cea din interiorul celulei trebuind să fie nulă. Variaţ iile
temperaturii au efect asupra randamentului de transformare a substratului î n produsul dorit, asupra
cerinţ elor nutritive ale microorganismului ş i compoziţ iei biomasei obţ inute precum ş i asupra vitezei
de creş tere microbiană. În funcţ ie de domeniul de temperatură î n care microorganismele, ating viteza
maximă de creş tere, acestea se clasifică î n : criofile, mezofile ş i termofile. Microorganismele
industriale sunt î n general mezofile, astfel î ncât acest domeniu este plasat î n intervalul 25 – 35C.
În culturile aerobe, este esenţ ial să se realizeze dizolvarea î n mediu a î ntregii cantităţ i de oxigen
necesare microorganismului î n orice moment al fermentaţ iei. De aceea se urmăreş te î n general
obţ inerea unor aerări cât mai eficiente, transferul de oxigen din faza gazoasă î n faza lichidă având loc
cu viteze mari. În cazul î n care procesul de biosinteză se desfăş oară î n laborator la flacoane agitate,
aerarea depinde de următorii parametrii: viteza de rotaţ ie sau translaţ ie a agitatorului, mărimea
flacoanelor Erlenmayer, volumul de mediu de cultură din flacon, creş terea turbulenţ ei prin ş icane.
Prelucrarea primară a mediilor de biosinteză cuprinde o serie de operaţ ii cum ar fi: filtrarea,
centrifugarea, decantarea, concentrarea fazei lichide, dezagregarea celulelor, extracţ ia, uscarea,
atomizarea, precum ș i procese mai specifice de tipul precipitării cu solvenţ i sau cu săruri anorganice,
purificării ş i concentrării prin ultrafiltrare.
Separarea produselor din lichidul rezultat din fermentaţ ie, constituie o problemă dificilă, indiferent
de procedeul aplicat. Dificultăţ ile provin din faptul că produsele biologic active obţ inute î n general
prin biosinteză sunt substanţ e termolabile, ceea ce impune evitarea degradării sau modificării
chimice a acestora. Pentru a alege cea mai adecvată metodă de separare a produselor biosintetizate,
este necesar să se cunoască proprietăţ ile fizico – chimice a acestora ş i anume:
1. Solubilitatea :
î n apă sau î n soluţ ii diluate de săruri ;
î n solvenţ i polari (metanol, etanol, acetonă) ;
î n solvenţ i slab – polari (cloroform, hidrocarburi) ;
2. Stabilitatea î n soluţ ie :
î n funcţ ie de pH;
efectul temperaturii ;
efectul soluţ iilor tampon ;
efectul solvenţ ilor organici ;
4. Proprietăţ i fizice :
dializabilitate prin membrane ; o adsorbţ ia pe suprafeţ e solide ;
migrarea î n câmp electric ;
sedimentarea î n ultracentrifuge ;
5. Proprietăţ i chimice :
stabilitatea faţ ă de diverse enzime ;
stabilitatea la acţ iunea unor agenţ i chimici.
Pentru separarea produsului din mediile de biosinteză se aplică î n general următoarele metode:
extracţ ia cu solvenţ i organici; separarea pe schimbători de ioni; cromatografie; adsorbţ ia.
Faţ ă de filtrarea substanţ elor chimice, filtrarea mediilor de biosinteză ridică adesea probleme datorită
compoziţ iei chimice deosebit de complexe a mediilor ş i apariţ ia materialului biologic (bacterii,
fungi) care complică fenomenul. Operaţ ia de filtrare a mediilor de biosinteză este adeseori uş urată
prin utilizarea adjuvanţ ilor de filtrare care formează î n cursul operaţ iei straturi microporoase
micş orî nd diametrul aparent al porilor ş i implicit mărind eficienţ a de colectare prin reţ inerea unor
particule de diametru mai scăzut. Utilizarea lor industrială conduce la mărirea vitezei de filtrare ş i
reducerea consumurilor de materiale.
O variantă a operaţ iei de filtrare mult utilizată î n biotehnologie este filtrarea sterilizantă. La
prelucrarea suspensiilor se execută î ntâi o prefiltrare grosieră, urmată de filtrarea sterilizantă propriu
zisă. Pentru filtrarea sterilizantă se montează î n filtru plăcile (din acetat de celuloză, azbest sau
polimeri sintetici) cu diametru redus al porilor, executând apoi î n mod normal operaţ ia de filtrare.
Când substanţ ele biologic active care interesează ş i care s-au format î n cursul procesului de
biosinteză sunt intracelulare este necesară distrugerea membranei celulare semipermeabile ş i a
peretelui protector î n vederea recuperării componentelor respective. Această operaţ ie se realizează
prin procedee de dezagregare. După natura agentului de dezagregare utilizat, procedeele de
dezagregare ale celulelor microbiene se clasifică î n :
procedee mecanice
procedee fizice nemecanice
procedee chimice
procedee enzimatice.
Procedeele mecanice cuprind dezagregarea celulelor î n mori coloidale sau î n mori vibratoare,
menţ inând un anumit raport de recirculare, până la dezagregarea totală a celulelor microbiene; î n
timpul operaţ iilor de dezagregare mecanică are loc o creş tere a temperaturii materialului biologic.
Evitarea acestui fenomen ş i menţ inerea sistemului la o temperatură acceptabilă se efectuează prin
circulaţ ia unui agent de răcire prin mantaua aparatului.
Procedee fizice nemecanice se poate efectua prin decomprimare rapidă, prin î ngheţ are lentă sau prin
ş oc osmotic. Un procedeu deosebit de eficace este aplicarea de vibraţ ii ultrasonice suspensiei de
celule. Vibraţ iile cu frecvenţ e de cca. 20.000 Hz determină dezintegrarea celulelor microbiene.
Procedee chimice cuprinde distrugerea componentelor lipoproteice ale membranei celulare prin
acţ iunea detergenţ ilor cationici sau anionici sau a solvenţ ilor organici, determinând trecerea î n faza
lichidă a unora din componentele biologic active.
Tratarea cu diferite preparate enzimatice - liza celulelor bacteriene poate fi indusă prin atacul
enzimatic specific al legăturilor α-1,4 dintre moleculele de N-acetilglucozamină ş i acidul N-
acetilmuramic.
Dezintegrarea biologică enzimatică este una din cele mai vechi metode de obţ inere a omogenatelor
celulare. Cel mai cunoscut exemplu este cel al descompunerii autolitice a drojdiei de bere uscată la
30C, timp de 2–3 zile. Dezintegrarea celulelor de Micrococcus lysodeikticus poate fi realizată cu
suc pancreatic; distrugerea ţ esutului muscular poate fi produsă cu enzyme proteolitice izolate din
Bacillus subtilis, iar dezintegrarea biologică a E.coli poate fi realizată cu bacteriofagi litici.