Developmental Biology 433 (2018) 240-253

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Artículo de Investigación Original

Impacto del ciclo de las células y la regulación del ciclo celular en Hidra regeneración

Wanda Buzgariu, Yvan Wenger, Nina Tcaciuc, Ana-Paula-Catunda Lemos, Brigitte Galliot •
Departamento de Genética y Evolución, Instituto de Genética y Genómica en Ginebra (iGE3), Universidad de Ginebra, Ginebra, Suiza

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO ABSTRACTO

palabras clave: Hidra tejidos están hechos de tres poblaciones distintas de células madre que continuamente de ciclo y de pausa en G2 en lugar de G1. Para caracterizar el papel de
arresto genes S-fase Hydra la proliferación celular después de mediados de bisección gástrica, hemos (i) utilizado Florida ow citometría y marcadores clásicos para monitorear modulaciones del
regeneración celular ciclo celular, (ii) cuanti fi ed los reglamentos transcriptomic de 202 genes asociados con la proliferación celular durante la cabeza y la regeneración del pie, y (iii)
ciclismo
comparación del impacto de los tratamientos anti-proliferativos en la regeneración e FFI ciencia. nos estafa fi rm dos informó anteriormente eventos: una onda mitótico
Hidroxiurea, transcriptómica
temprano en puntas de la cabeza de regeneración, cuando algunos genes del ciclo celular están reguladas, y una onda temprano-tardío de la proliferación en el
RNA-seq nocodazole Citometría
segundo día, precedida por la regulación de los genes del ciclo 17 de células . Estas regulaciones aparecen más intensa después de mediados de gástrico bisección
de flujo pro DNA fi ling-Pro
que después de la decapitación, lo que sugiere una regulación dependiente de la posición de la proliferación celular durante la regeneración cabeza. La hidroxiurea,
blastema
que bloquea la fase S progresión, retrasos cabeza regeneración cuando se aplica antes, pero no después de bisección. Este resultado es consistente con el hecho de
que la Hidra

región central está enriquecida en células madre adultas G2-en pausa, a punto de dividir después de la lesión, formando así un constitutiva pro-blastema necesario.
Sin embargo, una exposición prolongada a la hidroxiurea no bloquea la regeneración de las células como puede di ff erentiate estructuras apicales sin atravesar la
fase S, y también escapar en pocos días el bloqueo de la fase S hydroxyureainduced. Así Hidra regeneración de la cabeza, que es un evento rápido, es altamente
plástico, basándose en grandes cantidades de células madre adultas se detuvo en G2 en el momento de la amputación, que dividen inmediatamente a proliferar y /
o di ff erentiate estructuras apicales incluso cuando la fase S se bloquea.

1. Introducción
el agua dulce Hidra pólipo, que pertenece a la clase de cnidarios hidrozoos, un filo hermana
para Bilateria, es famoso por su increíble capacidad de regenerar cualquier parte faltante del cuerpo
sea cual sea su edad. Desde el descubrimiento de este fenómeno en el siglo 18, Hidra se ha
mantenido un sistema modelo experimental fructífera para estudiar la regeneración ( Galliot, 2012 ).
Una observación interesante es que, en contraste a la columna gástrico, trozos de tejido procedente
de las extremidades, tales como tentáculos o disco basal no se regeneran. Dada la distribución
restringida de células madre a lo largo de la columna de la carrocería ( Figura 1 A), esto sugiere que
se requiere su presencia para la regeneración. Hidra pólipos se rellenan con tres distintos de células
madre adultas (ASC) poblaciones, la epidérmico unipotent y células madre epiteliales gastrodermal
(eESCs, gESCs) presentes a lo largo de la columna de la carrocería, y las células multipotentes
intersticiales (SICS) que pueblan la región gástrica centro ( David y Plotnick, 1980 ). Todas estas
células madre adultas se caracterizan por un estado altamente proliferativo, los CES dividiendo cada
3 - 4 días, IscS cada 24 - 30 h ( David y Campbell, 1972; Campbell y David, 1974 ). De manera similar a
las células madre embrionarias de mamíferos ( Blanco y Dalton, 2005 ) Y células madre epiteliales ( Harper predominantemente de terminalmente di ff células erentiated.
et al., 2010 ), Hidra ASC exhiben una muy
corta fase G1 y una fase G2 extendida ( David y Campbell, 1972; Campbell y David, 1974; Holstein y
David, 1990; Holstein et al., 1991; Buzgariu et al., 2014 ) ( Figura 1 SEGUNDO). Un estudio reciente
sugiere que una pequeña subpoblación de Hidra ASCs permanecen en reposo en G2 ( Govindasamy
et al., 2014 ).
En la columna cuerpo central la, dividir ISC y dar lugar a progenitores intersticiales (IPS), que
por una fracción grande, migran hacia los polos y di apical y basal ff erentiate post-mitóticamente ( Holstein
y David, 1990; Technau y Holstein, 1996; Hager y David, 1997 ). Por el contrario, los CES se dividen
continuamente a lo largo de la columna del cuerpo y de repente detenerse antes de llegar a los
extremos terminales di ff erentiate y
fi finalmente obtener sloughed o ff. células Sorprendentemente epitelial di ff erentiate sin atravesar
mitosis, permaneciendo así en la fase G2 ( Dubel et al., 1987; Dubel y Schaller, 1990; Buzgariu et al.,
2014 ). Como resultado de estas dinámicas de células, la columna central del cuerpo del animal se
enriquece en la división de células madre, mientras que los polos apical y basal se compuestas
La relevancia de la proliferación celular en la estrategia de regeneración (-ies) adoptado por Hidra
Es una cuestión de larga data. La visión clásica es que
Hidra la regeneración es morphallactic, es decir, basándose únicamente en la remodelación de los
tejidos pre-existentes y no en la formación de nuevo tejido

• Autor correspondiente.

Dirección de correo electrónico: brigitte.galliot@unige.ch (B. Galliot).

https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2017.11.003
Recibido el 12 de junio de 2017. Recibido en forma 31 de octubre 2017 revisado; Aceptado 08 de noviembre 2017
0012-1606 / 2017 © los autores. Publicado por Elsevier Inc. Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY-NC-ND licencia (http://creativecommons.org/licenses/BY-NC-ND/4.0/).
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Figura 1. eventos síncronos mitótico en la primera fase de regeneración de la cabeza después de mediados de bisección gástrico. (A) Esquema que representa la anatomía y la organización del tejido de Hidra. ( B) Propiedades del ciclo celular de las células epiteliales y

madre intersticiales (CES, SICS). Tenga en cuenta la falta de G1 y G2 en la pausa. Por el contrario ciclismo progenitores intersticiales (IPs) atraviesan una fase G1 más tiempo. (C) La citometría de flujo análisis del contenido de ADN de células obtenidas después de

mediados de gástrico bisección de dos regiones adyacentes: las puntas de la cabeza de regeneración (R4) y la región subyacente (R5). El análisis se realizó en H. vulgaris con el HM-105 ( panel izquierdo) y SF-1 ( paneles) cepas central y derecha. Los animales eran o

no choque térmico como se indica en el esquema. Cuatro repeticiones biológicamente independientes (3 - 4 animales por réplica) se ensayaron en cada condición. signi fi cativas tasas de falsos descubrimiento (FDR) entre cada medición sucesiva se indican mediante

estrellas (ver detalles en Tabla S1 ). Nótese la disminución síncrono en G2 / M y el aumento de células en fase S en 4 - 6 hpa en HM-105 y SF-1 animales, y una regulación similar en (HS) animales conmocionado al calor retrasado por 10 h. (D) La inmunodetección de

las células G2 / M en la regeneración de mitades con un anticuerpo anti P-histona H3 (pH 3). Nota las células pH3 en la frontera de la región más apical de la punta en 6 hpa. (E) Impacto de la transitoria G2 / M detención en apical di ff erentiation en SF-1 los animales

tratados con NDZ durante 33 h, ya sea antes o después de bisección mediados de gástrico. (F) Impacto de G2 transitoria / M detención en apical di ff erentiation en SF-1 Los animales expuestos a NDZ durante 33 h antes de la decapitación o antes de bisección

mediados de gástrico. Las flechas grises señalan el retardo más largo inducida por el tratamiento NDZ en animales en regeneración su cabeza después de la decapitación que después de bisección mediados de gástrico.

( Morgan, 1901 ). De hecho Morgan escribe: “ hay, en general, dos modos mediante los cuales una
pieza de todos los adultos pueden regeneran: (A), ya sea por el desarrollo de nuevo tejido en las
regiones expuestas, - epimorphosis; o (B) por transformación de la parte antigua en una nueva
forma, - morphallaxis ”. Un año más tarde, una fi análisis histológico primer realiza en su laboratorio de Hidrabloqueo parcial y reversible de la síntesis de ADN, la reducción de alrededor del 60% después de un
rebanadas en proceso de regeneración concluyeron que “ las nuevas células que aparecen durante la
regeneración de la hidra se forman por la división de las células viejas a lo largo de toda la pieza,
como en el animal normalmente creciente ”( Rowley, 1902 ). Este resultado sugiere hoy que la tasa de
proliferación sostenida observó a lo largo de la columna de la carrocería en condiciones
homeostáticas su FFI ce para proporcionar nuevas células para la estructura de regeneración.
Décadas más tarde se hizo posible para etiquetar células proliferantes ( Burnett et al., 1962; Plickert y
Kroiher, 1988 ), Para cuantificar la composición del tejido ( David, 1973 ) Y para aplicar tratamientos de
pulsos que eliminan todas las células en ciclo rápido, es decir, SICS y ciclismo IPs, sin una ff ión de la
las células epiteliales, lo que mantiene a los animales vivos ( Campbell, 1976; Marcum y Campbell,
1978a; Sacos y Davis, 1979; Schaller et al., 1980; Pequeño fi ELD y Bode, 1986; Nishimiya-Fujisawa y
Sugiyama, 1993 ).
regeneración. Sin embargo, si la regeneración cabeza en ese contexto es en gran parte morphallactic
(nuevas estructuras producidas a pesar de la falta de ciclismo células intersticiales), que no permite la
restauración de la función original. En segundo lugar los tratamientos de pulso HU sólo conducen a un
tratamiento de 20 h de acuerdo con ( Clarkson, 1969b ), Dejando abierta la cuestión de un papel putativo de
la síntesis de ADN en las células epiteliales durante la regeneración. Para resolver este problema
Cummings y Bode han probado regeneración de la cabeza en los animales continuamente expuestos a
HU a alta concentración (10 mM) durante varios días antes de la decapitación y durante una semana
después, suponiendo que la proliferación epitelial sería bloqueado ( Cummings y Bode, 1984 ).
regeneración de la cabeza se retrasa, pero por lo demás normal en animales expuestos a HU sólo
después de la decapitación, signi fi cativamente alterada en animales expuestos a HU durante al menos 3
días antes de la amputación ( Fig. S1A ). Una vez más este paradigma experimental su ff ERS limitaciones
que los autores encontraron numerosas células que escapan del bloqueo de la fase S y detectaron una
elevada toxicidad después de 5 días de tratamiento (véase a continuación).

En tercer lugar, la mayoría de estos estudios se centraron en la regeneración después de la

La determinación de la tasa de síntesis de ARN y ADN en la regeneración de los tejidos
después de la decapitación no identificó ningún aumento en la replicación del ADN ( Clarkson, 1969a ).
Del mismo modo el recuento de mitosis
fi cifras en di ff niveles Erent lo largo del cuerpo regenerar concluyeron a un número estable ( Park et al.,
1970 ). En paralelo, los tratamientos anti-proliferativos administran antes de bisección, tal como
irradiación con rayos X o medicamentos entregados antes y durante la regeneración no abolir
regeneración de la cabeza, de nuevo después de la decapitación ( Hicklin y Wolpert, 1973 ). De hecho
la exposición a corto (15 - 24 h) a la hidroxiurea (HU) que bloquea la fase S, o para nocodazol o
colchicina que actúan como venenos mitóticos, retrasos pero no impiden la formación de la cabeza
después de la decapitación ( Clarkson, 1969b ), A pesar de que la nueva cabeza está más
frecuentemente dismórficos, con un mayor número de tentáculos o tentáculos fuera de lugar ( Marcum
y Campbell, 1978a; Sacos y Davis, 1979 ). Estos experimentos condujeron a la conclusión de que ni la
síntesis de ADN, ni la mitosis son necesarios para regenerar correo FFI cientemente una cabeza bien
modelada-después de la decapitación. Sin embargo los animales expuestos a la donante de óxido
nítrico NOC-18 exhiben un aumento sostenido de la proliferación de células de 8 a 16 h después de la
decapitación, junto con un proceso de regeneración cabeza acelerada, lo que sugiere una relación
entre la proporción de proliferación de las células dentro de la fi primera 24 hPa y la e FFI eficiencia de la
regeneración de la cabeza ( Colasanti et al., 2009 ). Todavía una serie de inconvenientes limitan la
interpretación de estos experimentos utilizando anti-proliferativa o fármacos anti-mitóticos.
decapitación y no investigó la regulación de la proliferación celular después de mediados de bisección
gástrico. De hecho varias evidencias apuntan a un papel para la proliferación celular en la regeneración
cabeza después de bisección a niveles inferiores a la decapitación, con una acumulación temprana y
temprano-tardío del ciclo de las células en las puntas de regeneración. En condiciones fisiológicas, los
animales bisected en el nivel medio-gástrica, exhiben una onda inmediata de la muerte celular en las
puntas headregenerating, un evento que conduce un evento mitótico sincrónica seguido por un rápido
incremento en el índice de BrdU-etiquetado en la proximidad del plano amputación dentro de el fi primera
12 h después de la amputación (hpa) ( Chera et al., 2009, 2011 ). Esta proliferación compensatoria en
respuesta a la muerte celular fi ts el comportamiento esperado de las células madre intersticiales, es
decir, aumentar la auto-renovación cuando la densidad de gotas ( Holstein y David, 1990; David et al.,
1991 ). Ciclo células intersticiales también contribuyen a la formación de una zona proliferativa mediante
la migración hacia la herida, probablemente en respuesta a señales de daño, como se espera de su
comportamiento migratorio condicional ( Boehm y Bosch, 2012 ). En el contexto de “ epitelial Hydra ”, es
decir, agota de sus células intersticiales, las células epiteliales después de un corte en el tercer nivel
superior de los animales exhiben una regulación bifásica de su comportamiento en bicicleta en las
puntas de la cabeza de regeneración, una caída precoz de células en fase S seguido por un aumento
progresivo durante el 20 - 36 hPa ( Holstein et al., 1991 ). Esta localizada temprano-tardío sobre regulación
de la proliferación celular también se observó en los animales de tipo salvaje, como la proliferación de
progenitores intersticiales que expresan cnox-2 acumular al 30 - 36 hPa en las puntas headregenerating
después de mediados de bisección gástrica ( Miljkovic-Licina et al., 2007 ). En conjunto, estos datos
indican que bajo condiciones fisiológicas dos ondas coordinados de ciclo celular se producen durante Hidra

En primer lugar HU o tratamientos colchicina no son inequívocas: que bloquean la proliferación

celular pero ipso facto También activar programas pro-apoptóticos, que en la zona lesionada, se
sabe que un impacto positivo en el proceso de regeneración ( Chera et al., 2009 ), Y en cualquier caso
llevar rápidamente a la eliminación de los CSI y IPs, por lo tanto prevenir la neurogénesis. Jefes
regeneran en ausencia de la neurogénesis como estructuras nerviosas libres. Tales animales
carecen de la respuesta de alimentación y necesitan ser alimentados manualmente para sobrevivir ( Marcumbasa en la proliferación de células tal como se evaluó en el hydrozoan marina Hydractinia donde la
y Campbell, 1978a; Sacos y Davis, 1979; Wenger et al., 2016 ). Por lo tanto es prescindible para la
neurogénesis de novo cabeza patrón, pero es necesario para la restauración de una cabeza
completamente funcional. Este resultado no es sorprendente, ya que las células epiteliales llevan las
propiedades morfogenéticas en Hydra ( Marcum y Campbell, 1978b; Sugiyama y Fujisawa, 1978 ), Y
por lo tanto su FFI CE para lograr
regeneración: un evento mitótico temprana, posiblemente restringida a la cabeza de regeneración
después de bisección mediados de gástrico, y una proliferación temprano-tardío con la síntesis de ADN.
Esta situación muestra similitudes con la regeneración de la cabeza en otros cnidarios, que más bien se
migración de células en proliferación forman un blastema ( Bradshaw et al., 2015 ) Y en el anthozoan
Nematostella donde la proliferación celular precede apical di ff erentiation ( Amiel et al., 2015 ). En este
estudio, hemos combinado Florida ow citometría y transcriptómica cuantitativos a enfoques celulares y
farmacológicos clásicos a reconsiderar el papel de la proliferación celular en la cabeza de
regeneración Hidra después de mediados de la sección gástrica.

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2. Materiales y métodos
2.1. cepas Hydra y cultura animales
El seguimiento H. vulgaris (Hv) Se utilizaron cepas: Basel ( Hv_Basel), magnipapillata-105
(HM-105), jussy ( Hv_Jussy), el mutante termosensible ( SF-1), el AEP transgénico cnnos1: eGFP
( Hemmrich et al., 2012 ). Los animales fueron masa-cultivaron a 18 ° C en Hydra Medium (HM) como
en Gauchat et al. (2004) .
2.2. Hydra tratamientos y manipulaciones
Para los tratamientos de choque térmico (HS), SF-1 animales se transfirieron a 28 ° C durante
62 h y se devuelven a 18 ° C. La hidroxiurea (HU, 5 mM en HM a menos que se especifique otra
cosa fi ed tratamiento) fue dado en tres ciclos como se ha descrito inicialmente ( Bode et al., 1976 ),
Combinado o no con las exposiciones continuas como se indica. Para los experimentos de
regeneración, los animales se bisecaron ya sea inmediatamente (t0) o uno o tres días después de la
liberación del fármaco, y permiten regenerar en ausencia o presencia de HU. En paralelo, los
animales no tratados se bisecaron e inmediatamente expuesto a HU continuamente durante 8 días,
el fármaco siendo reemplazado cada 24 - 36 h. Nocodazol (NDZ 1,4 nM) tratamientos se realizaron en HM-105
homeostáticos y regenerativos y para el montaje de de-novo Transcriptomes como se describe en ( Wenger
animales, tratados ya sea bisección antes durante 33 h, o después de bisección durante 6 días. Cada
experimento se repitió al menos dos veces. A menos específica fi ed, los animales se dividía en dos a
mediados de nivel gástrico después de dos días de inanición. Cabeza de regeneración e FFI deficiencia
se expresó como el porcentaje de animales di ff erentiating estructuras apicales, al menos rudimentos
tentáculo.
2.3. índice de BrdU-etiquetado (BLI)
Para cada condición 3 - 5 animales intactos o en regeneración fueron expuestos a la
bromodesoxiuridina análogo de la timidina (BrdU, Sigma, 5 mM) como se indica, después se lavó en
HM. Las puntas de la cabeza de regeneración se cortaron y se maceran como en David (1973) .
queso Brie Florida tejidos Y se disociaron en medio de disociación (glicerol 7,7%, ácido acético glacial
7,7%) a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora, a continuación, las células se fi jos
durante una hora en PFA al 4%, se extendió sobre portaobjetos, se secó durante 40 h, rehidratada en PBS,
se trató con metanol durante 15 min, se rehidrataron en PBS, permeabilizadas durante 15 min en PBT 0,5%
(PBS, Triton-X100 0,5%) y fi finalmente incubó en HCl 2 N durante 30 min. Las células se immunodetected
con el anticuerpo anti-BrdU (Roche, Kit N ° 11296736001, 01:20) como en Chera et al. (2009) . Al menos 500
células por muestra fueron fotografiados en Leica TCS SP5 o Leica DM 5500 microscopios, caracterizan y
se contaron.
2.4. Todo el montaje inmuno Florida fluorescencia
Las muestras fueron brie Florida y se relajó en uretano 2%, fi fijos durante la noche a 4 ° C en 4%
PFA, se lavó extensivamente en metanol y se almacena a - 20 ° C. Después de la rehidratación y
lavados en PBS, las muestras fueron entonces permeabilized y se bloquearon durante una hora en
2% de BSA, PBT1% (PBS, Triton-X100 al 1%) se incubaron durante la noche a 4 ° C en el anticuerpo
anti-histona H3 fosfo-S10 (pH 3 , mAbcam 14.955, 1: 1000) o el anticuerpo anti-GFP (Novus
Biológica, NB600-308, 1: 600), se lavó y se detectó con el anticuerpo anti-ratón Alexa555 (Invitrogen,
A-31570, 1: 400) y el contra -rabbit Alexa488 (Invitrogen, A-21206, 1: 400) anticuerpos
respectivamente. Para BrdU inmunotinción, las muestras se trataron durante 30 min en HCl 2 N, se
lavaron en PBS y se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo de ratón antiBrdU (como
anteriormente), se lavaron y se detectaron con el anticuerpo anti-anticuerpo de ratón Alexa555 (1:
400) . Después de la tinción DAPI (1: 5000, 20 min), las muestras se representa con los microscopios
confocales SP8 Leica DM5500-B o Leica.
2.5. Los análisis de citometría de flujo (FC)
El procedimiento FC se detalla en ( Buzgariu et al., 2014 ). Grande
budless animales se utilizaron en todos los experimentos por cuadruplicado para
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cada condición. Dos regiones adyacentes, 0,5 - 1 mm de espesor cada uno, se cortaron en 20
animales en regeneración en cada punto de tiempo y rodajas de 3 o 4 animales fueron utilizados
para cada réplica (ver Figura 1 DO). signi estadística fi valores Cance (disponible en Tabla S1 ) Se
calcularon mediante la realización sistemática Welch dos muestras t- prueba en intervalos de tiempo
sucesivos y corregir las múltiples pruebas usando la Tasa de Falso Descubrimiento enfoque (FDR) ( Benjamini
y Hochberg, 1995 ). Para tejidos HUtreated, los tejidos gástricos de 4 a 5 animales se agruparon
juntos.
2.6. La hibridación in situ (ISH)
HM-105 animales eran relajado en uretano 2%, fi jos en PFA 4% cuatro horas a TA, se transfirió
a metanol a - 20 ° C y se procesó como en
Gauchat et al. (2004) .
2.7. análisis de RNA-seq
Hv_Jussy animales fueron utilizados para la preparación de ARN a partir de tejidos
et al., 2014, 2016 ). queso Brie Florida y, todas las muestras se colocaron en RNALater (Qiagen) y el
ARN total se extrajo la (mini kit RNAeasy, Qiagen) mismo día. Todas las condiciones fueron
recogidos por triplicado biológicos más de di ff Erent semanas. Las bibliotecas se prepararon con el
protocolo de baja TruSeq muestra total preparación de ARN de Illumina (San Diego, CA, EE.UU.).
Grupos de cuatro a fi cinco bibliotecas multiplexados se cargaron por carril de un HiSeq. 2500
secuenciador (Illumina) y secuenciados hasta 100 nt (single-end). El resto de los adaptadores y los
líderes trans-empalmados conocidos ( Derelle et al., 2010 ) Fueron retirados de lecturas de
secuenciación usando cutadapt 1.11 ( Martin, 2011 ). Transcripciones niveles de expresión se
estimaron en el Hv_Jussy transcriptoma de referencia mediante el uso de Salmon 0.7.2 con el - seqBias
y - Opciones gcBias encendidos ( Patro et al., 2017 ); DESeq. 2 ( Amor et al., 2014 ) Se aplicó para la
normalización de la biblioteca y pruebas estadísticas. Un manuscrito que detalla todo el análisis del
transcriptoma está en preparación y estará acompañado por una liberación completa de los datos y
el código utilizado para su procesamiento (Wenger et al., En preparación).
2.8. Mapas de calor: la selección transcripción de datos y representación
Una lista de referencia de 202 Hidra genes asociados con el ciclo celular, la proliferación celular
se recuperó de la página web de UniProt ( El UniProt, 2017 ) ( Tabla S2 ). Esta lista fue curada
manualmente, 36 genes que codifican marcadores de tipo celular y los genes regulados durante la
cabeza o el pie de regeneración se añadieron como controles, algunos de ellos asociados con el
ciclo celular.
Hv_Jussy ortólogos utilizados para la cuantificación de ARN-seq fi cationes se obtuvieron utilizando BLAST
alineaciones ( Camacho et al., 2009 ). 95 genes seleccionados utilizando una prueba de razón de
verosimilitud como se aplica en DESeq. 2 (P adj < 10 - 3),
tener por lo menos una muestra con más de 50 lecturas asignadas y muestran una significante fi variación
no puede durante la cabeza o el pie condición de regeneración (HR50 o FR50). Para la representación
de datos, se utilizaron valores de la mediana de las bibliotecas normalizadas para cada condición,
registro 10 ( count + 1) Los datos fueron normalizados por la transcripción (es decir, que conduce a una
media de 0 y una desviación estándar de 1 para cada transcripción / filas en cada uno de los dos mapas
de calor). La agrupación de genes con patrones de renovables similares se determinó manualmente.
3. resultados
3.1. eventos mitóticos síncronos en la fase temprana de regeneración de la cabeza
Embaucar fi rm que una onda de la división celular sincrónica está teniendo lugar en la región de
la herida ( Chera et al., 2009, 2011 ), Se midió por Florida ow citometría de la progresión del ciclo
celular durante el fi primeras 24 h después de la amputación midgastric en la punta de regeneración
apical (R4) y en el
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región subyacente (R5) ( Figura 1 DO). Early después de bisección (entre 4 y 6 hpa), nos dimos
cuenta en R4 un signi fi gota no puede en la fracción de células G2 / M, y un aumento concomitante de
células en fase S en dos cepas distintas,
HM-105 y SF-1, dentro SF-1 animales una disminución de células G2 / M desde
32,6% a 16,3% y un aumento de células en fase S de 30% a 36,4%. Esta regulación sincrónica es
visible en la región R5 pero menos llamativa. También probamos si esta regulación se lleva a cabo en
animales epiteliales. Para ello, se utilizó choque térmico SF-1 animales bisectados 11 días después de
choque térmico, que regeneran e FFI cientemente, aunque con un retardo ( Figura 1 C, Suplemento Fig.
S1 ). Como era de esperar por la ausencia de células en ciclo rápido, el pro ciclo celular fi les de los
tejidos gástricos desde epitelial intacta Hidra es distinta de la registrada en de tipo salvaje Hidra, con
57% de células que se encuentran en G2, 17% en G0 / G1 y 26% en la fase S. Durante la
regeneración, este patrón ciclismo es bastante estable, tanto en las regiones de R5 más de la R4 y fi primera la expresión del gen celular glándula Kazal1 se reduce progresivamente durante la cabeza y la
12 hpa, a continuación, seguido por una reducción drástica de la fracción de células G2 / M a 16 hPa,
concomitante con un aumento en G1 y fracciones de células en fase S. Por lo tanto, de manera similar
a la condición de tipo salvaje, pero con un retraso de 10 h, las células epiteliales de la punta de
regeneración de los animales calor conmocionado sincrónicamente se dividen y el progreso a través
del ciclo celular. Este resultado está de acuerdo con un estudio previo que se evidencia en el epitelio
Hidra bisecado en la tercera un aumento superior en la proliferación de células en puntas de la
cabeza de regeneración a partir de 18 hpa para alcanzar un máximo a 36 hPa ( Holstein et al., 1991 ).
Como un enfoque complementario, detectamos células que entran en mitosis en enteros monturas
animales con una específica anticuerpo fi c a Histona 3 fosforilada en Ser10 ( Crosio et al., 2002 ) Y se
encontró un mayor número de células positivas en las proximidades de la zona más apical a 6 hpa ( Figura expresión y que identi fi ed fi ve di ff tipos Erent de modulaciones de genes ( Figura 2 DO, Tabla S2 ). los fi Tipo
1 RE).
A continuación, probamos el efecto de bloqueo mitótico en la regeneración cabeza mediante el tratamiento
de los animales con el nocodazol veneno mitótico (NDZ), que no es tóxico para las Hidra cuando se administra
durante 33 h en 1,4 nM pero sólo induce un bloqueo transitorio ( Buzgariu et al., 2014 ). NDZ administrada
inmediatamente antes o después de mediados de bisección gástrica de manera similar retrasa la regeneración
de la cabeza ( Figura 1 MI). Sorprendentemente, el tratamiento NDZ pre-amputación parece retrasar más
fuertemente la activación de regeneración de la cabeza después de la decapitación (HR80) que después de
bisección mediados de gástrico (HR50), lo que indica que los acontecimientos mitóticos probablemente
contribuyen a la cabeza de regeneración después de la decapitación ( Figura 1 F). Por lo tanto, el evento mitótico
temprana que tiene lugar durante la regeneración cabeza temprano, probablemente juega un papel en la
regeneración de la cabeza, proporcionando células post-mitóticas listo para di ff erentiate y formar estructuras
apicales, sino también las células que mantienen el ciclismo.
3.2. reglamentos espaciales y temporales de los genes vinculados a la progresión del ciclo celular
A continuación, queríamos probar cómo se regulan los genes relacionados con la progresión del
ciclo celular durante Hidra regeneración. Nos extendió un estudio que informó previamente los datos de
RNA-seq durante la regeneración de la cabeza después de la decapitación ( Petersen et al., 2015 )
Mediante la realización de un análisis exhaustivo RNA-seq en condiciones homeostáticas y regenerativos
(YW, en preparación). Este experimento se diseñó para proporcionar una vista detallada de las
regulaciones transcriptomic espaciales y temporales durante la regeneración cabeza después de la
decapitación (nombrado HR80), así como durante la cabeza y la regeneración pie después de bisección
mediados de gástrico (HR50 y FR50 respectivamente, ver Figura 2 A, B). Nos centramos aquí en 202
genes que codifican proteínas asociadas con la progresión del ciclo celular, ya sea expresa en las células
de ciclismo en Hidra o identi fi ed como ortólogos a genes humanos que codifican componentes de la
maquinaria del ciclo celular o reguladores de la proliferación celular. Para validar el procedimiento de
RNA-seq, también hemos añadido 35 genes de control conocidos anteriormente como componentes del
organizador cabeza, o marcadores de especi fi linajes de células c ( Tabla S2 ). Nosotros fi primera
examinado los genes conocidos por estar involucrados en la formación del organizador cabeza y observó
como se esperaba, una regulación temprana durante la regeneración cabeza, como se observa para Wnt3,
uno de los genes upregulated más temprana ( Lengfeld et al., 2009 ), TCF ( Hobmayer et al., 2000 ),
hyBra1 ( Technau y Bode, 1999 ), hyBra2 ( Bielen et al., 2007 ), prdl-a
( Gauchat et al., 1998 ), cnNos2 ( Mochizuki et al., 2000 ) ( Figura 2 C, luz
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los nombres de genes verdes). Para todos estos genes, la sobre regulación se produce más rápidamente
después de la decapitación de bisección mediados de gástrico, de acuerdo con estudios anteriores ( Lengfeld et
al., 2009 ) Y el hecho de que la regeneración procede más rápido después de la decapitación que después de
mediados de bisección gástrico. Los genes expresados ​en linajes intersticiales apicales, tales como CNOT o cnox-2,
implicados en la neurogénesis apical ( Miljkovic-Licina et al., 2007 ), cnASH
en nematogenesis ( Grens et al., 1995 ) o RFamide en el terminal di ff células nerviosas erentiated ( Darmer
et al., 1998 ), Exhiben una expresión predominantemente apical en animales intactos, hasta reguladas
en una etapa tardía de la regeneración de la cabeza ( Figura 2 C, oscuro nombres de genes verdes).
Un modelo homeostático y regenerativa similar se encontró para Inx1, que codifica la proteína Innexin1
detectó en uniones intercelulares de las células epiteliales ( Alexopoulos et al., 2004 ). Por el contrario,
regeneración pie, como células de la glándula, abundante en la columna de la carrocería, conseguir
excluidos progresivamente de la regeneración de extremidades que di ff erentiate ( Chera et al., 2006 ).
Todos estos resultados ARN-ss son consistentes con los patrones de expresión previamente
publicados.
A continuación, analizamos el conjunto de datos que comprende los genes asociados con la
progresión del ciclo celular, y pareció que la mayoría de estos genes predominantemente expresados ​en
la columna de la carrocería, con baja o indetectable expresión en la región apical ( Figura 2 C, los nombres
de genes rojos). Esta fi hallazgo fue anticipado, como la proliferación celular está ausente o limitada en los
polos apical y basal. Durante la cabeza y / o regeneración del pie, encontramos 86/202 genes del ciclo
celular putativo que muestran estadísticamente significativa fi cativos variaciones de sus niveles de
de primera corresponde a una la regulación del pulso inmediatamente temprano genérico, es decir, genes
inmediatamente (de 2 a 8 hpa), pero transitoriamente y de manera similar hasta reguladas en todas las
condiciones de regeneración, lo que representa la primera ola de regulación observada en este conjunto
de datos. Estos genes codifican en su mayoría factores de transcripción (Brf1, CREB1, CREB3l1,
CREB3l3, Gli3, KLF11, etiquetado como genes inmediatos en Figura 2 C) sino también el de detención del
crecimiento-2 como la proteína GAS2L1 y la histona H2B. Esta regulación de impulso también se observó
para 43 genes immunerelated ( Wenger et al., 2014 ) Y aparece vinculada al proceso de cicatrización de la
herida en lugar de a la adquisición de la cabecera o pie identidades.
El segundo comportamiento corresponde a una regulación al alza temprana y sostenida de los
ocho genes, ING4, NFIC, FGFR, TUSC2, TUBGCP2, City College, CDK9, CDC42, detectado en 8 - 16
hpa, a menudo más pronunciada en HR50 que en HR80 tejidos. En la comprobación pro persona fi les,
esta regulación es el más llamativo de FGFR, NFIC, TUSC2 y
TUBGCP2 ( Suplemento Fig. S2 ). Curiosamente, la regulación de
NFIC y TUBGCP2 parece ser sensible al nivel de amputación, con regulaciones más arriba, entre 16
y 24 hPa después de mediados de amputación que gástrica después de la decapitación. NFIC, que
se expresa en niveles muy bajos en intacta Hidra, codifica el Factor Nuclear 1 de tipo C que regula la
replicación de la transcripción y el ADN en mamíferos, mientras
TUBGCP2 que codifica el componente complejo gamma-tubulina 2, es necesaria para el proceso de
nucleación de los microtúbulos de todo el centrosoma, por tanto, posiblemente implicados en el
ensamblaje del huso mitótico.
La tercera corresponde a la conducta una regulación temprano-tardío de 17 genes del ciclo
celular, Shox1, E2F7, TFDP1, POLQ, CCNF, PLK4, CCNE1, CCND2, Cdc7, SIPA1L3, MCM5,
DLEC1, MCM9, CDC6, CCNA2, CCNB3, PLK1, observado entre 16 y 24 hPa. Como era de esperar
de los genes implicados en la proliferación celular, todos estos genes excepto POLQ, SIPA1L3,
DLEC1 están excluidos de la región apical en animales intactos. Además, como ya se observó, la
sobre regulación de CCNA2, CCNB3, CCNF, CDC6, MCM5, MCM9, Plk1 es mayor cuando la
amputación se lleva a cabo en 50% (HR50, FR50) que en consejos de regeneración HR80. Varios
genes están también regulados hasta en una etapa tardía aunque expresado a niveles más altos en
la región apical: CDKL5, DAB2IP, TTC28 posiblemente están involucrados en la mitosis, así como TMEM30A
inicialmente llamado ciclo celular proteína de control 50A.
Por último, como cuarto comportamiento, señalamos que, paralelamente a estas regulaciones
ascendentes primeros y principios y finales, 30 genes del ciclo celular, expresados ​en condiciones
homeostáticas en la columna del cuerpo y poco o nada en absoluto
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Figura 2. Pro expresión fi les de los genes del ciclo celular durante la cabeza y el pie de regeneración. (A, B) Diseño experimental para producir RNA-seq pro expresión fi les en homeostático (A) y condiciones de regeneración (B). Para la regulación espacial
en estado homeostático, fi VE rebanadas fueron disecados de 25 animales intactos como se representa. Para la regulación temporal durante la regeneración, piscinas de 25 animales se seccionaron transversalmente a 50% (mid-gástrica) o 80%
(decapitación) del total de sus alturas y se dejan regenerar para tiempos que varían de 0 a 48 h. puntas de la cabeza de regeneración (~ 500? M) desde el 50% (HR50) y los niveles de 80% (HR80), así como consejos pie de regeneración desde el nivel de
50% (FR50) se recogieron entonces y se utilizan para RNA-seq. Todas las condiciones se prepararon por triplicado biológicos. (C) Heatmaps que representan la pro expresión homeostático y regenerativa fi les de 95 genes relacionados con el ciclo celular
(rojo), cabeza-organizador (verde claro), de tipo celular específico fi c marcadores (verde oscuro) y de señalización factores moléculas / de transcripción (negro). Vea la sección de materiales y métodos para más detalles. Las estrellas indican una
transcripción dada la significación estadística fi cado de las modulaciones observados en el contexto homeostático en todos fi ve condiciones (ANODEV, * P adj < 10 - 5; ** PAG adj < 10 - 10; *** PAG adj < 10 - 20). Barras de la derecha indican las regulaciones temporales
predominantes observadas durante la regeneración de genes agrupados, sobre fondo azul, sobre fondo rojo. Ver secuencias y números de acceso en Tabla S2 , Pro persona fi les en Fig. S2 .

en las extremidades, presentan una progresiva regulación a la baja durante la cabeza y la
regeneración pie. Se espera que este silenciamiento como el tejido gástrico se convierte
progresivamente en terminalmente di ff estructuras que caracterizan los polos apical y basal
erentiated. Durante varios genes tales como
BOD1, CINP, CNPPD1, MRE11A, ORC5, TOP3A, este proceso silenciamiento procede más
rápidamente durante el pie de regeneración de la cabeza, un di ff la regulación diferencial de acuerdo
con el hecho de que la regeneración del pie es más rápido. Por otro subconjunto de genes, CCNK,
CINP, E1F3H, Lin37, Myc1, MYC2, pa2g4, Pax-A, PCNA, POLD1, POLD2, RAD51, RAD17, RFC2,
RRM1, ZNF845, pudimos observar sutil di ff erences entre HR80 y HR50 regeneración de
células, lo que indica que las células epiteliales continuamente expuestos a HU superar sus e
anti-proliferativa ff ect como se informó anteriormente ( Clarkson, 1969b ; Cummings y Bode, 1984 ).
Para evaluar el correo FFI ciencia de la detención del ciclo celular inducida por HU, que supervisa el
pro DNA fi les de las células de HU-tratada SF-1 (pólipos Higos. 3 MI, 3 F, Suplemento Fig. S3 SEGUNDO).
Durante el tratamiento HU, dado ya sea como 3 pulsos o de forma continua, se registró un
incremento gradual en las células Sphase, mientras que las células / M-fase G2 permanecen más o
menos constante ( Fig. 3 MI,
Fig. S3 SEGUNDO). Como se esperaba, la fracción G1 / G0 disminuye drásticamente del 46% al 27% en el fi primeros

extremidades, el proceso de silenciamiento se produce poco antes en HR80. esta di ff diferencial baja cuatro días debido a la pérdida de células intersticiales, a

regulación entre HR50 y HR80 podría indicar que la proliferación celular es más intenso y persiste fi nalmente se mantienen constantes. Inmediatamente después del tratamiento HU de tres ciclos, se registró 54%

más tiempo después de mediados de gástrico una bisección central que después de una de las células en la fase S, 22% en / M-fase G2 ( Fig. 3 E, izquierda). A-1 día después de la liberación, más del

decapitación distal, lo que sugiere de nuevo modulaciones dependientes de la posición de ciclo 50% de células epiteliales aún permanecen en Sphase, mientras que en días-3 posterior a la liberación, la

celular. mayoría de las células han dejado Sphase (ahora hasta 22%) y la pausa en G2 (> 50%) . Cuando el tratamiento

HU se mantiene 2 días más, las células también escapar de la detención de la fase S, pero un día más tarde ( Fig.

En total, estos resultados muestran que sólo unos pocos genes con función ciclo celular putativo 3 E, derecha).

están regulados a la primera fase de regeneración, lo que sugiere que el evento mitótico observado es
más bien mediada por las regulaciones postranscripcionales o post-traduccionales en lugar de por los
cambios en la expresión génica. Por el contrario, 17 genes están regulados en el período earlylate
cuando se produce el ciclo celular, mientras que progresivamente alrededor de 30 genes de ciclismo
que son activos en la columna de la carrocería homeostático consiguen silenciados. Estas regulaciones
apuntan a una regulación coordinada del ciclo celular en esta especificación fi fase c de la regeneración.
3.3. Procedimientos para bloquear la proliferación celular sólo están transitoriamente correo FFI ciente en los
Para caracterizar adicionalmente la estabilidad de la pausa inducida por HU, que supervisó
durante ocho días el pro DNA fi les de los animales tratados con HU o bien liberados de la exposición
HU ( Fig. 3 F, a la izquierda, Fig. S3 B) o continuamente expuesta a HU ( Fig. 3 Susto). Durante el fi dos
primeros días, el patrón del ciclo celular sigue siendo similar entre las dos condiciones, con una
disminución lenta de la proporción de células en fase S, una disminución mantiene constante y
paralelo para las dos condiciones más de los siguientes días. De día-3 en adelante, el G0 / G1 y G2 /
M poblaciones parecida aumentan en ambas condiciones, lo que sugiere que a pesar de la
exposición continua HU, las células escapan de detención replicación del ADN, progresan a través
del ciclo celular y llegar a la G2-etapa. Sin embargo entre el día-4 y día-

tejidos Hydra

8, el aumento de la G2 / M fracción es más limitada para las células continuamente expuestos a HU,
A continuación se investigó el impacto de la detención del ciclo celular en la regeneración de Hidra después
mientras que las células en G1 / G0 exceden 30%. Este experimento demuestra que una exposición
de mediados de bisección gástrica. Como un fi paso primero, que Verí fi ed el e FFI ciencia de los enfoques
prolongada HU no conduce a una pausa de la fase S sostenida (sólo 20% de células en fase S en
farmacológicos utilizados para detener, o al menos la pausa, progresión del ciclo celular en Hidra. Nosotros fi primero
día-8), pero parece promover, en ~ células epiteliales 10%, una detención en G1 / G0. Por lo tanto, el
aplica el de tres ciclos tratamiento clásico HU ( Bode et al., 1976 ) a Hv_AEP animales de la
ciclo de las células epiteliales bajo exposición prolongada HU es probable anormal.

cnnos1: eGFP cepa transgénica, que expresan constitutivamente GFP en sus ISC ( Hemmrich et al., 2012 ).
Tal HU tratamiento e FFI cientemente elimina las células en ciclo rápido como ya se ha visto a tres días
después de la liberación del fármaco cuando el número de células GFP + se reduce drásticamente, muy
pocos sobreviviente después de siete días ( Fig. 3 UN). También QUANTI fi ed los diversos tipos de células de
la columna de cuerpo de Hv_Basel animales en varios puntos de tiempo de tratamiento con HU ( Fig. 3 SEGUNDO).
Hemos tomado nota de la rápida pérdida de todas las células intersticiales ya después de una sola
exposición HU, la supervivencia de las células de la glándula y el predominio progresivo de las células
epiteliales que alcanzan el 75% de todos los tipos de células después de tres exposiciones HU.
Mediante la realización de un corto BrdU-etiquetado en animales intactos tomadas en varios puntos de
tiempo después del tratamiento HU, que con fi confirmado la Sphase pausa transitoria de las células
supervivientes. Inmediatamente después de la liberación HU, las células marcadas con BrdU no pueden ser
detectados mientras que unos pocos se hacen visibles un día después, y numerosas células positivas para
BrdU rellenar la columna del cuerpo de los animales tratados con HU en día-3, lo que indica que las células
supervivientes se han reanudado progresión del ciclo celular ( Fig. 3 C, Suplemento Fig. S3 UN). Para probar si
las células epiteliales reanudar ciclismo en presencia de HU, el tratamiento de tres días se ha descrito
anteriormente fue seguido por un continuo de cuatro días de exposición HU asociado a BrdU ( Fig. 3 RE).
Mediante la cuantificación de los tipos de células que sobreviven con tejidos macerados y midiendo el índice
de BrdUlabeling, hemos observado, como se esperaba, una reducción drástica de las células intersticiales,
pero también cuenta entre las células epiteliales 12% BrdU-positivas
3.4. Epitelial bloqueo S-fase y la pérdida de células intersticiales-ciclismo rápido
impactan en la iniciación de la regeneración cabeza
Para evidenciar las respectivas impactos de la eliminación de las células intersticiales
fastcycling y del bloqueo del ciclo celular epitelial sobre la regeneración de la cabeza, que supervisó
varios parámetros de regeneración de la cabeza, i) la cinética de la iniciación de apical di ff proceso
erentiation ( fi apariencia primera de rudimentos de tentáculos), ii) El e FFI eficiencia de regeneración
de la cabeza después de 6 días ( presencia o no de tentáculos que rodean la hypostome), iii) el
número de tentáculos que se forman dentro de los 6 días ( tentáculos más largos que el diámetro
apical del animal). Estos parámetros fueron fi primera medida en termosensible SF-1 animales
expuestos ya sea a un tratamiento HU de tres ciclos antes de bisección mediados de gástrico, o para
un tratamiento continuo HU después de bisección, o a una combinación de ambos, antes y después
de bisección ( Fig. 4 UN). Como control, se utilizó SF-1 animales un choque térmico durante 62 h antes
de bisección, como el HS conduce rápidamente a la degeneración de las células intersticiales sin ff eja
la progresión del ciclo celular ( Marcum et al., 1980 ). Al igual que los animales del SA, el SF-1 animales
expuestos a tratamientos HU sólo antes bisección gástrica mediados de regenerarse por completo
sus cabezas dentro de los seis días, pero iniciar el proceso con un retraso de un día, en comparación
con

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Fig. 3. pausa de la fase S transitoria en los animales tratados con HU. (A) Pérdida progresiva de la CSI que expresan GFP en transgénico cnnos1: eGFP AEP Los animales expuestos a tres pulsos HU. Las flechas rojas: la alimentación, puntas de flecha verde: imaginando días. (B) Tipo de

célula identi fi cación y cuanti fi catión después de la maceración de la columna de cuerpo central de Hv_Basel animales en los puntos de tiempo indicados durante y después de tratamiento con HU (realizada como en a). (C) Reversible detención de la fase S después del tratamiento HU tal

como se detecta mediante marcaje BrdU realizado durante 2 h a indicados los puntos de tiempo (barras rojas). (D) la detención Reversible-fase S en las células (puntas de flecha blancas) de los animales continuamente expuestos a HU tal como se detecta mediante marcaje BrdU realizado

durante 4 días (barra verde). (E, F) La citometría de flujo análisis del contenido de ADN de las células (FC) de la columna central de cuerpo de SF-1 animales disecados en indicados los puntos de tiempo durante o después del tratamiento con HU. puntas de flechas negras indican los puntos

de tiempo de análisis. Los experimentos mostrados en F se realizaron en paralelo y comparten el fi primer punto de tiempo. Tenga en cuenta que la acumulación de células en fase S observados después de un tratamiento con HU de tres impulsos no se mantiene independientemente de las

condiciones. Barras de escala: 1 mm (A), 100 m (C).

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Fig. 4. Impacto del ciclo celular haciendo una pausa en la regeneración de la cabeza. (A, B) Impacto de la fase S deteniéndose en apical di ff erentiation en SF-1 los animales tratados con HU y atravesada a media gástrico nivel como se indica en el esquema. Los

gráficos a la derecha (A) indican para cada condición de que el porcentaje de animales que regenera su cabeza en 7 dpa (barras azules, escala superior), y el número medio de tentáculos por animal (puntos verdes, escala inferior). (B) Aspecto de apical di ff erentiation

(al menos rudimentos de tentáculos), registrados en los animales, ya sea expuesto a HU como se representa en

A. (C) Aspecto de apical di ff erentiation registró en animales bisectados en varios puntos de tiempo después de la liberación HU. (DG) Impacto de pausa de la fase S en apical di ff erentiation en Hv_Basel
animales continuamente expuestos a HU durante 7 días y atravesada a media gástrico nivel en varios puntos de tiempo durante el tratamiento con HU (como se indica en el esquema). (E) Aparición de apical di ff erentiation registrada en animales HU-tratado
como se describe en D. Ver información complementaria acerca de la finalización de apical di ff erentiation en la figura-S4. (F) número tentáculo contaba con cada animal a las 6 dpa representado como un punto negro. El valor medio para cada condición se
representa como un punto rojo. rudimentos tentáculo más pequeños que el diámetro apical del animal regeneración fueron considerados como no tentáculo. (G) células detectadas después de un 4 h BrdU-etiquetado realizó en el día-7 de regeneración de la
cabeza en proliferación. Tenga en cuenta el alto número de células en fase S en las condiciones de HU7 / 0 y 5/2 y el bajo número de células en fase S en la condición HU1 / 6 y HU0 / 7. (H) índice de BrdU-etiquetado medido en un solo y pares de células
intersticiales (IC), grupos de nematoblasts (NB) y células epiteliales (EP). Los animales fueron decapitados o bien (HR80) o bisecaron a media gástrico nivel (HR50), luego a la izquierda para regenerar durante 26 o 34 h, se expusieron a BrdU durante dos horas
hasta que las puntas de regeneración eran fi finalmente amputada y maceraron a 28 o 36 hPa. La caída en el ciclismo células intersticiales (IC) en la condición HR80 es altamente signi fi peralte (* adj. p-valor = 0,0005838).

animales no tratados o con los animales tratados Solo después bisección. Además, exhiben una decapitación (Suplemento Fig. S1 UN). Este estudio muestra que una corta exposición (16 o 24 o 48
ligera reducción del número de tentáculos wellpatterned ( Higos. 4 UN, 4 B, Suplemento Fig. S1 SEGUNDO).h) antes de la decapitación combinado a una exposición continua post-bisección HU no parece una ff ect
Por el contrario, la mayoría de los animales expuestos a HU antes y después de bisección no se regeneración de la cabeza. Sin embargo, cuando la exposición pre-bisección dura 3, 4 o 5 días, el e FFI
regeneran su cabeza, 39% animales que presentan algunos rudimentos de tentáculos, creciendo en eficiencia de regeneración de la cabeza se reduce progresivamente, muy bajo después de fi cinco
promedio un tentáculo por regenerado. Estos resultados son completamente coherentes con los días cuando sólo el 20% animales regeneran cabezas anormales equipados con un único tentáculo.
Sin embargo este tipo de tratamientos son largos
obtenidos por Cummings y Bode (1984) , Que supervisa la regeneración de la cabeza después de decapitación,
en los animales continuamente expuesta a HU cualquiera antes de, o después, o antes de y después
fi rst parcialmente ine FFI ciente en términos de inhibición de la síntesis del ADN (ver resultados en Fig.
3 ) Y probablemente tóxicos, induciendo así no fisiológico

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condiciones para la regeneración como se observa por Cummings y Bode (1984) .
El hecho de que el inicio de la regeneración se retrasa cuando se da HU antes de bisección, de
manera similar a la situación observada en heatshocked SF-1 animales, donde no parece que el ciclo
celular de una ff reflejada ( Buzgariu et al., 2014 ), Sugiere que la pérdida de ciclismo células intersticiales
en lugar de la fase S epitelial deteniéndose impactos de la activación de la regeneración de la cabeza.
Para probar si los animales reanudación de proliferación de células epiteliales después de un tratamiento
con HU de tres ciclos todavía exhiben una iniciación retardada de la regeneración de la cabeza, que
bisecado animales HU-tratada ya sea inmediatamente después de la liberación del fármaco, cuando la
mayoría de las células están detenidas en Sphase, o un día después cuando las células reanudar la
progresión del ciclo celular, o tres días más tarde de la fase S cuando las células epiteliales más han
escapado y hacer una pausa en G2 ( Fig. 4 DO). Encontramos la cinética de regeneración cabeza más o
menos similares entre estas tres condiciones, lo que indica que, o bien el nivel rescatado de la
proliferación epitelial no es su FFI ciente para rescatar el retardo de la regeneración, y / o que la pérdida de
las células intersticiales de ciclismo su FFI CES para retrasar el inicio de regeneración cabeza.
Para diseccionar más los respectivos impactos de la pérdida de células epiteliales e
intersticiales pausa S-fase en el proceso de regeneración, sometimos
Hv_Basel animales a HU durante 7 días de forma continua, y atravesada los animales en el nivel
medio-gástrica en di ff veces Erent durante el tratamiento ( Fig. 4 RE). De esta manera, el número total
de días pasados ​en HU es el mismo en todas las condiciones, pero los animales están expuestos a
HU durante periodos de tiempo variables antes y después de la amputación. Como en los
experimentos indicados anteriormente, sólo los animales expuestos a HU para 5 o 7 días antes de la
amputación (condiciones HU7 / 0, HU5 / 2) muestran un retraso de un día en la iniciación de la
regeneración ( Fig. 4 MI). Además de la terminación de la di ff erentiation de las estructuras apicales es
también una ff refleja en estas dos condiciones, como se evidencia por el menor número de tentáculos
por animal registrado a los 6 DPA, 3,49 y 3,36 tentáculos por animal respectivamente, frente a 5,11
en los animales no tratados ( Fig. 4 F). De hecho, una pequeña fracción de estos animales parece
incapaz de regenerar una cabeza completa (Suplemento Fig. S4 ). Por contraste animales expuestos
a HU poco antes y después de bisección (condición HU3 / 4) o sólo después de bisección
(condiciones HU1 / 6, HU0 / 7) no muestran ningún retraso en la iniciación de la di ff erentiation de las
estructuras apicales, pero mostrar un número intermedio de tentáculos (4,02, 4,30, 4,13 tentáculos
por animal, respectivamente) y en pocos casos un bloqueo de apical di ff erentiation, o degeneración
(1 caso). Estos resultados sugieren que la pérdida de células intersticiales en bicicleta por sí sola no
hace Do FFI ce para retrasar la iniciación regeneración de la cabeza y que la disminución inducida por
HU en el stock de células G2-en pausa epiteliales obtenido tras el tratamiento HU prolongada ( Fig. 3 F)
antes de bisección contribuye a retrasar la activación de regeneración cabeza.
Para probar el nivel de síntesis de ADN en cada una de estas condiciones, los animales se
incubaron en breve en BrdU 7 días después de la amputación ( Fig. 4 RE). Como era de esperar, se
observó células numerosos en fase S en las condiciones donde HU fue lanzado para varios días en
el momento de etiquetado BrdU (HU7 / 0, HU5 / 2) y mucho menos en condiciones en las que HU se
mantuvo después de bisección (HU1 / 6, HU0 / 7) ( Fig. 4 G, Suplemento Fig. S5 ). Estos resultados
indican que las células también escapar de la pausa de la fase S inducida por HU durante la
regeneración. Por el contrario, los procesos morfogenéticos que conducen de novo formación de la
cabeza permanecen e FFI ciente en condiciones en las que sólo unas pocas células progresan a
través del ciclo celular (condiciones HU1 / 6 y HU 0/7), lo que sugiere que la ola temprano-tardío de
la proliferación celular observada en cabezas presuntivos es prescindible para el patrón. Para
comparar los niveles de proliferación de células en la punta de regeneración en los dos contextos
(HR50 y HR80), los animales se incubaron en BrdU (5 mM) durante dos horas a partir de 26 y 34
hPa. Las proporciones de la proliferación de células intersticiales signi fi cativamente disminuye a
estos dos puntos de tiempo después de la decapitación, mientras que todos los tipos celulares
mantienen un estado altamente proliferativo durante HR50 ( Fig. 4 H). Por tanto, este resultado apunta
a una regulación temporal distinta de la proliferación celular de acuerdo con el nivel de bisección
como se evidencia por los datos de RNA-seq. En conjunto, estos resultados indican que la pérdida de
ciclismo células intersticiales antes de bisección, ya sea sobre SA o por tratamiento HU, retrasa la
activación de
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regeneración después de bisección mediados de gástrico, tal como se propone anteriormente en el
contexto de la regeneración de la cabeza después de la decapitación ( Marcum y Campbell, 1978a ; Cummings
y Bode, 1984 ), Mientras que grandes cantidades de ASCs disponibles en el momento de la amputación, a
saber ISC, favorecen una rápida activación de los procesos regenerativos. cuando se aplica después bisección,
el patrón de las estructuras apicales no es una ff ected por el tratamiento con HU, lo que sugiere un
mecanismo de regeneración que se aplica independientemente de la síntesis de ADN, a pesar de que la
síntesis de ADN se bloquea sólo transitoriamente a HU y las células epiteliales a mantener la bicicleta.
3.5. pausa del ciclo celular no impide la regulación de los genes del organizador o de modelado en
puntas de la cabeza de regeneración
A continuación se investigó si la lesión inducida por la sobre regulación de genes implicados en
la regeneración de cabeza se produce en ausencia de la proliferación celular. Para ello se
seleccionaron cuatro genes Wnt3, HyBra1 ( Technau y Bode, 1999; Lengfeld et al., 2009 ), Ambos
implicados en la formación temprana del organizador de la cabeza, cnox2, involucrada en el
temprano-fase tardía de la formación de la cabeza ( Miljkovic-Licina et al., 2007 ) y GOLPE-TF1 como
control gen expresado en grupos de nematoblasts a lo largo de la columna de la carrocería, pero no
se expresa en la cabeza ( Gauchat et al., 2004 ). Hemos seguido su expresión en los animales
expuestos-HU, a las 8 hPa para el
“ temprano ” genes Wnt3 y HyBra1, y en 32 hpa para la “ principios y finales ” gene
cnox2 ( Fig. 5 ). Los animales se bisecaron ya sea inmediatamente después de la liberación del fármaco
(detenido las células epiteliales de la fase S) o 72 h después (células epiteliales de nuevo a G2). En ambos
contextos, se han detectado Wnt3 y HyBra1
expresando-células en las puntas de regeneración, lo que indica que los tratamientos HU que inducen
pausa fase S y retrasan la activación de apical di ff erentiation no impiden que las células de puntas de la
cabeza de regeneración para expresar los genes de cabeza del organizador. Este resultado es
consistente con los experimentos de injerto que mostraron que la actividad del organizador no se abolió
en animales libres de los nervios ( Marcum y Campbell, 1978a ). Sin embargo, hemos observado un
dominio más amplio de la expresión cuando la amputación tuvo lugar inmediatamente después de la
liberación HU. En los animales amputada 72 h después de la liberación del fármaco, el dominio de
expresión de Wnt3
y HyBra1 es similar a la detectada en animales no tratados, pero la adición de HU inmediatamente
después de bisección parece su FFI ce para ampliar la expresión de dominio ( Fig. 5 UN). Por lo tanto,
si una exposición reciente a su HU FFI ces para ampliar el dominio de expresión de estos genes
tempranos, el tratamiento HU podría ya sea inducir una modi fi cación de la permeabilidad de los
tejidos, o de hecho modificar los patrones de expresión (véase abajo).
Como era de esperar, la nematoblast especí fi patrón de expresión c de cnox-2
y GOLPE-TF1 en el cuerpo de la columna se pierde al agotamiento intersticial, mientras cnox-2 y GOLPE-TF1
transcripciones detectadas en las células de la capa gastrodermal de puntas de la cabeza de regeneración
persisten en animales expuestos-HU ( Fig. 5 SEGUNDO). Como se observó para los genes tempranos,
animales fi fijo 72 h después de la liberación HU exhiben un menor nivel de expresión en la regeneración de
consejos que los animales expuestos a HU después de la amputación. Por lo tanto, una exposición reciente
a HU parece mejorar la expresión de gastrodermal cnox-2 y
GOLPE-TF1. Estos patrones apicales gastrodermal principios y finales no se ha informado
anteriormente, ni a favor cnox-2 ni por GOLPE-TF1
( Gauchat et al., 2004; Miljkovic-Licina et al., 2007 ). Sobre
cnox-2, que podría haber sido enmascarado por el patrón intersticial apical densa. Estos resultados
sugieren que además de una posible ubicua e ff ect de tratamiento con HU en la expresión génica, ya
sea la pérdida de células intersticiales, o la pausa de la fase S inducida por HU podría modular la
expresión de los genes expresados ​en la regeneración de puntas. El impacto del tratamiento HU en
la regulación de genes necesita ser explorado más.
4. Discusión
4.1. La región central de la columna de cuerpo Hydra, hecho de células G2paused, es un
pro-blastema
Este estudio muestra que la proliferación celular se produce en tres contextos distintos importantes
para Hidra regeneración de la cabeza: (1) antes de amputación
W. Buzgariu et al. Developmental Biology 433 (2018) 240-253

Fig. 5. HU-inducida por la pausa del ciclo celular no impide la sobre regulación de los genes del organizador y los patrones en puntas de la cabeza de regeneración. (A) Los patrones de expresión de Wnt3 y hyBra1

detectado en 8 hpa en animales expuestos o no a HU durante 4 días, bisecado inmediatamente o 72 h después de la liberación del fármaco, y se mantuvieron en HU-contenía medio durante 8 h (8 h) o no después de bisección. asteriscos blancos indican tinción

artefacto del disco basal. (B) Los patrones de expresión de cnox-2 y GOLPE-TF1 detectado en 32 hpa en animales expuestos o no a HU durante 4 días, bisecado inmediatamente o 72 h después de la liberación HU, y mantenido en HU-contenía medio durante 32 h

(32 h) o no. Las flechas blancas indican las agrupaciones nematoblast que son eliminados al tratamiento con HU; puntas de flecha negras a las transcripciones detectadas en las puntas de regeneración.

ción cuando ASCs activos se detuvieron en G2 formar un pro-blastema en la columna del cuerpo central, (2) poco
después de la bisección cuando las células se someten de forma sincrónica mitosis y (3) en el primera etapa
tardía cuando los genes implicados en la progresión del ciclo celular están reguladas up-en puntas de la
cabeza de regeneración, que precede a una onda local de la proliferación celular ( Fig. 6 ). Sin embargo, el
organización pro-blastema es probable que restringe a la columna de cuerpo central como en la
columna de la parte superior del cuerpo, se reduce la densidad de ISC, las células más intersticiales ya
que se cometen, listo para di ff erentiate ( David y Plotnick, 1980 ). En relación con el evento posterior a la
bisección temprana, sabemos que las células epiteliales son altamente resistentes a señales de muerte
celular

250
W. Buzgariu et al. Developmental Biology 433 (2018) 240-253

síntesis que no lleva a la muerte celular necesita ser realizada como una alternativa.

4.2. Una regulación dependiente de la posición de la proliferación celular durante la regeneración cabeza

El análisis transcriptomic realizado en condiciones homeostáticas y regenerativas sugiere un

Fig. 6. esquema Resumen que muestra las regulaciones celulares y moleculares vinculada a la proliferación celular en Hidra regenerar
su cabeza después de mediados de bisección gástrico. En condiciones homeostáticas, las células madre adultas abundantes
presentes en la región central de la columna de cuerpo se detuvieron en G2 y listo para dividir a la muerte celular inducida por
la lesión inmediatamente después de bisección (señal roja). En el primer periodo progenitores intersticiales migran hacia la
herida. En el período temprano-tardío (20 - 40 hPa) la sobre regulación de genes implicados en la progresión del ciclo celular
coordinado sobre regulación de los genes asociados con el ciclo celular a partir de 16 h después de
bisección, que precede a la proliferación de células epiteliales y intersticiales grabadas en las puntas
de la regeneración de la cabeza entre 20 y 30 hPa ( Figura 2 ). Estas regulaciones en la expresión
génica también sugieren que el programa proliferativo activado en el temprano-fase tardía de la
regeneración es distinta de la activo en la cabeza homeostático. Curiosamente, esta regulación
transcriptomic varía (i) con el programa regenerativa, más limitado en el caso de la regeneración del
pie, y (ii) con la posición de la bisección lo largo del eje para la regeneración de la cabeza, es decir,
más limitada después de la decapitación que después de bisección mediados de gástrico . El análisis
comparativo de los índices de BrdU de etiquetado en 28 y 36 hpa apoya el hecho de que la

precede a una onda de la proliferación celular que tiene lugar en las cabezas presuntivas. análisis Transcriptomic y celulares proliferación celular se ve reforzada o sostenida en la primera etapa tardía de HR50 pero se reduce
sugieren una regulación dependiente de la posición de la proliferación celular durante la regeneración cabeza, más intenso y drásticamente en ISC y IPs en HR80 condiciones ( Fig. 4 J). Nuestra hipótesis es que la intensidad de
sostenido después de bisección mediados de gástrico que después de la decapitación. apical di ff erentiation toma la proliferación celular en el temprano-fase tardía de la regeneración está vinculado con el tamaño de
progresivamente lugar desde el día-2 en adelante, directamente de G2 para las células epiteliales (pre-mitótico terminal de di ff erentiation),
la estructura para volver a crecer, redujo después de la decapitación donde sólo la cabeza necesita
post-mitóticamente para las células intersticiales.
para volver a crecer, mejorada o sostenida después de bisección mediados de gástrica cuando la
mitad de la cuerpo necesita para regenerarse. Tal regulación se documentó en cebra fi sh regenerar
su fi ns desde cualquiera de las posiciones amputación proximal o distal ( Lee et al., 2005 ). Si con fi confirmado,
esto significaría que la regulación de la proliferación celular se asocia con información posicional en Hidra.
( Chera et al., 2009 ), Probablemente como resultado de su pausa G2 en condiciones homeostáticas ( Buzgariu
En la cebra fi sh fi n, la actividad de la maquinaria de ciclismo está bajo el control de la señalización de
et al., 2014 ). En el momento de mediados de gástrico bisección, células del linaje intersticial, más
FGF, que proporciona información de posición a lo largo de la fi norte. En la misma línea, es
sensible a las señales pro-apoptóticas, se someten a la muerte celular y liberar factores como la
interesante observar que en
proteína Wnt3 que impulsa la división sincrónica de las células circundantes ( Chera et al., 2009, 2011 ).
Este proceso es apoyado por este estudio, que con fi rms que un evento mitótico síncrono temprana
tiene lugar en mitades de la cabeza de regeneración de tipo salvaje así como de los animales
epiteliales, aunque retrasado en este contexto más tarde ( Figura 1 ). Un pulso NDZ tratamiento dado
inmediatamente antes de bisección (decapitación o bisección mediados de gástrica) o después de
bisección mediados de gástrico retrasa de manera similar regeneración de la cabeza, lo que sugiere
Hydra, FGFR es di ff erentially expresado en FR50, HR50 y HR80 consejos ( Figura 2 ).
que la ola de la división mitótica observada en el período temprano contribuye a desencadenar el
proceso de regeneración. NDZ actúa como un agente antimitótico mediante la inhibición de la
formación del huso, lo que lleva en
4.3. La creación del organizador cabeza se produce independientemente de la proliferación celular

Hidra a la rápida acumulación de células en ciclo en G2-M ( Buzgariu et al., 2014 ). Sin embargo, NDZ
Este estudio también muestra que la sobre regulación de los genes implicados en el organizador de
también se conoce para alterar otros procesos no mitóticas, haciendo de este enfoque di FFI culto a
la cabeza o precoz tardía patrones cabeza tiene lugar incluso cuando las células se bloquean en la fase
analizar ( Verdoodt et al., 1999; Baudoin et al., 2008 ). Por lo tanto el siguiente paso será estudiar la
S ( Fig. 5 ). Junto con el hecho de que apical di ff erentiation, aunque retardada y / o reducida, puede tener
regulación de la progresión del ciclo celular in vivo con la ayuda de sensores moleculares ( van
lugar cuando el número de células capaces de proliferar es baja, este resultado indica que los animales
Rijnberk et al., 2017 ).
son capaces de di ff estructuras apicales erentiate en ausencia de la proliferación celular, probablemente
como una adaptación proceso. Por lo tanto están disponibles para la regeneración de la cabeza después
Curiosamente, la pausa de la fase S inducida por un tratamiento con HU aplica justo después de
de bisección mediados de gástrico varias rutas: una ruta rápida, que se toma cuando los animales
bisección no modifica la cinética de apical di ff erentiation, mientras que los tratamientos prolongados
pueden utilizar una de valores local preexistente de células proliferativas listos para dividir en la fase
iniciados al menos cuatro días antes de la amputación transitoriamente bloquean la iniciación de la
temprana, y producir nuevas células en la fase temprana-tardía seguido rápidamente por el di
regeneración de la cabeza ( Fig. 4 ). Dos eventos celulares distintas tienen lugar en paralelo al
coordinada ff erentiation de estructuras apicales ( Fig. 6 ). Como alternativa, los animales pueden tomar
tratamiento con HU, la pérdida completa de ciclismo células intersticiales observados dentro de los tres
una ruta más lenta cuando la proliferación celular está limitada o bloqueada, basándose
días, y la detención transitoria de la mayoría de las células epiteliales en la fase S observada después
predominantemente en coordinada di célula ff erentiation eventos. En el contexto de la decapitación, la
de tres días ( Higos. 3 SEGUNDO, 3 MI). Ambos procesos conducen a una disminución drástica de las
segunda ruta sería favorecido como la mayoría de las células de esta región ya se han comprometido a
células madre G2 en pausa, que nos dice que junto a la bicicleta ISC e IPS, un gran stock de células
di ff erentiate. El número de células disponibles para apical di ff erentiation en el momento de la bisección
epiteliales se detuvo en G2 es probable que sea necesario para iniciar la regeneración de la cabeza
mediados de gástrica podría ser un factor limitante para este proceso de adaptación, nos dimos cuenta
inmediatamente después de bisección midgastric. De acuerdo con este escenario, un tratamiento
el pequeño tamaño de los animales que no pueden regenerar sus cabezas (Suplemento Fig. S4 ). Por lo
continuo HU entregado después de bisección llega demasiado tarde para afectar las células en ciclo
tanto el número de células o tejidos tamaño podría ser otro factor importante promover la plasticidad
participan en la fase temprana de la regeneración de la cabeza. Aún así, es di FFI culto para ordenar el
observado en Hidra
impacto respectivo de estos dos eventos celulares. En cuanto a la fase temprana-finales donde se
detectan las células en proliferación en las puntas headregenerating, la observación de que las cabezas
se regeneran bajo un tratamiento continuo HU sugiere que la síntesis de ADN no es necesario ( Cummings
y Bode, 1984 ; este trabajo). Sin embargo, una importante di FFI cultad para concluir sobre el impacto de
la regeneración de la cabeza.
la síntesis de ADN viene del hecho de que las células escapan bloqueos del ciclo celular
farmacológicos ( Cummings y Bode, 1984 ; Buzgariu et al., 2014 ; este trabajo). Una inhibición genética
Expresiones de gratitud
de DNA

Esta investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (SNF otorga
31003A_149630, 31003_169930), el cantón de Ginebra y la donación Claraz. Los autores agradecen
a Joana Cruz y

251
W. Buzgariu et al.
Marie-Laure Curchod por su excelente apoyo técnico, Denis Benoni para un excelente cuidado de los
animales. Los cálculos se llevaron a cabo en la Universidad de Ginebra en el cluster de computación
de alto rendimiento Baobab.
Apéndice A. Información de apoyo
Los datos complementarios asociados a este artículo se pueden encontrar en la versión en línea
en doi: 10.1016 / j.ydbio.2017.11.003 .
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