[Seleccionar fecha] BIOQUIMICA I

GUIA PRÁCTICA DE BIOFARMACIA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

GUIA DE PRÁCTICAS DE
BIOQUÍMICA I
Lic Q.F. Sháneri Marcilla Truyenque
Magister en Microbiología Clínica

AREQUIPA – PERÚ
201

Q.F. Sháneri Marcilla Truyenque MC 1

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PRACTICA N° 1
DETERMINACIÓN DE PH EN FLUIDOS BIOLÓGICOS

I. OBJETIVOS
 Aplica los conceptos fundamentales sobre el pH.
 Utiliza las técnicas para medir el pH.

II. FUNDAMENOS
METODOS DE DETERMINACION DEL pH:
Existen varios procedimientos:
 Mediante indicadores.
 Mediante cintas o papel de pH universal.
 Mediante el potenciómetro o pHmetro.

DETERMINACION DEL pH MEDIANTE EL USO DE INDICADORES:

Indicadores.-Son soluciones o cuerpos químicos que se agregan a los líquidos para
dosar, con el fin de ver el momento preciso del término de la reacción; manifestándose
por la aparición, desaparición o modificación del color.

DETERMINACIÓN DEL pH MEDIANTE EL USO DEL PAPEL INDICADOR:

Papel Indicador: Es un papel especial que contiene absorbidos indicadores en serie o
a lo largo, que al ponerse en contacto con la solución a evaluar da un color que
corresponde al pH aproximado de la solución problema.

DETERMINACIÓN DE pH MEDIANTE EL POTENCIÓMETRO O pHMETRO:

Se fundamenta en la generación de una diferencia de potencial que se establece
cuando se emplean dos soluciones ionizadas de diferente concentración en las cuales
se hace pasar una corriente eléctrica, es decir la diferencia de potencial es
proporcional a la diferencia de concentración(es) entre las soluciones.

III. MATERIALES
 Potenciómetro
 Beacker 100Ml
 Matraz 100mL
 Anaranjado de metilo
 Papel tornasol azul
 Papel tornasol rojo
 Bureta 25mL
 Pipetas 1mL, 2mL, 5 mL, 10mL
 Soporte universal y pinzas
 Fenolftaleína
 NaOH
 HCl
 Tubos y gradillas.
IV. PROCEDIMIENTO
1. Identificación de pH con Papel Tornasol:

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 Con la ayuda de un gotero o una bagueta coloca en una placa de toques unas
gotas de cada muestra.
 Enfrenta la solución al papel de tornasol (rojo/azul) y tabula tus resultados.

2. Identificación de pH con Reactivo Indicador de Fenolftaleína:

 En tubos de ensayo coloca 01 mL de muestra problema y dilúyela con 01 mL de

agua destilada.
 Adiciona a cada tubo II gotas de Reactivo Indicador de Fenolftaleína.
 Tabula tus resultados.

3. Identificación de pH con Papel Indicador 1-14:

 Con la ayuda de un gotero o una bagueta coloca en una placa de toques unas
gotas de cada muestra.
 Enfrenta la solución al Papel Indicador y con la ayuda de la cartilla de referencia
identifica la naturaleza ácida o básica de las soluciones.
 Tabula tus resultados.

4.- Identificación de pH con el uso del pHmetro.

 Con los estándares de pH verifica la calibración del pHmetro.
 En un beacker limpio y seco, coloca una muestra de 150 mL de orina y sumerge el
electrodo del pHmetro.
 Anota el pH de la muestra y compárala con los resultados anteriores.

V. TRABAJO
1. Mencione el pH normal de: Sangre, orina, líquido seminal, líquido cefalorraquídeo,
líquido amniótico, saliva y su correlación con alguna patología.

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PRÁCTICA 02:
ENZIMAS Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

I. OBJETIVOS
 Identifica la presencia de la enzima catalasa en tejidos animales y vegetales.
 Relaciona la acción de la temperatura con la actividad enzimática.
 Identifica la acción hidrolítica del enzima amilasa.

II. FUNDAMENOS
Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas,
siempre que sea termodinámicamente posible. En estas reacciones, las enzimas
actúan sobre una molécula denominada sustrato; las cuales se convierten en
moléculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en la célula
necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones
mediadas por enzimas se les denomina reacciones enzimáticas.

III. MATERIALES
 Gradillas
 Tubos De Ensayo
 Mechero
 Pipeta 2 Ml
 Pipeta 5 Ml
 Beacker 250 Ml
 Tripode
 Malla De Asbesto
 Bureta
 Propipeta
 Trozos De Papa
 Trozos De Hígado De Pollo
 Mortero Y Pilon
 Peroxido De Hidrógeno
 Agua Destilada
 Beacker 50 Ml
 Acido Clorhidrico 0.5 N
 Arena Fina
 Solucion De Almidon 1%
 Reactivo De Lugol
 Reactivo De Benedict
 Pinza De Madera

IV. PROCEDIMIENTO

1. RECONOCIMIENTO DE LA CATALASA:
La catalasa es un enzima que se encuentra en las células de los tejidos animales y
vegetales.
La función de ésta enzima en los tejidos es necesaria porque durante el metabolismo
celular, se forma una molécula tóxica que es el peróxido de hidrógeno. (H2O2)

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Esta enzima, la catalasa, lo descompone en agua y oxígeno, por lo que se soluciona el

problema.
La reacción de la catalasa es la siguiente:

La existencia de la catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para utilizar el agua

oxigenada como desinfectante cuando se echa sobre una herida. Como muchas
bacterias son anaeróbicas (no pueden vivir con oxígeno), mueren con el
desprendimiento de oxígeno que se produce cuando la catalasa de los tejidos actúa
sobre el agua oxigenada.
DESARROLLO:
 Rotula tres tubos de prueba con las letras A,B y C.
 Colocar en el tubo A un pedazo de hígado del tamaño de un frijol, en el tubo B un
tamaño similar de papa y en el C arena.
 Anadir 03 mL de agua oxigenada a cada tubo.
 Observa, anota e interpreta los resultados.

2. REUTILIZACIÓN DEL ENZIMA:

 Rotula dos tubos con las letras D y E.
 Sacar 02 mL del sobrenadante del tubo A.
 Verter 01 mL de dicho sobrenadante en D y 01 mL en E.
 Anadir al tubo D un pedazo de hígado fresco y al tubo E 01 mL de agua oxigenada.
 Observa, anota e interpreta los resultados.

3. DESNATURALIZACION DE PROTEÍNAS:
 Colocar en un tubo de ensayo un trocito de hígado entero.
 Poner el tubo a baño maría con agua en ebullición durante 05 minutos.
 Retirar el tubo
 Añadir 02 mL de agua oxigenada.
 Observar anotar e interpretar los resultados.
 Repetir la experiencia con papa.
4. HIDRÓLISIS DEL ALMIDON POR ACTIVIDAD DE LA AMILASA.
COLECCIÓN DE SALIVA: Antes de la colección se procederá a un enjuague simple
de la cavidad oral con agua; manteniendo la boca cerrada esperará entre 5 a 7
minutos evitando hablar y pasar la saliva. La colección se realizará en un recipiente de
boca ancha (beacker) dejando caer por gravedad la saliva, evitando así la formación
de espuma.
DILUCIÓN DE LA SALIVA: En un tubo de ensayo colocar 01 mL de saliva y agregar
04 mL de agua destilada. Mezclar por inversión. Se obtiene así la saliva diluida.

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Incubar a baño María de 37ᵒ C por 10 minutos. Luego retirar el tubo y agitando
previamente los tubos de digestión preparar las siguientes baterías:
REACCIÓN DE LUGOL:

Mezclar, observar, anotar e interpretar los resultados.

REACCIÓN DE BENEDICT.

Colocar a Baño de agua hirviente por 05 minutos. Observe, anote e interprete los
resultados.

V. TRABAJO

1. ¿Cuáles son los productos finales de la digestión del almidón por la amilisa?
2. ¿Qué función cumple el HCl 0.5 N en el tubo de digestión?

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PRÁCTICA 03:
OBTENCIÓN DE DNA DE BAZO.

I. OBJETIVOS
 Extrae DNA del bazo.

II. FUNDAMENOS
Cuando se desea purificar una sustancia se deben seleccionar las células o tejidos
que se van a utilizar como materia prima. En el caso del DNA esta selección es en
especial importante porque el contenido de DNA es pequeño en la mayor parte de las
células. La célula ideal será aquella que tenga una relación núcleo/citoplasma alta,
como en los linfocitos y células del tumor ascítico de Ehrlich. Sin embargo, no es
fácil obtener este tipo de células por lo que frecuentemente se usan órganos
típicamente linfoides como el timo y el bazo.
El primer paso en la extracción del DNA es la homogeneización del tejido. Este
paso puede degradar en parte la molécula del DNA si no se toman las precauciones
necesarias, la solución reguladora es de citrato 0.01M y NaCl 0.14M, a pH de 7.2 a
7.4; la fuerza iónica de esta solución hace insoluble a la desoxirribonucleoproteína.
Si se centrifuga este homogeneizado, en el residuo quedarán los restos celulares y
las desoxirribonucleoproteínas insolubles. En el sobrenadante se encuentran
compuestos solubles como la mayor parte de los ácidos ribonucléicos.
Al homogeneizar el tejido se liberan las enzimas de los lisosomas, entre ellas la
DNAasa, la cual hidroliza el DNA. Se sabe que el Mg++ es indispensable para la
actividad de esta enzima; si en la solución existe citrato, éste se une al Mg++ e
impide la acción de la DNAasa. Otra forma de evitar la acción hidrolítica de la enzima
es trabajar a temperaturas bajas (0°C a 2°C).
El siguiente paso en la purificación está basado en que las
desoxirribonucleoproteínas y el DNA son solubles en soluciones salinas
concentradas, mientras que la mayor parte de las proteínas precipitan en estas
condiciones. Si el residuo se suspende en solución de NaCl 2.6M y se centrifuga, el
residuo insoluble estará formado fundamentalmente por proteínas, mientras que el
DNA permanecerá en solución. Este DNA se puede precipitar selectivamente por la
adición selectiva de 2 volúmenes de alcohol etílico al 95% formándose un precipitado
blanco fibroso, el cual se puede recoger por rotación de un agitador de vidrio con
pequeños salientes.

III. MATERIALES
 Solución De Citrato 0.01 M
 Solucion De Nacl 0.14 M.
 Centrifuga
 Tubos De Centrífuga
 Hielo Seco
 Solución De Nacl 2.6 M.
 Alcohol Etilico 95 %
 Baguetas
 Beacker 250 Ml
 Beacker 50 Ml
 Gradilla
 Papel Filtro
 Aro De Metal

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 Soporte Universal
 Pinza Y Nuez.
 Equipo De Disección.
 Licuadora.
 Embudo De Vidri

IV. PROCEDIMIENTO

 La muestra de bazo se coloca en un mortero, previamente enfriado y se secciona lo

más finamente posible con una tijera. Se colocan 450 mL de la solución reguladora de
citrato 0.01M – NaCl 0.14M, a pH de 7.2 fría, en una licuadora cuyo vaso haya sido
previamente enfriado.
 Se hace funcionar la licuadora a baja velocidad y se van añadiendo los trozos de
bazo de todos los equipos, esperando a que se homogeneice completamente el
primero antes de añadir el segundo y así sucesivamente.
 Una vez terminada la adición, continúe homogeneizando por 30 – 60 segundos
más.
 Utilizando la centrifuga automática refrigerada, se coloca el homogeneizado en
tubos de centrífuga apropiados teniendo cuidado de tarar perfectamente los tubos
opuestos. ¡PRECAUCIÓN! (CONSULTE AL PROFESOR).
 Se centrifuga por 15 minutos a 5 000 rpm. El sobrenadante se desecha.
 El residuo insoluble se lava en el mismo tubo con 15 mL de citrato 0.01M – NaCl
0.14M, pH 7.2, agitando hasta volver a resuspender con ayuda de una varilla de vidrio,
si es necesario.
 Se vuelve a centrifugar a 5 000 rpm por 5 minutos y el sobrenadante se desecha.
 Al residuo insoluble que contiene el DNA y residuos celulares se le añaden 15 mL
de NaCl 2.6M frío y se homogeneiza por agitación.
 El ácido desoxirribonucléico es soluble en esta solución mientras que la mayor
parte de las proteínas son insolubles.
 Centrifugue a 8 000 rpm por 30 minutos. El líquido sobrenadante contiene el DNA
en solución y el sedimento, que contiene restos celulares y proteínas insolubles, se
desecha.
 La solución salina sobrenadante se coloca en un vaso de precipitados y se añaden
lentamente dos volúmenes de alcohol etílico al 95%, procurando que la fase alcohólica
quede en la parte superior.
 Se deberá observar la formación de un precipitado blanco, denso, en la interfase.
Utilizando un agitador con pequeños salientes, agite esta mezcla lentamente
procurando enrollar sobre el agitador las fibras del DNA precipitadas.

V. TRABAJO

1. Explique por qué se utilizó bazo como materia prima y no otro órgano cualquiera.
2. ¿Sería conveniente utilizar solución reguladora de fosfatos para la extracción del
DNA? ¿Por qué?
3. ¿Por qué es conveniente trabajar durante toda la extracción a baja temperatura?

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PRÁCTICA 04:
INTRODUCCIÓN A LA ESPECTROFOTOMETRIA
I. OBJETIVOS
II. FUNDAMENOS
Se denomina Análisis Colorimétrico al conjunto de métodos de análisis cuantitativos
que se fundamentan en la medición de la intensidad de la luz transmitida a través de
una solución coloreada, ya sea que se trate de sustancias naturalmente coloreadas ò
que se han hecho de tal calidad mediante reacciones químicas adecuadas.
Cuando una haz de luz (luz incidente, Io) atraviesa una solución, una parte de la
radiación queda absorbida por las moléculas del soluto coloreado, sufriendo una
reducción de su intensidad (Luz transmitida, I), proporcional a la capacidad de
absorción de dichas moléculas.

Casi todas las sustancias en solución tienen la capacidad de absorber en forma

selectiva determinadas radiaciones luminosas unas más que otras dejándolas pasar.
La longitud de onda en la que las moléculas de dicha sustancia absorbe con mayor
intensidad la luz, se denomina “longitud de máxima absorción” o “lambda máximo”.
Si consideramos que cada molécula absorbe una determinada cantidad de luz, la
intensidad de la luz transmitida por una solución disminuirá en relación con el aumento
del número de moléculas que se interpongan entre la fuente luminosa y el observador.
Este número varía de acuerdo con la concentración del soluto y el espesor del
recipiente que contiene la solución, estos factores están considerados en la “Ley de
Lambert y Beer”, que rige los principios de la Espectrofotometría y cuyas formas de
expresión son:

Donde:
Io = Intensidad de la luz incidente.
I = Intensidad de la luz transmitida.
E = Coeficiente de extinción molar, valor constante dependiendo de la naturaleza de la
Sustancia y de la longitud de onda
I = Espesor del recipiente en cm.
C = Concentración de la solución.
A = D.O. = Absorbancia (A) aumenta conforme disminuye la Transmitancia (T) y la
relación entre ambas es logarítmica.

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CALCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE UNA SOLUCION PROBLEMA:

Para calcular la concentración de una solución problema con el empleo de un
Espectrofotómetro, existen dos formas:
- Método de la curva standard o curva de calibración.
- Factor de calibración.
a) CURVA STANDARD.- Este método consiste en utilizar varios estándares de
concentraciones conocidas y progresivas para luego construir un gráfico en un sistema
de coordenadas en el que se colocan las lecturas en las ordenadas (Eje Y) y las
concentraciones en las abscisas (Eje X). En la recta obtenida (Función lineal), se
puede extrapolar la absorbancia o densidad óptica de la muestra problema, hallando la
concentración de la misma en el eje de las abscisas.
b) FACTOR DE CALIBRACIÓN.- (Fc), El factor de calibración es un término que se
relaciona con la concentración de una sustancia con su absorbancia, es decir la
intensidad que absorbe una sustancia de concentración conocida (Standard o Patrón).
Así tenemos:
Fc = [ Standard ] / A
Donde:
Fc = factor de calibración.
A = absorbancia del tubo standard.
[Standard] = concentración del standard.

Con el factor de calibración se puede fácilmente determinar la concentración de una

muestra desconocida o problema (MP), conociendo su absorbancia.
Si la muestra problema y el standard son procesados de la misma manera (diluciones)
se podrá usar directamente la siguiente fórmula:
[ MP ] = A. Fc
Si la muestra problema sufre diluciones previas se encontrará el factor de dilución (Fd)
que es matemáticamente la inversa de la dilución (dil) y esta a su vez es:
Dil = Vol / Vol o
Donde:
Vol = Volumen de la muestra problema tomada para hacer la dilución.
Vol o = Volumen total.
Para este segundo caso cuando se quiere saber la concentración de una muestra
problema se procederá usando la siguiente fórmula:
[ MP ] = A. Fc. dil
Donde:
A = Absorbancia de la muestra problema.
Fc = Factor de calibración.
Dil = Factor de dilución.
[MP] = Concentración de la muestra.

III. MATERIALES
 Bicromato de Potasio 80 %.
 espectrofotómetro
 H2O destilada
 Gradillas
 Tubos De Ensayo
 Pipeta 2 Ml
 Pipeta 5 Ml
 Beacker 250 Ml

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 Propipeta
 Fiolas
 Picetas
 Tubo
 Gradillas

IV. PROCEDIMIENTO
Preparar la siguiente batería de tubos:

Solución stock: Bicromato de Potasio 80 mg%.

Calcular la concentración en mg% de bicromato de K en cada uno de los tubos
Standard (I-II-II-IV).
Leer las absorbancia de los cuatro tubos a 350 nm de longitud de onda (‫ )ג‬en el
espectrofotómetro contra el H2O destilada (Abs. H2O=0).
2. Con los datos obtenidos construir en un papel milimetrado la gráfica de absorbancia
en el eje de las Ordenadas vs concentración de bicromato de K en el eje de las
Abscisas.
3. Una vez obtenida la curva de calibración, medir la absorbancia de la muestra
problema (Problema X).
4. Obtener el factor de calibración (Fc) promedio con las soluciones standard y sus
Absorbancia utilizadas para construir las curvas de calibración ajustadas.
5. Calcular la concentración de la muestra problema por los siguientes métodos:
A.- Gráficamente extrapolando su absorbancia en la curva de calibración.
B.- Usando Factor de Calibración, multiplicando su absorbancia por el factor de
calibración del standard.

V. TRABAJO
1.- Explique el mecanismo de funcionamiento de un espectrofotómetro.
2.- ¿Qué diferencias existen entre un fotocolorímetro y un espectrofotómetro?.
3.- Grafique el espectro de luz, tanto en el rango visible como no visible con sus
respectivas longitudes de ondas.
4.- Qué relación matemática existe entre Absorbancia y Transmitancia?

5.- Construya una curva de calibración con los siguientes valores:

Con la curva obtenida hallar la concentración de las siguientes muestras, sabiendo

que sus absorbancia fueron:
Muestra A........................0.015

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Muestra B........................0.125
Muestra C........................0.350

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PRÁCTICA 05:

DETERMINACIÓN DE GLICOSURIA
I. OBJETIVOS
II. FUNDAMENOS
En estado normal no existen cantidades detectables de glucosa en orina, por lo menos
con los métodos habitualmente utilizados en el laboratorio. La glucosuria (presencia de
glucosa en orina) se presenta en la diabetes Mellitus pero cuando se supera el umbral
renal de glucosa que ocurre cuando la glicemia es mayor de 180 mg/dl.
Para la detección cualitativa de glucosa en orina se basa en la acción de la glucosa,
que reduce las sales de cobre en medio alcalino por ebullición. Para ello utilizaremos
el reactivo de Benedict el cual contiene: sulfato de cobre, citrato de sodio y carbonato
de sodio.

III. MATERIALES
 Tubos de ensayo de 20 ml.
 Pipetas.
 Mechero de Bunsen.
 Reactivo de Benedict.
 Pinzas porta tubos.

IV. PROCEDIMIENTO
Calentar directamente a la llama de un mechero hasta la ebullición de la mezcla en
cuestión. Si la orina contiene glucosa, se observa un precipitado color verde, amarillo ò
rojo ladrillo dependiendo de la cantidad en que se halle presente la glucosa en la orina.
De ser negativa la reacción permanecerá de color azul.

V. TRABAJO
1.- ¿Qué es la diabetes Mellitus y como se diagnostica desde el punto de vista del
laboratorio?
2.- Explique en qué consiste el umbral renal y la tasa de reabsorción de la glucosa.
3.- Describa los métodos que existen para el dosaje de la glicemia.
4.- Explique el mecanismo de acción de los reactivos de Benedict y de Fehling.
5.- ¿Qué son la hemoglobina glicosilada y la fructosamina y cuál es su importancia en
la diabetes?

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PRÁCTICA 06:

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE GLUCOSA EN SANGRE.

I. OBJETIVOS
II. FUNDAMENOS
Como se ha indicado, la diabetes dependiente de insulina cursa con un aumento de la
concentración de glucosa en sangre (glicemia), que se produce de manera repentina y
además es severa. Una hiperglucemia superior a 124 mg/dl detectada en más de una
ocasión en ayunas, además se considera también un valor mayor a 200 mg/dl en
cualquier momento son indicativos de posible diabetes, diagnóstico que debe
confirmarse con otras pruebas.
La determinación de glucosa sanguínea es una prueba muy frecuente en bioquímica y
se puede llevar a cabo tanto por métodos químicos como enzimáticos, siendo estos
últimos los más específicos.
Hay dos tipos de métodos químicos:
a. Reducimétricos, que se basan en la capacidad reductora de la glucosa. Debido a la
presencia en la muestra de otros compuestos reductores, estos métodos dan cifras
superiores a las correspondientes a la glucosa verdadera. Ejemplos son el método de
Folin-Wu y el de Somogy-Nelson.
b. Furfurálicos: se basan en la capacidad de la glucosa para formar furfural al sufrir
deshidratación en un medio ácido. Un ejemplo es el método que emplea orto-toluidina.

En cuanto a los métodos enzimáticos:

a. Método de la hexoquinasa: emplea las enzimas hexoquinasa y glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa. Por cada molécula de glucosa se forma una de NADPH, que puede
medirse espectrofotométricamente a 340 nm. Es el método de referencia
recomendado por las organizaciones internacionales.
b. Método de glucosa oxidasa y peroxidasa (GOD-POD): es el que se utiliza en esta
práctica para medir los niveles de glucosa sanguínea de la muestra problema y de los
estándares. Se explica a continuación:
En el método GOD-POD, en un primer paso la glucosa oxidasa cataliza la oxidación
de la D-glucosa a ácido D-glucónico con formación de peróxido de hidrógeno. Éste es

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utilizado por la peroxidasa para oxidar a la 4-aminofenazona y al fenol, dando lugar a

una quinonaimina coloreada. La intensidad de color será proporcional a la
concentración de glucosa presente inicialmente. El esquema de la reacción es el
siguiente:

III. MATERIALES
 Tubos de ensayo de 10 ml.
 Pipetas.
 Espectrofotómetro.
 Agua destilada.
 Solución patrón de glucosa (100 mg/dl).
 Reactivo de color de glucosa, que contiene: Glucosa oxidasa, peroxidasa, 4-
aminofenazona, fenol, tampón fosfato pH: 7.0

IV. PROCEDIMIENTO
La muestra de sangre extraída del paciente será centrifugada y se separará el suero.
Hacer una dilución del suero midiendo exactamente en un tubo de ensayo 0.2 ml de
suero y agregar 4.8 ml de agua destilada, mezclar hasta homogenizar. Luego se
preparan los siguientes tubos:

Incubar los tres tubos en Baño María de 37ºC por 10 minutos. Mezclar bien la
solución. Leer las absorbancias en el espectrofotómetro a 505 nm.

V. TRABAJO
Encontrar la concentración de glucosa en la muestra utilizando el método del factor de
calibración.
VALORES NORMALES
La glicemia normal en ayunas es de 70 a 110 mg/dl.

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PRACTICA 7
ÍNDICE GLICÉMICO Y GLUCOSA POST PRANDIAL

I. OBJETIVOS
II. FUNDAMENOS
Definición de DM
La diabetes Mellitus es un grupo de enfermedades metabólicas caracterizadas por la
presencia de hiperglucemia resultante de un defecto en la secreción de insulina, en la
acción insulínica, o en ambas.
Clasificación de DM

Diagnóstico
Es muy importante el diagnóstico temprano de la enfermedad debido a que niveles
elevados de glucosa, aún cercanos al límite superior normal, producen daños en la
microvasculatura de retina y riñón

Existen otras entidades fisiopatológicas relacionadas con hiperglucemia que no llegan

a cumplir los criterios de diabetes pero que son muy importantes ya que deben ser
vigiladas ya que estos pacientes presentan riesgo elevado de evolucionar a diabetes.
Estas son la tolerancia disminuida a la glucosa y la glucosa en ayunas anormal.

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Tolerancia disminuida a la glucosa es aquel caso cuando después de una prueba

de tolerancia con 75 g de glucosa se obtienen a las dos horas valores mayores a 140 y
menores a 200 mg/dl.
La glucosa anormal en ayunas es aquel caso en que los valores en ayunas son
mayores a 110 pero menores a 126 mg/dl.

TEST DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA Y GLUCOSA POSTPRANDIAL

FUNDAMENTO TEÓRICO
Las pruebas de tolerancia a la glucosa oral fueron utilizadas por mucho tiempo para
diagnóstico de Diabetes Mellitus o intolerancia disminuida, pero ya no se utilizan de
rutina, pero si pueden servir tanto para la Diabetes como para la intolerancia.
Importante es recalcar que los niveles importantes en ambos casos son los obtenidos
a las dos horas, y que la cantidad de glucosa a ingerir debe ser de 75 gramos. El
disolver 75 gramos en por lo menos 300 ml de agua hace la solución más agradable al
paladar y por lo tanto tendrán más aceptación por parte del paciente.

En caso de la prueba de tolerancia de 75 gramos en adultos en niños se debe utilizar

una cantidad de glucosa correspondiente al peso del niño (1,75 g de glucosa por Kg
de peso). Es de suma importancia recordar que antes de iniciar cualquier prueba de
tolerancia a la glucosa oral, se debe pedir una muestra de orina al paciente, para
hacerle un análisis cualitativo glucosa. Esto debido a que si el paciente presenta
glucosuria, no se debe realizar la prueba de tolerancia, ya que la glucosuria indica en
la gran mayoría de los casos, niveles sanguíneos de glucosa elevados y la ingesta de
altas concentraciones de glucosa le podría provocar al paciente un shock
hiperglicémico.
Existen otras pruebas de tolerancia que son aceptadas tanto por la Organización
Mundial de la Salud como por la American Diabetes Association, estas son las
relacionadas con la Diabetes Mellitus Gestacional.
La curva de tolerancia a la glucosa para tamiz de la DMG consiste en la ingesta en
ayunas de 50 gramos de glucosa, se mide la glicemia a la hora, si los niveles son
menores a 140 mg/dl se desecha la DMG, si los niveles son iguales o mayores a 140
mg/dl se debe proceder a hacer la prueba confirmatoria para DMG. Esta consiste en
ingerir en ayunas 100 gramos de glucosa y hacer una curva de tres horas. Si dos de
los niveles obtenidos en dicha curva sobrepasan los valores indicados en la siguiente
tabla, se hace el diagnóstico de DMG.

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La prueba de glucosa postprandial viene a ser una prueba de tolerancia a la glucosa

acortada, donde solo se considera el valor basal y el de las dos horas.

III. MATERIALES
 Tubos de ensayo de 5 ml.
 Micro pipetas automáticas de 10 ul.
 Espectrofotómetro.
 Solución patrón de glucosa (100 mg/dl).
 Reactivo de color de glucosa, que contiene: Glucosa oxidasa, peroxidasa, 4-
aminofenazona, fenol, tampón fosfato pH: 7.0

IV. PROCEDIMIENTO
Se determinará la glicemia en muestras obtenidas a una persona en forma basal, a los
30 min, 60 min y 120 min. Luego de tomar la muestra sanguínea basal se le da de
tomar al paciente 75 gr de glucosa disuelto en 300 mL de agua con unas gotas de
limón. Las muestras de sangre extraídas de la persona serán centrifugadas y se
separarán los sueros. Para la determinación de las glicemias se utilizará el método de
la glucosa oxidasa – peroxidasa (GOD-POD).

Incubar los tubos en Baño María de 37ºC por 10 minutos. Leer las absorbancias para
cada una de los tubos en el espectrofotómetro a 505 nm.

V. TRABAJO

1. Encontrar la concentración de glucosa en cada una de las muestras utilizando el

método del factor de calibración.
2. Con los datos de glicemia obtenidos en el experimento construir en un papel
milimetrado una gráfica de tiempo vs. Glicemia y apreciar la curva de tolerancia a la
glucosa.
3. Como sería esta curva en el caso de una persona normal, un diabético y un
intolerante a la glucosa.
4. ¿Qué importancia tiene la detección de micro albuminuria en una persona?
5. ¿Qué son y en qué casos se hace un dosaje de péptido C y de insulina en un
paciente diabético.
6. ¿Cuáles son las complicaciones agudas y crónicas de la diabetes?

PRACTICA Nº 8:

Q.F. Sháneri Marcilla Truyenque MC 18

 [Seleccionar fecha] BIOQUIMICA I

DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE COLESTEROL

I. OBJETIVOS:
II. FUNDAMENOS
El nivel sérico de colesterol ha sido objeto en los últimos años de numerosas
investigaciones tanto en individuos sanos como enfermos.
Desde un punto de vista médico la determinación de colesterol en forma aislada
tiene utilidad diagnóstica limitada. Sin embargo, su concentración varía de manera
más o menos predecible en un gran número de condiciones clínicas. Se ha visto
que el colesterol es uno de los factores contribuyentes a la formación de ateromas
dado que las complicaciones arterioescleróticas prevalecen en individuos
hipercolesterolemicos.
Diversos estudios epidemiológicos han permitido observar además, que el riesgo
de contraer enfermedad cardíaca coronaria (ECC) para los individuos (varones de
más de 40 años) con colesterolemia menor ò igual a 200 mg% es 3 veces menor
que entre individuos con más de 230 mg% y 6 veces menor que entre individuos
con más de 260 mg%.
Sin embargo, actualmente se sabe que es necesario conocer además la
distribución de las lipoproteínas encargadas del transporte: HDL (lipoproteínas de
alta densidad), considerada como el “factor protector” y LDL (lipoproteínas de baja
densidad), consideradas como el verdadero “factor de riesgo”. Las funciones
biológicas inherentes a los distintos grupos de lipoproteínas, las variaciones en su
composición y los resultados de los diversos estudios epidemiológicos, indican que
los valores aislados de colesterol HDL y colesterol LDL no pueden tomarse como
índices predicativos de riesgo, sino que es necesario conformar un perfil Lipidico
con los valores de colesterol total, colesterol LDL y colesterol HDL.

Experimento A:
DETERMINACIÓN DE COLESTEROL EN SUERO
El colesterol es oxidado enzimáticamente por la colesterol oxidasa (CHOD), previa
hidrólisis enzimática de los esteres mediante una lipasa de origen fungal. El agua
oxigenada generada en la oxidación, produce la copulación oxidativa del fenol con
la 4-aminofenazona (4-AF) mediante una reacción catalizada por la peroxidasa. El
producto es una quinonaimina roja con absorbancia máxima a 505 nm.

Experimento B:
DETERMINACIÓN DE COLESTEROL HDL EN SUERO
FUNDAMENTOS DEL METODO:

Q.F. Sháneri Marcilla Truyenque MC 19

 [Seleccionar fecha] BIOQUIMICA I

Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) se separan precipitando selectivamente

las lipoproteínas de baja y muy baja densidad (LDL y VLDL) mediante el agregado
de Sulfato de Dextrán de PM 500,000 en presencia de iones Mg++.
En el sobrenadante separado por centrifugación, quedan las HDL y se realiza la
determinación del colesterol ligado a las mismas, empleando el sistema más
conveniente.

Experimento C:
DETERMINACIÓN DE COLESTEROL LDL EN SUERO
Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) se separan del suero precipitándolas
selectivamente mediante el agregado de polímeros de alto peso molecular. Luego de
centrifugar, en el sobrenadante quedan las demás lipoproteínas (HDL y VLDL), el
colesterol ligado a las mismas se determina empleando el sistema más conveniente.
Por diferencia entre el colesterol total y el determinado en el sobrenadante, se obtiene
el colesterol unido a las LDL.

III. MATERIALES
Experimento A: REACTIVOS:
Standard: solución de colesterol 200 mg%
Enzimas: suspensión conteniendo lipasa fungal (300 U/ml), colesterol oxidasa (3
U/ml) y peroxidasa (20 U/l).
Reactivo 4-AF: solución de 4-aminofenazona (25 mmol/l).
Reactivo Fenol: solución de fenol (55 mmol/l).
Reactivo de trabajo: de acuerdo al volumen de trabajo colocar en una probeta 50
partes de agua destilada, 5 partes de reactivo 4-AF, 5 partes de reactivo fenol y
llevar a 100 partes con agua destilada. Agregar 2 partes de enzimas previamente
homogenizadas. Mezclar por inversión, sin agitar.

Experimento B:REACTIVOS:
REACTIVO PRECIPITANTE.- Contiene una solución de Sulfato de Dextrán y de
Cl2Mg.H2O

Experimento C: REACTIVOS:
REACTIVO PRECIPITANTE.- Solución de sulfato de polivinilo disuelto en
polietilenglicol (PM 600).

IV. PROCEDIMIENTO
Experimento A:
En tres tubos colocar:

Incubar 15 minutos en Baño María a 37ºC.

Leer en el espectrofotómetro a 505 nm.

CALCULO DE RESULTADOS:

Q.F. Sháneri Marcilla Truyenque MC 20

 [Seleccionar fecha] BIOQUIMICA I

Calcular la concentración de colesterol total en suero, aplicando el método del

factor de calibración.
Recordar que la concentración del standard de colesterol es de 200 mg%
VALORES DE REFERENCIA:
Los valores de colesterol en sangre fluctúan según edad, sexo y hábitos de dieta y
de ejercicio. Sin embargo, es preferible no hacer referencia a valores “normales”,
pues la norma promedio de una población no necesariamente refleja ausencia de
riesgo patológico en el caso de colesterol.
Menos de 200 mg% valor deseable
200 a 239 mg% valor frontera
Mayor de 240 mg% valor alto

Experimento B:
En un tubo medir 0.5 ml de muestra y agregar 0.05 ml (50 ul) de Reactivo
Precipitante.
Homogenizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos.
Dejar 30-40 minutos en refrigeración (4-10°C). No colocar en el congelador.
Centrifugar a 3000 rpm. X 03 minutos
Usar el sobrenadante como muestra.

En tres tubos colocar:

Incubar 15 minutos en Baño María a 37ºC.

Leer en el espectrofotómetro a 505 nm.
CALCULOS:
De acuerdo al método del factor de calibración, considerando que la concentración
del standard es de 45.7 mg%.
VALORES NORMALES:
40 – 65 mg%
Experimento C:
En un tubo, colocar 0.2 ml (200 ul) de suero problema y añadir 0.1 ml (100 ul) de
Reactivo Precipitante.
Homogenizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos.
Dejar 15 minutos en un baño de agua a 20-25°C.
Centrifugar a 3000 rpm. X 03 minutos
Usar el sobrenadante como muestra.

Incubar 15 minutos en baño de agua a 37ºC.

Leer en el espectrofotómetro a 505 nm.

Q.F. Sháneri Marcilla Truyenque MC 21

 [Seleccionar fecha] BIOQUIMICA I

CALCULOS:
LDL Colesterol = Colesterol total - (Abs muestra neta x factor de calibración)
La concentración del standard es de 62.4 mg%.
VALORES NORMALES:
Riesgo bajo o nulo: Menor de 140 mg%
Riesgo moderado: 140 a 190 mg%
Riesgo elevado : Mayor de 190 mg%

V. TRABAJO
1.- Qué es RIESGO CORONARIO y como se calcula?
2.- Explique que diferencias hay entre la arterioesclerosis y la ateroesclerosis?
3.- Describa como se produce la biosíntesis de colesterol dentro del organismo.
4.- Explique que es el colesterol VLDL y como se calcula.
5.- Que rol cumplen los triglicéridos y como se realiza su metabolismo.

Q.F. Sháneri Marcilla Truyenque MC 22

 [Seleccionar fecha] BIOQUIMICA I

PRACTICA Nº 9:
DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE TRIGLICERIDOS

I. OBJETIVOS
II. FUNDAMENOS
Los triglicéridos forman la mayor parte del peso seco del tejido adiposo,
constituyendo por lo tanto una potente forma de almacenamiento de energía.
El movimiento de ácidos grasos entre los distintos compartimientos del organismo,
se produce con gran rapidez en respuesta a diversos estímulos (dieta, actividad
física, stress, edad, etc.). Por este motivo es de esperar que los triglicéridos (uno
de los más importantes vehículos para el transporte de ácidos grasos) varíen
también su concentración en respuesta a estos factores fisiológicos.
Sin embargo, el equilibrio de estos mecanismos puede verse alterado,
conduciendo a niveles anormales de triglicéridos circulantes. La persistencia de
esta condición, se asocia con numerosas patologías, tales como enfermedad
hepática, renal, Hiperlipidemias esenciales, etc.
Un caso que resulta de particular interés es el aumento de triglicéridos en
individuos obesos, en los cuales tiene importancia pronostica, respecto a la
probabilidad de desarrollar enfermedad cardíaca coronaria. Alrededor del 50% de
los lípidos de las lesiones ateromatosas que ocurren en las arterias coronarias son
triglicéridos, por lo que es posible relacionar a los triglicéridos con la patogénesis
de la arteriosclerosis coronaria. Este punto de vista está sustentado por el hecho
de que un gran porcentaje de pacientes con infarto de miocardio también exhiben
Hipertrigliceridemia.
Para la determinación de triglicéridos en suero se usará la determinación
enzimática de glicerol a partir de glicéridos.
Los métodos enzimáticos se basan en la determinación del glicerol contenido en
las moléculas de los triglicéridos, tras la hidrólisis (química ò enzimática) para
remover los ácidos grasos. La determinación enzimática del glicerol ha sido usada
durante muchos años; sin embargo, en estos métodos se empleaba la hidrólisis
alcalina de los triglicéridos. El reciente desarrollo del uso de enzimas (lipasa,
usualmente combinada con una proteasa) para catalizar la hidrólisis, ha
posibilitado el empleo de métodos directos, rápidos y específicos. Los sistemas
totalmente enzimáticos eliminan el uso de reactivos cáusticos, extracción con
solventes, baños de altas temperaturas y mezclas de adsorción para la remoción
de Fosfolípidos. Estudios recientes se han concentrado en desarrollar reactivos
con lipasas, que hidrolizan completamente los triglicéridos.

Experimento A:
DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS EN SUERO
FUNDAMENTOS DEL METODO:
Se producen reacciones químicas basadas en la determinación química de glicerol a
partir de glicéridos.
La primera etapa consiste en que los triglicéridos son hidrolizados enzimáticamente
por una lipoproteína lipasa específica, produciendo glicerol y ácidos grasos.

Q.F. Sháneri Marcilla Truyenque MC 23

 [Seleccionar fecha] BIOQUIMICA I

En una segunda etapa el glicerol se fosforila a glicerol-1-fosfato en presencia de

glicerolkinasa.

En una tercera etapa el derivado fosforilado se oxida mediante la glicerol fosfato

oxidasa (GPO), con producción de agua oxigenada.

Finalmente el agua oxigenada así formada produce la unión oxidativa del fenol y la 4-
aminofenazona, en reacción catalizada por la peroxidasa (POD), con formación de una
quinonaimina roja.

III. MATERIALES
- Espectrofotómetro.
- Probeta, micro pipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.
- Frasco de vidrio color ámbar.
- Cubetas espectrofotométricas.
- Baño de agua a 37ºC.
- Reloj ò timer.
- Standard: solución acuosa de glicerol equivalente a 200 mg% de triglicéridos.
- Buffer: solución de buffer conteniendo clorofenol a pH 7,5.
- Enzimas: Viales conteniendo lipoproteína lipasa, glicerol kinasa (GK), glicerol fosfato
oxidasa (GPO), peroxidasa (POD), adenosina trifosfato (ATP) y 4-aminofenazona (4-
AF).

INSTRUCCIONES DE RECONSTITUCION Y MEZCLADO:

- Standard: listo para usar.
- Reactivo de trabajo:
*5/10 x 20 ml: agregar 20 ml de Buffer a un vial de Enzimas.
Mezclar hasta disolución completa. Homogenizar y fechar.
*4 x 50 ml: reconstituir el contenido de un vial de Enzimas con una porción de Buffer y
luego transferir al frasco de Buffer enjuagando varias veces. Homogenizar y fechar.

IV. PROCEDIMIENTO
Homogenizar la muestra antes de usar, especialmente frente a sueros lechosos.
En tres tubos de ensayo marcados B (Blanco), S (Standard) y M (Muestra), colocar:

Q.F. Sháneri Marcilla Truyenque MC 24

 [Seleccionar fecha] BIOQUIMICA I

Mezclar.
Incubar 5 minutos en Baño María a 37ºC.
Enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con agua
destilada.
CALCULO DE LOS RESULTADOS:
Corregir las lecturas con el blanco y usar las lecturas corregidas para los cálculos.
Para hallar la concentración de triglicéridos en el suero problema, se debe utilizar el
método del factor de calibración.
Triglicéridos (mg%) = M x Fc

VALORES DE REFERENCIA:
El panel de expertos del National Cholesterol Education Program (NCEP) provee los
siguientes valores de triglicéridos:
Deseable: < 150 mg%.
Moderadamente elevado a elevado: 150 – 199 mg%.
Elevado: 200 – 499 mg%.
Muy elevado: > 500 mg%.

V. TRABAJO
1.- Describa las características principales de los lípidos y su clasificación.
2.- Explique la importancia biológica de los triglicéridos.
3.- ¿Cómo se produce la digestión y absorción de los triglicéridos?
4.- Mencione la proporción de triglicéridos dentro de las lipoproteínas y la acción de
la lipasa lipoproteíca.
5.- Enumere los diferentes métodos tanto químicos como enzimáticos para el
dosaje de triglicéridos.

Q.F. Sháneri Marcilla Truyenque MC 25

 [Seleccionar fecha] BIOQUIMICA I

PRÁCTICA Nº 10
DETERMINACIÓN DE PROTEINAS TOTALES Y ALBÚMINA EN SUERO

I. OBJETIVOS
II. FUNDAMENOS
Determinación de Proteínas Totales:
Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión cúprico, en medio
alcalino, para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a 540 nm, cuya
intensidad es proporcional a la concentración de proteínas totales en la muestra.
Determinación de Albúmina:
La albúmina reacciona específicamente (sin separación previa) con la forma aniónica
de la Bromo Cresolsulfon Ftaleínas (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en
medio tamponado a pH 3,8. El aumento de absorbancia a 625 nm respecto al blanco
de reactivo, es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra.
Experimento B: DETERMINACIÓN DE CREATININA URINARIA
FUNDAMENTOS DEL METODO:
La Creatinina reacciona con el picrato alcalino en medio tamponado, previa
desproteinización con ácido pícrico, obteniéndose un cromógeno que se mide a 510
nm.

III. MATERIALES
Espectrofotómetro.
Micro pipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.
Tubos de ensayo.
Baño María a 37ºC.
Reloj ò timer.
Reactivo EDTA/Cu: complejo EDTA/Cu 13 mmol/l en NaOH 875 mmol/l y alquil aril
poli éter (AAP).
Reactivo BCF: solución de Bromo Cresolsulfon Ftaleínas (en polioxietilèn lauril éter).
Suero Patrón: solución de albúmina y globulinas en estado nativo con título conocido
de proteínas (Biuret ò Kjeldhal) y albúmina (unión BCF).
Experimento B: DETERMINACIÓN DE CREATININA URINARIA
Reactivo 1: ácido pícrico 41,4 mmol/l.
Reactivo 2: buffer glicina/NaOH 1 mol/l, pH final 12,4.
Standard: solución de Creatinina 2 mg%
MATERIAL REQUERIDO:
Espectrofotómetro.
Tubos de ensayo.
Micro pipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.
Reloj ò timer.

IV. PROCEDIMIENTO
DETERMINACIÓN DE PROTEINAS TOTALES:
En tres tubos colocar:

Q.F. Sháneri Marcilla Truyenque MC 26

 [Seleccionar fecha] BIOQUIMICA I

Mezclar los tubos.

Incubar durante 15 minutos en Baño María a 37ºC.
Leer en espectrofotómetro a 540 nm.

DETERMINACIÓN DE ALBÚMINA:
En tres tubos colocar:

Mezclar los tubos.

Mantenerlos a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Leer en espectrofotómetro a 625 nm.

CALCULO DE LOS RESULTADOS:

Proteínas totales (g/dl) = M x fc fc = P.T. (g/dl) / S
Albúmina (g/dl) = M x fc fc = Alb. (g/dl) / S
Albúmina (g/dl)
Relación A/G = ---------------------------------------
Prot. Tot. (g/dl) - Alb. (g/dl)
VALORES DE REFERENCIA:
PROTEÍNAS TOTALES: 6,1 a 7,9 g/dl.
ALBÚMINA: 3,5 a 4,8 g/dl.
RELACION A/G: 1,2 a 2,2

Experimento B: DETERMINACIÓN DE CREATININA URINARIA

PROCEDIMIENTO:
Recolectar orina de 24 horas.
Medir la diuresis, tomar una alícuota y efectuar una dilución 1:50 de la misma.
Luego en tres tubos de ensayo preparar lo siguiente:

Mezclar por inversión.

Incubar 20 minutos a temperatura ambiente.
Leer en espectrofotómetro a 510 nm.
CALCULO DE LOS RESULTADOS:
M
Creatinina en orina (mg/24 horas) = ------ x 20 mg/l x 50 x V
S
Siendo:

Q.F. Sháneri Marcilla Truyenque MC 27

 [Seleccionar fecha] BIOQUIMICA I

V = volumen de la diuresis expresado en litros/24 horas.

M = Absorbancia neta del tubo muestra.
S = Absorbancia neta del tubo standard.

VALORES DE REFERENCIA:
900 a 1,500 mg/24 horas.

VALORACIÓN DEL ESTADO NUTRICIONAL

V. TRABAJO
1.- Con los datos obtenidos en los experimentos, realizar la valoración nutricional de
dicha persona sabiendo que es varón, pesa 60 Kg, su talla es 1,56 m y su volumen
urinario en 24 horas fue de 1000 ml.
2.- Cómo hubiera sido la valoración nutricional en el caso que la persona hubiera sido
mujer?
3.- Mencione las características generales de las proteínas y su clasificación.
4.- ¿Qué son las globulinas y cuáles son sus clases?
5.- Describa los métodos de dosaje tanto químicos como enzimáticos para proteínas
totales, albúmina, globulina y Creatinina.

Q.F. Sháneri Marcilla Truyenque MC 28

 [Seleccionar fecha] BIOQUIMICA I

PRÁCTICA Nº 11
DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE UREA EN ORINA

I. OBJETIVOS
II. FUNDAMENOS
El producto final más importante del metabolismo proteico es la UREA. Esta es
excretada en la orina en mayor cantidad que cualquier otra sustancia.
Concentraciones elevadas de urea en sangre son indicador de una inadecuada
función excretora y por consiguiente de la función renal.
La urea sanguínea puede aumentar por otras razones además de excreción renal
insuficiente, dichas causas se clasifican en: Pre-renal, son los estados en los cuales se
altera la circulación por el riñón y Post-renal por obstrucción de las vías urinarias. Por
ello la información más exacta con respecto a la habilidad excretora de la urea por los
riñones requiere de una comparación de la concentración de urea en sangre (BUN) y
en la orina. Fisiológicamente la urea se eleva debido a una dieta hiperproteica o con la
edad y disminuye durante una dieta de bajo valor proteico.
FUNDAMENTOS DEL METODO:
La urea presente en la muestra es hidrolizada hasta amoníaco y dióxido de carbono,
mediante una reacción catalizada por la enzima ureasa:
Ureasa
Urea + H2O CO2 + 2 NH3
El amoníaco en presencia de una base reacciona con fenol e hipoclorito de sodio
formando azul de indo fenol. La intensidad de color azul es proporcional a la cantidad
de urea en la muestra.

III. MATERIALES
Espectrofotómetro.
- Probeta, micro pipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.
- Frasco de vidrio color ámbar.
- Cubetas espectrofotométricas.
- Baño de agua a 37ºC.
- Reloj ò timer.
Reactivo 1.- Solución de fenol y nitro prusiato de sodio.
Reactivo 2.- Solución de hipoclorito de sodio en NaOH 0.625N
Enzima.- Solución de ureasa.

IV. PROCEDIMIENTO
Se diluye la orina a 1:50 con agua destilada.
Preparar los siguientes tubos:

Mezclar e incubar los tubos en un Baño María a 37°C por 5 minutos.

Asegurarse que los reactivos no se hayan quedado en las paredes de los tubos.
Luego agregar en cada tubo, 1 ml del Reactivo 1, y posteriormente 1 ml del Reactivo
2.

Q.F. Sháneri Marcilla Truyenque MC 29

 [Seleccionar fecha] BIOQUIMICA I

Mezclar el contenido de los tubos e incubarlos en un baño de agua a 37°C por 5

minutos.
Transcurrido este tiempo agregar 4 ml de agua destilada en cada tubo.
Mezclar los tubos por inversión y proceder a leer la absorbancia en un
espectrofotómetro a 540 nm vs el blanco.

CALCULOS:
Abs muestra
Urea (mg/dl) = --------------------- x 60 x Factor de dilución
Abs standard
Dato: Urea x 0.466 = Nitrógeno ureico.
VALORES NORMALES:
Nitrógeno ureico.- 7 a 14 gr/24 hrs.
Urea.- 15 a 30 gr/24 hrs.
BN = Ingesta nitrogenada – (N ureico + N creatinìnico + 2)
BN = ...................... gr/24 hrs.

V. TRABAJO

1.- Con los datos obtenidos en la práctica, calcular el balance nitrogenado del paciente
sabiendo que ingirió 8 gr de proteínas en 24 horas.
2.- ¿De donde proviene la Creatinina?
3.- ¿A qué se denomina uremia y que consecuencias trae?
4.- ¿A qué se llama BUN y que representa?
5.- ¿Para qué sirve la depuración de Creatinina en orina de 24 horas?

Q.F. Sháneri Marcilla Truyenque MC 30