INSTITUTO TECNOLÓGICO DE

ACAPULCO
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA

MICROBIOLOGÍA GENERAL A

“DISEÑO ESXPERIMENTAL 9 GRAM NEGATIVAS

M.A. MIGUEL ÁNGEL DÍAZ ALDAY

ALUMNA:
ARIOSHA IBARROLA ARMIJO

NÚMERO DE CONTROL
15320563

ACAPULCO, GRO., A 15 DE ABRIL DE 2018

1
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 3
OBJETIVO GENERAL ....................................................................................................... 4
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................. 4
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................................ 4
HIPÓTESIS ....................................................................................................................... 4
HIPÓTESIS NULA.......................................................................................................... 4
HIPÓTESIS ALTERNATIVA ........................................................................................... 4
MARCO TEÓRICO ............................................................................................................ 5
Estructura de la pared celular de bacterias Gram negativas ........................................... 5
Membrana citoplasmática ........................................................................................... 5
Espacio periplasmático y capa de peptidoglicano ....................................................... 5
Membrana externa...................................................................................................... 6
La tinción de Gram ......................................................................................................... 6
Limitaciones de la tinción de Gram ............................................................................. 7
Implicaciones sanitarias ................................................................................................. 7
Factores de patogenicidad ............................................................................................... 10
MATERIALES, EQUIPO Y REACTIVOS.......................................................................... 11
METODOLOGÍA .............................................................................................................. 12
CÁLCULOS ..................................................................................................................... 12
CONCLUSIÓN ................................................................................................................. 13
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................ 13

2
INTRODUCCIÓN

El gran grupo de bacilos Gram negativos no exigentes incluye diferentes familias y

géneros muchos de ellos muy frecuentes en patología médica. Comparten algunas
características tales como poseer en su pared externa un lipopolisacárido (LPS),
que les otorga características patogénicas particulares, tóxicas, la llamada
endotoxina de las bacterias Gram negativas.

En otro orden de cosas muchos de ellos son ubicuos, encontrándose muy

difundidos entre los animales y la naturaleza, pudiendo causar enfermedad en el
hombre y los animales como es el caso de Salmonella; otros aunque bien
adaptados al medio ambiente son patógenos humanos exclusivos por ejemplo
Vibrio cholerae por último otros se encuentran bien adaptados a su huésped,
como por ejemplo, Shigella. Algunos de estos bacilos Gram negativos poseen
atributos de virulencia bien definidos, comportándose como patógenos primarios,
Yersinia pestis, Salmonella typhi, responsables de la Peste y la Fiebre Tifoidea
respectivamente. Otros tales como Acinetobacter y Pseudomonas producen
infecciones oportunistas. Es de destacar que algunos de ellos como Escherichia
coli forman parte de la flora normal del tubo digestivo y permanecen en él sin
causar enfermedad siempre y cuando no se modifiquen las condiciones de su
hábitat.

Enterobacteriaceae

Esta familia comprende un número muy variado de géneros y especies bacterianos cuyo
hábitat natural es el tubo digestivo del hombre y los animales. No todos los bacilos Gram
negativos que tienen este hábitat forman parte de la familia Enterobacteriaceae. Se los
encuentra en el suelo, agua, frutas, vegetales y otras plantas y en los animales desde los
insectos al hombre. La familia está definida por un conjunto de características fenotípicas
(bioquímicas, fisiológicas e inmunológicas) a las que se han agregado posteriormente
otros elementos establecidos por técnicas de hibridización de ácidos nucleicos que miden
distancias evolutivas y han definido mejor la interrelación de todos los microorganismos
integrantes de la familia.

Son bacilos Gram negativos rectos, con un diámetro de 0.3 a 1.5 micras. Si son móviles,
presentan flagelos perítricos. No forman esporos. Desarrollan en presencia o en ausencia
de Oxígeno (aerobios-anaerobios facultativos). Desarrollan rápidamente en medios
simples, no siendo exigentes desde el punto de vista nutricional. Algunos desarrollan en
glucosa como única fuente de carbono, mientras otros requieren el agregado de vitaminas
y/o minerales en el medio de cultivo. Son quimioorganotrofos, poseen metabolismo
fermentativo y respiratorio. Son catalasa positivos y oxidasa negativos; reducen los
nitratos a nitritos. El contenido de Guanina + Citosina del DNA total es de 38 a 60 moles
%.

3
En los medios de cultivo forman colonias lisas, convexas y circulares de bordes definidos.
Algunas especies desarrollan colonias más mucoides que otras (por ejemplo Klebsiella).

OBJETIVO GENERAL
Identificar bacterias gramnegativas en la muestra a estudiar.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Determinar en qué tipo de medios de cultivos crece las gramnegativas
 Determinar la bacteria presente en el medio mediante pruebas bioquímicas
 Aprender a interpretar resultados de gramnegativas.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Las bacterias gramnegativas son muy patógenas en los huéspedes que llegan a portar
este tipo de bacterias, lo que nosotros como alumnos debemos darnos la tarea de cómo
identificarlos, aislarlos y estudiar su complejidad para saber qué tipo de familia, especie o
bacteria pertenece y cómo atacarla.

HIPÓTESIS
HIPÓTESIS NULA
En la cepa hubo crecimiento de Gramnegativo (Neisseria meningitidis, Neisseria
gonorrhoeae, Escherichia coli, Salmonella typhi, Salmonella enteritidis,
Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Brucella abortus, Francisella
tularensis, Pasteurella multocida).

HIPÓTESIS ALTERNATIVA
En la cepa no hubo crecimiento de Gramnegativo.

4
MARCO TEÓRICO
En microbiología, las bacterias se pueden clasificar en dos grandes grupos según
la estructura de la pared celular: las bacterias Gram positivas y las bacterias Gram
negativas. Las diferencias en la pared celular de ambos tipos generan
una respuesta diferente al someterse a la conocida como tinción de Gram. Las
bacterias Gram negativas aparecen teñidas de rosa – fucsia y las bacterias Gram
positivas de azul – morado. Pero como veremos, la tinción de Gram no es un
método del todo fiable para la clasificación bacteriana.1

Estructura de la pared celular de bacterias Gram negativas

La característica clave que diferencia una bacteria Gram negativa de una bacteria
Gram positiva es la composición y estructura de la pared celular. La pared celular
de las bacterias Gram negativas está formada por dos membranas lipídicas, una
interna (citoplasmática) y otra externa, con un espacio entre ellas
denominado espacio periplasmático en el que se dispone una capa de una
sustancia llamada peptidoglicano. Las Gram positivas no cuentan con membrana
externa y la capa de peptidoglicano es generalmente mucho más gruesa.

Membrana citoplasmática

La membrana citoplasmática, o membrana celular, es la membrana que rodea el

medio interno de la célula bacteriana (citoplasma). Es similar a cualquier otra
membrana celular existente en la naturaleza y consiste en una bicapa lipídica con
diversas proteínas y lípidos que ejercen funciones específicas.

Espacio periplasmático y capa de peptidoglicano

El espacio entre la membrana citoplasmática y la membrana externa se denomina

espacio periplasmático. En este espacio se encuentra una sustancia característica
de las bacterias, tanto Gram positivas como Gram negativas,
llamada peptidoglicano (o mureína). En el espacio periplasmático también se
pueden encontrar enzimas importantes para la nutrición de la bacteria.
El peptidoglicano es un polímero de glúcidos y aminoácidos que forma una capa
con un papel estructural muy importante en la pared celular de la bacteria al dar
fuerza y contrarrestar la presión osmótica del citoplasma. También participa en la
fisión binaria durante la reproducción bacteriana. En general, la capa de
peptidoglicano es más delgada en bacterias Gram negativas que en Gram
positivas.

1 (Prescott, 1999)

5
Membrana externa

La membrana externa de las bacterias Gram negativas es una bicapa lipídica de

estructura similar a la membrana citoplasmática. En esta membrana se pueden
encontrar diversas proteínas; una de las más características son las poninas, unas
proteínas que forman canales por los que pueden pasar determinadas sustancias
Otra estructura característica de la membrana externa son los lipopolisacáridos.
En cada lipopolisacárido bacteriano se pueden diferenciar tres regiones: el lípido
A anclado en la parte externa de la membrana (actúa como endotoxina),
una estructura polisacaroídica central conocida como núcleo o core y
el polisacárido O, más conocido como antígeno O.
Algunas bacterias Gram negativas presentan una capa S (estructura cristalina de
proteínas y glicoproteínas) apoyada sobre la membrana externa (en las Gram
positivas, si aparece, se sitúa sobre la membrana citoplasmática). Otra diferencia
es que si las bacterias Gram negativas presentan flagelos, estos tienen cuatro
anillos de apoyo, dos por cada membrana, en lugar de dos como las Gram
positvas.

La tinción de Gram

La tinción de Gram fue desarrollada por Hans Christian Gram en 1884 y consiste
es una mezcla de sustancias coloreadas que se aplica sobre una muestra
bacteriana. Primero se aplica una solución de cristal violeta, un colorante que tiñe
todas las células bacterianas, tanto Gram negativas como Gram positivas, y da
una coloración azul – morada a las bacterias.
Posteriormente se aplica una mezcla yodo y lugol que fija el cristal violeta.
Después se lava la muestra con una mezcla de alcohol y acetona que es capaz de
disolver el cristal violeta y decolorar las bacterias. Algunas bacterias no se
decoloran y permanecen azules. A estas bacterias que permanecen azules se les
llama Gram positivas, a las que se han decolorado se les llaman Gran negativas.
Para ver mejor las bacterias Gram negativas se aplica otro colorante,
generalmente safranina o fucsina, que dan un color rosa a las bacterias. Así,
quedan bacterias teñidas de azul (Gram positivas) y bacterias teñidas de rosa
(Gram negativas).
La diferente respuesta a la tinción de Gram se debe a que el cristal violeta es
retenido por la capa de peptidoglicano y, al ser más delgada en las bacterias Gram
negativas, estas sufren la decoloración al aplicar la mezcla de alcohol y acetona.
Se creía que el cristal violeta pasaba al interior celular pero recientemente se ha
observado que no ocurre así sino que las moléculas de cristal violeta se adhieren
al peptidoglicano y no atraviesa la membrana citoplasmática. En las bacterias
Gram negativas esta adherencia sería menor al tener menos peptidoglicano.

6
Limitaciones de la tinción de Gram

Existen bacterias que dan respuestas a la tinción de Gram que no se corresponde

con la estructura real de su pared celular. Por ejemplo, existen bacterias con una
estructura de pared celular Gram positiva pero con una capa delgada de
peptiglicano que dan negativo en la tinción de Gram. Incluso hay bacterias con
una sola membrana y sin peptidoglicano (mycoplasmas) que también dan negativo
en la tinción de Gram aunque están estructuralmente más relacionadas con las
bacterias Gram positivas. Por este motivo, aunque la tinción de Gram sigue siendo
ampliamente utilizada como método de aproximación diferencial, la definición de
bacteria Gram negativa y bacteria Gram positiva en función de su respuesta a la
tinción de Gram no es del todo fiable.
La respuesta a la tinción de Gram también se utilizó como clasificación taxonómica
(Negibacterias y Posibacterias) pero con el desarrollo de la biología molecular se
pudo comprobar que esta clasificación no forma grupos filogenéticos coherentes.
La línea monofilética de las Gram negativas fue desacreditada definitivamente en
1987 con el estudio de Carl Richard Woese sobre la evolución bacteriana.
Todos estos hechos hacen que los términos Gram negativa y Gram positiva sean
actualmente ambiguos pudiendo referirse a una clasificación taxonómica, a un tipo
de estructura de pared celular o la respuesta a la tinción de Gram. Dado que la
presencia de una o dos membranas lipídicas rodeando a la célula son los dos
principales tipos de ultra estructuras de células procariotas, se han propuesto otros
nombres para referirse de forma específica a esta característica. El microbiólogo
Gupta propuso en el año 2000 los términos monoderma y diderma para referirse a
bacterias con una o dos membranas respectivamente. También se propuso estos
términos como aplicables de forma general para referirse a las características de
cualquier célula procariota.2

Implicaciones sanitarias

Entre las bacterias Gram negativas muchas son patógenos para el ser humano y
la estructura de la pared celular de estas bacterias tiene un papel destacado tanto
en la patogenicidad como en el tratamiento. Por un lado, el lípido A (la parte
lipídica del lipopolisacárido) es una endotoxina y es capaz de estimular respuestas
del sistema inmunitario generando una reacción tóxica responsable de muchos de
los efectos patógenos. Entre los efectos tóxicos más importantes del lípido A está
la estimulación de la respuesta inflamatoria y fiebre. El mecanismo de acción está
relacionado con la activación de los macrófagos, los cuales liberan Interleucina-1,
factor de necrosis tumoral y óxido nítrico que desencadenan la respuesta
inflamatoria y la fiebre.
Por otro lado, la membrana externa supone una barrera de protección que impide
o dificulta la actividad de agentes antimicrobianos como pueden ser antibióticos o

2 (Prescott, 1999)

7
detergentes antisépticos. Por ejemplo, la membrana externa de las bacterias Gram
negativas es la responsable de que sean resistentes a la lisozima y a la penicilina.
No obstante, hay disponibles antibióticos con actividad frente a las bacterias Gram
negativas, por ejemplo, la estreptomicina o la ampicilina. 3
Familia Enterobacterias
 Bacilos gram negativos.
 Anaerobias facultativas.
 Fermentan la glucosa.
 Reducen los nitratos.
 Son catalasa-positivas y oxidasa-negativas.
 Ubicuas.
 Inmóviles o móviles con flagelos perítricos.
 No forman esporas.
 Algunas presentan cápsulas prominentes, mientras que otras están
rodeadas de una capa viscosa, difusible y suelta.
 Poseen antígeno común enterobacteriano
 Se adquieren de un reservorio animal, de un portador humano o por
diseminación endógena.
 Incluye géneros que pueden ser: – Patógenos primarios. – Flora comensal
normal y producir infecciones oportunistas. – Flora comensal que deviene
patógena cuando adquiere genes con factores de virulencia presentes en
plásmidos, bacteriófagos e islas de patogenicidad.
Es el grupo más grande y heterogéneo de bacilos gramnegativos con importancia
clínica.
Estos géneros se han clasificado según sus propiedades bioquímicas (baterías
bioquímicas), estructura antigénica (serotipificación) e hibridación y secuenciación
de su material genético.
A pesar de la complejidad de la familia menos de 20 especies son responsables
de la mayor parte de las enfermedades humanas.4
Familia enterobacteriaceae
 Género Escherichia
 Género Klebsiella

3 (Prescott, 1999)
4 (Brock, 2004)

8
 Género Salmonella
 Género Shigella
 Género Citrobacter
 Género Enterobacter
 Género Morganella
 Género Proteus
 Género Serratia
 Género Yersinia

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Factores de patogenicidad

• Fimbrias comunes: adherencia a receptores específicos.

• Pili sexual: transferencia genética horizontal entre bacterias.

• Endotoxina: lípido A del LPS que se libera durante la lisis celular.

• Cápsula: evasión de la respuesta inmune.

• Variación de fase antigénic: El antígeno capsular K y el antígeno flagelar H se

pueden expresar alternativamente o no expresarse en absoluto (variación de
fase).

• Sistemas de secreción tipo III: facilita la secreción de factores de virulencia

bacterianos. Sus efectos son diferentes, y su ausencia comporta pérdida de
virulencia.

• Secuestro de factores de crecimiento: sideróforos y hemolisinas.

• Resistencia al efecto bactericida del suero: evasión del complemento.

• Resistencia antimicrobiana: a través de plásmidos transferibles entre especies,

géneros y familias de bacterias. 5

Medio de cultivo

El agar MacConkey es un medio de

cultivo selectivo y diferencial para bacterias diseñado para aislar
selectivamente bacilos Gram negativos y entéricos (encontrados normalmente en
el tracto intestinal) y diferenciarlos sobre la base de la fermentación de la lactosa.

5 (Prescott, 1999)

10
El cristal violeta y las sales biliares inhiben el crecimiento de
organismos grampositivos, lo que permite la selección y el aislamiento de bacterias
gramnegativas. Las bacterias entéricas que tienen la habilidad de
fermentar lactosa pueden ser detectadas utilizando el carbohidrato lactosa y
el indicador de pH rojo neutro.

MATERIALES, EQUIPO Y REACTIVOS

MATERIALES

 Cajas petri
 tubos de ensaye de 13 x 100
 Gradilla
 Asa bacteriológica
 Mechero bunsen
 Espátula
 Gasas estériles
 Algodón
 Papel Kraft
 Papel Aluminio
 Sangre

EQUIPO

 Incubadora

REACTIVO

 Agar nutritivo
 Agar Macconkey
 Agar E.M.B.

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METODOLOGÍA

Medio de cultivo Agar macconkey

Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el crecimiento de gérmenes Gram

positivos. La lactosa y el indicador de pH rojo neutro, permiten la diferenciación de
las bacterias lactosa positiva (colonias rosa intenso con halo de precipitación), de
las no fermentadoras (colonias transparentes o ambar).

Sembrar el medio de cultivo con la muestra problema por estría cruzada. Incubar
24 h a 35ºC.

PREPARACION:

 Rehidratar 50 g del medio en un litro de agua destilada.

 Reposar 10 a 15 minutos.
 Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullición durante 1
minuto para disolverlo por completo.
 Esterilizar en autoclave a 121ºC (15 lbs de presión) durante 15 minutos.
 Enfriar aproximadamente a 45°C.
 Vaciar en cajas de Petri estériles.
 Conservar en refrigeración de 2 a 8ºC.

CÁLCULOS

 Agar Macconkey
50 g – 1000 mL
x – 36 mL

35 𝑚𝐿 ∗ 50 𝑔
𝑥= = 𝟏. 𝟖 𝒈 𝒂𝒈𝒂𝒓 𝑴𝒂𝒄𝒄𝒐𝒏𝒌𝒆𝒚
1000 𝑚𝐿

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CONCLUSIÓN

Los bacilos Gram-negativos, catalasa-positivos, son los agentes más importantes en el

deterioro de los alimentos y al mismo tiempo los patógenos más relevante de origen
entérico transmitidos por alimentos.

Por lo tato debemos tener extremo cuidado con los alimentos que consumimos, ya que
por medio de ellos podemos infectarnos por este tipo de bacterias patógenas, que en
algunos casos las colonias pueden ser lisas y ser extremadamente peligrosas para el
organismo.

Por ello es importante siempre desinfectar los alimentos, así como manos y utensilios a
utilizar, tener buena higiene personal y poder inhibir el crecimiento de este tipo de
bacterias peligrosas.

BIBLIOGRAFÍA
Brock. (2004). Biología de los microorganismos. México: Pearson Prentice Hall.

Prescott, H. K. (1999). Microbiología. Madrid: Mc Graw Hill Interamericana.

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