Cuprins

1. Introducere

 Substanțele pectice sunt un grup complex de polizaharide, constituind cel mai abundent
component glucidic din peretele celular al plantelor. 1

 Pectinele sunt alcătuite dintr – un schelet de α – 1,4 – galacturonan partial metilat (15 –
20%), cunoscut și sub denumirea de acid poligalacturonic, legat de unități de L –
ramnopiranoză care prezintă lanțuri laterale neutre ce sunt, de fapt, complecși de
arabinogalactan de tipul II și arabinan. 2

 Substanțele pectice reprezintă aproximativ 35% din substanța uscată a peretelui celular al
plantelor mono- și dicotiledonate, în timp ce procentele de celuloză, hemiceluloză și
glicoproteine sunt, respectiv, 20 -30 % , 25% și 20%.

 Pectinele sunt importante în formarea peretelui celular, fiind responsabile cu cimentarea

fibrelor de celuloză, incluziv la fructe în perioada de coacere. 3

 Ele formează un gel în jurul rețelei celuloză – hemiceluloză și acționează ca un material

de umplutură care previne dezagregarea și ruperea acestei rețele.

 Acești compuși joacă un rol important în tehnologiile alimentare prin creșterea

vâscozitățiiși ca sursă (fibră) de nutriție. 4

 Pectinele prezintă câteva proprietăți coloidle folositoare, dar, în același timp, prezența lor
poate fi o problem la extracța sucurilor din legume și fructe,ca și în operații secundare
precum limpezirea și filtrarea.

 Pectinele pot fi degradate de către enzimele pectinolitice, clasificate în :

- pectinesteraze;
- poligalacturonaze;
- pectatliaze;
- pectinliaze;

1
Darvill ș.a. 1980, Brioullet, 1987
2
Ș. Jurcoane ș.a. – Tratat de Biotehnologie, Vol. l , Ed. Tehnică, București 2009
3
Rees și Wight, 1996
4
Rombouts, 1978, Easrwood, 1990
  Punctele de atac ale enzimelor pectinolitice sunt prezentate în Figura 1.

Figura 1 – Degradarea substanțelor pective de către enzimele pectinolitice

 Enzimele pectinolitice sunt sintetizate numai de plante și microorganism, celulele

animale nedispunând de astfel de enzime.

2. Scurt istoric

 Cele dintâi informații științifice asupra enzimelor pectinolitice datează din mijlocul
secolului trecut, când apar primele referate științifice privind procesele de degradare ale
pectinei din unele legume (de exemplu din morcovi) sau în procesele de macerare ale
tulpinilor de in. 5
 Cercetările effectuate ulterior au dus la evidențierea importanței practice a acestor enzime
pentru diferite sectoare ale industriei alimentare ca, de exemplu, industria de sucuri,

5
Kertesz, 1951
 vinificaței, ceaiului, boabelor de cafea și cacao. Mai pot fi utilizate și în industria textilă
la topirea plantelor textile, ca inul și cânepa.

Pectinliazele

Fac parte din clasa liaze, cee ace înseamnă că scindează C-O printr-un mecanism de
transeliminare.
- degradează substraturi cu grad înalt de esterificare, produșii finali fiind oligo – D –
galacturonați nesaturați;
- activitatea lor este legată de distribuția grupărilor esterificate în catena poligalacturonică.
Astfel, pectinliazele au o activitate mai ridicată asupra substraturilor deesterificate
enzimatic, față de substraturile deesterificate în mediu alcalin;
- pectații, amidele, acidul pectic și glicilesterii pectinei nu sunt degradați de pectinliaze.
Până în prezent, au fost isolate și caracterizate numai pectinliaze de origine fungică.
Acestea au un pH optim în domeniul acid și valori reduse ale KM. nu necesită pentru activitatea
lor ioni de calciu, cu mici excepții (Fusarium oxysporum), dar pot avea rol activator alături de
alți ioni, precum ionii de cupru, magneziu, mangan și mercur (2 mM). 6 Activitatea pectinliazei
poate fi inhibată de acidul p – cloromercuri – fenil – sulfonic, anhidrida maleică, N –
etilmaleimida. 7
Modul de acţiune al pectin liazelor (Figura 2) a fost pus în evidenţă prin analiza
produşilor rezultaţi în urma scindării tetra-, penta- şi hexa-galacturonaţilor.

Substrat Produşi de reacţie

 O-O-O + -O-O
O-O-O-O-O-O
 O-O + -O-O-O

O-O-O-O-O  O-O + -O-O

O-O-O-O  O + -O-O

O – rest de acid galacturonic esterificat

  rest de acid galacturonic esterificat, cu o dublă legătură între C4 şi C5

6
Lim ș.a. 1983
7
Manachini ș.a. 1988
 Figura 2 – Modul de acțiune al pectinliazelor
Mikhailova (1994) a arătat că unele specii de Penicillium produc forme moleculare ale pectin
liazelor care diferă din punct de vedere al controlului biosintezei. Unele dintre acestea sunt
represate de glucoză şi depresate prin intermediul AMP ciclic. Fuziunea protoplaştilor de la fungii
pectinolitici de tipul Aspergillus a condus la obţinerea a patru hibrizi cu activităţi
endopoligalacturonazice, exopoligalacturonazice şi pectin liazice nemodificate.8

O bacterie endofilică izolată de pe suprafaţa sâmburilor de cireşe s-a dovedit ca produce o

pectinliază cu acţiune optimă la 400C şi pH 7,9 şi o valoare KM faţă de pectină de 4,5 mg/ml. 9

Pectinliaza produsă de Bacillus pumillus

- Bacillus pumillus a fost izolat si identificat cu ajutorul sistemului Sherloxk Microbiene
Indemtication (MIS);

- Activitatea pectinliazei a fost determinată prin metoda TBA (evaluare spectrofotometrică

ce utilizează reactivul TBA, care conține : 30g acid tricloracetic, 0.75g acid tiobarbituric,
5.2ml HCl 0.25N), descrisă de către Nedjma.

- Drept unitate de activitate pectinliază (PL) a fost definită cantitatea de enzimă care
produce 1 mMol de galacturonid/ min.

8
Solis ș.a. 1997
9
Sakiyana ș.a. 2001
 Purificarea pectinliazei

- Activitatea pectinliazei a fost examinată din tărâţe de grâu 1672 UE10/gram. Prin
folosirea DEAE- Celuloza, cromatografiei cu schimb de ioni, pectinliaza a fost purificată
de 36,36 ori (Tabelul 1).

Fracţia de enzime
Parametri
controlabili
Extras DEAE- celuloza Sephadex G 150
brut

Volum, ml 65 50 30

Activitate, 1,583 1,376 2,195

EU/ml
Activitate
totală: EU 102,9 68,8 54,9
% 100 81,4 79,8

Proteine, mg/ml 0,912 0,285 0,0125

Specific, EU/mg 1,736 4,83 175,6

Purificare (ori) _ 3,39 36,36

Tabelul 1 – Purificarea Pectinliazei produsă de Bacillus pumillus.

10
UE = unitate enzimatică
- Gradul de purificare al enzimei a fost verificat cu SDS-PAGE.

Influența temperaturii asupra AE a pectinliazei

 Efectul temperaturii a fost investigat în intervalul de temperaturi 0 - 90˚C,

înregistrând valorile activităţii enzimatice la fiecare 10 grade (Figura 3), temperatura
optimă fiind 60˚C.

Figura 3 - Efectul temperaturii asupra activităţii de purificare a pectinliazei, produsă de

Bacillus

- Enzima a avut activitate între 20 şi 80˚C.

- Temperatura optimă a pectinliazei produsă de B. pumillus a fost similară cu cea produsă

de Bacillus sp. DT7, AMD a fost mai mare decât cea produsă de Rhiyopus oryzae ,
Curvularia inaequalis NRRL 13884, Bacillus sp. PN 33.
 Influența pH –ului asupra AE a pectinliazei

 Influenţa pH asupra activităţii pectinliazei, care a fost realizat în limitele valorilor pH

4 - 11 (Figura 4).

Figura 4 - Efectul pH-ului asupra activităţii pectinliazei purificate produse de Bacillus

- Rezultatele indică faptul că pH-ul optim al reacţiei enzimatice a fost 6, activitatea

enzimatică s-a observat pe intervalul pH (5 ... 10).

- PH-ul optim al pectinliazei a fost identic cu PL elaborat de Bacillus sp. D17. Această
valoare este mai mare decât pH-ul optim (pH: 5) al PL produse de Rhizopus oryzae,
Curvularia inaequalis NRRL 13884 şi cel al Aspergillus niger, dar mai mică, decât pH-ul
optim (pH: 9) al PL produse de Moniliella sp. şi (pH: 10) produse de Penicillium sp.
EGC5.
 Influența sărurilor metalice și a substanțelor chimice asupra AE
a pectinliazei

 Studiul atestă de asemenea şi aprecierea influenţii sărurilor metalice şi a altor

substanţe chimice asupra activităţii pectinliazelor.
- Efectul fiecărui agent chimic a fost determinat prin măsurarea activităţii enzimatice,
utilizând acidului thiobarbituric, metoda (TBA). Termostabilitatea pectinliazelor a fost
studiată în intervalul de temperaturi cuprinse între 40 şi 80˚C (Figura 5).

Figura 5 - Stabilitatea PL purificate produsă de Bacillus la diferite temperature

- Studiul atestă că enzima purificată (Figura 5) a fost stabilă şi şi-a păstrat pe deplin
activitatea după incubare timp de 1h în intervalul de temperaturi de la 40˚C la 50˚C.

- Temperaturile de 20 şi 60˚C au redus activitatea enzimei, iar cele de 70, 80˚C au

diminuat brusc activitatea pectinliazei. Termostabilitatea PL a fost constatată la
temperatura de 40˚C, deoarece aceasta a rămas activă aproximativ 24 h.
- Termostabilitatea PL produsă de Aspergillus niger a fost observată la 40 -50˚C. S-a
stabilit că PL din Rhizopus oryzae a fost inactivată după 45 minute la 70˚C.

- Chiar dacă s-a constatat că PL din Pythium a fost stabilă la 40-50oC, dar activitatea sa a
scăzut rapid la temperatura peste 50˚C.

 Acţiunea ionilor metalelor şi a altor substanţe chimice asupra activităţii PL a fost

diferită (Tabelul 2).
 PL purificată a fost complet inhibată de 10mM Hg 2+, Mn 2+, EDTA, β-
mercaptoethanol şi SDS, un efect de activitate relevant a fost observat în prezenţa
Ca 2+, Mg 2+, L-cisteina, acid ascorbic (10mM).
 În timp ce Mg 2+ (10mM) a stimulat activitatea PL, iar Zn 2-, Cu 2- şi Fe 2+ a
inhibat-o.

Tabelul 2 - Efectul unor ioni metalici şi substanţe chimice asupra activităţii PL produsă de
Bacillus
 Utilizări

Utilizarea enzimelor pectinolitice obținute industrial cu ajutorul microorganismelora fost

introdusă în prelucrarea fructelor sub formă de sucuri în 1930, de către Kertesy, în SUA si de
către Mehlitz, în Germania.

Aceste enzime sunt absolut indispensabile în industria sucurilor din fructe și legume,
fiind utilizate în procesul tehnologic pe parcursul etapelor de extracție, limpezire și
depectinizare.
Sub acțiunea combinată a enzimelor pectinolitice, a celulazelor și a hemicelulazelor,
fructele pot fi lichefiate .11
De asemenea, unele fructe și legume au fost macerate cu ajutorul acestor enzime în
vederea obținerii alimentelor pentru sugari. 12
Mai pot fi utilizate la tratarea boabelor de cafea, evitându – se fermentarea nedorită a
boabelor. Sunt eficiente și în procesul de obținere a cafelei tip instant în procesul de
prelucrare a boabelor de cafea.
Au fost introduse în vinificație încă din anul 1947 și, de atunci, au fost utilizate pentru a
mări rata de extracție a mustului (8 – 14%), pentru a mări rata filtrării și pentru a optimiza
extracția culorii și a aromelor.13
În domeniul textil, la înmuierea fibrelor vegetale.
Domeniile mai noi de utilizare a enzimelor pectinolitice sunt legate de cercetare. Astfel,
obținerea de protoplaști folosește alături de celulaze și hemicelulaze, enzime
pectinolitice.
De asemenea, ele pot fi utilizate la dozarea concentrațiilor de pectin prin metoda
enzimatică.

Tendințele pieței

Deoarece prețurile acestor enzime sunt ridicate din cauza preparatelor fungice,
cercetările din ultima vreme s – au axat pe pectinaze native obținute de la specii de drojdii
din genul Saccharomyces. Foarte puține specii s-au dovedit a fi bune producătoare de
enzime.

11
Grassin ș.a. 1996
12
Recourt ș.a. 1996
13
Cruess ș.a. 1955; Brown și Ough 1981; Haight și Gump 1994; Lao ș.a. 1997; Ducruet ș.a. 1997
 Ingineria genetică vine în ajutorul acestui neajuns tehnologic prin clonarea genelor ce
codifică enzimele de la fungi la drojdii, și utilizarea acestor drojdii mutante în procesele
fermentative.

Pe plan mondial…

Există preocupări de relansare a exploatării enzimelor pectinolotice specific, de

origine microbiană, în procesele agro – industriale. Cercetările se îndreaptă spre studii
combinate asupra enzimelor și asupra substraturilor la nivel molecular. Principalele obiective
ale cercetătorilor sunt legate de:
- obținerea de tulpini de fungi și bacterii înlt producătoare de enzime pectinolitice prin
manipulare genetică și printr-un management correct al fiziologiei microbiene;
- caracterizări ale specificității enzimelor prin analize cinetice (pH, profil T, substrat oligo-
sau polimeric, mod de acțiune, inhibitori);
- analiza structurii ultrafine a diferitelor pectine în relația cu specificitatea enzimelor
pectinolitice;
- studiul degradării enzimelor in situ;

Tabel 3 – Veniturile aduse pe piață de enzimele industriale, valori estimate între 2013 – 2024,
valorificate în milioane de dolari
 Metodă de determinare a pectinliazei

Metoda vâscozimetrică
Principiul metodei
- metoda se bazează pe micșorarea vâscozității substratului (pectina) în urma acțiunii
pectinazelor;
- este, de fapt, mai mult utilizată în scopul estimării mecanismului de hidroliză al
enzimelor pectinolitice;
- compararea creșterii puterii reducătoare a substratușui cu scăderea vâscozității permite să
se facă deosebirea între activitatea endo- și exo- ;
- metoda vâscozimetrică prezintă ca avantaje atât aspectele prezentate mai sus cât și faptul
că este o metodă rapidă, iar ca dezavantaj este acela că are la bază relația complex dintre
η și greutatea moleculară medie;
Mod de lucru
- în vâscozimetru de 18 mL se pipetează soluție de pectin 2%;
- după 15 minute , timp în care soluția a ajuns la 30˚ C, se adaugă 2 mL soluție pectinază
1%;
- concomitant cu adăugarea enzimei se declanșează un cronometru;
- la interval scurte de timp se urmărește scăderea η amestecului de reactivi, determinarea
timpului în secunde necesar pentru curgerea acestuia între cele doua repere înscrise pe
vâscozimetru;
- astfel, se măsoară timpul în care vâscozitatea probei scade cu 50% (T50), socotind 100%
vâscozitatea probei martor (2 mL soluție pectinază inactivat prin fierbere și 18 mL soluție
pectin 2%);