Abstracto

Los alcaloides vegetales tienen una rica ecología química que ha sido explotada
con fines medicinales durante miles de años. A pesar de estar altamente
representados dentro de la farmacopea actual, se sabe relativamente poco sobre
la biosíntesis, la regulación y el transporte de estas moléculas. Comprender cómo
la naturaleza sintetiza los alcaloides de las plantas mejorará nuestra capacidad de
producir en exceso, es decir, de diseñar metabólicamente, estos compuestos de
utilidad médica así como los compuestos nuevos para la naturaleza (con
bioactividad potencialmente mejorada) derivados de estos andamios
naturales. Avances recientes en la ingeniería metabólica de productos naturales
de plantas que contienen nitrógeno, específicamente los alcaloides de indol
monoterpenos. los alcaloides de la bencilisoquinolina y los glucosinolatos, fue
posible gracias a la caracterización de varios componentes en las vías enzimáticas
nativas y de ingeniería. La posterior reconfiguración y ajuste de estas "partes"
biológicas ha permitido la producción de productos seleccionados a títulos cada
vez más altos.

Introducción

Los productos naturales de plantas han sido explotados durante miles de

años. Los alcaloides, particularmente, tienen una narrativa larga y narrada. Esta
historia se destaca en la vida de Cleopatra, que usó extractos de belladona
que contienen alcaloides (en italiano, " bella mujer" ) para dilatar sus pupilas a fin
de aumentar su belleza y desarmar así a sus enemigos [ 1 ]. Lejos de limitarse a
las crónicas antiguas, los alcaloides retienen una presencia palpable en las
clínicas actuales. Por ejemplo, los optometristas todavía aplican gotas para los
ojos que contienen el alcaloide atropina, un componente activo de la belladona ,
para dilatar la pupila durante los exámenes oculares de rutina [ 1] No es
sorprendente que la mayoría de los alcaloides sean bioactivos dado que el
proceso evolutivo selecciona productos que confieren una ventaja al organismo
productor. A pesar de la rica tradición etnofarmacológica y el alto uso de alcaloides
en la era moderna, se conoce relativamente poco sobre la biosíntesis, la
regulación y el transporte de estas moléculas. Esta falta de conocimiento impide
fundamentalmente nuestra capacidad de cooptar la maquinaria de la naturaleza
para producir en exceso, es decir, para diseñar metabólicamente, estos valiosos
compuestos.

Notablemente, muchos esfuerzos de detección de drogas excluyen los productos

naturales de plantas debido a sus altos costos de producción y en su lugar
seleccionan un mayor número de moléculas más simples, que pueden producirse
de manera económica y en menos pasos químicos [ 2 ]. Teniendo en cuenta los
desafíos de obtener estas moléculas a través de la tubería de medicamentos,
sostenemos que los productos naturales, incluidos los alcaloides de plantas,
deberían incluirse en las pantallas de medicamentos. Los productos naturales de
plantas tienen una alta tasa de éxito como candidatos y líderes [ 3 , 4 ]. Mientras
que la síntesis química de productos naturales de plantas, particularmente los
alcaloides, está mejorando dramáticamente [ 5], muchas síntesis son demasiado
largas para la producción comercial o requieren pasos de separación poco
prácticos desde el punto de vista industrial. Por lo tanto, las plataformas de
producción alternativas deben ser desarrolladas, evaluadas e instituidas. Un
creciente cuerpo de trabajo recluta microbios y cultivos de células y tejidos para
producir estos valiosos productos derivados de plantas [ 4 ]. Los sistemas
biológicos tienen el potencial de ser escalables y selectivos, a la vez que son más
amigables con el medio ambiente y, lo que es más importante, menos costosos
que las reacciones sintéticas [ 4 ].

En esta Opinión, destacamos los recientes esfuerzos de ingeniería metabólica

diseñados para mejorar la producción de alcaloides derivados de plantas
seleccionados. Nos enfocamos en los alcaloides de indol monoterpenos (MIA), los
alcaloides de bencilisoquinolina (BIA) y los glucosinolatos. Aunque no están
clasificadas clásicamente como alcaloides, los glucosinolatos son compuestos que
contienen nitrógeno, que han sido objeto de un exhaustivo cuerpo de investigación
que informará la ingeniería de todos los productos vegetales naturales. Estas tres
clases de productos naturales que contienen nitrógeno derivados de plantas han
sido objeto de esfuerzos de investigación recientes destinados a descubrir y
manipular actividades celulares, que incluyen la función enzimática, el transporte
de metabolitos y el control reglamentario. En última instancia, este trabajo puede
conducir a enzimas biotecnológicamente útiles y nuevos fármacos candidatos.

El monoterpeno indole alcaloides

Introducción

Los alcaloides indol monoterpenos (MIA) han despertado interés en las últimas
décadas en gran parte debido a vinblastina 8 y vincristina 9 , dos agentes
anticancerígenos potentes y ampliamente prescritos que actualmente se producen
únicamente a través de la cosecha de las hojas de las plantas bígaro maduras
( Catharanthus roseus ) [ 6 ]. Las concentraciones de vinblastina y vincristina por
gramo de material de hoja seca son de aproximadamente 0,01% y 0,003%,
respectivamente, y dependen en gran medida de las condiciones de crecimiento
de la planta [ 7 ]. Sus bajos rendimientos y la larga línea de tiempo de producción
han provocado intensos esfuerzos para diseñar títulos más altos de estos MIAs de
importancia medicinal.
Los MIA se encuentran con mayor frecuencia en las familias Apocynaceae,
Loganiaceae y Rubiaceae [ 8 ]. La mayoría de los MIA se construyen a partir de la
seciroanid secologanin 3 y la molécula que contiene indol triptamina 2 ( Figura 1a )
[ 9 ]. La strictosidina sintasa (STS) condensa estas dos moléculas a través de una
condensación de Pictet-Spengler que forma strictosidine 4, que se cree que
finalmente sucumbe a cualquiera de los dos destinos químicos [ 9 , 10 ]. Si la
planta no está bajo ataque de herbívoros, la estricitosidina 4 se desglucosila y se
reorganiza en los más de 3000 MIA encontrados en la naturaleza [ 10] La
vincapervinca de Madagascar tiene un subconjunto de aproximadamente 130
MIA. Alternativamente, si la planta está bajo ataque herbívoro, la
reserva de estricitosidina 4 (estimada en aproximadamente 10 mM en células
epidérmicas de hoja de Vinca tratadas hormonalmente para imitar el ataque de
herbívoros) puede dirigirse al núcleo para deglucosilación masiva, lo que lleva a
una especie de dialdehído reactivo capaz de proteínas de entrecruzamiento
[ 10 ]. Este mecanismo se ha denominado la "bomba" nuclear de estricitosidina en
referencia al mecanismo de "bomba de aceite de mostaza" de la biosíntesis de
glucosinolato (ver a continuación) [ 10 ]. Es importante destacar que muchos de
los metabolitos MIA en sí mismos también han sido implicados en las estrategias
de defensa de las plantas [ 11 ].

Obtención de los componentes básicos para los esfuerzos de ingeniería

metabólica: un estudio de caso sobre el descubrimiento de los P450 implicados en
la biosíntesis de MIA

Las vías enzimáticas que conducen a los MIA aún no se han dilucidado
completamente en ningún organismo. Estos pasos bioquímicos no caracterizados
pueden utilizar nuevas químicas o poseer especificidades informativas e
interesantes que permiten que las enzimas se empleen en varios diseños de vías
metabólicas sintéticas [ 12 , 13 ]. En particular, se predice que muchas plantas,
incluidos los productores de MIA, contienen un alto porcentaje de citocromos P450
(P450). Algunas estimaciones sitúan a los P450 en aproximadamente el 1% de los
genomas representativos de plantas [ 14 ], más de 5 veces más que la proporción
de P450 encontrados en el genoma humano [ 15].] Mediante el uso de oxígeno
molecular para adaptar esqueletos de hidrocarburos, los P450 facilitan un panel de
transformaciones químicas difíciles y, en consecuencia, se utilizan en muchas
rutas biosintéticas de alcaloides [ 13 ]. Los P450 también se han diseñado con
éxito con fines biotecnológicos [ 15 , 16 ]. Diversas tecnologías, como los
nanodiscos [ 17 ], y los esfuerzos de reingeniería N-terminal [ 16 ] han mejorado la
expresión de los P450 unidos a la membrana, haciendo que esta clase de enzimas
sea accesible para un conjunto completo de técnicas de caracterización
bioquímica y biofísica.
Dada la alta similitud de secuencia entre los P450, identificar un P450 que facilite
una reacción bioquímica específica dentro de una ruta biosintética sigue siendo un
desafío. Esto ha disminuido considerablemente el descubrimiento y la
caracterización de nuevos P450 dentro del reino vegetal. Sin embargo, Giddings et
al . Recientemente, se utilizó el análisis de coexpresión para identificar P450 con
perfiles de expresión similares a los conocidos genes biosintéticos MIA
[ 12 ]. Mediante el ensayo funcional de estos candidatos en Saccharomyces
cerevisiae , Giddings et al. descubrió un P450 (CYP71BJ1) que hidroxilaba la
posición 19 de cualquiera de lochnericine o tabersonine 7 , un intermedio que se
coloca en un punto de ramificación metabólica [ 12]] La hidroxilación de
tabersonine 7 en la posición 16 compromete la biosíntesis intermedia de vindoline
y vinblastina 8 , mientras que la hidroxilación en la posición 19 compromete a la
molécula a la formación de 19-O-acetilhörhammericine [ 12 ].

Ingeniería de productos naturales "antinaturales"

Los alcaloides vegetales a menudo requieren modificaciones para mejorar sus

propiedades farmacológicas para el consumo humano. La halogenación,
particularmente la fluoración y la cloración, es una modificación omnipresente en
los candidatos farmacéuticos exitosos [ 18 , 19 ]. Los halógenos a menudo
confieren la potencia de un fármaco, alteran su farmacocinética o funcionan como
mangos específicos del sitio para modificaciones posteriores [ 18 - 20 ]. Los
halógenos se pueden introducir en las vías de MIA mediante una serie de
métodos. Un ejemplo particular empleó la mutasíntesis, un proceso mediante el
cual la biosíntesis natural se bloquea primero mediante el silenciamiento genético
del precursor natural, y luego se rescata alimentándose con análogos
estructurales del precursor [ 21].] En este caso, junto con la disminución mediada
por ARNi de la triptófano descarboxilasa (TDC), se añadieron análogos
de triptamina 2 no naturales a un fondo químicamente "silencioso" que no
producía alcaloides y se observaron análogos de MIA fluorados [ 21 ]. En una
estrategia de ingeniería separada, la strictosidina sintasa (STS), la enzima situada
en el primer paso comprometido de la biosíntesis de MIA, fue diseñada para
aceptar una gama expandida de precursores de triptamina 2 halogenados [ 22 ]; la
utilidad de esta enzima se demostró en planta al alimentar precursores no
naturales previamente no aceptados a las raíces pilosas de C. roseus [ 23 ].

Finalmente, Runguphan et al . interconectadas RebH y PyrH-dos triptófano

halogenasas aisladas de especies de actinomicetos que habitan en el suelo - con
el metabolismo MIA de la vincapervinca para producir productos naturales
halogenados de novo [24 ••] ( Figura 1b ). Sin embargo, las líneas que
sobreexpresan RebH y RebF también mostraron una morfología de crecimiento
marrón y lenta [ 24 •• ]. Runguphan et al . hipotetizó que esta morfología era el
resultado de la acumulación de 7-clorotriptán 1a , un análogo del metabolito
primario L-triptófano 1 que es estructuralmente similar al ácido 4-cloroindol-3-
acético, una auxina que se sabe está involucrada en la regulación del crecimiento
de las plantas [24 •• ].

Para circunnavegar este problema, Glenn et al. emplearon el diseño de proteínas

guiadas por estructuras para diseñar una halogenasa que preferencialmente
clorata triptamina 2 , un precursor de MIA más directo ( Figura 1c ) [ 25 ]. Se
observaron microgramos por gramo de cantidades de 12-cloro-19,20-
dihidroakuamicina 5a en fresco con esta estrategia, pero ni 7-
chlorotryptophan 1a ni 7-chlorotryptamine 2a se acumularon en planta , lo que
indica que el precursor clorado se transportaba efectivamente al metabolismo de
MIA [ 25] La ingeniería de la halogenación en el metabolismo de la MIA pone de
relieve la importante necesidad de interconectar el metabolismo especializado con
el metabolismo primario de carbono y nitrógeno.

Los Alcaloides Benzylisoquinoline

Introducción

Los alcaloides de Benzylisoquinoline (BIA) se encuentran principalmente en las

familias de plantas Papaveraceae, Ranunculaceae, Berberidaceae y
Menispermaceae. Aproximadamente 2500 BIA se han aislado hasta la fecha
[ 26 ]. Esta clase de compuestos se ha usado a lo largo de la historia humana y
contiene productos farmacéuticos que todavía se usan ampliamente en la
actualidad, incluidos la morfina 28 narcótica y analgésica , la codeína 26 supresora
de la tos , la papaverina relajante muscular y los agentes antimicrobianos
sanguinarine 19 y berberina 29 . Todas las BIA conocidas, como las MIA, se
derivan de un solo intermediario, que, para esta clase de compuestos, es
norcoclaurina 13. La norcoclaurina sintasa (NCS) cataliza la condensación entre
dopamina 11 y 4-hidroxifenilacetaldehído 12 para producir la norcoclaurina
intermedia intermedia 13 . Notablemente, las vías biosintéticas de varios
alcaloides de la bencilisoquinolina -morfina 28 , sanguinarina 19 y berberina 29-
han sido completamente dilucidadas a nivel genético, lo que ha permitido
enfoques de ingeniería metabólica sofisticados. La aplicación de estrategias de
ingeniería metabólica para BIA se ha enfocado predominantemente en mejorar los
rendimientos de compuestos alcaloides específicos que exhiben valor medicinal.

Descubrimiento de enzimas e ingeniería en vías BIA

Se han informado varios esfuerzos sobresalientes en el descubrimiento de

enzimas para las rutas biosintéticas de BIA. En un esfuerzo reciente, Hagel et
al. Caracterizó dos O-desmetilasas que participan en la biosíntesis de morfina,
completando la caracterización de la ruta del morfinano ( Figura 2b ) [ 27 • ]. Este
trabajo también destacó claramente cómo el análisis de coexpresión se puede
utilizar para descubrir enzimas con una función catalítica sin precedentes. Estas
enzimas ofrecen los primeros ejemplos de oxoglutarato dioxigenasas de hierro no
hemo (II) capaces de catalizar la O-desmetilación. La codeína-O-desmetilasa
(CODM) desmetila regioselectivamente la codeína 26 y la tebaína 22 en la
posición 3, mientras que la tebaína-6-O-desmetilasa (T6ODM) desmetiliza la
tebaína22 y oripavine 24 en la posición 6. El intercambio de regiones de
aminoácidos entre las dos desmetilasas dio como resultado un mutante CODM
que desmetila selectivamente la codeína ( Figura 2b ) [ 28 ]. Este mutante, que
esquiva eficazmente la producción de oripavina 24 al comprometer la
tebaína 22 con una de dos rutas posibles, podría afectar los títulos de
codeína 26 y morfina 28 en posteriores esfuerzos de ingeniería
metabólica. Colectivamente, estos estudios destacan cómo la caracterización de
los pasos de las vías individuales y la comprensión de su especificidad y
selectividad pueden informar y permitir los esfuerzos de ingeniería metabólica.

Mientras que el análisis de la transcripción ha demostrado tener un éxito

espectacular en la elucidación de las desmetilasas de la biosíntesis de
morfina 28 , Winzer et al . proporcionar un raro ejemplo de agrupamiento de genes
en una vía de BIA [ 29 •• ]. Los autores describen un grupo de 10 genes en el
genoma de la adormidera que supuestamente codifica toda la ruta biosintética de
la noscapina BIA 15 . Este es el primer grupo de genes descubierto para una vía
de alcaloides, y es el mayor conjunto de genes de plantas descubierto hasta la
fecha. Los autores silenciaron con éxito seis de los diez genes propuestos
utilizando VIGS para validar su papel en la biosíntesis de noscapina 15 [ 29
••] Este estudio indica que los datos genómicos, además de los datos de
expresión, se pueden utilizar para descifrar las vías de alcaloides en las plantas.

Ingeniería en hosts nativos

En uno de los primeros intentos para diseñar plantas productoras de BIA, se usó la
interferencia de ARN (ARNi) para silenciar la expresión de codeinona reductasa
(COR) en la adormidera [ 30 ]. COR, la penúltima enzima de la biosíntesis de
morfina, convierte la codeinona 25 en codeína 26 ( Figura 2b ). Mientras que uno
podría anticipar que el silenciamiento de COR conduciría a niveles elevados de
codeinona 25 , el estudio encontró en cambio que las plantas silenciadas con COR
acumularon reticulina 14 -un intermedio siete pasos aguas arriba de la
codeinona 25-a expensas de la morfina 28 , codeína 26 , oripavine 24 y
thebaine22 . Un mecanismo de retroalimentación se propuso como una
explicación para los niveles elevados de reticulina 14, aunque la prueba de esta
hipótesis ha dado resultados contradictorios [ 30 ].

Otros intentos tempranos para mejorar los rendimientos de los alcaloides BIA
incluyen la sobreexpresión de la enzima del puente de berberina (BBE) en cultivos
de raíz de Eschscholzia californica . Este esfuerzo dio como resultado niveles
elevados de alcaloides corriente abajo y niveles disminuidos de aminoácidos,
aunque los niveles notables de tirosina 10 -el aminoácido empleado en la síntesis
de BIA- no se alteraron [ 31 ]. Por el contrario, la supresión antisentido de la
expresión de BBE condujo al silenciamiento efectivo de la producción de BIA y al
aumento de los niveles de aminoácidos celulares, aunque, de nuevo,
los niveles de tirosina 10 no se modificaron (menos de dos veces más que en las
líneas de control) [ 32] No obstante, estos dos estudios destacan cómo las
perturbaciones en el metabolismo de los alcaloides pueden afectar el metabolismo
primario [ 31 , 32 ]. Estudios más recientes sugieren, sin embargo, que la
supresión de ARNi de BBE en E. californica conduce a un aumento de las
acumulaciones de (S) -reticulina 14 enlugar de varios aminoácidos canónicos
[ 33 ]. Estos resultados contradictorios son sorprendentemente comunes en la
ingeniería metabólica de los alcaloides en plantas y cultivos celulares y nos
proporcionan el ímpetu para comprender estas vías con mayor detalle, prestando
especial atención a sus elementos reguladores bioquímicos y moleculares.

La reconstitución de la biosíntesis de BIA en sistemas microbianos

Muchas rutas en la biosíntesis de BIA están completamente caracterizadas, lo que

abre la posibilidad de trasplantar rutas alcaloides enteras en huéspedes
microbianos. Aunque relativamente difícil, la reconstitución de vías metabólicas
enteras en huéspedes microbianos confiere una serie de ventajas, que incluyen
una rápida acumulación de biomasa, una fácil purificación y acceso al conjunto de
herramientas disponibles para organismos de caballos de tiro como E. coli y S.
cerevisiae. Varios informes recientes han reconstituido con éxito partes de las vías
de BIA en S. cerevisiae, E. coli y combinaciones de las mismas en sistemas de
cocultivo [ 34 - 36 ]. Por ejemplo, Hawkins et al. fueron capaces de producir
reticulina14así como sanginarine / berberine-type y morphinan-type BIAs en
levadura al sobreexpresar genes de fuentes vegetales mixtas y humanos
[ 35 ]. Notablemente, también fueron capaces de ajustar los niveles de expresión
de la enzima mediante el uso de un promotor inducible por glucocorticoides y
la valoración del promotor in situ [ 35 ]. Este nivel de ajuste permite el flujo máximo
de la ruta y la expresión mínima de la enzima. El sistema de expresión
nominalmente se grava en estas condiciones, ya que los recursos celulares
valiosos no se usan en la biosíntesis de proteínas supernumerarias y ácidos
nucleicos.
Los glucosinolatos

Introducción

Los glucosinolatos no están clasificados como alcaloides, aunque, junto con los
alcaloides, estos compuestos son pequeñas moléculas de origen vegetal
derivadas de aminoácidos y que contienen nitrógeno. Los glucosinolatos se
incluyen en esta revisión porque los recientes y creativos estudios de ingeniería
metabólica realizados en esta clase de compuestos indudablemente informarán la
ingeniería avanzada de todos los productos vegetales naturales, incluidos los
alcaloides.

Los glucosinolatos son compuestos que contienen azufre y nitrógeno que se

derivan de la glucosa y varios aminoácidos ( Figura 3a ) [ 37 ]. Se encuentran en
vegetales crucíferos (la familia de plantas Brassicaceae) y se ha demostrado que
poseen una gama de bioactividades [ 37 ]. Los glucosinolatos ocupan un espacio
esencial en la ecología química de sus organismos hospedadores al atraer
polinizadores e insectos especializados en crucíferas y disuadir a los herbívoros
predadores [ 38 ]. Específicamente, las crucíferas emplean myrosinases
(hidrolasas) para dividir el resto de glucosa de glucosinolatos en respuesta a la
depredación y la herbivoría ( Figura 3b ) [ 39]] Las myrosinases y glucosinolates se
separan físicamente, entrando en contacto solamente sobre la interrupción del
tejido vegetal ( Figura 3b ) [ 39 ]. Tras la hidrólisis, el intermedio de aglicona
inestable resultante se reorganiza espontáneamente en el isotiocianato
correspondiente a través de una transposición de tipo Lossen [ 39 ]. Los tres tipos
conocidos de proteínas especificadoras, proteínas formadoras de tiocianato (TFP),
proteínas formadoras de nitrilo (NFP) y proteínas epitioespecificadoras (ESP), que
se pueden encontrar en planta o en varios insectos especializados, pueden
redireccionar la hidrólisis glucosinolada de los productos isotiocianato hacia
tiocianato, productos simples de nitrilo y epitionitrilo, respectivamente ( Figura 3b )
[ 39]] En particular, muchos especificadores pueden dirigir la hidrólisis
glucosinolada a más de un producto [ 39 ]. Los primeros trabajadores de este
sistema de defensa y polinización de plantas lo denominaron "La bomba de aceite
de mostaza" [ 38 ]. Hasta la fecha, se han identificado más de 120 glucosinolatos
[ 40 ].

Mejora del rendimiento en hosts no nativos

La reconstitución de vías metabólicas completas en hospedadores de plantas

heterólogas requiere el uso de metodologías de "apilamiento de genes" eficientes
y fáciles. Un ejemplo espectacularmente exitoso es la ingeniería de la biosíntesis
de bencilglucosinolato en Nicotiana benthamiana . El bencilglucosinolato se
reconstituyó en N. benthamiana usando un sistema de expresión transitorio. En
este estudio, Geu-Flores et al. identificó un cuello de botella de γ-glutamil
peptidasa, lo que sugiere que el azufre reducido se incorpora a los glucosinolatos
a través de la conjugación de glutatión ( Figura 3a ) [ 37] La coexpresión de esta
peptidasa aumentó el rendimiento de bencilglucosinolato 5,7 veces, lo que indica
cómo la consideración de los recursos de metabolitos primarios puede afectar el
rendimiento del producto natural [ 37 ]. En un análisis de metabolitos por
separado, MØdlrup et al . monitoreó la acumulación de desulfobencilglucosinolato,
el penúltimo producto en la vía del bencilglucosinolato [ 41 ]. Dirigir el azufre del
metabolismo primario al secundario a través de la coexpresión de adenosina 5-
fosfosulfato cinasa, que proporciona el cosustrato de 3'-fosfoadenosina-5'-
fosfosulfato (PAPS) necesario para el paso final de la biosíntesis de
bencilglucosinolato ( Figura 3a ) - en el N. benthamianaEl sistema de expresión
alivió el cuello de botella subsecuente y aumentó el rendimiento de
bencilglucosinolato en 16 veces [ 41 ]. En levadura, Mikkelsen et al. fueron
capaces de reconstituir la biosíntesis de indolylglucosinolate [ 42 ]. Este ejemplo
fue un estudio de prueba de concepto para una tecnología que permite el
apilamiento de grandes cantidades de genes, un requisito para la reconstitución
total de las vías.

Notablemente, la ruta biosintética de bencilglucosinolato también se ha

transformado establemente en Nicotiana tabacum, otra planta no crucifera, que
normalmente no produce glucosinolatos [ 43 • ]. Se ha demostrado que esta planta
rediseñada atrae a la polilla ( Plutella xylostella ) y fomenta la oviposición (depósito
de huevos), destacando su utilidad potencial como cultivo de trampa sin salida
para disuadir a los insectos depredadores y evitar daños millonarios a cultivos
crucíferos en todo el mundo [ 43 • ].
Direcciones y conclusiones futuras: alcaloides y más allá

Históricamente, la alteración de las rutas metabólicas en las plantas para lograr un

fin dado ha sido difícil. La ingeniería metabólica en las plantas está todavía en su
infancia y en gran parte se ha limitado a la expresión de un solo gen o eventos de
silenciamiento en el fondo del metabolismo de las células vegetales
endógenas. La complejidad del metabolismo del huésped de la planta se ha
demostrado, en muchos casos, para silenciar eficazmente el esfuerzo de
ingeniería o conducir a resultados impredecibles ( Tabla 1) Sin embargo, en los
últimos años, una gran cantidad de nuevos enfoques ha ampliado las capacidades
de la expresión de vías multigenas tanto en plantas como en microbios y ha
resaltado nuestra creciente capacidad para diseñar la producción de productos
vegetales naturales tanto en plantas como en sistemas heterólogos. El aumento
de los datos disponibles y confiables de secuenciación y expresión permite el
descubrimiento (relativamente) fácil de gen, transportador y elementos
reguladores, cuya identificación es a menudo un requisito previo para los
esfuerzos de ingeniería metabólica en varios pasos. Los tres estudios de casos en
esta revisión (MIA, BIA y glucosinolatos) ejemplifican los desafíos y el progreso en
la ingeniería metabólica de productos naturales derivados de plantas. Si bien
hemos hecho un esfuerzo especial para resaltar las ventajas y los peligros de las
técnicas y esfuerzos individuales a lo largo de esta Opinión,

Estrategias efectivas de minería

Estrategias efectivas de minería, como las empleadas por Giddings et al. [ 12 ],

Hagel et al. [ 27 • ], Winzer y col. [ 29 •• ] y Liscombe et al. [ 44], están obligados a
examinar los datos de montaje de la edad de secuenciación. Hanson et al. (este
número) proporciona una revisión más exhaustiva de estrategias efectivas de
minería y análisis filogenéticos. Tradicionalmente, los métodos de descubrimiento
de enzimas vegetales han dependido en gran medida de la genética inversa que
requiere mucho tiempo. Las técnicas bioinformáticas que involucran análisis de
coexpresión y perfiles comparativos de metabolitos para limitar el espacio de
genes que se investigará están mejorando el proceso de descubrimiento. Además,
un conjunto de nuevas herramientas de silenciamiento, que incluyen VIGS [ 7 ],
RNAi [ 23 ] y el sistema IL-60 [ 45 ], puede proporcionar una visión rápida de la
función fisiológica de las enzimas de las plantas.

Ingeniería metabólica en hosts nativos versus no nativos

Muchos esfuerzos dirigidos a mejorar el rendimiento de alcaloides en huéspedes

nativos se han centrado en alimentar precursores y sobreexpresar factores de
transcripción o enzimas situadas en cuellos de botella metabólicos. Si bien estos
esfuerzos a menudo resultan en mejoras modestas en el rendimiento ( Tabla 1),
muchos a menudo están acompañados de efectos morfológicos adversos que
pueden obstaculizar significativamente el crecimiento de cultivos de plantas y
tejidos, lo que destaca la estricta regulación de los procesos metabólicos dentro de
las células y tejidos vegetales altamente organizados. En los sistemas nativos,
especialmente, las morfologías de crecimiento lento pueden ser el resultado del
agotamiento de los recursos celulares utilizados para sintetizar un exceso de
transcripciones y enzimas o de la acumulación de productos intermedios que
afectan negativamente el crecimiento y el desarrollo. La ingeniería en
hospedadores nativos o especies de plantas heterólogas es atractiva porque no
tener que construir los sustratos iniciales y suministrar los cofactores simplifica
enormemente los esfuerzos de ingeniería. Sin embargo, con esta
estrategia, mantener el equilibrio entre el metabolismo primario y el metabolismo
modificado, una hazaña que probablemente mejorará las morfologías del
crecimiento, se complica precisamente porque los grupos de metabolitos primarios
endógenos se expropien por la sobreproducción de metabolitos
seleccionados. Además, a pesar de la ventaja del apilamiento genético mínimo,
los elementos reguladores y metabólicos complejos a menudo no caracterizados e
imprevistos de los sistemas nativos pueden conducir a resultados de ingeniería
que son particularmente difíciles de controlar y predecir. La producción a escala
industrial de productos naturales de plantas probablemente requerirá esfuerzos de
ingeniería más exhaustivos que la sobreexpresión de un solo gen o eventos de
silenciamiento en el contexto de hospedadores de plantas nativas. La ingeniería
en hospedadores heterólogos de crecimiento más rápido y “químicamente
silencioso" puede aumentar la acumulación de biomasa y simplificar la
purificación.

Controlar el flujo metabólico a través de nuevos constructos de expresión,

andamios y elementos reguladores sintonizables

Debe considerarse la relación intrincada entre el metabolismo primario (es decir, la

glucólisis, el ciclo de TCA) y el metabolismo secundario nativo o heterólogo (es
decir, isoprenoides y alcaloides). En plantas, Park et al . aludió a esta interacción
demostrando que los niveles de expresión de BBE afectan enormemente los
niveles de aminoácidos [ 31 , 32 ]. Como estrategias de ingeniería metabólica en
las plantas se vuelven más sofisticados, también hay que empezar a considerar
los análisis de flujo, teniendo en cuenta que las vías de productos naturales son
evolutivamente optimizados para canalizar intermedios hacia producto a través de
un sistema altamente coreografía de las interacciones proteína-proteína, la
localización y la regulación [ 46] El objetivo general es canalizar al máximo los
recursos metabólicos a los productos deseados sin sobrecargar el sistema host.

La colocalización a través del andamiaje es una forma comprobada de canalizar

metabolitos en E. coli. Estos sistemas intentan burlarse de las megasintasas
naturales, que transportan eficientemente los metabolitos entre los sitios
activos. Esencialmente, el andamiaje aumenta las concentraciones de metabolitos
y enzimas locales y reduce de manera efectiva el K m del sustrato. Estos sistemas
son ampliamente modulares y se sabe que mejoran los títulos, alivian los cuellos
de botella metabólicos y reducen las cargas metabólicas impidiendo que el
carbono salga de la vía. En condiciones de baja expresión enzimática (disminución
de la carga metabólica), Dueber et al.. logró con éxito una mejora de 77 veces en
la producción de mevalonato al construir un andamio basado en las interacciones
proteína-proteína de los dominios GBD, SH3 y PDZ y sus ligandos afines
[ 47 ]. Construyeron el andamio sobre la hidroximetilglutaril-CoA reductasa, el
cuello de botella enzimático de la producción de mevalonato [ 47 ]. Notablemente,
estos sistemas de andamios requieren que la enzima en el cuello de botella
metabólico, la subsiguiente enzima y el substrato se colocalicen [ 47 ], lo que
subraya por qué pueden ser insostenibles para algunos sistemas altamente
compartimentados. No obstante, la perspectiva de diseñar metabolones en las
plantas es emocionante.

La ingeniería metabólica efectiva de los productos vegetales naturales requerirá

inevitablemente técnicas de apilamiento genético avanzadas pero fáciles de
usar. Tradicionalmente, la expresión de múltiples genes en las plantas ha estado
plagada de eventos de silenciamiento inadvertidos, la incorporación incompleta de
todos los genes y procedimientos largos y técnicamente desafiantes [ 48 ]. Sin
embargo, se están desarrollando varias tecnologías nuevas para ensamblar y
trasplantar fácilmente grandes fragmentos de ADN [ 48 ]. La clonación Golden
Gate y la fusión USER se han usado para clonar múltiples elementos de ruta
[ 48 , 49] Además, los cromosomas de plantas sintéticas y la plataforma universal
IL-60 de expresión y silenciamiento tienen la capacidad demostrada de introducir
múltiples elementos de la vía vegetal en las plantas [ 48 , 50 ]. Por ejemplo, bajo la
plataforma de IL-60 sin transformación, Mozes-Koch et al. expresaron un operón
bacteriano completo en tomate y produjeron pirolinitrina, que observaron después
de solo dos días [ 50 • ].

Varios sistemas de silenciamiento basados en ARN, incluido el ARNi, también se

han diseñado y aplicado a plantas medicinales [ 21 ]. Notablemente, el ARNi, que
proporciona un fenotipo o quimotipo permanente, se ha empleado para bloquear
las vías de derivación y canalizar los recursos metabólicos hacia un producto
deseado, mejorando nuestra capacidad de diseñar en múltiples dimensiones [ 21 ].

Por último, bibliotecas de promotores, regiones no traducidas modificadas

genéticamente (es decir, regiones 5 'no traducidas y regiones intergénicas),
diseños de circuitos genéticos y reguladores de biosensores han sido
tremendamente útiles en la ingeniería microbiana. La aplicación de estos
principios de diseño a la ingeniería metabólica de las plantas puede enriquecer en
gran medida nuestros esfuerzos para producir alcaloides valiosos y químicamente
diversos. Notablemente, una variedad de promotores de plantas constitutivos e
inducibles y sistemas de expresión están ahora ampliamente disponibles. Los
elementos de ARN sintético, los elementos del sitio de unión del ribosoma y una
combinación de diferentes promotores de la fuerza colocados estratégicamente
frente a los genes de la ruta apilada teóricamente podrían permitir la expresión de
proteína sintonizable [ 35 , 51].] Estos elementos podrían limitar potencialmente la
expresión de actividades tóxicas o la acumulación de metabolitos tóxicos hasta la
fase estacionaria (o una etapa apropiada) de crecimiento, absolviendo así el
sistema de carga metabólica insostenible.
Localización y transporte - Ingeniería en múltiples dimensiones

Muchas vías de biosíntesis de alcaloides están altamente compartimentadas en

los niveles inter e intracelulares. Por ejemplo, se requieren al menos tres tipos de
células para la biosíntesis de muchas MIA [ 6 ]. La ingeniería avanzada de
productos naturales de plantas requerirá tamizar a través de la creciente cantidad
de datos disponibles de secuenciación y expresión y desenredar la complejidad de
la célula vegetal y los diferentes tipos de tejidos. Además del diseño lineal y la
canalización de las vías metabólicas, la ingeniería metabólica exitosa de los
productos vegetales naturales requerirá ingeniería en la "tercera dimensión",
concretamente en el nivel de localización y tipo de célula [ 52 ].

Biosíntesis combinatoria en plantas: vías de mezcla y coincidencia e ingeniería de

nuevas especificidades enzimáticas

La biosíntesis combinatoria de novo en los sistemas de las plantas ha quedado

muy poco explorada. La mayoría de los pocos esfuerzos para diseñar productos
naturales no naturales han utilizado enfoques de alimentación precursora o
basados en mutasíntesis, lo que puede ser costoso y requerir mucho
tiempo. La biosíntesis de novo de productos naturales no naturales requerirá que
las enzimas constituyentes se hayan rediseñado o que tengan una amplia
especificidad. Notablemente, la evolución dirigida se ha utilizado con éxito para
alterar la especificidad de la enzima. Sin embargo, los esfuerzos de ingeniería
enzimática se mejoran mucho si se conoce la estructura de la proteína y se
entiende bien el mecanismo. Entonces, la enzima puede someterse a técnicas
guiadas por estructura, tales como mutagénesis dirigida al sitio e intercambio de
dominio, que crean bibliotecas de proteínas más pequeñas enriquecidas con
mutantes funcionales.

A medida que buscamos convertir plantas y microbios en las fábricas de productos

químicos para satisfacer nuestras necesidades medicinales, debemos recordar
que, aunque muchos productos naturales de plantas son bioactivos y sirven como
importantes compuestos de plomo, a menudo requieren modificaciones antes de
llegar a la clínica. Por lo tanto, la ingeniería avanzada de productos naturales
"antinaturales" o "nuevos a la naturaleza" también debe ser un gran desafío si los
productos naturales de plantas van a ser transportados de los anales de la
tradición humana a los programas de desarrollo de fármacos y clínicas del
mañana.