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Una vez obtenido el amplificado, cortar banda con bisturí, fue pesado un eppendorf 1,5ml.
Para obtener el amplificado sin el gel se utilizó el kit “EZNA Gel Extraction Kit”
-Modelo: DS2500-01
Una vez obtenido el purificado, se procede a clonarlo utilizando el kit “pGEM®-T easy
Vector Systems”
-Proveedor: Promega
Este kit permite la obtención de clones por medio del vector pGEM-T Easy Vector, que
A) Ligación: En esta fase del proceso se busca que nuestro fragmento de estudio se
incorpore dentro del plásmido, para controlar esta fase es necesario utilizar un
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Reacción de Ligación de producto de PCR en vector pGEMt easy
Echerichia coli JM109, bacteria cuya pared celular y membrada se encuentra con
Para controlar esta fase se agregan dos controles (placa 5-6) y se siembran de la
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Preparación de medios cultivo para clonación
Medio SOC
Reactivo Volumen
Lacto tryptone 2 gr
Lacto 0,5gr
NaCl 1M 1 mL
KCl 1M 0,25mL
Mg2+ 2M 1mL
Glucosa 2M 1mL
Medio LB
Reactivo Volumen
Lacto tryptone 10 gr
Bacto yeast extract 5gr
NaCl 5gr
Medio agar a agar 15gr
Ajustar el pH a 7,0 con NaOH y una vez tibio el medio agregar 1mL de ampicilina
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4. Screening de células transformadas.
en 20 uL agua destilada, para someterla a calor a 95°C por 10 minutos. Después se realizó
se corrieron las muestras en un gel agarosa. Las muestras positivas con el fragmento de
estudio se tomaron con un asa estéril y se inocularon en medio LB caldo con ampicilina y
Al día siguiente se utilizó el kit “E.Z.N.A plasmid DNA minikit II”, para obtener el
REF: D6945-01
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6. Digestión enzimática con enzima EcoRI
digestión con la enzima EcoRI Esta enzima nos permite cortar el plásmido justo en la zona
- EcoRI Promega
Reactivo Volumen
Agua libre de nucleasas 16.3 uL
Buffer enzima restricción 10x 2 uL
Acetato BSA 0,2 uL
Enzima restricción Eco RΙ 0,5 uL
ADN( muestra) 1 uL
Volumen total = 20 uL