LABORATORIO DE TÉCNICAS

MICROBIOLÓGICAS

PRÁCTICA No. 4

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS.

OBJETIVOS
El alumno:
Practicará las técnicas comunes de aislamiento de microorganismos en medio sólido.
Analizara las colonias aisladas y comparará la eficiencia de las técnicas utilizadas en el aislamiento.

INTRODUCCIÓN
El hábitat de los microorganismos es muy diverso, por lo que se dice que los microorganismos
presentan la característica de ser ubicuos, cualquier hábitat que tenga las condiciones idóneas permitirá
que el microorganismo forme poblaciones. El crecimiento de los microorganismos en la naturaleza
depende de factores como la cantidad y tipo de nutrientes, así como las condiciones fisicoquímicas
necesarias para su crecimiento. En el laboratorio se pueden obtener poblaciones de ciertos
microorganismos utilizando los cultivos, en los cuales se pueden tener condiciones más definidas a
diferencia de un ambiente natural. Un cultivo puede contener una mezcla de varios microorganismos y
se conoce como cultivo mixto, y un cultivo que contiene solo un tipo o clase de microorganismo se
conoce como cultivo puro o axénico. Estamos hablando de dos procesos que son la base de la
microbiología, el aislamiento y el cultivo de los microorganismos para poder ser estudiados. (Prescott,
et al, 2004, Madigan, et al, 2004, Stanier, y Villanueva, 1992)

La preparación u obtención de un cultivo puro inicia con el aislamiento de un microorganismo a partir

de una población microbiana mixta, seguida por el mantenimiento de su descendencia en un ambiente
artificial en donde no debe permitirse la contaminación por otros microorganismos.
Existen tres tipos de recipientes más utilizados para cultivar a los microorganismos; el matraz, el tubo
de ensaye y la caja de Petri. Dichos recipientes deben inicialmente estar estériles y posterior a la
inoculación del microorganismo deben protegerlo de la contaminación externa. Para evitar
contaminaciones debe seguirse una serie de recomendaciones al abrir y cerrar los recipientes, y al
momento de inocular la muestra. Generalmente el inoculo (o muestra) se introduce con el asa de
siembra previamente esterilizada en la flama del mechero, y si la muestra es líquida puede inocularse
utilizando una pipeta estéril. (Stanier y Villanueva, 1992)

En microbiología se utilizan tres técnicas de aislamiento de colonias; 1) la siembra por estría en placa,
2) siembra por extensión en placa y 3) siembra por vertido en placa.
La siembra por estría en placa (también por agotamiento), consiste en tomar la muestra con un asa de
siembra, se hacen estrías sobre la superficie del medio sólido en la caja de Petri, y conforme se
realizan las estrías en forma de zigzag se va agotando la carga microbiana depositando menos
microorganismos en donde se realizan las últimas estrías (Fig. 1). Esta técnica permite que las células
queden separadas lo suficiente para que en un lapso de 18-24 horas a temperatura optima se pueden
observar las colonias individuales. Si es un cultivo mixto se podrán apreciar diferentes morfologías
coloniales y si estas colonias son inoculadas por separado, podrán obtenerse cultivos puros. (Olivas y
Alarcón, 2004, Stanier y Villanueva, 1992)
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Para las técnicas de extensión en placa y vertido en placa, la muestra debe diluirse previamente usando
diluciones seriadas (Fig. 2). Las diluciones pueden ser de 10 en 10 ó de 100 en 100, dependiendo de la
carga microbiana que se espera tenga la muestra original.

Figura 1. Técnica por agotamiento en placa, conforme se realizan las estrías (a-d) haciendo un
pentágono se reduce la carga microbiana.

En la técnica de vertido en placa (fig. 3-B), el inoculo se coloca en las placas de Petri estériles y sobre
el inoculo se vierte el medio de agar fundido, pero enfriado, se van mezclando y se dejan solidificar.
Las colonias se desarrollarán en la superficie e incorporadas en el agar.

Figura 2. Técnica de diluciones seriadas, obsérvese que se aplica para muestras sólidas y muestras
líquidas.

La siembra por extensión (difusión) en placa (fig.3-A), se vierte sobre la placa de agar solidificado el
inoculo en suspensión (dilución) y se extiende de forma uniforme con el asa de Drigalski. La
suspensión se absorbe en el agar permitiendo que las células microbianas crezcan en la superficie.
(Stanier y Villanueva, 1992)
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Figura 3. A- Técnica de siembra por extensión en placa, las colonias crecen en la superficie, B- técnica
de siembra por vertido en placa, las colonias crecerán en superficie y otras quedaran incluidas en el
agar.

MATERIAL POR EQUIPO

Cada equipo traerá una muestra sólida y una muestra líquida, a partir de las cuales se aislaran los
microorganismos.

MATERIAL Y REACTIVOS

Material que debe traer el equipo Reactivos (por equipo)

• 2 Muestras biológicas. • 6 placas de agar nutritivo
• Asa de siembra (una por persona) • 8 tubos de ensaye con 4.5 mL de agua
• 6 Cajas Petri desechables estériles (debe peptonada estéril.
llevarlas tres días antes de la práctica a • 2 tubos con 15 mL cada uno de agar
la Técnico de laboratorio) nutritivo estéril, aún en estado líquido
• 2 Cajas Petri desechables (50°C).
estériles(llevarlas el día de la práctica) • 2 tubos con agar nutritivo inclinado
• Varilla de vidrio (un metro aprox) de estéril (estos se usaran en la segunda
0.5 cm de diámetro para hacer el asa de sesión)
Digralsky, • Kit de tinción Gram (para la segunda
• Portaobjetos sesión)
• Puente de tinción.
• Etanol 96°

Material (por equipo) proporcionado en el

laboratorio
• 1 caja con puntas estériles para micropipeta de 100-1000 microlitros
• 1 micropipeta de 100-1000 microlitros.
• 1 espátula
• 2 mecheros
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• 1 Vortex
• Incubadora a 37°C
• 1 microscopio
• 1 estereoscopio
• 1 gradilla
• 1 caja de Petri de vidrio

METODOLOGIA (1ª sesión)

I. Siembra por estría cruzada en placa. (Siembra directo de la muestra)

1. Esterilice el asa bacteriológica en la flama del mechero, deje enfriar.
2. Tome una asada de la muestra a inocular, sobre una placa de agar nutritivo desarrolle el método de
siembra de estría cruzada, girando la caja al ir rayando hasta formar un pentágono con el propósito de ir
diluyendo el inoculo, siga las indicaciones del profesor.
3. Esterilice el asa una vez terminada la inoculación.
4. Rotule la placa de Petri, incube la placa invertida (tapa hacia abajo) a 37°C por 24 horas.

II. Dilución de la muestra

1. Pesar con mucho cuidado 0.5 g de la muestra si es sólida y/o tomar 0.5 mL con la micropipeta si la
muestra es líquida, verter el contenido en un tubo de ensaye que contiene 4.5 mL de agua peptonada
estéril, agitar en vortex a baja velocidad por 30 seg, rotular este tubo que contendrá la dilución 10-1 .
2. Tomar 0.5 mL de la dilución 10-1 con una micropipeta y traspasarlo a un tubo con 4.5 mL con agua
peptonada estéril, rotular el tubo con dilución 10-2
3. Realizar bajo el mismo esquema del paso anterior la dilución 10-3

III. Siembra por estría cruzada en placa.

1. Esterilice el asa bacteriológica en la flama del mechero, deje enfriar.
2. Tome una asada de la dilución 10-3, y sobre una placa de agar nutritivo desarrolle el método de
siembra de estría cruzada, girando la caja al ir rayando hasta formar un pentágono con el propósito de ir
diluyendo el inoculo.
3. Esterilice el asa una vez terminada la inoculación.
4. Rotule la placa de Petri, incube la placa invertida a 37°C por 24 horas.

IV. Siembra por extensión en placa

1. Tomar con la micropipeta 0.5 mL de la dilución 10-3 y vertirlos sobre la superficie de una placa de
agar nutritivo.
2. Esterilizar el asa de Digralsky pasándola primero por etanol al 96°, y posteriormente pasarla por la
flama del mechero, no dejarla sobre la flama porque se calentara demasiado.
3. Deje enfriar el asa de Digralsky y/o enfríela sobre la superficie de la placa de agar con cuidado de no
tocar la muestra.
4. Coloque el asa sobre la muestra, gire la placa de agar para permitir que la muestra quede distribuida
por toda la superficie de la placa y permitir que el agar absorba el líquido completamente.
5. Cuando la superficie se observe seca, deje de girar la placa.
6. Rotular la placa sobre la base, incubar la placa invertida a 37°C por 24 horas.
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V. Siembra por vertido en placa.

1. Tome con la micropipeta 0.5 mL de la dilución 10-3 y traspase el líquido a una caja de Petri
desechable y estéril.
2. Tome el tubo con agar nutritivo que aún se encuentra líquido (40-50 °C) y viértalo sobre la muestra
del paso anterior.
3. Agite la caja petri haciendo círculos sobre la mesa para permitir que la muestra se diluya en el agar.
4. Deje solidificar, rotule e incube la placa invertida a 37°C por 24 horas.

Nota. Revisar el crecimiento a las 24 horas, si hay mucho crecimiento de las colonias, guardar las
placas en una bolsa y refrigerar a 4°C hasta la siguiente sesión. Si las colonias están muy pequeñas,
dejarlas a temperatura ambiente hasta la siguiente sesión.

METODOLOGIA (2ª Sesión)

1. Una vez que haya obtenido colonias aisladas, analícelas bajo el estereoscopio, describa la
morfología colonial.
2. Realice tinción Gram para las colonias aisladas, obsérvelas bajo el microscopio y describa la
morfología celular.
3. Seleccione dos colonias y siémbrelas en tubos con agar nutritivo inclinado para preservarlas.

CUESTIONARIO
1. Existen técnicas de aislamiento de microorganismos en medio líquido, investigue y explique
para que tipo de microorganismos se recomiendan y cómo se lleva a cabo éste método.
2. Investigue y realice un cuadro comparativo de las técnicas de aislamiento utilizadas en
microbiología, considerando el propósito, ventajas y desventajas.

BIBLIOGRAFÍA
• Prescott, L., Harley, J. P. y Klein, D.A. 2004. Microbiología. 4ª. Edición. McGraw Hill.
• Madigan, M.T., Martinko, J.M. y Parker, J. 2004. Brock. Biología de los Microorganismos. 10ª.
Edición. Prentice- Hall Pearson. España.
• Olivas, E.E., y Alarcón, L.R. 2004. Manual de prácticas de microbiología básica y
microbiología de los alimentos. Programa de nutrición. Universidad Autónoma de Ciudad
Juárez. Instituto de Ciencias Biomédicas.
• Stanier, R.Y, y Villanueva, J. 1992. Microbiología. Segunda edición en español. Editorial
Reverte.
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NÚMERO DE PRÁCTICA: PRÁCTICA No. 4

NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Aislamiento de microorganismos.
FECHA:

Material (por equipo) proporcionado en el Reactivos (por equipo)

laboratorio
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• 1 caja con puntas estériles para • 6 placas de agar nutritivo

micropipeta de 100-1000 microlitros • 8 tubos de ensaye con 4.5 mL de agua
• 1 micropipeta de 100-1000 peptonada estéril.
microlitros. • 2 tubos con 15 mL cada uno de agar
• 1 espátula nutritivo estéril, aún en estado líquido
• 2 mecheros (50°C).
• 1 Vortex • 2 tubos con agar nutritivo inclinado
• Incubadora a 37°C estéril (estos se usaran en la segunda
• 1 microscopio sesión)
• 1 estereoscopio • Kit de tinción Gram (para la segunda
• 1 gradilla sesión)
• 1 caja de Petri de vidrio

Número de Nombre del alumno(a) Firma del alumno(a)

equipo