DIVISIÓN DE BIOTECNOLOGÍA. ANÁLISIS INSTRUMENTAL.

PRÁCTICA No. 2 CURVA TIPO.

INTRODUCCIÓN.

Las técnicas espectrofotométricas son métodos de análisis químico instrumental basados en las propiedades del espectro
electromagnético, donde este es descrito por el comportamiento de la energía como onda. Como tal, la radiación
electromagnética esta caracterizada por una longitud de onda o  (en cm o nm), energía (joules o ergios) y la frecuencia ()
dada en Hertz o Hz (o 1/cm).

La región del espectro electromagnético útil en la identificación y cuantificación de analítos esta comprendida dentro de una
longitud de onda 750-2500 nm para el Infrarrojo Cercano (NIR), 400-750 nm para la región Visible y 10 hasta 380 nm para la
la región ultravioleta (UV).

Un analíto para que sea candidato a una determinación espectrofotométrica debe de cumplir los siguientes requisitos:

 Ser excitado a la longitud de onda analizada

 Tener una máxima absorción a la longitud de onda seleccionada

 Ser una muestra diluida.

 Ser estable en el intervalo de energía de análisis.

La espectrofotometría se basa en dos leyes establecidas por Lambert, Bouguer y Beer, también conocidas como leyes de la
espectrofotometría. Los postulados son los siguientes:

1ª. Ley: A una longitud de onda en la que puede ocurrir absorción, al aumentar el espesor de la muestra absorbente (o
camino óptico “b”), disminuirá la cantidad de luz transmitida a través de ella. Entonces.

Ln P/Po = -kb, donde.- P: energía no absorbida (o transmitida), Po: energía incidente y b: camino óptico

El cociente de la energía transmitida entre la energía incidente se conoce como “Transmitancia” (T = P/Po) y la Absorbancia
“A” se define como el logaritmo negativo de la relación P/Po es decir, A = -log P/Po.

2ª. Ley: a una longitud de onda en la que pueda ocurrir absorción, al aumentar la concentración de la solución absorbente
disminuirá la energía luminosa trasmitida en forma logarítmica similar a la ecuación del camino óptico. Entonces:

Ln P/Po = -k’c, donde.- c: concentración, P: energía no absorbida (o transmitida), Po: energía incidente.

Al combinar las ecuaciones de cada ley da como resultado -log P/Po = kbc = A donde.- k: absortividad, b: camino óptico y c:
concentración. Pero A = log[1/(%T/100)] = 2 – log%T. Si la concentración es expresada en moles y el camino óptico es 1 cm,
entonces la absortivida “k” se transforma en Absortividad Molar “” y entonces A = bc.

Los métodos mas comúnmente usados en la espectrofotometría cuantitativa son:

a) Comparación patrón. A partir de la Absorbacia de una muestra de concentración conocida (o patrón) se determina
la Concentración del analíto a partir de su Absorbacia mediante la siguiente relación:

A1/A2 = C1/C2, donde 1: Analíto y 2: Patrón

b) Ley de Beer.- Conociendo la Absorbancia “A”, y la concentración “c” del Patron ( 1 ) siendo el mismo camino óptico
“b” tanto para la muestra ( 2 ) y el patrón. De la ecuación de la Ley de Beer se despeja la Absortividad Molar “”, es
decir:  = A1/(bc1) y una vez determinada se despeja la concentración de la muestra c2 = A/(b)
 c) Curva Tipo o Patrón o de Calibración.- Se determina la Absorbancia (variable dependiente Y) a diferentes
concentraciones conocidas del patrón (variable independiente X). Donde con los datos experimentales se obtiene
la ecuación de regresión Y = mX + b, donde Y: variable independiente (o Absorbancia A), m: pendiente de la recta
(o Absortividad Molar “”), X: variable dependiente (o concentración del patrón c) y b: la ordenada al origen (o
intercepto), que en términos de la Ley de Beer queda A = c + b donde a partir de las constantes de la ecuación de
la recta m =  y el intercepto b se despeja la concentración de la muestra a partir de su absorbancia registrada, es
decir: c = (A – b)/

OBJETIVOS.

Determinar la concentración de un analíto en una muestra por espectrofotometría UV-Vis

Realizar los cálculos necesarios para la obtención de la curva patrón

Obtener la ecuación de regresión de la Curva Patrón

Determinar las concentración de un analíto por los tres métodos analíticos.

EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS.

Espectrofotómetro

Celda para espectrofotómetro

Glucosa

Agua desionizada

Gradilla

Tubos de ensaye de 15 x 200 mm.

Pipetas de 1, 5 y 10 mL

Acido 3,5 dinitro salicílico (DNS) (disolver 4 g de Hidróxido de Sodio y 75 g de Tartrato de Sodio y Potasio en 250 mL de
agua. En baño maría a 50ºC disolver 2.5 g de ácido 3,5 DiNitroSalicilico y aforar a 500 mL)

Probeta de 100 mL

Vaso de precipidados de 250 mL

Parrilla

Baño de hielo

METODOLOGÍA y RESULTADOS.

1. Realizar los cálculos pertinentes para establecer el sistema de dilución de la curva patrón con un intervalo de
concentración de 0 a 200 mg/dL de glucosa.

2. Preparar 20 mL de una solución concentrada o stock de 2 g/L de glucosa

3. Realizar el sistema de dilución BINARIO de 4 puntos en la curva patrón y el sistema de dilución a partir de la
solución stock

4. Preparar 5 mL de una solución Cloruro de Cobalto al 1%

 5. Calibrar el espectrofotómetro mediante un barrido de 470 a 550 nm con incrementos de 10 nm con la solución de
Cloruro de Cobalto al 1%. Registrar la longitud de onda de máxima absorción de dicha solución.

6. Tomar 1 mL de cada dilución de glucosa y la muestra problema, transferirlos a un tubo de ensaye de 15 x 200 mm

7. Adicionar a cada uno de los tubos incluyendo el de la muestra problema y el blanco reactivo (sin glucosa) 1 mL de
la solución ácido 3,5 DNS

8. Someter a ebullición los tubos por 5 min.

9. Adicionar 2.5 mL de agua y dejar enfriar a temperatura ambiente (en baño de hielo como opcional)

10. Leer los tubos de curva tipo (empezando de la concentración más diluida a la más concentrada) y la muestra
problema a 540 nm, enjuagando en cada lectura la celda con agua destilada.

11. Obtener la ecuación de regresión de la curva patrón a partir de los datos experimentales. Calcular la señal de
respuesta SC de la curva de calibración.

12. Calcular la concentración de la muestra a partir de:

a. Curva Patrón

b. Ley de Beer y

c. Comparación patrón.

13. Graficar los resultados de la curva patrón

14. Calcular la precisión (reproducibilidad) de la curva tipo a partir de aquellas preparadas desde solución stock y las
obtenidas por sistema de dilución binaria.

15. Calcular la repetibilidad del método a partir de los datos de curva tipo obtenidos en el espectrofotómetro “Perkin
Elmer” contra los datos obtenidos en el espectrofotómetro Genesis 10Vis.

CUESTIONARIO.

1.¿Cómo se podría determinar la sensibilidad y selectividad del método de azúcares reductores por el método del 3,5 DNS?

2. ¿Cuál es la relación entre la sensibilidad del método y el límite de detección.

3. ¿Cuál es el significado de la absortividad molar? Determine las unidades de la absortividad molar

4. ¿Por qué es importante la concentración de la muestra en una determinación espectrofotométrica?

5. Para que sea valida la determinación de la concentración de un análito por un método espectrofotométrico ¿En qué
intervalos de absorbancia debe de caer las lecturas?

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

Pietrzyk D.J., Frank C.W. (1983) “Química Analítica” Ed. Interamericana, México, D.F.
 PROBLEMARIO DE ESPECTROFOTOMETRIA
1. De diez tabletas de clorhidrato de tetraciclina (PM=480.9 g/mol) se toma una porción de 0.45 g y se disuelve en un
litro de HCl 0.1 N. Se toman 10 mL y se diluyen a 100 mL en un matraz aforado. Se analizo por espectrofotometría
de acuerdo a la siguiente curva patrón con una celda de 1 cm de ancho. Calcule la concentración de la tetraciclina
por A) Curva patrón, A2) Obtenga la ecuación de regresión y la R2 A3) Grafique los datos de la curva patrón, B) Ley
de Beer (justifique la elección del punto seleccionado), C) por comparación patrón (justifique la elección del punto
seleccionado) y D) Calcule el porcentaje del antimicrobiano mediante la formula siguiente:
a. % Tetraciclina = (gramos de Tetraciclina / gramos muestra) * 100 (nota tome en cuenta la dilución que se
hizó de la muestra.
[tetraciclina] en mol/L 0.000025 0.000042 0.000050 0.000064 problema
Absorbancia 0.46 0.76 0.90 1.15 0.94
2. Calcule la concentración del Fe en solución, a partir de los siguientes datos: b = 1 cm,  = 465 nm.
[Fe] en mol/L 0.10000 0.00050 0.00010 0.00005 problema
A465 nm 18 1.2 0.60 0.13 0.54
A) Obtenga la ecuación de regresión. B) Determine si se puede realizar el cálculo de la concentración por curva
patrón de acuerdo a la R2 . C) Elija entonces otro método alternativo para realizar el cálculo de la
concentración del analíto, justifique su elección.
3. 10 mL de una muestra de agua contiene trazas de hierro que se pasan a un embudo de decantación.
Simultáneamente se prepara una serie de patrones. Se añade a todas las disoluciones cloruro de hidroxilamina
para reducir el ión férrico a ión ferroso, se amortiguan la disolución y se añade batofenantrolina. A continuación se
agregan a cada muestra 6 mL de alcohol isoamílico y se extrae el complejo Fe-batofenantrolina. La absorbancia de
cada solución se mide a 533 nm en una celda de 1 cm de ancho. Seleccione el método mas adecuado para realizar
el cálculo de la concentración del hierro en ppm (mg/L)
[Fe] g/mL Vol. Solución tomada (mL) [Fe] en alcohol Absorbancia a 533 nm
isoamílico (g/mL)
0.100 10.00 0.167 0.08
0.100 20.00 0.333 0.16
1.000 5.00 0.833 0.41
1.000 10.00 1.667 0.83
1.000 20.00 3.333 1.61
problema 10.00 0.54
4. Una disolución de 1.2x10-5M de un compuesto tiene una absorbancia de 0.21 a una l de máxima absorción.
Calcule la absortividad molar si el camino óptico es de 0.1 cm
5. Un compuesto tiene una absortividad molar de 13200 L/mol*cm. Si la disolución del mismo tiene una absorbancia
de 0.41 en una celda de 1.0 cm de ancho, calcule su concentración.
6. Una solución de 3 ppm (mg/L) tiene una transmitancia del 65% en una celda de 1.0 cm. A) Calcule su absorbancia,
B) Calcule la absorbancia y la transmitancia de una solución de 5.2 ppm y C) Calcule la absortividad molar si el
compuesto tienen un PM = 155 g/mol
7. ¿Cuál es la absortividad molar de un compuesto cuyo PM = 192 g/mol si una solución del 0.015% (p/v) tiene una
transmitancia del 27% en un camino óptico de 1 cm.
8. La transmitancia (a 520 nm) de una solución de 5.0 ppm en una celda de 1 cm es del 27%. A) Calcule su
absorbancia, B) Calcule la absorbancia y el %T de una solución de 3.20 ppm de permanganato de potasio y C)
¿Cuál es la absortividad molar del permanganato de potasio?