UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE DE GROHMANN

ESCUELA DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

COLORACIÓN GRAM

COLORACIÓN GRAM

I. INTRODUCCIÓN:

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles

de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste
entre la célula y el medio que la rodea. El modo más simple de aumentar el
contraste es la utilización de colorantes.
Si se desea simplemente aumentar el
contraste de las células para la
microscopía, son suficientes los
procedimientos que usan un solo
colorante llamado tinción simple. Sin
embargo, a menudo se utilizan métodos que no tiñen de igual modo todas
las células, es el proceso denominado tinción diferencial. Uno muy usado en
microbiología es la tinción Gram. Basándose en su reacción a la tinción Gram,
las bacterias pueden dividirse en dos grupos: Gram positivas y Gram
negativas. Esta tinción tiene gran importancia en taxonomía bacteriana ya que
indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias.

II. OBJETIVOS:

 Distinguir dos tipos de bacterias utilizando la técnica de coloración Gram.

 Analizar la forma y las características propias de cada una de las bacterias
presentes en los alimentos.

III. FUNDAMENTO TEORICO:

COLORACION GRAM

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Las tinciones son extensiones de los cultivos bacterianos, fijadas usualmente y

teñidas. Las diferentes técnicas de tinción incluyen el tratamiento de
colorantes que se unen a ciertos componentes celulares, con lo cual se
produce una mayor absorción de la luz incidente, aumentándose el contraste.
Las células por lo general son transparentes e incoloras y para poderlas
observar se realiza un preparado microscópico, utilizándose colorantes con
una adecuada técnica de coloración.
Las diferentes técnicas de tinción incluyen los tratamientos con colorantes que
se unen a ciertos componentes celulares, con lo cual se produce una mayor
absorción de la luz incidente, aumentándose el contraste.

DIFERENCIAS RELATIVAS
T
I
N
C
I
O
N

G
R
AM:
Se usa (2 láminas), más de un colorante y se utiliza fundamentalmente para
diferenciar características morfológicas de los microorganismos y para
diferenciar distintos grupos bacterianos: organismos Gram positivos y Gram

negativos.

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CARACTERÍSTICA Gram-positivas Gram- negativas

Estructura de la Gruesa (15-80nm). Una Delgada (10-15nm) Triple

pared celular. sola capa (Monocapa). capa (multicapa).

Composición de la Baja en lípidos (1-4%) Alta en lípidos (11-22%)

P pared celular. Peptidoglicano presente Peptidoglicano presente:
R formando monocapa; es en uno capa misma rígida,
un componente muy poca cantidad, representa
E
importante que supone el 10% del peso seco. No
P
el 50% del peso seco de hay ácidos teicoicos.
A algunas células
R bacterianas. Ácidos
Susceptibilidad a la Más susceptibles. Menos susceptibles.
teicoicos.
A penicilina.
D El crecimiento es El crecimiento se retrasa El crecimiento se retrasa
frenado por notoriamente. menos.
O
colorantes básicos,
S por ejemplo el cristal
: Requerimientos
violeta. Relativamente complejos Relativamente sencillos.
nutricionales en muchas especies.
a) E
Resistencia a la Más resistentes. Menos resistentes.
N
rotura mecánica

FRESCO:
Son aquellos cuando la sustancia a examen se encuentra fija a la lámina
portaobjetos y está sumergido a una sustancia líquida y generalmente se
utiliza una lámina portaobjeto para la observación.

b) EN SECO:
Son aquellos cuando la sustancia examen se encuentra fija a la lámina
portaobjeto. La observación se hace generalmente con el objetivo de
inmersión debiendo emplearse previamente aceite de cedro. Los

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preparados en seco se hacen por extensión y frotis.

 EXTENSIÓN:
Consiste en extender la sustancia examen en la placa portaobjeto
tratando de hacerla al centro de la lámina, uniformemente y lo
más fino posible, utilizando para ello un asa de Koll.
 FROTIS:
Consiste en extender la
sustancia examen en la lámina
utilizando para ello dos
láminas portaobjetos. En el
tercio exterior de una de ellas
se coloca la sustancia examen (gota de leche por ejemplo).
Sobre la cual se coloca el borde de la otra lámina de tal manera
que se formen un ángulo de 45°C. Después de observar que la
sustancia examen se extiende por todo el borde de la lámina
superior deslizar esta hacia el otro extremo mediante un
movimiento rápido tratando de obtener un frotis fino y uniforme.

IV. MATERIALES Y REACTIVOS:

Microscopio
Asa de inoculación
Láminas de vidrio
Alcohol - Acetona o alcohol 95 °
Solución de cristal violeta
Solución de lugol
Solución de Safranina

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Aceite de cedro
Cultivos: Ejemplos: Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus
y Saccharoroyces cerevisiae.

V. PREPARACION DEL REACTIVO:

a) SOLUCIÓN DE CRISTAL VIOLETA:

Composición:
- Cristal violeta 2 gr.
- Alcohol etílico a 95 % 20 ml.
- Oxalato amónico 0,8 gr.
- Agua destilada 80 ml.
Preparación:
Disolver el cristal violeta en el alcohol y el oxalato amónico en el
agua destilada- Mezclar las dos soluciones y esperar 24 horas antes de
utilizar la mezcla.

b) SOLUCIÓN DE YODO (LUGOL):

Composición:
- Yodo 1 gr.
- Yoduro potásico 2 gr
- Agua destilada 100 ml.

Preparación:

Triturar el yoduro potásico y el yodo juntos en un mortero

añadiendo sucesivamente pequeñas cantidades de agua durante la
operación. Pasar la solución a un matraz volumétrico y enjuagar el

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mortero completando el volumen a 100 ml.

Nota : Puede utilizarse también la modificación de Gram de la

solución de Yodo de Lugol Esta solución es la misma que la de Burke,
excepto que la cantidad de agua es de 300 ml. en
lugar de 100 ml.

c) COLORANTE DE CONTRASTE:
Composición:
- Safranina 0,25 gr
- Alcohol etílico 10 ml
- Agua destilada 100 ml
Preparación:
Disolver la Safranina en el alcohol y mezclar la solución resultante
con el agua destilada.

QUE PASA CON LOS COLORANTES EN LAS TINCIONES:

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VI. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

TINCION GRAM:

a) Limpie 2 láminas portaobjetos

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b) Realizar en cada una un frotis de los cultivos indicados.

c) Secar; al mechero Bünsen a una temperatura moderada.
d) Pasando varias veces la lámina por la llama hasta que toda el agua sea
evaporada.
e) Recubrir la lámina con la solución de cristal violeta por 1 minuto.
f) Lavar suavemente con agua.
g) Recubrir con la solución de lugol por 1 minuto.
h) Eliminar el exceso.
i) Lavar suavemente con agua.
j) Decolorar con Alcohol-ácetona.
k) Lavar con agua para eliminar el exceso de la acetona residual.
l) Recubrir la lámina de safranina por 30 segundos.
m) Lavar suavemente con agua.
n) Secar con un papel de filtro o al calor del mechero.
o) Observar al microscopio con objetivo de inmersión (Emplear aceite de
cedro).

TINCIÓN DE ESPORAS:

MICROORGANISMO: (EJEMPLO BACILLUS THURINGIENSIS)

Las esporas se forman cuando las condiciones ambientales son desfavorables.
Las esporas aparecen al microscopio como estructuras refringentes y son de
difícil tinción. El verde de malaquita, en caliente, puede teñir la espora. El
colorante no muestra afinidad por la célula vegetativa.
Procedimiento:

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a) Hacer un frotis de un
cultivo en fase estacionaria.
b) Fijar por calor.
c) Cubrir con verde de
malaquita y calentar 5
minutos, de forma que,
sobre la llama, el colorante
haga humo. La muestra no
debe hervir ni secarse.
d) Lavar con agua.
e) Teñir 1 minuto con safranina.
f) Lavar con agua.
g) Secar y observar al microscopio.

VII. RESULTADOS: (SÓLO SON EJEMPLOS)

TINCION GRAM POSITIVAS:

Bacterias Escherichia coli

(GRAM NEGATIVAS) vistas
al microscopio tras ser
teñidas con la tinción de
Gram.

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TINCION GRAM POSITIVAS:

Bacterias Clostridium
perfringens (gram
positivas).

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VIII. CONCLUSIONES:
- Tanto las bacterias Gram positivas como las Bacterias Gram negativas
se presentan morfológicamente como cocos o bacilos, sin embargo al

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ejecutar tinción de Gram en estas para identificar su grupo taxonómico,

las Gram positivas se tiñen de color violeta mientras que las Gram
negativas se tiñen de color rosado.
- La tinción de Gram permite conocer la morfología celular, el tamaño, la
forma y su clasificación taxonómica (Gram positivos o Gram negativos)
de acuerdo al color que tornan las bacterias después de la tinción, sin
embargo no permite conocer la especie o género de la bacteria al cual
pertenece.
- Las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su
pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de
peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa, por este
motivo a las bacterias Gram+ se les fija el primer colorante usado en la
mezcla, mientras que las Gram- después del lavado se desprende el
colorante y se fija el colorante de contraste de la tinción.

IX. BIBLIOGRAFIA:

- D. PARSON, Manual de técnicas de Laboratorio para el Análisis de

los Alimentos
- L. HART, Análisis moderno de los alimentos.
- HANS GERHARD MAIER, Métodos modernos de Análisis de los

Alimentos, Editorial Acribia, 2º Ed. Zaragoza - España.

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