Sunteți pe pagina 1din 6

APARATURA DE IMUNOLOGIE

CURS 2
SL DR SUCEVEANU ANDRA
DEFINITIE
În concepţia modernã, funcţia imunitarã se defineşte ca o proprietate biologicã esenţialã a organismului
uman şi animal, care constã în capacitatea de a diferenţia rapid şi specific, substanţele proprii, self, de
cele strãine, nonself.
Sistemul imunitar este esenţial pentru supravieţuirea organismelor multicelulare, datoritã agresiunii
permanente a agenţilor infecţioşi (microorganisme şi virusuri).
Omul adult poartã pe suprafaţa mucoaselor şi a tegumentului, un numãr uriaş de celule bacteriene (circa
1014), mai multe decât propriile celule, unele având potenţialul de a iniţia procese infecţioase.
Disfuncţia severã congenitalã sau dobânditã a funcţiei imunitare este incompatibilã cu viaţa.
Funcţia imunitarã este mediatã de molecule cu rol de receptori de pe suprafaţa limfocitelor şi de
molecule solubile în umorile organismelor.
Stãrile de hipersensibilitate definesc o stare de reactivitate imunitarã crescutã şi se caracterizeazã prin
aceea cã, la primul contact cu o substanţã nonself, nu se produce un rãspuns imun detectabil, ci
organismul dobândeşte o stare specialã de sensibilizare imunitarã faţã de un antigen.
La contactul secundar ulterior, chiar cu cantitãţi foarte mici ale antigenului sensibilizant, organismul
rãspunde cu manifestãri patologice de intensitãţi variabile, al cãror rezultat final poate fi fatal. Aşa se
întâmplã în stãrile de hipersensibilitate (alergii) la polen, la diferite medicamente (de exemplu,
penicilina), la veninul insectelor sau la diferite substanţe alimentare. Modificãrile patologice consecutive
alergiilor pot fi locale sau generalizate.
Bazele conceptului imunitãţii humorale au fost puse de Behring şi Kitasato (1890), care au evidenţiat
anticorpii serici, dupã imunizarea animalelor de laborator.
Serurile imune pot fi folosite în scop terapeutic pentru a stopa sau a atenua evoluţia unei boli
infecţioase, cu condiţia ca administrarea acestor seruri sã fie foarte precoce.
In 1923, Behring a organizat producţia de seruri imune, preluatã de Institutul Pasteur din Paris (înfiinţat
în 1894) şi apoi de Institutul Babeş şi de Institutul Cantacuzino.
Conceptul imunitãţii mediate celular a fost formulat de Metchnikoff (1891). El a evidnţiat cã în
organism existã o serie de celule specializate, cu capacitatea de a recunoaşte celulele strãine şi de a le
îngloba prin procesul de fagocitozã, care sunt digerate şi eliminate din celula fagocitarã.
Metchnikoff a fãcut observaţii pe crustaceul Daphnia magna, ale cãrui celule fagocitare înglobeazã şi
digerã sporii fungici (Monospora bicuspidata).
Când infecţia cu spori este masivã, capacitatea de apãrare a organismului este depãşitã şi gazda moare.

 Imunobiologia este cea mai cuprinzãtoare dintre ramuri.


Ea studiazã fenomenele imunitare ca manifestãri ale unei funcţii biologice esenţiale → funcţia de
apãrare.
Studiazã substratul biologic al rãspunsului imun (celulele imunitare, originea şi mecanismele
diferenţierii lor, factorii celulari şi humorali care asigurã diferenţierea lor), mecanismele celulare şi
moleculare ale biosintezei anticorpilor, explicã implantarea celulelor tumorale şi geneza cancerului
clinic în condiţiile acţiunii efectorilor sistemului imunitar.
Studiazã mecanismele imunitare ale respingerii grefelor de ţesuturi şi organe, mecanismele
reactivitãţii imunitare în filogenie şi ontogenie, precum şi bazele celulare şi moleculare ale stãrilor
de hipersensibilitate şi ale maladiilor autoimune. Imunochimia este o disciplinã de graniţã ce aparţine
Imunologiei şi Biochimiei, care studiazã funcţia imunitarã sub aspect biochimic.
Preocuparea esenţialã a constat în studiul chimiei antigenelor şi anticorpilor şi al mecanismului lor de
interacţiune în reacţia antigen-anticorp.
Datele referitoare la structura chimicã a antigenelor şi anticorpilor au pus bazele imunochimiei, dar
ulterior, domeniul şi-a lãrgit sfera de activitate şi studiazã urmãtoarele aspecte:
factorii moleculari ai rãspunsului imun şi în special ai imunitãţii mediate celular;
 moleculele de histocompatibilitate;
 markerii antigenici specifici diferitelor populaţii de celule limfoide;
 moleculele cu funcţie de receptor de antigen, pe suprafaţa celulelor limfoide;
 factorii de cooperare celularã în cursul elaborãrii rãspunsului imun (interleuchine);
 componentele complementului etc.
 Termenul de Imunochimie a fost introdus de chimistul suedez Arrhenius (1907). El şi-a intitulat
astfel studiul cu privire la reacţiile chimice care se produc în organismul uman şi animal, dupã
imunizare.
 Fondatorul Imunochimiei este P. Ehrlich. El a introdus metode cantitative în studiul reacţiilor
antigen-anticorp şi a elaborat o teorie generalã asupra recunoaşterii imune (teoria catenelor
laterale sau a receptorilor).
 Dupã 1950, Imunochimia s-a dezvoltat spectaculos, datoritã descoperirilor din domeniul
biochimiei, datoritã utilizãrii unor metode fizico-chimice de analizã a macromoleculelor şi prin
aplicarea acestora la domeniul Imunologiei.
 S-a nãscut un set de metode, în esenţã biochimice, puse în slujba analizei moleculelor implicate
în funcţia imunitarã. Domeniul s-a numit analizã imunochimicã şi utilizeazã metode care derivã
din îmbinarea tehnicilor fizico-chimice cu cele imunologice.
 Imunochimia este deservitã de metoda imunodifuziei, imunofluorescenţei, RIA, ELISA, dializa la
echilibru etc. Efectul utilizãrii acestor metode de investigare a fost cunoaşterea mecanismelor
moleculare care stau la baza rãspunsului imun, îndeosebi humoral şi aplicarea în laboratorul
clinic, a unor noi metode de diagnostic.
Testul ELISA
 Acesta este testul cel mai larg folosit si consta dintr-o reactie imuno-enzimatica. A fost acceptat
in anul 1985.
Tehnica
 Pe un suport solid constituit in general din placi de plastic cu godeuri, se fixeaza antigenele
virale naturale sau obtinute prin inginerie genetica.
 In godeul astfel preparat se introduce serul de testat. Cand reactia se produce, aceasta are la baza
legarea anticorpilor specifici din ser de antigenul fixat pe godeu.In continuare se introduce in
godeu un alt anticorp, anti - imunoglobulina umana, care este conjugata cu o enzima care poate
actiona asupra unui anumit substrat chimic determinand o reactie de culoare, a carei intensitate
este masurata printr-un aparat special
Citirea rezultatelor se efectueaza prin intermediul aparatului special,
nu cu ochiul liber, cum s-ar putea crede din aceasta imagine.
 Clasificare:
- Teste ELISA indirecte
- Teste ELISA competitive
- Teste ELISA cu antigene de captura.
Teste ELISA indirecte:
- Serul pacientului se adauga la faza solida care contine antigen si este incubat un timp caracteristic si la
o anumita temperatura. Testul ELISA indirect produce o reactie atat de intens colorata cu cat
concentratia anticorpilor din proba este mai mare.
Teste ELISA competitive
- Difera prin aceea ca Ac din proba competitioneaza cu conjugatul (care este de asemenea un Ac)
pentru situsurile respective de pe antigenul legat de faza solida.
- Prin urmare, in testul ELISA competitiv, atat proba ce contine Ac, cat si conjugatul, se adauga
concomitent la faza solida care contine Ag. Daca Ac din proba au un titru ridicat, conjugatul nu
mai are acces, decat in mica masura, la situsurile specificede pe suprafata Ag-ului.
- Consecinta este absenta dezvoltarii culorii deoarece putin conjugat inseamna putina enzima, deci
putina culoare. In schimb, o proba fara Ac va fi generata in final deoarece, in absenta unei
conmpetitii serioase, conjugatul se va lega de faza solida, iar enzima caracteristica va putea
modifica substratul specific si va genera produsul colorat.
Teste ELISA cu antigene de captura.
- diferă prin aceea că anticorpii din probă competiţionează cu conjugatul (care este de asemenea un
anticorp) pentru situsurile respective de pe antigenul legat de faza solidă. Prin urmare, în testul ELISA
competitiv, atât proba ce conţine anticorpi, cât şi conjugatul se adaugă concomitent la faza solidă care
conţine antigen. Dacă anticorpii din probă au un titru ridicat, conjugatul nu mai are acces, decât în mică
măsură, la situsurile specifice de pe suprafaţa antigenului. Consecinţa este absenţa dezvoltării culorii
deoarece puţin conjugat înseamnă putina enzima şi, deci, puţin produs colorat. In schimb, o probă fără
anticorpi va fi genetă in final, deoarece, în absenţa unei competiţii serioase, conjugatul se va lega de faza
solida iar enzima caracteristică va putea modifica substratul specific şi va genera produsul colorat.
-pot fi cu principiu indirect, cât si cu principiu competitiv, diferind doar in etapa initiala a atasarii
antigenului la faza solida. La suportul solid este legat un anticorp monoclonal (anticorp obtinut
impotriva unui singur determiannt antigenic) pentru a captura antigenul. Scopul acestei capturi este de a
diminua cantitatea substantelor contaminate, care conduc la reactii mai putin specifice.
- teste disponibile astăzi (bazate pe reacţia de aglutinare) nu se bucură înca de o largă răspândire şi
utilizare în ţară.
TEHNICA IMUNOENZIMATICĂ CU TRUSE TIP ELISA
Testul Wellcozyme recombinat se bazează pe dozarea imunoenzimalică competitivă în scopul
detectării anticorpilor specifici în ser sau plasmă. Antigenete utilizate încorporează epitopii
imunodominaţi.
Etape de lucru pentru acest tip de test sunt:
 Etapa 1. După pregătirea atentă a protocolului de lucru şi a plăcii de microfiltrare, se pipeteaza
câte 50 ml din eşantioanele supuse testării în fiecare godeu; serurile de control se adaugă
ultimele.
 Etapa 2. Se distribuie conjugatul în fiecare godeu, câte 75 ml.
 Etapa 3. Se incubează placa la 43°C, o oră.
 Etapa 4. Se spală placa cu tamponul de spălare, respectând procedeul şi numărul de cicluri de
spălare recomandat de producător.
 Etapa 5. Se pipeteaza în fiecare godeu câte 100 ml de substrat în acest test, substrat 3, 5, 5, -
tetrametil benzidină (TMB).
 Etapa 6. Se incubează placa la temperatura camerei, la adăpost de lumină şi de vapori de
hipoclorit, 20 minute.
 Etapa 7. Se adaugă 50 ml de acid sulfuric 2M în fiecare godeu cu scopul de a stopa dezvoltarea
reacţiei enzimatice (în godeurile ce conţin probe şi in care s-a dezvoltat culoarea ai acum
culoarea glabenă).
 Etapa 8. Se citeşte absorbţia fiecărui godeu Ia 450 nm, în următoarele 30 minute.
Testul ELISA
 Testul ELISA are mai multe variante tehnice. Pentru a evita reactiile false in sens pozitiv sau
negativ se recomanda efectuarea a doua teste care sa difere ca principiu.
 Testul este relativ ieftin, rapid si fiabil, avand o specificitate si sensibilitate de aproximativ 99%.
Se foloseste in diagnosticul clinic, studii epidemiologice, screening-ul donatorilor.
Se intampla insa ca o persoana sa fie infectata, dar testul sa fie negativ. De ce? Pentru ca de la
momentul infectarii si pana la aparitia in sange a anticorpilor produsi de organismul infectat,
trece un interval de timp ce variaza, in general, intre saptamani si luni. Abia dupa ce acesti
anticorpi au o concentratie suficienta in sange, testul devine pozitiv. Aceasta perioada de
negativitate a testului la o persoana infectata se numeste fereastra imunologica.
 De aici, se poate deduce o concluzie fireasca: pentru a avea certitudinea unui test negativ, acesta
trebuie repetat si la 6 luni de la ultima expunere posibil infectanta.
Testul ELAVIA
 reprezintă o tehnică imunoenzimatică pentu, autoAc în ser sau plasmă. Testul se bazează pe
utilizarea a două faze solide (preparate cu antigene), ca şi a unui anticorp (de capră) anti-
imunoglobulină G umana purificat prin cromatografie de afinitate şi cuplat cu enzima.
Etapele de lucru cu trusa ELAVIA sunt:
 1. Se distribuie eşantioanele de cercetat diluţie de 1/100, 100 ml de asemenea controalele.
 2. Se incubează placa de microtitrare la 40°C, 45 minute.
 3. Se aspira conţinutul godeurilor şi se spală placa cu soluţia de spălare, respectând instructiunile
furnizorului şi numărul ciclurilor de spălare.
 4. Se pipeteaza câte 100 ui ml de conjugat in toate godeurile.
 5. Se incubează ca în etapa 2.
 6. Se spală placa la fel ca în etapa 3.
 7. Rapid, la adăpost de lumina puternică, se pipeteaza câte 100 ml de substrat in toate godeurile,
incubând apoi la temperatura camerei şi întuneric, 30 minute.
 8. Se adauga 50 ml soluţie de stopare a reacţiei enzimatice.
 9. Se citeşte absorbţia la 492 nm in cursul a 30 min de la stopare şi la adăpost de lumină
puternică.
TEHNICI ELISA ORIENTATE SPECIFIC
Determinarea anticorpilor anticolagen tip II
 Trusa ELISA pentru determinarea anticorpilor anti colagen tip II (livrată de Institutul
Cantacuzino) reprezintă un complex de reactivi de diagnostic utilizaţi într-o reacţie
imunoenzimatică tip ELISA.
Principiu
 Evidenţierea anticorpilor anti colagen tip II se realizează în urma legării lor de antigenul
corespunzător fixat pe suportul solid. Complexul antigen-anticorp format reacţionează cu
conjugatul anti IgG om-fosfatază alcalină care, în prezenţa substratului specific fosfatazei
alcaline (p-nitrofenil fosfat disodic), determină formarea p-nitrofenolului de culoare galbenă
(Bampton, 1985).
Indicaţii
 Determinarea anticorpilor anti colagen tip II se utilizează în principal pentru precizarea
diagnosticului şi a evoluţiei bolii în poliartrita reumatoidă. Apariţia anticorpilor anti colagen tip
II s-a semnalat în 65-70% din cazurile de poliartrita reumatoidă şi în 45-50% din cazurile de
artrită reumatoidă juvenilă. Aceşti anticorpi au fost evidenţiaţi şi în lichidul sinovial. Ei
reacţionează cu colagenul tip II (colagen care reprezintă componenta majoră a cartilagiilor) la
nivelul articulaţiei, putând provoca distrugerea acesteia. Valori peste 400 Ue sunt considerate
pozitive.
Determinarea anticorpilor anti DNA
Prezenţa acestora reprezintă un marker important pentru stabilirea
diagnosticului şi monitorizarea tratamentului în LES, permiţând diferenţierea acestei boli de alte tipuri
de colagenoze. Apariţia anticorpilor anti-ADN s-a evidenţiat şi în anumite forme de hepatită (proporţie
care variază între 26 şi 30%) şi, în mod excepţional, în poliartrita reumatoidă (4-6%).
Cercetarea anticorpilor antihistone
 Este indicată efectuarea în suspiciune de lupus medicamentos (în 100% din cazuri testul este
pozitiv).
 Testul ELISA are o specificitate slabă în LES, este pozitiv la 30-50% din cazuri, în PR în 20-
30%. În concluzie, testul negativ nu exclude lupusul medicamentos, iar testul pozitiv nu are
decât o semnificaţie limitată (Aitkaci, 1981).
TEHNICI COMPLEXE IMUNOCHIMICE-IMUNOSEROLOGICE
WESTERN BLOT (WB)
 Testul îşi datorează specificitatea a doi factori: separarea componentelor şi concentraţia
componentelor. El este condus în trei etape, astfel:
 separarea antigenelor prin electroforeza în gel de poliacrilamidă cu dodecisulfatde sodiu (SDS-
PAGE);
 transferul (bloting) antigenelor separate pe hârtie de nitroceluloză (fig. );
 testarea probei de ser direct pe membrană, utilizând o tehnică RIA sau ELISA (Samter, 1988).
 In prezent numai partea a treia este efectuată în laboratoarele clinice, WB fiind disponibil sub
formă de truse comerciale.
 Interpretarea WB este destul de dificilă (Rose, 1986).
Reactia de imuno-fluorescenta (RIF)
 Aceasta presupune punerea in contact a antigenului fixat pe o lama, cu serul de testat. Dupa ce
are loc reactia de fixare Ag-Ac (sau Ac-Ag) se continua cu adaugarea anti-imunoglobulinei
umane care este conjugata, nu cu o enzima, ca in cazul testului ELISA, ci cu o substanta ce
devine fluorescenta, daca este luminata cu un spectru de raze ultraviolete.
 Concureaza testul ELISA ca acuratete.
 In prezent, se considera inca necesara confirmarea acestor teste prin "testul de confirmare
Western Blot". Exista insa discutii intre specialistii din tara pentru a utiliza testul Western Blot
doar in situatii speciale, pe considerente economice.
Testul WESTERN BLOT
 Este o metoda mai laborioasa, complicata, mai scumpa si mai specifica decat testele discutate
anterior, deoarece utilizeaza ca antigen virusul, care a fost in prealabil "disrupt", pentru a se
putea etala toti constituentii antigenici. Reactia este ca o electroforeza, prin care fragmentele
antigenice sunt separate prin migrare. Benzile preparate astfel sunt puse in contact cu serul de
testat. In cazul in care serul provine de la o persoana infectata care a produs deja anticorpi,
acestia se vor fixa in mod corespunzator de antigenele continute de benzi.
 Daca testele ELISA au fost pozitive si confirmate si printr-un test Western Blot pozitiv, persoana
testata este sigur infectata cu HIV.
 Rezultatele pot fi insa nu doar pozitive sau negative, ci si incerte sau nedeterminate, necesitand
in ultimele doua situatii repetarea testului, dupa o perioada de timp.
Analiozorul automat de imunologie
 Cititor automat microplaci ELISA
 Lungimi de unda standard: 405, 450, 492, 630
 Sistemul de fibra optica bicromatic cu 8 canale si 4 lungimi de unda
 Imprimanta externa paralela
 Memorie pentru 10 000 rezultate
 Sistem de operare Windows
 Spalator complet automat de microplaci
 Programe de spalare: 16 preprogramate,
48 programabile de catre utilizator
 Volum de lichid dispensat 50-2000 µl,
programabil in pasi de 50 µl
 Durata de ciclu pentru o microplaca
75 sec. (1 ciclu) resp. 120 sec. (3 cicluri)
 Rezervor de lichide 2x2 litri pentru solutia
de spalare si pentru reziduuri).
 Sistem compact usor de întretinut ELFA (Enzime-Linked Fluorescent Assay) capacitate - 12 / 30
probe simultan teste diferite procesate simultan timp de lucru: maxim 90 minute 2 / 5 sectiuni de
lucru independente
 Calibrarea o datã la 14 zile - semnal acustic la expirarea calibrãrii imprimanta termica
incorporata
 Rezultatele pot fi imprimate sau exportate (transfer unidirectional de informatii) 1 test = 1 strip +
1 con impachetare - 30 sau 60 teste / kit