EXTRACCIÓN Y AISLAMIENTO FORENSE DE ADN DE CABELLO, TEJIDO

Y HUESO

RESUMEN
El kit de extracción de tejido y pelo (para uso con ADN) proporciona un enfoque
simple y rápido para procesar muestras de tejido y cabello y conduce sin
problemas al protocolo del sistema de ADN para purificar y liberar de
inhibidores de la pcr en un formato manual o automático. Un protocolo y
reactivos personalizados también están disponibles para extraer rápidamente
ADN del hueso.

INTRODUCCIÓN

Recientemente se han desarrollado protocolos de noticias que utilizan el

sistema DNA IQ para la extracción y el aislamiento de ADN de muestras de
cabello, tejidos y huesos. El sistema DNA IQ, que utiliza nuevas partículas
paramagnéticas para purificar el ADN, tiene un fuerte agente desnaturalizante
que interrumpe muchos tipos de muestra en preparación para la purificación de
ADN. Este enfoque se ha aplicado a sangre líquida, a sangre sobre diversos
materiales y a otras muestras, como hisopos bucales y de saliva, y
espermatozoides y células epiteliales extraídas diferencialmente.
El tampón de lisis de ADN de ADN no lisa las células en el interior de las
masas de tejido, incluido el pelo y los huesos, por lo que se requiere un
tratamiento con proteínas K para garantizar la lisis completa. El kit de
extracción de tejido y pelo y los reactivos personalizados para la extracción de
ADN para el hueso se diseñaron para facilitar el preprocesamiento de estas
muestras difíciles antes de la purificación del ADN con el sistema DNA IQ.
Estos pasos de preprocesamiento no aumentan significativamente el tiempo
"práctico" del usuario y aún proporcionan las capacidades de extracción y
aislamiento del sistema DNA IQ para eliminar los inhibidores de la pcr y
administrar el ADN para su uso en ensayos posteriores. La figura 1 muestra el
enfoque modular de este sistema e ilustra cómo algunos pasos adicionales de
preprocesamiento para un conjunto diverso de tipos de muestras fluyen en el
protocolo estándar DNA IQ.

EXTRACCIÓN DE ADN DEL CABELLO

El pelo es un tipo de muestra común descubierto en escenas del crimen, pero

el pelo presenta un problema para los forenses porque, a medida que se
elimina el pelo, el ADN genómico sufre una degradación programada. Como
resultado, el procesamiento del ADN nuclear del cabello con frecuencia no
tiene éxito. La tasa de éxito puede aumentar ocasionalmente con los folículos
pilosos del pelo despojado si los pelos no se lavan, ya que las células
epiteliales se unen con frecuencia a los folículos y contienen ADN genómico no
degradado. Sin embargo, se puede observar la contaminación del ADN
genómico de las huellas dactilares en el tallo del cabello. El sistema de ADN IQ
elimina pequeños fragmentos de ADN, que actúan como inhibidores de la pcr,
por lo tanto, los resultados de la amplificación obtenidos usando este sistema
pueden mejorarse sobre ADN extraído mediante métodos orgánicos estándar.
 La figura 2 muestra los resultados de la amplificación usando el sistema
powerplex 16 y DNA genómico extraído por el kit de extracción de tejido y pelo
seguido de purificación con el sistema DNA IQ. La figura 2A muestra las alturas
de pico equilibradas en una amplificación de ADN aislado de un folículo piloso.
La figura 2B muestra la amplificación de ADN aislado de un segundo folículo
capilar del mismo individuo procesado al mismo tiempo. Este patrón muestra la
pérdida de los loci más grandes típicos de la degradación programada.

La purificación y el análisis de la secuencia de las regiones hipervariables del

ADN mitocondrial de los tallos capilares, que en general son ricos en ADN
mitocondrial, ofrecen un enfoque alternativo pero menos discriminador. El uso
de concentraciones muy altas de proteínas K y ditiotreitol (DTT), como se
describe en el boletín técnico # TB307 del kit de extracción de tejido y cabello,
digiere efectivamente los tallos del cabello en una hora y permite la fácil
purificación del ADN mitocondrial utilizando el sistema DNA IQ en el formato
manual o automatizado. La figura 2C muestra la amplificación de la región
hipervariable 2 de la mitocondria extraída de un tallo capilar utilizando el
protocolo del kit de extracción de tejido y pelo seguido de purificación con el
sistema de ADN IQ.

EXTRACCIÓN DE ADN DE MUESTRAS DE TEJIDO

Las muestras de tejido son bastante raras en el trabajo forense, pero se
encuentran, especialmente en casos de incendios provocados o en masa. En
algunos casos, una muestra de referencia disponible es una muestra embebida
en parafina y fijada en formalina. El kit de extracción de tejido y pelo se
desarrolló para procesar estas muestras difíciles de modo que el ADN se
pueda purificar fácilmente con el sistema de ADN IQ. Pequeñas cantidades de
tejido fresco, 1 mg o menos, dan los mejores resultados y no requieren picada
antes de la digestión con proteínas K. Muestras de hasta 25 mg han sido
examinadas y pueden requerir picada para ayudar a alterar el tejido y extraer el
ADN. Las muestras severamente comprometidas, tales como las expuestas a
temperaturas elevadas, presentan dificultades de acceso. Gran parte de la
ADN puede degradarse y la proteína puede alterarse hasta el punto de ser
resistente a la digestión con proteínas K. en estos casos, el mejor enfoque es
picar. La muestra para exponer la mayor cantidad de tejido posible y para usar
grandes cantidades de tejido. Además, el tiempo de digestión debe aumentar
ya que la proteína adicional competirá en grandes muestras por los sitios de
unión a ADN de la resina IQ de ADN y reducirá la recuperación de ADN.
Debido a que el sistema de ADN IQ aísla una cantidad consistente pero
limitada de ADN, las muestras que contienen cantidades muy grandes de ADN
microbiano serán menos adecuadas, ya que el ADN microbiano competirá con
la pequeña cantidad de ADN humano por unirse a la resina ADN IQ. El uso de
tres veces la cantidad normal de resina IQ de ADN puede reducir este efecto.
La figura 3A muestra el perfil de una muestra de tejido de 1 mg extraída con el
kit de extracción de tejido y pelo, seguido de purificación de ADN con el
sistema de ADN IQ y amplificación con el sistema powerplex 16.
Se han desarrollado protocolos para el aislamiento automatizado de ADN del
tejido para la estación de trabajo de automatización de laboratorio biomek 2000
de beckman coulter y se han utilizado con éxito en laboratorios forenses. La
muestra de tejido embebida en parafina y fijada con formalina plantea
problemas adicionales, ya que el ADN y la proteína con frecuencia se
entrecruzan. las secciones delgadas de este tipo de muestra pueden
procesarse fácilmente y no necesitan ser desparafinizadas cuando se percibe
una digestión excesiva de proteínas K. la adición de dos volúmenes de tampón
de lisis de DNA IQ disolverá la muestra de tejido. La amplificación del ADN
purificado del tejido embebido en parafina y fijado a formalina es
frecuentemente exitoso, pero el éxito depende en cierta medida del tiempo de
fijación. Doblar el tiempo de extensión para cada ciclo de amplificación puede
ayudar a aumentar el equilibrio interalelico si se observa inicialmente un
desequilibrio grave. La figura 3B muestra el perfil genético del ADN purificado a
partir de una sección de 10 μm de tejido embebido en parafina fijado a
formalina.

EXTRACCIÓN DE ADN DEL HUESO

Aunque no es un tipo de muestra común en la mayoría de los laboratorios, el
hueso se encuentra con la frecuencia suficiente como para justificar un
protocolo estándar. Los científicos de promega han colaborado con un
laboratorio externo para proporcionar un protocolo y reactivos personalizados
que permiten la purificación rápida del ADN del hueso utilizando la digestión
con proteínas en un tampón descalcificador, seguido de una pequeña
modificación del protocolo del sistema DNA IQ. El tampón de incubación /
solución de proteínas K proporcionado en el kit de extracción de tejido y pelo
no extraerá eficientemente ADN de muestras de hueso. El protocolo óseo se ha
probado en restos de fosas comunes bajo diversas condiciones del suelo, lo
que puede afectar profundamente la calidad del ADN. Al igual que con otros
tipos de muestras, la resina DNA IQ elimina fragmentos de ADN muy
pequeños, que son la causa de la inhibición de la pcr, lo que lleva a mejores
resultados de amplificación. La figura 4 muestra el perfil genético del ADN
aislado del hueso encontrado en un sitio de fosas comunes. Nuestros reactivos
óseos personalizados y el sistema DNA IQ se usaron para el aislamiento de
ADN, y la amplificación se realizó utilizando el sistema powerplex 16.
CONCLUSIÓN
el kit de extracción de tejido y pelo proporciona un procedimiento para disolver
masas de tejido en tubos individuales o en placas de 96 pocillos. Para procesar
muestras óseas, se requieren los reactivos de extracción ósea personalizados
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