Un conjunto de plásmidos para la transgénesis bacteriana eficiente del cromosoma bacteriano (BAC) en

el pez cebra

Abstracto
La transgénesis de grandes construcciones de ADN es esencial para el análisis de la función del
gen. Recientemente, la transgénesis mediada por transposasa Tol2 se ha convertido en una poderosa
herramienta para insertar construcciones de ADN de cromosoma artificial bacteriano (BAC) en el
genoma del pez cebra. Para una transgénesis eficiente, la pieza de ADN genómico en la construcción
BAC necesita estar flanqueada por sitios de transposón Tol2, y las construcciones deben contener un
marcador de transgénesis para la fácil identificación de animales transgénicos. Divulgamos un conjunto
de plásmidos que contienen casetes de orientación que permiten la inserción de sitios Tol2 y diferentes
marcadores de transgénesis en BAC. Usando BAC que contienen estos casetes de orientación,
mostramos que la transgénesis es tan eficiente como iTol2, que la preselección para la expresión del
marcador de transgénesis aumenta la tasa de transgénesis,

Introducción

Los modelos animales transgénicos son herramientas experimentales esenciales para desentrañar la
función de los genes en el desarrollo y la enfermedad normales. Un transgén ideal recapitula el patrón y
los niveles de expresión génica endógena. Para lograr esto, debe contener todas las secuencias
reguladoras en el gen de interés. Dado que estas secuencias reguladoras a menudo están muy separadas,
una construcción transgénica ideal con frecuencia necesita abarcar más de 100 kb de ADN. Los
fragmentos grandes (50-200 kb) de los genomas de la mayoría de los sistemas modelo animales se han
clonado en cromosomas artificiales bacterianos (BAC). Estos BAC pueden modificarse mediante
recombinación (ingeniería genética recombinante) para generar la construcción transgénica de elección.

El desarrollo reciente de la transgénesis de BAC mediada por transposasa de Tol2 permite la integración
eficiente de constructos de ADN grandes en el genoma del pez cebra. Este método utiliza un
mínimo Tol2 cis -secuencias (iTol2) que se insertan en la construcción de BAC para flanquear la pieza
de ADN genómico. La construcción de BAC con iTol2 se coinyecta con ARNm de Tol2 en embriones
de una etapa celular. Este enfoque aumenta la tasa de inserción de transgenes de BAC de 0.5 a 5% a
alrededor del 20%.

Aunque esto constituye un impresionante aumento de cuatro a 40 veces en la tasa de transgénesis, este
método se basa en gran medida en la identificación de peces transgénicos BAC basados en proteínas
fluorescentes impulsadas por el promotor de elección. Esto conduce a la identificación de líneas
transgénicas BAC con niveles de expresión suficientemente altos para la detección ocular, lo que
probablemente da lugar a un sesgo para la sobreexpresión de líneas transgénicas BAC, un problema si
se desea estudiar la proteína de interés a niveles endógenos de expresión génica. Además, los sitios de
promotores e inserciones con niveles de expresión de proteínas fluorescentes por debajo del límite de
detección del ojo no pueden identificarse fácilmente. Para eludir estos problemas, desarrollamos un
conjunto de plásmidos que albergan casetes de destino para diferentes cadenas principales de BAC y
contienen Tol2 cis-secuencias y marcadores de transgénesis fluorescente. Usando estos casetes de
orientación, generamos más de 70 líneas transgénicas de BAC. Encontramos que la tasa de transgénesis
BAC es comparable con el enfoque iTol2, pero permite la identificación imparcial de líneas transgénicas
BAC, y que la preselección para la expresión del marcador de transgénesis aumenta la tasa de
transgénesis. También encontramos que los transgénicos BAC recapitulan fielmente los patrones de
expresión génica endógena y permiten la estimación de los niveles de expresión génica endógena si se
generan de manera imparcial.

Materiales y métodos
CONSTRUCCIÓN DE PLÁSMIDOS DE CASSETTE DIRIGIDOS A LA CADENA
PRINCIPAL BAC
Para los BAC basados en pTARBAC2-backbone, casetes dirigidos que contienen sitios Tol2 (exón 4 y
exón 1) que flanquean un casete de selección bacteriana (FRT-galK-FRT, kanaR o tetR) seguido
del promotor cryaa específico del cristalino que conducían una proteína fluorescente (dsRed,
superfolder GFP, Citrine o Cerulean), flanqueada por brazos de homología con el gen sacB en
pTARBAC2, se ensamblaron en vectores pBluescript usando PCR, clonación con enzimas de restricción
y clonación Gibson. Los brazos de homología 5 'y 3' son fragmentos de 231 pb y 242 pb
correspondientes a los nucleótidos 2777-3007 y 3053-3294 de la cadena principal de pTARBAC2,
respectivamente. Tras la recombinación homóloga, estos brazos reemplazan los nucleótidos 3008-3052
del esqueleto pTARBAC2 e interrumpen la secuencia de codificación del sacB pero no interfieren con
la propagación del BAC. Los casetes de direccionamiento para pTARBAC2 (alrededor de 4900 pb
dependiendo de la proteína fluorescente y el marcador de selección) se amplificaron usando los dos
cebadores siguientes: ggcggccgccaggcctaccca (adelante) y taaagacacggcccgcgtttt (reverso).
Para los BAC basados en pIndigoBAC-536-backbone, casetes de selección que contienen sitios Tol2
(exón 4 y exón 1) que flanquean un casete de selección bacteriana (FRT-galK-FRT o tetR) seguido del
cristalino específico del cristalinoel promotor que conduce dsRed, flanqueado por brazos de homología
con el gen lacZ en pIndigoBAC-536, se ensambló en vectores pBluescript usando PCR, clonación con
enzimas de restricción y clonación con Gibson. Los brazos de homología fueron fragmentos de 320 pb
correspondientes a los nucleótidos 409-728 y 761-1080 de la cadena principal pIndigo-356,
respectivamente. Tras la recombinación homóloga, estos brazos reemplazan los nucleótidos 409-728 y
761-1080 de la cadena principal de pIndigo-356, respectivamente, e interrumpen el gen lacZ pero no
interfieren con la propagación del BAC. Los casetes de orientación para pIndigoBAC-536 (alrededor de
5100 pb dependiendo de la proteína fluorescente y el marcador de selección) se amplificaron usando los
dos cebadores siguientes: taaatagctggcgtaatca (adelante) y gtttctacacatatattcgc (reverso).
Los plásmidos pBluescript que contienen los casetes de direccionamiento de la cadena principal BAC y
su secuencia completa de ADN están disponibles en Addgene.
CONSTRUCCIÓN DE LOS TRANSGENES BAC
Para el transgén sdf1a: sdf1a-3xFlag-4xHA BAC, el clon BAC CH73-199F2 se modificó de dos
maneras mediante recombinación. Primero, los sitios Tol2 y el marcador de transgénesis cryaa:
dsRed se insertaron en la cadena principal de BAC. En segundo lugar, la secuencia de
codificación 3xFlag-4xHA se insertó entre el último aminoácido y el codón de parada
de sdf1a utilizando la recombinación mediada por galK sin fisuras. Aproximadamente 50 pb de
homología cadena arriba y cadenaabajo del codón de parada sdf1a se añadieron a los casetes 3xFlag-
4xHA mediante PCR. El transgén BAC final se caracterizó por Spe I y EcoDigestión de restricción de
RI, secuenciación de amplicones de PCR del locus modificado y secuenciación de BAC-end.
Para el transgén cxcr4b: Lifeact-Citrine , el clon BAK DKEY-169F10 se modificó de dos maneras
mediante recombinación. Primero, los sitios Tol2 y el marcador de transgénesis cryaa: dsRed se
insertaron en la cadena principal de BAC. En segundo lugar, un casete constituido por Lifeact-
citrino lanqueada por 413 pb y 420 pb de homología aguas arriba de cxcr4b exon2, y aguas abajo de
la cxcr4b codón de parada, respectivamente, se insertó para reemplazar el cxcr4b secuencia en la
codificación cxcr4b exón 2 (aminoácido 6-358, el último aminoácido antes del codón de parada) usando
recombinación mediada por galK. Este transgén expresa los primeros cinco aminoácidos de cxcr4b exón
1 fusionado a Lifeact-citrino de la cxcr4b promotor. El transgén BAC final se caracterizó pordigestión
con restricción Spe I y Eco RI, secuenciación de amplicones de PCR del locus modificado y
secuenciación BAC-end.
Para el transgén sdf1a: sdf1a-GFP sin el casete de orientación, el clon BAC CH73-199F2 se modificó
como se describió anteriormente, con la modificación de que se insertó GFP en lugar de 3xFlag-4xHA,
y que el casete de orientación con los sitios Tol2 y el cryaa :marcador de transgénesis de proteína
fluorescente no se insertó en el BAC.
La generación del sdf1a: sdf1a-GFP (con el casete de segmentación), los transgenes cxcr4b: cxcr4b-
Kate2-IRES-GFP-CaaX y cxcr4b: cxcr4b-GFP-IRES-Kate2-CaaX se describió anteriormente
( Lewellis et al., 2013) . ; Venkiteswaran et al. 2013 ). Tenga en cuenta que el cassette de selección de
GalK funcionará en las cepas SW102, SW105 y SW106. Sin embargo, dado que la cepa SW102 es
resistente a tetraciclina, los casetes de direccionamiento basados en tetR no pueden usarse para esta
cepa. Los BAC de la biblioteca CHORI-73 BAC se obtuvieron del Children's Hospital Oakland
Research Institute ( bacpacorders@chori.org), y los BAC de la biblioteca DanioKey BAC se obtuvieron
de ImaGenes GmbH, Alemania, (sales@imagenes-bio.de).
GENERACIÓN DE LÍNEAS TRANSGÉNICAS BAC
Los transgenes BAC se purificaron con el kit nucleobond BAC 100 (Clontech) y se manipularon con
puntas de gran calibre para evitar el corte del ADN. Se coinyectaron 1 nl de 50-250 ng / μl de ADN de
BAC y 40 ng / μl de ARNm de Tol2 en la célula de elevación del cigoto de embriones de 0 a 20 min de
edad. El ARNm de Tol2 se transcribió a partir de pCS2FA-transposasa ( Kwan et al., 2007) utilizando
el kit de transcripción mMessage mMachine SP6 (Thermo Fisher). Sin embargo, dado que el ADN BAC
es muy viscoso y difícil de cuantificar, la concentración de ADN BAC y el volumen de inyección
anterior son estimaciones. A los 4 días postfertilización (dpf), se calificó la velocidad de expresión en
mosaico de la proteína fluorescente en la lente. La cantidad de ADN de BAC inyectada se tituló para
producir embragues con un 50% o más de embriones que muestran la expresión de la proteína
fluorescente de mosaico en la lente. Observamos que la velocidad y el alcance de la expresión de la
proteína fluorescente mosaico en embriones a 4 dpf depende de la cantidad y calidad de ADN de BAC
inyectado. Los embragues con un 50% o más de embriones que muestran la expresión de la proteína
fluorescente del mosaico en el cristalino se elevaron a la edad adulta. En el caso del sdf1a: sdf1a-3xFlag-
4xHA ; cryaa: dsRedLas inyecciones de transgén BAC, embriones con y sin expresión de proteína
fluorescente de mosaico en la lente se plantearon por separado hasta la edad adulta. En el caso de las
inyecciones del transgén sdf1a: sdf1a-GFP BAC sin el casete de orientación, se fijaron 20 embriones
inyectados de un clutch y se tiñeron para las transcripciones de GFP in situ . Los embragues con
expresión de mRNA de GFP en mosaico en más del 25% de los embriones se elevaron a la edad
adulta. Las larvas transgénicas estables se identificaron cruzando a los adultos inyectados con los
transgenes, y elevando las larvas positivas para el marcador de transgénesis fluorescente en la lente a 4
dpf. En el caso del sdf1a: sdf1a-GFPTransgén BAC sin el casete de orientación, los peces fundadores
adultos se identificaron por tinción de sus descendientes para las transcripciones de GFP. La línea
estable se generó criando descendientes del fundador a ciegas e identificando los peces TgBAC (sdf1a:
sdf1a-GFP) al teñir sus descendientes para las transcripciones de GFP. La línea germinal de todos los
posibles peces fundadores (peces adultos que se inyectaron como embriones) se cribó analizando 60 o
más de sus descendientes para ojos fluorescentes o expresión de ARNm de GFP a menos que se
identificara descendencia transgénica estable antes de alcanzar este límite. Para el transgén cxcr4b:
Lifeact-Citrine BAC, se seleccionaron 63 posibles fundadores; para el transgen cxcr4b: cxcr4b-Kate2-
IRES-GFP-CaaX BAC, se seleccionaron 12 posibles fundadores; Para elsdf1a: sdf1a -GFP transgén
BAC sin el casete de orientación, 60 posibles fundadores fueron seleccionados; para el transgén sdf1a:
sdf1a-GFP BAC con el casete de orientación, se seleccionaron 61 posibles fundadores; para el transgén
sdf1a: sdf1a-3xFlag-4xHA BAC, se exploraron 33 fundadores potenciales sin expresión de proteína
fluorescente en el cristalino a 4 dpf; y para el transgén sdf1a: sdf1a-3xFlag-4xHA BAC, se cribaron 42
posibles fundadores con expresión de proteína fluorescente en el cristalino a 4 dpf (para detalles, ver
Información de apoyo, Tabla S1 , Tabla S2 , Tabla S3 , Tabla S4 , Tabla S5 y la Tabla S6) Los nombres
completos de las líneas transgénicas identificadas son TgBAC (sdf1a: sdf1a-GFP) p1, TgBAC (sdf1a:
sdf1a-GFP; cryaa: dsRed) p1 a p20, TgBAC (sdf1a: sdf1a-3xFlag-4xHA ; cryaa: dsRed) p1 a través de
p16, TgBAC (cxcr4b: cxcr4b-Kate2-IRES-GFP-CaaX ; cryaa: dsRed) p1 a p9, y TgBAC (cxcr4b:
Lifeact-Citrine ; cryaa: dsRed) p1 a p16. Las líneas TgBAC (sdf1a: sdf1a-GFP ; cryaa: dsRed)p10
y TgBAC (cxcr4b: cxcr4b-Kate2-IRES-GFP-CaaX ; cryaa: dsRed) p7 se han descrito previamente
( Lewelliset al. 2013 ; Venkiteswaran y col. 2013 ). Las líneas utilizadas para la cuantificación
de cxcr4b BAC, TgBAC (cxcr4b: cxcr4b-GFP-IRES-Kate2-CaaX ; cryaa: dsRed)p1, p5 y p7, también
se han informado previamente ( Venkiteswaran et al., 2013 ).
CUANTIFICACIÓN DE NIVELES DE EXPRESIÓN
Vivo cxcr4b: Lifeact-Citrine y cxcr4b: cxcr4b-GFP-IRES-Kate2-CaaX embriones se montaron en
0.5% de agarosa de bajo punto de fusión / solución de Ringer (HEPES 5 mM, NaCl 116 mM, KCl 2.9
mM, CaCl 21,8 mM). Las pilas Z se recogieron con una lente de inmersión en agua Leica 40x (NA 0,8),
un microscopio confocal Leica SP5 II equipado con detectores HyD (Leica Microsystems) y una etapa
calentada (Warner Instruments). La temperatura del baño de agua se controló y mantuvo entre 27,9 ° y
28,4 °. Todas las pilas Z se recogieron con los detectores HyD en el modo de recuento de fotones y con
la configuración de microscopio idéntica. La potencia del láser se ajustó a 43 μW para la línea láser de
514 nm, y a 1,00 mW para la línea láser de 561 nm utilizando una lente Leica 10x (NA 0,3) y un medidor
de potencia x-cite (Lumen Dynamics Group Inc). Usando ImageJ (NIH), se aplicó una máscara al canal
YFP o RFP con un algoritmo de umbral para marcar el primordio de la línea lateral posterior. Todos los
valores en los canales YFP y RFP fuera de la máscara fueron descartados. Se promediaron todos los
valores en los canales YFP y RFP dentro de la máscara. Los recuentos medios de fotones por primordio
y por embrión se trazaron utilizando Prism (GraphPad Software Inc.). Se escribió un script de lenguaje
de macro personalizado ImageJ (NIH) para automatizar este análisis (Archivo S1 ).
ARNM Y TINCIÓN DE ANTICUERPOS
Para la tinción de ARNm, la síntesis de la sonda de ARN y la hibridación in situ se realizaron como se
describió previamente ( Thisse y Thisse 2008 ). La sonda de ARN contra sdf1a se marcó con DIG
(Roche) y se detectó con anticuerpo anti-DIG acoplado a fosfatasa alcalina (1: 5000, Roche) y NBT /
BCIP (Roche). Para la tinción de GFP, los embriones se fijaron durante 2 horas a temperatura ambiente,
se deshidrataron en metanol al 100%, se tiñeron con anticuerpo anti-GFP (1: 1000, Torrey Pines) y se
detectaron con un anticuerpo secundario contra conejo acoplado a Cy3 (1: 1000, Jackson Immuno
Research).
ADQUISICIÓN DE IMÁGEN
Los embriones sdf1: sdf1a-GFP teñidos y vivo cxcr4b: embriones Lifeact-Citrine y cxcr4b: cxcr4b-
GFP-IRES-Kate2-CaaX , se montaron en agarosa como se describe, pero en un cubreobjetos con un
anillo de vidrio y una diapositiva en la parte superior para permitir para el uso de los objetivos de
inmersión. Se obtuvieron imágenes de los embriones con los objetivos de Leica (10x, NA 0.5 y 40x, NA
1.1) usando un microscopio confocal Leica SP5 II. Las imágenes de resumen se proyectaron en suma
con ImageJ y se unieron usando un plugin ImageJ ( Preibisch et al., 2009 ).
CEPAS DE PEZ CEBRA
Los embriones se generaron cruzando adultos de Tübingen de tipo salvaje ( Haffter et al., 1996 ), y se
estadificaron como se describió previamente ( Kimmel et al., 1995 ).
DISPONIBILIDAD DE DATOS
Las líneas de pescado están disponibles bajo petición. Las secuencias de plásmidos y el ADN plasmídico
están disponibles a través de Addgene ( www.addgene.org ).

Resultados
UN CONJUNTO DE PLÁSMIDOS QUE CODIFICA CASSETTES DE SELECCIÓN DE BAC
QUE INCLUYEN SITIOS TOL2 Y DIFERENTES MARCADORES DE TRANSGÉNESIS
Para insertar las secuencias Tol2 cis junto con un marcador de transgénesis en clones BAC, generamos
un conjunto de plásmidos con casetes de orientación para las cadenas principales de la biblioteca
DanioKey BAC basada en indigoBAC y las bibliotecas CHORI-211 y CHORI-73 BAC basadas en
TARBAC ( http://www.sanger.ac.uk/resources/zebrafish/faq.html ). Específicamente, generamos
plantillas de PCR basadas en plásmidos que contienen las dos secuencias cis completas de Tol2
( Kawakami et al., 2000 ), el promotor de alfaA-crystallin ( cryaa ) que impulsa una proteína
fluorescente ( Kurita et al., 2003), un marcador de selección bacteriana y dos brazos de ADN que son
homólogos a las cadenas principales de BAC. Utilizamos Cerulean, Citrine, superfolder GFP (sfGFP) y
dsRed como marcadores fluorescentes, y galK flanqueado por sitios FRT, kanaR o tetR como
marcadores de selección bacteriana. El promotor cryaa conduce altos niveles de expresión en la lente
del pez cebra adulto y larvario; cuando se maneja una proteína fluorescente, cumple tres propósitos. En
primer lugar, permite la evaluación de la eficacia con la que se inyectó el transgén BAC en embriones
en función de la proporción de embriones con expresión de proteínas fluorescentes en mosaico en el
cristalino. En segundo lugar, es un marcador de transformación fácilmente identificable y, en tercer
lugar, es una herramienta para realizar un seguimiento de los peces transgénicos adultos. Tabla
1 y Figura 1Acontienen los nombres de estos plásmidos y la disposición y orientación de estas
secuencias de ADN.

Tabla 1Nombres de los plásmidos que contienen cassettes que se dirigen a la cadena principal de
BAC

Figura 1
Construcciones transgénicas y tasas de transgénesis mediada por tol2 para BAC. (A) Representación
esquemática de casetes de orientación de la cadena BAC que contienen brazos de homología para la
cadena principal BAC (naranja), un marcador de selección (verde) flanqueado por sitios Tol2 (púrpura),
seguido por el promotor cryaa (gris) que conduce una proteína fluorescente (arco iris ) en la lente del
ojo (ver Tabla 1 ). (B) Representación esquemática de los transgenes BAC. Tenga en cuenta que cxcr4b-
GFP-IRES-Kate2-CaaX no se muestra. (C) Tasas de transgénesis para los transgenes de BAC
representados en B. Se indican el tamaño de los transgenes y el número de peces cribados ( n ). (D) Tasa
de transgénesis de los embriones inyectados con sdf1a: sdf1a-Flag 3-HA 4 transgén, y preclasificado
para la expresión de la proteína fluorescente de mosaico en la lente en comparación con embriones
inyectados sin expresión de la proteína fluorescente de mosaico en la lente. La tasa global de
transgénesis para el transgén sdf1a: sdf1a-Flag 3 -HA 4 está indicada en C. (E) Tasa de mosaicismo
germinal en el pez fundador transgénico para los transgenes indicados en B. Los puntos representan la
tasa de mosaicismo germinal en individuos pez y la línea horizontal indica la mediana.

LOS CASETES DE ORIENTACIÓN MEDIAN LA TRANSGÉNESIS DE BAC EFICIENTE

Para probar estos casetes de orientación, modificamos un clon BAC basado en TARBAC y un
indigoBAC. El clon BAC basado en TARBAC tiene un tamaño de 96 kb y abarca la región genómica
de la quimioquina sdf1a , y el clon BAC basado en indigoBAC tiene un tamaño de 69 kb y abarca la
región genómica del receptor de quimiocina cxcr4b . Usando la recombinación ( Warming et al., 2005 ),
insertamos casetes de direccionamiento en la columna vertebral de estos dos BAC. El sdf1a BAC se
modificó aún más para etiquetar Sdf1a en su C-terminal con 3xFlag-4xHA o GFP. El cxcr4b BAC se
modificó aún más marcando Cxcr4b en su C-terminal con Kate2-IRES-GFP-CaaX, GFP-IRES-Kate2-
CaaX, o reemplazando la mayoría de los cxcr4bsecuencia de codificación con Lifeact-Citrine , un
marcador para F-Actina ( Riedl et al., 2008 ) ( Figura 1B ).
Para determinar la velocidad de transgénesis de estos constructos, microinyectamos una mezcla del
transgén de BAC apropiado y el ARNm que codifica la transposasa de Tol2 en la célula de elevación
del cigoto. Como control, microinyectamos el sdf1a: sdf1a-GFP BAC de 96 kb que carece del casete de
orientación. Los embriones inyectados se elevaron a la edad adulta. Luego seleccionamos peces adultos
que dieron lugar a crías con lentes que expresan el marcador fluorescente de transgénesis, o -en el caso
de las inyecciones control- que expresan el ARNm de GFP en las ubicaciones donde se expresan
los transcritos sdf1a . La expresión de proteínas fluorescentes en el cristalino se puntuó en embriones
vivos usando un alcance de disección fluorescente y expresión de GFPEl ARNm se puntuó en
embriones fijados mediante hibridación in situ. Usando este enfoque, generamos 73 líneas transgénicas
BAC. En total, generamos una línea transgénica sdf1a: sdf1a-GFP sin el casete de orientación Tol2 ,
20 líneas transgénicas sdf1a: sdf1a-GFP con el casete de orientación Tol2 , 16 líneas
transgénicas sdf1a: sdf1a-3xFlag-4xHA , 17 cxcr4b: Lifeact-Citrine líneas transgénicas y nueve líneas
transgénicas cxcr4b: cxcr4b-Kate2-IRES-GFP-CaaX ( Figura 1E , Tabla S1 , Tabla S2 , Tabla
S3 , Tabla S4 , Tabla S5y la Tabla S6 ). Mientras que la tasa de transgénesis para el control sdf1a BAC
que carecía del casete de orientación fue del 1,6% (60 fundadores potenciales seleccionados), la tasa de
transgénesis para el sdf1a BAC de 96 kb que porta el casete de orientación varió del 21% al 31% (75 y
61 posibles fundadores seleccionados para sdf1a: sdf1a-3xFlag-4xHA y sdf1a: sdf1a-GFP ,
respectivamente) ( Figura 1C ). La tasa de mosaicismo de línea germinal varió de 0.5% a 50% ( Figura
1E , Tabla S4 , Tabla S5 y Tabla S6 ). La tasa de transgénesis para 69 kb cxcr4bBAC fue comparable,
oscilando entre 25% y 75% (63 y 12 fundadores potenciales seleccionados para cxcr4b: Lifeact-
Citrine y cxcr4b: cxcr4b-Kate2-IRES-GFP-CaaX , respectivamente) ( Figura 1C ), y la tasa de
mosaicismo en el la línea germinal varió de 2% a 59% ( Figura 1E , Tabla S1 y Tabla S2 ). Estas tasas
de transgénesis son comparables con los informes previos para la transgénesis de BAC mediada por
Tol2 usando iTol2, para el cual se informaron tasas del 10-30% ( Suster et al., 2011 ; Bussmann y
Schulte-Merker, 2011 ). Aunque estas líneas transgénicas recapitulan fielmente el patrón de expresión
endógeno ( Figura 2), muchos de ellos generan niveles muy bajos de expresión
del promotor sdf1a y cxcr4b , y probablemente se habrían pasado por alto mediante la detección visual
de la expresión. De hecho, ninguna de las líneas transgénicas sdf1a: sdf1a-GFP expresa Sdf1a-GFP a
niveles detectables ( Figura 2A ). Esto indica que el uso de un marcador de transgénesis brillante y
fácilmente identificable, tal como el promotor de cryaa quedirige la expresión de la proteína
fluorescente, en la lente facilita enormemente el aislamiento de las líneas transgénicas de BAC.

Figura 2
Los transgenes BAC recapitulan fielmente los patrones de expresión endógenos. Imágenes generales de
embriones que expresan sdf1a: sdf1a-GFP . (A) Embrión teñido a las 30 horas después de la
fertilización (hpf), (B) cxcr4b: cxcr4b-Kate2-IRES-GFP-CaaX (embrión de 36 hpf vivo) y (C) cxcr4b:
Lifeact-Citrine (embrión de 36 hpf vivo) ) Las imágenes son proyecciones de máxima (A) o intensidad
de suma (B y C) de z-stacks. La barra de escala corresponde a 300 μm.

LA SELECCIÓN DE EMBRIONES INYECTADOS CON EXPRESIÓN DE MOSAICO EN EL

OJO AUMENTA LA TASA DE TRANSGÉNESIS DE BAC
Para transgenes pequeños basados en plásmidos, una forma de aumentar la tasa de transgénesis en el
pez cebra es elevar solo los embriones inyectados que expresan mosaicamente la proteína fluorescente
impulsada por el promotor del transgén inyectado ( Rembold et al., 2006 ). Para probar si esto es cierto
también para los transgenes BAC más grandes, comparamos las tasas de transgénesis BAC de peces que
tenían expresión de proteína fluorescente mosaico en la lente después de la inyección, a los peces que
no tenían expresión de proteína fluorescente mosaico después de la inyección. Para el sdf1a: sdf1a-
3xFlag-4xHATransgén BAC, la tasa de transgenesis de embriones inyectados con expresión de proteína
fluorescente mosaico en el cristalino fue 31%, comparado con 9% para embriones inyectados sin niveles
detectables de expresión de proteína fluorescente en el cristalino (42 y 33 fundadores potenciales
seleccionados para peces con y sin expresión en mosaico de proteína fluorescente en la lente,
respectivamente) ( Figura 1D ). Sin preclasificación, la tasa de transgénesis para el transgén sdf1a:
sdf1a-3xFlag-4xHA BAC promedia al 21% ( Figura 1C ). Por lo tanto, similar a los transgenes pequeños
( Rembold et al., 2006 ), la preselección de embriones para la expresión de proteínas fluorescentes en la
lente aumenta significativamente la tasa de transgénesis de BAC.
LAS LÍNEAS TRANSGÉNICAS BAC PROPORCIONAN UNA ESTIMACIÓN DE LOS
NIVELES DE EXPRESIÓN GÉNICA ENDÓGENA
Se ha sugerido que los transgenes BAC dirigen la expresión a niveles comparables independientemente
de su sitio de inserción en el genoma del pez cebra ( Bussmann y Schulte-Merker 2011 ). Para probar
esta idea, comparamos los niveles de expresión de cxcr4b: cxcr4b-GFP-IRES-Kate2-CaaX y cxcr4b:
transgenes Lifeact-Citrine en diferentes sitios de inserción en el genoma de los peces mediante la
cuantificación de la intensidad de fluorescencia en el primordio de la línea lateral posterior, un tejido
que expresa cxcr4b ( archivo S1 ) ( Chong et al., 2001 ). Encontramos que los niveles de expresión
varían de tres a cuatro veces. Sin embargo, la mayoría de las líneas transgénicas BAC dirigen la
expresión a niveles similares ( Figura 3, A y B), y el número de copias del transgén se correlaciona
linealmente con el nivel de expresión ( Figura 3B ). De acuerdo con las observaciones en ratón ( Heintz
2001 , Yang y Gong 2005 ), esto sugiere que las líneas transgénicas BAC que expresan a niveles
inferiores o superiores al nivel medio de expresión representan inserciones en sitios que promueven la
expresión baja o alta, respectivamente, mientras que el resto las líneas probablemente reflejan los niveles
de expresión del locus endógeno. Adicionalmente, los niveles de expresión de la proteína fluorescente
dirigida desde el promotor de cryaa en la lente generalmente son una buena indicación de los niveles de
expresión del promotor contenido dentro del fragmento de ADN genómico de la BAC, pero esta
correlación no siempre es cierta.

figura 3
Efectos del sitio de integración en los niveles de expresión del transgén BAC. Cuantificación de la
fluorescencia promedio de citrina (A) y Kate2 (B) dentro del primordio de la línea lateral posterior a 36
hpf para los transgenes cxcr4b: Lifeact-Citrine y cxcr4b: cxcr4b-GFP-IRES-Kate2-CaaX en diferentes
líneas transgénicas. Los niveles de expresión varían entre tres y cuatro veces entre las diferentes líneas
transgénicas para ambos transgenes BAC, probablemente reflejando los efectos del sitio de integración
en los niveles de expresión. Las medidas individuales de la intensidad de fluorescencia promedio dentro
del primordio de la línea lateral posterior se indican mediante puntos grises. Las líneas horizontales
indican la intensidad de fluorescencia promedio de las diferentes líneas transgénicas, y las barras de
error indican el intervalo de confianza del 95%.

Discusión
Generamos un conjunto de plásmidos con cassettes BAC que contienen secuencias Tol2 cis y un
marcador de transgénesis, utilizamos estos casetes dirigidos para modificar dos BAC diferentes y
generamos 73 líneas BAC de peces transgénicos mediante transgénesis mediada por Tol2 ( Kawakami et
al., 2000 ; Kawakami 2007 ). Encontramos que la transgénesis de BAC mediada por Tol2 con sitios
Tol2, y marcadores de selección independientes para la transgénesis, es un método eficaz para insertar
grandes fragmentos de ADN genómico en el genoma del pez cebra. Este enfoque produce tasas de
transgénesis de BAC de más del 20%, que es similar a las tasas informadas para el sistema iTol2
( Suster et al. , 2009a , 2009b ,2011 ; Bussmann y Schulte-Merker 2011 ). Estos grandes transgenes
recapitulan fielmente los patrones de expresión génica endógena, y permiten la estimación de los niveles
de expresión génica endógena. Además, la inclusión de un marcador de transgénesis que dirige la
expresión de diferentes proteínas fluorescentes en el cristalino del ojo de la larva y del adulto permite
una clasificación rápida de embriones transgénicos de 2 a 3 dpf en adelante y facilita el mantenimiento
de reservas transgénicas adultas.
Utilizando enfoques clásicos en el pez cebra, las líneas transgénicas se identifican principalmente en
función de la intensidad de fluorescencia de proteínas fluorescentes solos, o proteínas fluorescentes
fusionadas a una proteína de interés ( Thermes et al.,2002 ; Udvadia y Linney 2003 ; Kawakami et
al., 2004 ; Villefranc et al. al. 2007 ; Kwan et al., 2007 ; Mosimann et al., 2013) Tal enfoque
selecciona las líneas transgénicas que dirigen la expresión a niveles elevados, pero no permite fácilmente
la identificación de transgenes de promotores que dirigen la expresión a niveles demasiado bajos para
detectar mediante microscopios de disección fluorescentes convencionales. De acuerdo con esta
consideración, encontramos que la identificación de líneas transgénicas cxcr4bBAC basadas en la
expresión del marcador de transgénesis en la lente produce líneas transgénicas que expresan Cxcr4b-
GFP o Lifeact-Citrine en niveles que son difíciles de detectar con una disección fluorescente estándar
microscopio. Más llamativamente, ninguno de los sdf1alos transgenes del promotor identificados por la
expresión del indicador de lente dirigen la expresión de Sdf1a-GFP a niveles que son detectables usando
un microscopio de disección fluorescente o un microscopio confocal de barrido láser. Estos hallazgos
sugieren que la selección de líneas transgénicas basadas en la intensidad de los informadores
fluorescentes, o proteínas de fusión fluorescentes expresadas a partir del locus del gen de interés, puede
dar como resultado la falla en la identificación de líneas transgénicas para genes con promotores
débiles. Además, este enfoque podría sesgar hacia la selección de líneas transgénicas que sobreexpresan
proteínas de fusión fluorescentes, lo que probablemente confundiría la interpretación de los estudios
funcionales.
En resumen, este conjunto de cassettes de orientación permite la generación eficiente de líneas
transgénicas BAC sin un sesgo en el sitio de inserción, la recapitulación de patrones de expresión
endógenos y la estimación de niveles de expresión endógenos, y proporciona una herramienta para
realizar un seguimiento de peces transgénicos adultos.