Transformación bacteriana en E. coli.

Laboratorio de Biología Molecular

Profesor Jorge Hernández

Universidad industrial de Santander

Freddy Cristancho.

Introducción

La transformación es el proceso en el que las células procariontes toman DNA

exógeno del ambiente, alterando a su fenotipo y el de sus descendientes. En
general la entrada del DNA a las células es independiente de la fuente del DNA
(o de sus secuencias), pero es muy dependiente del estado físico-químico del
DNA (tamaño, hebra simple o doble, lineal o circular, relajado o
superenrollado). La eficiencia con la que la célula blanco incorpora el DNA
exógeno varía ampliamente entre especies procarióticas y dentro una especie,
de las cepas . Algunas especies pueden ser manipuladas en el laboratorio para
incrementar la eficiencia con la que toman el DNA. Las células pre-tratadas que
toman el DNA más eficientemente se dice que son “competentes”.

El efecto que tiene el DNA al entrar en una célula blanco y en los

descendientes depende completamente de la secuencia específica del DNA
exógeno. El DNA exógeno pasará a la descendencia sólo si este se integra en
el material genético de la célula blanco o si el mismo tiene un origen de
replicación (ori), que funcione en la célula blanco.

En el desarrollo de la practica se tranforman células de E. coli para demostrar

la habilidad de este DNA para modificar permanentemente la herencia genética
de las células que lo adquieren. Se transformará con un plásmido que contiene
su propio ori y un gen de resistencia a antibiótico.( Ampicilina). Las células
blanco que adquieran el plásmido se transformarán, de un fenotipo sensible al
antibiótico, a otro, resistente al antibiótico. Después de mezclase con el
plásmido, encontraremos a las células resistentes al antibiótico sembrando las
células tratadas sobre cajas de agar que contienen antibióticos. El antibiótico
matará cualquier célula que no adqurio el plásmido.

Procedimiento

Preparación de bacterias competentes con cloruro de calcio.

1. Elaboracion de celulas competentes ( que sean aptas para ser
transformadas) incubar la colonia en medio LB a 37 °C en un baño de agua
durante una hora sin agitación. Posteriormente incubarlo de 2 a 3 horas a 37 °C
con agitación a 250 rpm. La densidad óptica del cultivo no debe sobrepasar 0.8
en el momento de la cosecha. (OVER NIGTH).
2. hacer repique 5 ml/ 100 ml en medio LB.

3. medir la absorbancia a 600 nm, debe ser de 0,4.

4.Centrifugar a 2700 RPM 100 minutos a 4 grados centigrados.

5. se agrega 2 microlitros de CaCl2 0,1 M y esperar 20 minutos.

6.repetir la centrifugacion.

Control 100 microlitros, 10 micro gramos de DNA

Celulas no recombinantes 100 microlitros , , 10 micro gramos de DNA

Celulas recombinates 100 mirolitros cada , , 10 micro gramos de DNA

Transformación
Nota: Es necesario trabajar con mucho cuidado para mantener la esterilidad y
no contaminar las muestras.

1. Cada grupo tomará dos tubos con 200 l de células competentes para
la transformación. Los tubos deberán conservarse sobre hielo.
2. Adicionar 2 l de plásmido sólo a uno de los tubos. Los dos tubos se
incubarán 30-60 minutos sobre hielo. (El tubo al que se le agregó el DNA
es el experimento y al que no se le agregó nada es el control negativo).
3. Colocar ambos tubos en un baño de agua a 42ºC por 90-120 segundos.
Remover el tubo inmediatamente hacia el hielo e incubarlo otros 5
minutos (Al finalizar este paso el DNA presente debió entrar en algunas
células).
4. Adicionar 900 l de LB a cada tubo resupendiendo suavemente las
células. Incubar 30-60 min, esto permitirá a las células recobrarse del
trauma del tratamiento de competencia y empezar la expresión de los
genes funcionales recién introducidos.
5. Después de la incubación, resuspender las células de ambos tubos y
sembrar por separado 100 l de cada uno en cajas con LB, o el
antibiótico al que confiera resistencia el plásmido (generalmente
50g/ml), previamente etiquetadas, y esparcir uniformemente sobre el
agar con una varilla de vidrio doblada como bastón de hockey
esterilizada mediante flameo con alcohol.
6. Pipetear 1.98 ml de medio LB en cuatro tubos estériles y arreglelos en
dos hileras de tubos.
7. Agitar en vortex el tubo con el cultivo tratado con el plásmido e
inmediatamente pipetear 20 l en el primer tubo de la primera serie y
agite vigorosamente. Este tubo contendrá la dilución 1 a 100. Cambiar la
punta de la pipeta e inmediatamente pipetear 20 ml de esta dilución
 1:100 al segundo tubo y agitar vigorosamente. Se realizaron dos
diluciones seriales 1:100. ¿Cuál es la dilución final en el segundo tubo?
Ahora repita las diluciones con el tubo del control negativo.
8. Agitar la dilución final y pipetear 100 ml de células diluidas en cajas con
LB márquelas como “transformadas”. Untarlas en la superficie de la
placa con la varilla de vidrio esterilizada. Repetir el procedimiento para la
dilución final del tubo del control negativo y márcar.
9. Incubar las placas a 35-37 ºC toda la noche y revisar si hay crecimiento
al otro día. Contar el número de colonias en las cajas con LB-antibiótico.
10. Cuente el número de colonias en las dos cajas con LB. ¿Debería ser el
número de colonias en estas dos cajas similar? ¿Podría decir cuantas
células vivas había en los tubos de cultivo al iniciar el paso 5?

Análisis del procedimiento

¿Cuántos ml de medio LB se requieren para la práctica? ¿Cuántos ml
requieren agar y de esos cuántos ampicilina?

Resultados
Llene la siguiente tabla.

Control Transformadas

# Factor de Células # Factor de Células

dilución suspendida colonia dilución suspendida
colonia
s (cels/ml) s (cels/ml)
s s

LB [1/ 1/
(dilución (0.1)]*104 (0.1)]*104
10-4)

LB- 1-0.1 1-0.1

amplicilin
a

Calcular la proporción del control de células transformadas (#células no

transformadas / total de células = ________

Calcule la proporción de células transformadas (#células transformadas / total

de células = ________
Medios de cultivo
Caldo TY

Materiales:

Triptona 5g

Extracto de levadura 3g

Matraz erlenmeyer 1L

1M CaCl2 esterilizar en autoclave aparte.

Procedimiento: Adicione 5 g de Triptona y 3 g de extracto de levadura a 1 litro

de agua. Esterilizar en autoclave. En condiciones estériles adicionar 10 ml de
CaCl2 1M.

NOTA: Indicar en la etiqueta que se le adicionó calcio.

Si se requiere sólido, agregar 15 g/l de agar, esterilizar y adicionar el calcio

después, llenar las cajas con 30 ml de medio cada una aprox.

LB.

g/L

Triptona 10

Extracto de levadura 5

NaCl 5

Bibliografía.
1. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2,
3 (1989).
 2. Jerpseth, J., et al.,"XL1-Blue MRF' E. coli cells: McrA-, McrCB-, McrF-,
Mrr-, HsdR- derivative of XL1-Blue cells" Strategies 6, 81 (1992).
3. 2. Glover, D.M. DNA Cloning Volume I: A Practical Approach. IRL Press,
Oxford, 1985.

Materiales y métodos

Preparación de células competentes.

Se inocularon 12.5 g/mL de Tetraciclina con cepas de Escherichia coli XL1-

Blue, en recipientes de 5 mL de medio LB (Luria bertoni) líquido, con gen de
resistencia a la Tetraciclina.
Luego, se incubaron los tubos con LB y el cultivo a 37ºC, con agitación a
250ciclos/min, y durante 12 horas, y con el fin de concentrar las células y
prepararlas para la transformación, por ultimo durante 30 segundos, los tubos
se centrifugaron a 2700 gravedades el precultivo se transfirió a tubos de
microcentrífuga.

Durante 30 min se retomaron en 200 L de 0.1 M de CaCl2, a 0ºC de el pellet

de células, durante estos 30 minutos el CaCl2 realiza cambio de polaridad de la
célula, para que se pueda insertar el plásmido y no pueda repelar el ADN del
exterior y, en otras palabras pueda neutraliza las membranas.

Transformación de células.
Durante 2 minutos, se les agregó el plásmido a las células competentes,
realizando baño de maría a 42ºC, y posteriormente se preincubaron por 45 min.
Posteriormente durante 45 minutos se preincubaron a 37ºC 30 mL de medio
sólido LB servidos en cajas de petri para facilitar su posterior evaporación,
constituido por NaCl, 0.01 g de Ampicilina, extracto de Levadura, Agar,
Triptona,y 96 µ L de IPTG, inductor gratuito que realiza las funciones de la
lactosa, es decir, permite que el operón inicie su actividad y sintetice β
lactamasa, enzima responsable de la resistencia a la Ampicilina.
Después, por 90 segundos las células se calentaron a 42ºC para crear choques
térmicos, y se agregaron 700 µ L de medio LB. Durante este periodo se
incubaron las células a 37ºC durante 45 min. Por último las células
transformadas se sembraron en las cajas de petri pre-incubadas, y se
incubaron nuevamente durante toda la noche a 37ºC.
Resultados y discusión

NOTA: Referenciar las citaciones de la discusión en la bibliografía.

• Figura 1. Plásmido recombinante Las bacterias transformadas con plásmido

recombinante (con inserto de ADN de E.coli) crecieron formando colonia de
color traslucido (dado que son resistentes a ampicilina, tetraciclina y no tienen
actividad β-galactosidasa

Figura 2. Plásmido no recombinante. Las bacterias transformadas con plásmido no

recombinante (sin inserto de ADN de E.coli) crecieron formando colonias de color azul
(dado que son resistentes a los antibióticos utilizados (ampicilina y tetraciclina) y dado
que tienen actividad β-galactosidasa
Figura 3. Control negativo. (Sin plasmido)

Conclusiones

Al observar las cajas de siembra de plásmido recombinante ( Figura 1) y la del

no recombinante ( Figura 2), se puedo observar claramente la formación de
colonias de color azul en la del plásmido no recombinante, esto se explica por
el uso de X- Gal e IPTG. El X-gal es un B- galactósido degradado por la B-
galactosidasa. Uno de sus productos de degradación forma un precipitado de
color azul sobre las colonias bacterianas con función B-galactosidasa, de esta
manera se pueden diferenciar las colonias de E.coli con plásmido
recombinante, las cuales al contar con un inserto de ADN en la región del
plásmido que codifica para la B-galactosidasa, se ve perdida la función que
codifica la actividad enzimática de la B-galactosidasa, observándose colonias
traslucidas (características de E.coli), sin degradación del X-gal. El IPTG actúa
como inductor de la actividad B-galactosidasa en la placa del plásmido no
recombinante al interactuar con el represor y permitir que se transcriba LacZ.

Bibliografía

Jiménez Sánchez, A & Guerrero, A. 1982. Genética Molecular Bacteriana. Ed.

Reverté. Barcelona, España.

Jiménez Sánchez A & Jiménez Martínez. 1998. Genética microbiana. Ed.

Síntesis. Madrid, España.

Maloy, S. R. Cronan, J. E & Freifelder, D. 1994. Microbial genetics. 2ª edición.

Jones and Bartlett Publishers. Boston y Londres.
Parodi, A. Bedo, G. y Pérez R. 2005. Genética Evolutiva. Algunas herramientas
para el análisis de ADN. Instituto de Biología. Universidad de la República
Oriental de Uruguay. Uruguay.

Snyder, L & Champness, W. 1997. Molecular Genetics of Bacteria. American

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Stainer, A. 2000. Microbiología. 2ª edición. Ed. Reverté.

Suzuki, A. 1992. Genética. 4ª edición. Ed. Interamericana-McGraw Hill. Madrid,

España.

Sambrook J., & Russel D.W. (2001). Molecular cloning: A laboratory manual,
3rd Ed. Ch. 25. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.