Sunteți pe pagina 1din 3

METODE DE LUCRU

TOLERANTA LA ACIZI SI SARURI BILIARE


Pe scurt, un stoc înghețat de spori Bacillus a fost diluat cu PBS pentru a obtine
10 𝑠𝑝𝑜𝑟𝑖 ∗ 𝑚𝐿−1. Tuburile conținând spori au fost incubate la 80 ° C timp de 20 minute cu agitare
8

pentru a scăpa de celulele vegetative rămase. După tratamentul termic, tuburile au fost plasate pe
gheață timp de 10 min.
10 mL de bulion MRS au fost transferati în tuburi sterile și pH-ul bulionului a fost ajustat
la diferite valori: 2,0, 2,5, 3,0 utilizând HCl 0,1 N. Au fost preparati 10 mL de bulion MRS
conținând 0,3% săruri biliare și transferate în tuburi de 50 ml. În acest experiment s-au inclus
tuburi de control conținând medii broth fără adăugarea de acizi sau saruri biliare. O cantitate de
100 μL de suspensie de spori diluată conține 5 × 107 unități de formare a sporilor per mililitru
(SFU · 𝑚𝐿−1 ) în fiecare tub (acid, bilă și tuburi de control).
La fiecare interval de timp, 0, 0,5, 1, 2 și 4 ore, metoda de dispersie a fost utilizată pentru
a enumera numărul de spori supraviețuitori după tratamentul cu acid și saruri biliare pe plăcile
MRS.
Plăcile inoculate au fost incubate aerobic la 37 ° C timp de 24 - 30 de ore. Pentru fiecare
tratament, au fost măsurate ratele de supraviețuire. Rata de supraviețuire a fost definită ca
procentele numărului logaritmic al SFU la toate intervalele de timp împărțite la numerele SFU la
timpul 0 (control). De exemplu, ratele de supraviețuire după 4 ore sunt ((log10 SFU · 𝑚𝐿−1 la 4
h) / (log10 SFU · 𝑚𝐿−1 la 0 h)) x 100.

Toleranța la acizi a tulpinei. O mostra de 1 ml din cultura lasata peste noapte a LN sau ATCC
23350 a fost centrifugată la 8.000 x g timp de 20 minute la 4 ° C. Granulele au fost spălate de două
ori în PBS steril (100 mM, pH 7,4) și apoi resuspendate în 10 ml de PBS steril (100 mM, pH 2,0
sau 3,0). Suspensiile bacteriene au fost incubate static la 37 ° C timp de 3 ore. În timpul perioadei
de incubare, a fost luată o mostra de 0,1 ml de probă la 0, 0,5, 2 și, respectiv, 3 ore, pentru a număra
celulele utilizând metoda placii standard de agar.

Toleranta la saruri biliare a tulpinei. Pe scurt, o mostra de 1 ml de cultură lasata peste noapte a
LN sau ATCC 23350 a fost inoculată în 100 ml de bulion LB conținând 0,3% (g / v) ox gall
(Sigma) și incubat la 37 ° C într-un agitator orbital la 250 rpm timp de 12 ore. În timpul perioadei
de incubare, a fost luată o mostra de 1 ml de probă la 0, 4, 8 și, respectiv, 12 ore, pentru a estima
populația celulară prin măsurarea turbidității la OD600.
Testul de stabilitate a pH-ului. Influența pH-ului asupra stabilității ECP (extra cellular products)
a fost măsurată în intervalul de pH de la 5,0 la 9,0. Se adaugă 10 mg de ECP la 50 µL de soluție
50 mM acid citric (pH 5), tampon fosfat de potasiu (pH 6-8) și tampon carbohidrat (pH 9) apoi
fiecare amestec a fost aplicat la tulpina A. hydrophila ZN1 plăci de cultura in gazon. Zonele de
inhibare au fost înregistrate pe plăcile cu A. hydrophila.

Stabilitatea termică.Pe scurt,10 mg de ECP au fost tratați independent la 20, 40, 60, 80 și100 ° C
timp de 30 de minute. Apoi, fiecare mostra de tratament a fost aplicata plăcilor cu A. hydrophila
ZN1. Zonele de inhibare au fost înregistrate pe plăcile cu A. hydrophila.

Testul de stabilitate a enzimei. Cele 10 mg de ECP s-au digerat cu 15 µL de proteinază K (974


U / mL) la 30 ° C timp de 2 ore. Apoi, proba prelucrată a fost aplicată plăcilor cu tulpina A.
hydrophila ZN1. Zonele de inhibare au fost înregistrate pe plăcile cu A. hydrophila.

Supraviețuirea în condiții gastrointestinale simulate. Culturile de Bacillus au fost crescute la


35 ° C peste noapte în MNB. Celulele bacteriene au fost recoltate prin centrifugare la 2795 x g, 4
° C timp de 20 min înainte de inocularea în fluide gastrice simulate [3 mg 𝑚𝐿−1 de pepsină
(mucoasă de stomac porc, Sigma) 2,5] pentru a obține concentrația inițială de celule 1 ∗ 106 UFC
𝑚𝐿−1 (OD600 = 0,1) și a fost incubată la 35 ° C într-un incubator cu agitare la 150 rpm.
Numărătoarea celulelor bacteriene s-a efectuat pe plăcile MNA la timpii 0, 0,5, 1, 2 și 3 ore de
incubare. În mod similar, culturile crescute peste noapte au fost incubate în fluide intestinale
simulate [1 mg 𝑚𝐿−1 de pancreatină (pancreas porcină; Sigma) și 0,3% săruri biliare (Oxiod)]
ajustate la pH 8. Mostrele au fost extrase la intervale de 0,1, 2, 3 și 6 ore pentru numărul de plăci
diluate pe plăcile MNA. Proporția de supraviețuire la fiecare interval de timp a fost calculată prin
compararea cu numărul de celule viabile la timpul 0 h.

Toleranța față de sarurile biliare. Pentru a determina toleranța față de sarurile biliare, s-a
utilizat bulionul MRS (pH = 6,5) cu 0% și 0,3% (greutate / volum) sare de sodiu a acidului
tauroglicocholic (TDCA). Aceste medii s-au inoculat cu cultura proaspătă (1% v / v) și la
intervale de 3, 6, 12 și 24 h, s-a măsurat absorbanța la 560 nm. Rezultatele au fost analizate ca
creștere procentuală în comparație cu proba cotrol (0% sare bilă)

Testul plăcii cu saruri biliare. Un test cu placa cu agar a fost utilizat pentru a detecta activitatea
BSH a CBSYD1 împreună cu screeningul probiotic. Plăcile cu sare biliară preparate prin MRS-
agar (87 mm x 15 mm) conțin 0,5% (greut / vol) TDCA. Odată ce plăcile au fost preparate, s-au
făcut 3 spoturi diferite utilizând un replicator pentru inocularea tulpinilor bacteriene cu 30
microlitri și plăcile au fost incubate sub atmosferă anaerobă la 37 ° C pentru 48H. După perioada
de incubare, plăcile au fost păstrate timp de 15 minute cu iodură de iodură de potasiu (1 g iod, 5 g
iod de potasiu și 330 ml apă deionizată) pentru a detecta o zonă de halouri limpezi. Escherichia
coli KCTC 1923 (E.coli) și Lactobacillus acidophilus au fost considerate, respectiv, bacterii
negative de control în testul de activitate BSH.
Toleranța condiției tractului gastrointestinal la CBSYD1. Un bulion MRS cultivat peste noapte
(pH 5.6, 37 ° C în atmosferă de CO2 (5% v / v)) a fost centrifugat (10000 rpm, 15 min, 5 ° C) și
spălat de două ori în tampon. După aceea, celulele izolate au fost transferate într-o soluție care
simulează condițiile de stomac (50 ml HCL, ph 2,0, 0,5% greutate / volum NaCL, 0,3% greutate /
volum pepsină). Celulele au fost incubate la 37 ° C în atmosferă de CO2 (5% v) cu agitare
ocazională la intervale de 0,1,2 și 3 h, determinările au fost facute pe MRS-agar prin metoda
plăcii. După 3 ore de cultivare, pH-ul a fost ajustat la 6,8 ± 0,2 (utilizând NaOH 10% greutate /
volum ). Pentru a simula condițiile existente în ileon s-au adăugat bila de bivol (0,3% greutate /
volum) și pancreatină (0,1% g / v), incubarea continuând în aceleași condiții și numărul de celule
(UFC / ml) au fost determinate în intervale orare după schimbările de mediu observate.