RAPORT FINAL

la contractul de cercetare
Tip A

CARACTERIZAREA ŞI TESTAREA ULEIULUI

POLINESATURAT DIN SEMINŢE DE
CALENDULA OFFICINALIS L.

Cod 583

Sef lucr. Dr. Adela Pintea

Universitatea de Stiinţe Agricole şi Medicină Veterinară
Cluj-Napoca

2002-2004
 INTRODUCERE

Seminţele de Calendula officinalis L. au fost studiate în primul rând datorită prezenţei

în uleiul gras a unui acid gras cu structură neobişnuită - acidul calendic - 18:3 (8t 10t 12c)
care poate ajunge la până la 60 % din totalul acizilor graşi [McLean and Clark, 1956].
Conţinutul în ulei gras al seminţelor variază între 16,5 şi 26% în funcţie de soi şi de
provenienţa plantelor. Seminţele de Calendula officinalis L. conţin plastochinone, vitamina
K1, ubichinone, tocoferoli şi tocoferil-chinone în cantităţi de ordinul 20-80 mg / 1000 seminţe,
deci mult mai scăzute decât în flori [Janiszowska şi Rygier, 1985]. Carotenoidele sunt şi ele
prezente în seminţe, literatura menţinonând dintre acestea -carotina ca fiind pigmentul
majoritar şi -carotina [Isaac, 1992].
Numeroase cercetări au demonstrat faptul că acizii graşi polinesaturaţi sunt implicaţi în
numeroase procese fiziologice, determină o scădere a nivelului colesterolului sanguin şi deci a
riscului apariţiei bolilor cardiovasculare. Recent s-a demonstrat, în mai multe sisteme
experimentale, că acizii graşi conjugaţi au proprietăţi antitumorale [Shultz et al, 1992, Iigo et al,
1997, Belury et al, 1997, Vanden Heuvel et al, 1999]. Acidul calendic, componentul majoritar
(între 50 – 60 % din totalul acizilor graşi) al uleiului din seminţele de Calendula, este un acid
gras polinesaturat lipsit de toxicitate, cu proprietăţi antiinflamatoare in vivo [Della Loggia et al.,
1991] şi care acţionează ca inhibitor al biosintezei prostaglandinelor (experiment In vitro)
[Nugteren et al, 1987]. Am considerat că aceste proprietăţi constituie argumente pentru evaluarea
efectului administrării acestui ulei asupra unor parametri sanguini şi hepatici. Un argument în
plus pentru aceasta îl constituie prezenţa antioxidanţilor naturali (carotenoide, tocoferoli).
Conţinutul în ulei al seminţelor este ridicat iar obţinerea lui pe scară largă nu prezintă probleme
tehnice speciale nici din punctul de vedere al culturii plantei şi nici al extracţiei uleiului.
Obiectivele propuse au fost:
 Caracterizarea compoziţiei chimice a uleiului din seminţe de Calendula officinalis L.
prin metode analitice performante (HPLC, GC-MS)
 Testarea in vivo a efectului administrării uleiului din seminţe de Calendula officinalis
L. la şobolani sănătoşi, prin urmărirea unor parametri sanguini şi hepatici
 Testarea in vivo a efectului administrării uleiului din seminţe de Calendula officinalis
L. la şobolani intoxicaţi cu tetraclorură de carbon

MATERIAL ŞI METODE
1) Analiza uleiului din seminţe de Calendula officinalis L.

Materialul biologic
Pentru analiza lipidelor din Calendula officinalis L. au fost utilizate soiurile “Radio”, “Esterel Double Jaune”,
“Esterel Double Orange” şi “Mammouth”. Plantele au fost cultivate în câmpul experimental de la Universitatea
de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Cluj-Napoca. Fiecare experiment a fost efectuat de trei ori, pe probe
independente.
Extracţia lipidelor totale
Pentru extracţia lipidelor totale a fost utilizată metoda clasică [Folch et al., 1957]. Proba cântărită (1 g) a fost
triturată manual sau cu un omogenizator electric şi tratată cu 10 ml metanol şi BHT. După o omogenizare de 1 –
2 minute, s-au adăugat 20 ml cloroform şi s-a omogenizat din nou timp de 2 minute. Amestecul a fost filtrat iar
reziduul tratat din nou cu un amestec de cloroform : metanol în raport de 2 : 1 (v/v). La extractul total obţinut se
adaugă un volum de soluţie KCl 0, 88 % în aşa fel încât raportul cloroform : metanol : clorură de potasiu să fie
8:4:3 (v/v). După separarea fazelor, prin centrifugare, se recuperează hipofaza cloroformică care conţine lipidele
totale. Extractul cloroformic este trecut peste sulfat de sodiu anhidru pentru a se îndepărta urmele de apă, este
evaporat la sec şi reluat într-un volum cunoscut de cloroform (1 ml). Extractul de lipide totale se păstrează în
flacoane din sticlă, de preferinţă cu dop rodat, la întuneric şi la temperaturi de - 20˚C până în momentul utilizării
pentru analize ulterioare.
 Pentru obţinerea uleiului din seminte s-au mai testat si alte metode: extracţia prin metoda Soxhlet,
extracţia cu eter de petrol.
Analiza lipidelor polare. Uleiul s-a obţinut prin extracţie cu cloroform:metanol (2:1) după metoda
clasică Folch. Fazele cloroformice au fost uscate pe Na 2SO4 anh., evaporate la sec, iar reziduul obţinut a fost
reluat într-un volum măsurat de cloroform. Extractul lipidic a fost apoi separat prin cromatografie pe strat subţire
de silicagel, folosind plăci Merck Silica Gel 60 de 10x20 cm. Faza mobilă, modificată minor după Heape [Heape
et al., 1985], a constat din: acetat de metil:2-propanol:cloroform:metanol:KCl 0,25% (25:25:28:10:7). Camera de
developare a fost saturată timp de 30 minute iar migrarea s-a făcut la rece. După migrare, plăcile au fost uscate şi
apoi scufundate timp foarte scurt în amestecul de revelare (CH3COO)2Cu/H3PO4 şi apoi încălzite timp de 30
minute la 130°C.
Pentru determinările semi-cantitative de fosfo- şi glicolipide s-a folosit un densitometru Desaga CD60 cu mod de
lucru prin reflexie la 366 nm.
Acizii graşi. O parte a extractului lipidic total a fost transesterificată cu metanol saturat cu acid
clorhicric, timp de 2 ore, la 80°C în tuburi închise. Esterii metilici au fost extraşi în eter de petrol:benzen (8:1),
purificaţi şi separaţi prin gaz-cromatografie în următoarele condiţii: gaz-cromatograf HP 5890 II/5972 GC-MSD,
70eV, bibliotecă de spectre Wiley. Coloană capilară HP5MS cu lungimea de 30 m, diametrul interior de 0.25
mm, grosimea filmului – 0.32 μm. Temperatura iniţială – 150ºC, 6ºC/min până la 250ºC (5 min). Gaz purtător
Heliu 1ml/min.
Separarea prin HPLC a pigmenţilor carotenoidici s-a efectuat cu un sistem ce include un sistem de
pompe Kontron 322, o coloană cromatografică în fază inversată (reversed phase) Zorbax ODS – 5 (C18), cu
lungimea de 250 mm şi diametrul de 4,6 mm. Detecţia s-a făcut cu un detector cu fotodiodă (photodiode array
detector) Waters 990. S-a utilizat sistemul:
Solventul A: Acetonitril:Apă (9:1, v/v) + 0,5 % EPA (etilizopropilamină)
Solventul B: Acetat de etil + 0,5 % EPA
Programul utilizat a fost: La minutul 0 : 20 % B în A, min 3 : 50 % B în A, min 18: 75 % B în A, min
30: 75 % B în A, min 32: 20 % B în A
Debitul fazei mobile a fost de 1 ml/minut.
Dozarea sterolilor totali s-a efectuat prin metoda spectrofotometrică, bazată pe reacţia de culoare
Liebermann-Burchard.

2. TESTAREA IN VIVO
Loturile experimentale
Experimentele s-au efectuat pe şobolani masculi Wistar, distribuiţi în loturi omogene, cu greutăţi
cuprinse între 90 şi 120g. Animalele au fost tratate timp de 7 zile prin gavaj intragastric şi au fost sacrificate în
ziua a opta prin decapitare. Loturile experimentale au fost următoarele:
Lotul I - Martor absolut - M, a primit pe parcursul celor 7 zile dieta obişnuită.
Lotul II - Martor tratat cu ulei rafinat de floarea soarelui - UFS, 0,2 ml / 100 g corp zilnic.
Lotul III - tratat cu ulei din seminţe de Calendula - UC 0.2, în doză de 0,2 ml /100 g corp zilnic.
Lotul IV - tratat cu ulei din seminţe de Calendula - UC 0.4, în doză de 0,4 ml /100 g corp zilnic.
Lotul V - tratat cu tetraclorură de carbon - T, 0,1 ml/100 g corp,
Lotul VI - T+UFS, tratat cu CCl4 ca mai sus şi cu 0,2 ml / 100 g ulei de floarea soarelui, zilnic.
Lotul VII - T+UC 0.2, tratat cu CCl4 ca mai sus şi cu 0,2 ml/100 g ulei din seminţe de Calendula,
zilnic.
Lotul VIII - T+UC 0.4, tratat cu CCl4 ca mai sus şi cu 0,4 ml / 100 g ulei din seminţe de Calendula,
zilnic.
Prelevarea şi prelucrarea probelor
Sângele a fost recoltat prin decapitare, fără anticoagulant. Probele au fost păstrate la temperatura
camerei timp de trei ore, apoi la rece timp de două ore pentru exprimarea serului. Serul a fost separat prin
centrifugare şi păstrat la -20°C până în momentul analizei.
Ţesutul hepatic (aproximativ 5g) a fost omogenizat cu 1 ml ser fiziologic într-un omogenizator Potter-
Elvehjem. Omogenatului obţinut i s-a adăugat un volum măsurat de soluţie PBS (tampon fosfat salin - reţetă
modificată după Dulbecco), şi a fost apoi centrifugat la 2000 rpm. Sedimentul depus (P 1) conţine membranele
celulare, nuclei şi resturi celulare. Supernatantul a fost separat, diluat cu PBS şi centrifugat din nou la 9000g.
Sedimentul (P2) conţine în principal mitocondrii, iar supernatantul (S) conţine microzomi şi citosol.
Parametri biochimici
Parametrii sanguini determinaţi au fost:, transaminaze (GOT, GPT), fosfataza alcalină, folosindu-se
aparatul automat de analiză Hospitex.
Parametri hepatici
Proteina. Determinarea conţinutului în proteine s-a efectuat după metoda Bradford [Bradford, 1976]
pentru toate cele trei fracţii P1, P2, S9.
 Determinarea nivelului peroxidării lipidelor s-a efectuat pe supernatantul (S9) conţinând microzomi,
după metoda descrisă de Palozza et al. [Palozza et al., 1995].
Superoxid dismutaza (SOD). Determinarea activităţii SOD s-a făcut după metoda cu nitrobluetetrazoliu
(NBT) şi pirogalol, propusă de Minami şi Yoshikawa [Kai-Wei, 1989].
ATP-azele Na+/K+ şi Ca2+ dependente s-au determinat după metoda Petzelt [Petzhelt et al., 1984] din P 2
, respectiv P1 şi P2.
Experimentul a fost repetat de două ori în aceleaşi condiţii, cu minimum cinci animale pe lot, iar rezultatele
determinărilor sunt prezentate ca valori medii plus-minus abaterea standard.

REZULTATE ŞI DISCUŢII

1. Compoziţia chimică a uleiului din seminţe de Calendula officinalis

Toate varietăţile de seminţe analizate au avut un conţinut de ulei cuprins între 19,5 –
20,6 %. Din punct de vedere cantitativ deci, diferenţele între cele patru varietăţi sunt
nesemnificative. Compoziţia în acizi graşi a fost diferită, atât de la o varietate la alta cât şi
pentru aceeaşi varietate, în funcţie de momentul recoltării. Cromatograma GC a esterilor
metilici ai acizilor graşi din seminţe este prezentată în Fig. 1.

Fig. 1. Gaz-cromatograma
esterilor metilici ai acizilor
graşi graşi totali din
seminţe de Calendula
(sistemul A – 1 - 16:0, 2 -
16:1, 3 – 18:2, 4 – 18:3, 5
– 18:0, 4c – 18:3 conjugaţi,
6 – 20:0, 7 – 20:09

Deşi literatura şi experienţele anterioare indicau faptul că seminţele de Calendula

conţin între 50 % - 60 % acid calendic, în varietăţile franceze el a fost pus în evidenţă în
proporţii mult mai mici (4,2 – 14,2 %). Prin analizarea unui număr mare de probe, recoltate la
diferite momente, s-a observat că acidul calendic se acumulează odată cu maturizarea
seminţelor. Valorile obţinute pentru compoziţia în acid calendic indică foarte clar faptul că
acesta este prezent în cantităţi mici în seminţele verzi – 8.62 %, creşte la 26.6 % în cele
imature şi ajunge la 53 % în cele mature. Un alt lucru interesant este acela că odată cu
creşterea cantităţii de acid calendic se observă o scădere drastică a conţinutului de acid
linoleic (în special) şi de acid olei în timp ce antitatea de acid stearic a suferit variaţii mici.
Rezultatele obţinute sunt în convergenţă cu rezultatele obţinute prin studii de încorporare a
unor izotopi radioactivi [Crombie şi Holloway, 1985] şi cu rezultate mai recente care indică
faptul ca acidul calendic este produs de un nou tip de (1,4)-acil lipid desaturază, (8, 11)-
linoleoil desaturaza [Fritsche et al, 1999]. Pentru trei dintre varietăţile analizate anterior s-a
determinat distribuţia acizilor graşi în categoriile majore de lipide din seminţe. Categoriile de
lipide separate au fost: trigliceride (triacilgliceroli, TG), digliceride (diacilgliceroli, DG),
monogliceride (monoacilgliceroli, MG), lipide polare (fosfo- şi galactolipide, PL) şi acizi
graşi liberi (AGL). S-a observat că acizii ocatadecatrienoici conjugaţi se concentrează practic
în triacilgliceroli şi eventual sunt prezenţi în diacilgliceroli. În lipidele polare ei au fost
prezenţi doar în urme, peak-urile situându-se sub limita de integrare a integratorului. Lipidele
polare conţin însă în toate cazurile cantităţi mai însemnate de acid palmitic şi palmitoleic şi
cantităţi mai mici de acid linoleic. Ponderea cantitativă a lipidelor polare este mult inferioară
celei a lipidelor neutre în seminţe, acestea conţinând prin excelenţă triacilgliceroli (date
detaliate în raportul 2002).
Prin separarea lipidelor polare prin cromatografie pe strat subţire, urmată de
densitometrie, s-a stabilit compoziţia în lipide polare a uleiului de Calendula – Tabelul 1.
Principalele lipide polare identificate sunt: monogalactozil-diacilglicerol (MGDG),
fosfatidilcolina (PC), digalactozil-diacilglicerol (DGDG), fosfatidil-etanolamina (PE). Se
poate remarca un conţinut ridicat de acid fosfatidic (PA) rezultat probabil prin degradarea
enzimatică a fosfolipidelor majore.
Conţinutul în carotenoide totale al uleiului din seminţe este de 54,4 g/g seminţe. Cea
mai mare parte a carotenoidelor sunt xantofile, dintre care majoritară este luteina (parţial
izomerizată cis). Dintre hidrocarburi, în cantităţi mai mari se găseşte -carotină. Pe baza
timpilor de retenţie şi a spectrelor de absorbţie au mai fost identificate violaxantina şi
neoxantina. Au mai fost evidenţiaţi, fără a fi identificaţi, şi alţi compuşi, probabil carotenali
(timpi de retenţie mici). In Tabelul 2 este prezentată compoziţia seminţelor (deci şi a uleiului)
în carotenoide, tocoferoli şi steroli.

Tabelul. 1. Compoziţia în lipide polare a uleiului din seminţe de Calendula

Lipida LPC PC PA PG PE DGDG SG MGDG

% arie 1.23 25.27 16.31 7.34 12.72 2.79 1.76 32.38

Tabelul 2. Compoziţia seminţelor de Calendula

Component Carotenoide Tocoferoli Steroli

cantitate 54.4 µg/g 1.2 mg/g 1.36 mg/g

2. Testarea in vivo a uleiului din seminţe de Calendula officinalis

Uleiul de Calendula officinalis L. are o compoziţie chimică deosebită, remarcabilă fiind

cantitatea mare de acizi graşi nesaturaţi, compuşi cu implicaţii deosebite asupra sănătăţii
omului şi animalelor, şi de pigmenţi carotenoidici cu rol de antioxidanţi.
Carotenoidele, pe lângă rolul lor de provitamine A, acţionează ca atare prin funcţia lor
antioxidantă. Carotenoidele fac parte, alături de tocoferoli, acid ascorbic, acid uric, din sistemul
antioxidant neenzimatic al organismului [Chaudiere şi Ferrari-Iliou, 1999]. Administrarea pe
termen lung a -carotinei s-a dovedit a avea un efect benefic în cazul hepatocarcinogenezei
indusă experimental, în sensul reducerii leziunilor preneoplazice [Schwartz, 1996; Martin et al.,
1996].
Acestea sunt câteva dintre argumentele care vin în sprijinul testării in vivo a uleiului din
seminţele de Calendula. Am considerat necesară urmărirea variaţiei unor parametri biochimici
din ser şi din ficat, pentru animale sănătoase şi pentru animale intoxicate cu tetraclorură de
carbon.
Tetraclorura de carbon, care generează prin scindare homolitică radicalul neutru electric
triclorometil ּCCl3, acţionează hepatotoxic printr-un mecanism de peroxidare la nivelul lipidelor
de membrană [Comporti, 1985]. Se cunosc modificările ce apar în urma intoxicării: creşterea
nivelului peroxidării lipidelor, creşterea nivelului trigliceridelor în detrimentul fosfolipidelor,
scăderea conţinutului în acizi graşi nesaturaţi în detrimentul acizilor graşi saturaţi, creşterea
nivelului transaminazelor serice, a fosfatazei alcaline, scăderea nivelului glutationului redus, a
citocromului P450 şi a enzimelor corespunzătoare.
În continuare vor fi prezentate rezultatele determinărilor biochimice efectuate pe şobolani
trataţi cu ulei de Calendula, respectiv pe şobolani intoxicaţi cu tetraclorură de carbon şi trataţi cu
ulei de Calendula.
Dintre enzimele serice care au relevanţă pentru evaluarea activităţii hepatice au fost
determinate transaminazele (glutamat-oxalilacetat transaminază GOT şi glutamat-piruvat
transaminază GPT) şi fosfataza alcalină (FA).
Variaţia activităţii transaminazelor serice şi a fosfatazei alcaline, ca procente faţă de
martorul absolut M, este prezentată în Figura 2. La loturile cu animale sănătoase, administrarea
uleiului de Calendula în doza de 0.2 ml a determinat o foarte uşoară scădere a activităţii
transaminazelor, în timp ce doza dublă a determinat o uşoară creştere a activităţii
transaminazelor. Loturile UFS, UC 0.2 şi UC 0.4 au determinat creşterea valorilor fosfatazei
alcaline faţă de lotul martor. Totuşi, creşterea activităţii fosfatazei este mai redusă la lotul UC 0.2
decât la lotul UFS. Lotul intoxicat cu tetraclorură de carbon prezintă creşteri semnificative la toţi
parametrii (25 % GOT, 50.5 % GPT, 77 % FA). Pe lângă această creştere a activităţii, este de
remarcat inversarea raportului GOT/GPT (raport De Ritis), care în mod normal trebuie să fie
supraunitar ( aprox. 1.3). La lotul tratat cu ulei de Calendula 0.2 se observă o scădere destul de
importantă a GOT şi FA şi mai mică pentru GPT. La lotul cu 0.4 ulei, scăderea valorilor GOT şi
FA este mai puţin semnificativă, iar valoarea GPT rămâne aproape constantă. Se poate observa
că efectul este dependent de doză şi că doza mai mică de ulei pare a fi mai potrivită pentru a
asigura o protecţie a celulei hepatice.
Datorită faptului că efectul tetraclorurii de carbon se manifestă prin intensificarea
peroxidării lipidelor, un parametru important în evaluarea acestui efect este stabilirea nivelului
peroxidării. Există numeroase metode de evaluare a nivelului peroxidării,cea mai folosită fiind
metoda cu acid tiobarbituric (TBA). In cazul intoxicaţiilor cu tetraclorură de carbon, are loc o
creştere importantă a concentraţiei TBARS, în special în fracţia microzomală. La nivelul fracţiei
mitocondriale şi a celei solubile, creşterea concentraţiei TBARS nu este atât de semnificativă
[Ohkawa, 1979].
Determinările efectuate în cele opt variante experimentale au pus în evidenţă variaţiile
nivelului peroxidării lipidelor, datele obţinute fiind prezentate în Figura 3. Rezultatele sunt
exprimate în variaţia procentuală faţă de martorul absolut. Nivelul cel mai ridicat al peroxidării
se atinge, aşa cum era de aşteptat, la lotul intoxicat cu tetraclorură, reprezentând o creştere de 43
% faţă de martorul absolut. La loturile fără tetraclorură, nivelul peroxidării este mai ridicat decăt
la lotul martor cu 10 până la 12.3 %. Interesant este faptul că, la loturile intoxicate şi tratate,
nivelul peroxidării scade faţă de lotul T cu 28 % pentru lotul T+UC 0.2, respectiv cu 45 % pentru
lotul T+ UC 0.4, astfel încât la ultimul lot nivelul peroxidării este aproape identic cu al
martorului absolut. Se poate deci afirma că uleiul de Calendula, atunci cînd este asociat cu un
compus ce promovează peroxidarea, determină o protecţie a ţesutului hepatic. Menţionăm că
determinările s-au efectuat pe supernatantul S ce conţine fracţia microzomală, citosol, etc. Din
acest motiv, nivelul peroxidării nu este atât de ridicat ca în fracţia microzomală purificată. In
măsura in care vom reuşi o purificare a supernatantului, obţinând o suspensie de microzomi, vom
relua aceste determinări. Măsurătorile efectuate pe peletul 2 (fracţia mitocondrială) au pus în
evidenţă aceleaşi efecte, însă variaţiile faţă de martor au fost mult mai mici.
 GOT
GPT
AP

80

Variation versus control (%)

60

40

20

M UFS UC 0.2 UC 0.4 T T+UFS T+UC 0.2 T+UC 0.4

-20

Experimental lots

Fig. 2. Valorile activităţilor GOT, GPT şi FA (variaţie faţă de martor - %)

În paralel s-a determinat şi activitatea superoxid-dismutazei. Această enzimă este

implicată în protecţia antioxidantă a organismului prin faptul că transformă anionul superoxid în
apă oxigenată. Activitatea SOD se exprimă în procente de inhibare a reducerii NBT. Activitatea
SOD este mare la lotul martor -72,5 %, şi destul de apropiată ca valoare şi la loturile UFS, UC
0.2 şi UC 0.4. Lotul intoxicat cu CCl 4 are o activitate SOD scăzută, ceea ce indică un procent
redus de anihilare a anionului superoxid. In general, scăderea activităţii SOD este legată de starea
de stres oxidativ. Administrarea uleiurilor determină o oarecare creştere a activităţii SOD, în
special la doza de 0.4 ml ulei de Calendula. Pentru evaluarea capacităţii antioxidante a uleiului
de Calendula, este necesară determinarea activităţii şi a altor enzime antioxidante - catalaza,
glutationperoxidaza.

50
Variation versus control (%)

40

30

20

10

M UFS UC 0.2 UC 0.4 T T+UFS T+UC 0.2 T+UC 0.4

-10
Experimental lots

Fig. 3. Nivelul peroxidării lipidelor determinat prin testul TBA.

Din fracţiile conţinând membrane celulare (P1) şi respectiv mitocondrii (P2), a fost
determinată şi activitatea ATP-azelor Na/K dependente, respectiv Ca dependente. ATP-azele,
denumite şi pompe de Na/K+, respectiv Ca2+, sunt implicate în menţinerea concentraţiilor
constante ale acestor ioni în spaţiul intracelular şi extracelular. Astfel, valorile activităţilor ATP-
azelor sunt markeri ai transportului activ prin membrane. Exprimarea rezultatelor s-a făcut în
moli fosfor anorganic eliberat / mg proteină / oră. Faţă de lotul martor, activitatea ATP-azelor
variază destul de puţin pentru lotul tratat cu UC 0.2, iar la lotul UC 0.4 se constată o creştere
uşoară a ATP-azei Ca dependente mitocondriale. Lotul intoxicat cu tetraclorură de carbon
prezintă creşteri ale activităţii ATP-azelor Na/K şi Ca mitocondriale. Lotul T+UC 0.2 are valori
mai scăzute la toţi parametrii determinaţi, comparativ cu lotul T, activităţile ATP-azelor fiind
apropiate de valorile lotului martor. In schimb, lotul T + UC 0.4 prezintă valori ridicate pentru
enzimele mitocondriale.
Din serul sanguin s-au mai determinat: lipidele totale (Fig. 4), trigliceridele şi colesterolul
total (Fig. 5).

600

500

400
mg/100ml

300

200

100

0
M UFS UC 0.2 UC 0.4 T T+UFS T+UC 0.2 T+UC 0.4

Experimental lots

Fig.4. Valorile lipidemiei la loturile experimentale

Din analiza datelor se poate observa faptul că faţă de martorul (M) netratat, a cărui
lipidemie este de 507 mg/100 ml, lotul tratat cu tetraclorură de carbon (T) prezintă o creştere
semnificativă - la 620 mg/100 ml ser. Uleiul de Calendula, în doză de 0,2 ml/100 g corp (UC
O.2), determină o creştere cu 36 mg faţă de martor, dar o valoare mult mai scăzută decît a lotului
intoxicat. Lotul tratat cu ulei de Calendula în doză de 0,4 ml/100 g corp (UC 0.4) are un nivel al
lipidemiei mai scăzut decât cel al lotului cu 0,2 ml, dar uşor mai ridicat decît al martorului
absolut şi al lotului tratat cu ulei de floarea soarelui (UFS). La loturile intoxicate cu tetraclorură
de carbon şi tratate se observă o scădere a nivelului lipidemiei faţă de lotul T, valoarea cea mai
scăzută având-o lotul UC 0.2 - 521 mg/100 ml ser. Această valoare, ca şi cea a lotului UC 0.4, se
apropie mult de valorile martorilor M şi UFS.
Aşa cum se poate observa în Figura 5, colesterolemia este maximă pentru lotul tratat cu
tetraclorură - 105 mg/ml. Administrarea a 0.2 ulei de Calendula nu a atras o creştere
semnificativă a colesterolemiei, spre deosebire de lotul UFS şi UC 0.4, unde valorile depăşesc cu
15, respectiv 20 mg colesterolemia lotului M. La loturile intoxicate şi tratate, nivelul
colesterolului seric se află sub cel al lotului T, valoarea cea mai redusă având-o lotul T+UC O.2.
Concentraţia trigliceridelor serice este maximă la lotul T+UFS, 72 mg/100 ml ser faţă de 51,5
mg/100 ml ser la martor. Valorile trigliceridelor la loturile UC 0.2 şi UC 0.4 prezintă variaţii
relativ mici în sens pozitiv, respectiv negativ faţă de martor. Loturile intoxicate şi tratate cu ulei
de Calendula au concentraţia trigliceridelor serice sub cea a lotului intoxicat sau a lotului
T+UFS. La o doză de 0.2 ml, uleiul de Calendula determină o creştere mică a colesterolemiei şi
trigliceridelor, comparativ cu uleiul de floarea soarelui la animalele sănătoase, şi o scădere
semnificativă la animalele intoxicate. La o doză de 0.4 ml, uleiul de Calendula determină
scăderea semnificativă a trigliceridelor, dar o creştere a colesterolemiei. La animalele intoxicate,
această doză determină o scădere semnificativă a ambilor parametri faţă de loturile T şi T+UFS.
 Cholesterol
Triglycerides

100

80
(mg/100ml

60

40

20

0
M UFS UC 0.2 UC 0.4 T T+UFS T+UC 0.2 T+UC 0.4

Experimental lots

Fig. 5. Valorile colesterolului total şi trigliceridelor serice

Determinarea compoziţiei în acizi graşi a ţesutului hepatic s-a făcut pentru şase dintre
variantele experimentale. Deşi nu a fost analizată doar fracţia microzomală, s-au putut observa
variaţii în compoziţia acizilor graşi. Rezultatele determinărilor sunt prezentate în Figura 6. Se
observă că la nivelul ţesutului hepatic predomină din punct de vedere cantitativ acidul palmitic
(14:0) şi acidul stearic (18:0), iar dintre acizii graşi nesaturaţi, acidul linolenic (18:3), linoleic
(18:2) şi arahidonic (20:4). Această ierarhie se păstrează pentru toate variantele experimentale,
dar apar modificări în ceea ce priveşte raportul între totalul acizilor graşi saturaţi şi cei nesaturaţi.
Lotul martor M conţine cea mai mare proporţie de acizi graşi nesaturaţi, 36.01 % din total, în
apropiere situându-se şi lotul tratat cu ulei de Calendula - 35,18 %. Loturile intoxicate cu
tetraclorură şi tratate prezintă procentaje semnificativ scăzute de acizi graşi nesaturaţi, în special
lotul cu tetraclorură şi ulei de floarea soarelui. Aceasta se explică prin procesele degradative ce
au loc la nivelul catenelor acizilor graşi nesaturaţi sub acţiunea tetraclorurii de carbon.
Semnificativ este însă faptul că la loturile intoxicate şi tratate cu Calendula, cantitatea de acizi
graşi nesaturaţi este mai mare decît la lotul T+UFS. Aceasta poate însemna că uleiul de
Calendula oferă protecţie celulelor hepatice împotriva acţiunii toxice a tetraclorurii de carbon.
Ca o consecinţă a peroxidării lipidelor, sub acţiunea tetraclorurii de carbon, în ţesutul
hepatic are loc o modificare a raportului dintre compoziţia în trigliceride şi fosfolipide. Deoarece
acizii graşi nesaturaţi intră preferenţial în componenţa fosfolipidelor, acestea sunt mai afectate de
acţiunea degradativă a tetraclorurii de carbon, fapt ce se manifestă prin creşterea cantităţii de
trigliceride raportat la cantitatea de fosfolipide. Descreşterea cantităţii de fosfolipide este vizibilă
la nivelul fracţiunii microzomale, unde este însoţită de creşterea semnificativă a conţinutului în
trigliceride [Ohkawa et al., 1979] însă nu există însă referiri la modul în care sunt afectate
diferitele clase de lipide polare constituente ale membranelor.
 16:0
18:0
18:2
18:3 (+18:1)
20:4

40

% of total lipids 30

20

10

0
M UFS UC 0.2 T + UFS T + UC 0.2 T + UC 0.4

Experimental lots

Fig. 6. Compoziţia în acizi graşi totali (% relative) a ţesutului hepatic

În experimentul nostru au fost separate şi identificate fosfolipidele din omogenatul total,

fracţia ce conţine membranele celulare şi fracţia mitocondrială. In urma separării cromatografice
au fost identificate următoarele fosfolipide: fosfatidil-colina (PC), fosfatidil-etanolamina (PE),
fosfatidil-serina (PS), sfingomielina S), acidul fosfatidic (PA), fosfatidil-inozitolul (PI) şi
lizofosfatidil colina (LPC). O parte dintre fosfolipide au fost identificate prin cocromatografie cu
standarde, iar cele pentru care nu au existat standarde, prin reacţii de culoare specifice. Separarea
fosfolipidelor din ţesutul hepatic ridică probleme datorită diferenţelor mari de concentraţie între
diferitele componente. Din această cauză, o analiză cantitativă prin densitometrie este foarte
dificilă, practic fiind imposibil de găsit o astfel de concentraţie a extractului încât toate
componentele să se găsească în domeniul de liniaritate a curbelor de calibrare. Din acest motiv,
în cadrul analizei densitometrice a fosfolipidelor ne-am limitat la aprecierea compoziţiei
procentuale în fosfolipide pe baza rapoartelor suprafeţelor integrate (Fig. 7).

Fig. 7. Densitograma separării lipidelor polare din ţesut hepatic (λ = 366 nm): 1 – Start, 2 –
LPC, 3 – S, 4 – PC, 5 – PS, 6 – PI, 7 – PA, 8 – PE (+PG), 9 – Front
 Din analiza compoziţiei procentuale a fosfolipidelor pentru cele trei tipuri de extracte s-a
observat că în toate tipurile de probe componenta majoră este PC, urmată de PE+PG, PA, PI, PS,
S şi LPC. Aceste separări au fost efectuate pentru extracte din ţesut, membrane celulare şi fracţia
mitocondrială, pentru şase variante experimentale (M, UFS, UC 0.2, T+UFS, T+UC 0.2, T+ UC
0.4). În urma analizării datelor obţinute nu s-au observat, în general, variaţii semnificative ale
compoziţiei procentuale a fosfolipidelor pentru cele şase variante experimentale. O singură
observaţie se poate face, şi anume cea legată de creşterea cantităţii de acid fosfatidic în toate
probele provenite de la loturi intoxicate, la toate tipurile de extracte. Valoarea cea mai mare este
de 17,17 % la extractul din ţesut (lotul T+UFS). Oricum valorile acidului fosfatidic sunt foarte
mari la toate probele datorită faptului că probele nu au putut fi prelucrate imediat după recoltare.
Din acelaşi motiv apare probabil în probe şi lizofosfatidil-colina în cantităţi mai mari decît cele
obişnuite, în special la nivelul membranelor celulare. Totuşi valorile cele mai mari ale acidului
fosfatidic apar la loturile intoxicate, observându-se concomitent o scădere a conţinutului de
fosfatidil-colină, în timp ce valorile celorlalte lipide rămân aproape constante.

CONCLUZII

În urma experimentului efectuat prin administrarea in vivo a uleiului din seminţe de

Calendula, la şobolani sănătoşi şi intoxicaţi cu tetraclorură de carbon, se pot formula
următoarele concluzii:
 Efectele administrării uleiului de Calendula sunt dependente de doză.
 În doză de 0.2 ml, uleiul de Calendula manifestă un efect de scădere a valorilor
transaminazelor serice şi a fosfatazei alcaline la lotul intoxicat.
 Uleiul din seminţe de Calendula pare a funcţiona ca protector împotriva
peroxidării acizilor graşi nesaturaţi, lucru manifestat prin scăderea nivelului
peroxidării în special la loturile intoxicate cu tetraclorură de carbon şi creşterea
activităţii superoxidismutazei.
 Administrarea uleiului din seminţe de Calendula a determinat o uşoară creştere a
colesterolemiei şi trigliceridelor serice la şobolanii sănătoşi dar mai ales o scădere
semnificativă a acestor parametri în loturile de animale intoxicate cu tetraclorură
de carbon.
 Un efect similar a putut fi observat asupra lipidelor serice totale, uleiul din seminţe
inducând o normalizare a concentraţiei lipidelor totale la loturile intoxicate.
 Compoziţia în acizi graşi a ţesutului hepatic a fost modificată semnificativ prin
administrarea tetraclorurii de carbon, în sensul scăderii ponderii acizilor graşi
nesaturaţi. In loturile intoxicate, dar tratate cu ulei de Calendula conţinutul de acizi
graşi polinesaturaţi este mai ridicat decât în lotul intoxicat şi tratat cu ulei de
floarea soarelui, fapt ce poate sugera un efect protector al uleiului din seminţe
împotriva hepatotoxicităţii induse de tetraclorura de carbon.
 Profilul fosfolipidelor foarte apropiat în toate probele analizate, observându-se
totuşi o uşoară creştere a lizofosfatidilcolinei şi acidului fosfatidic la loturile
intoxicate.
 Investigarea acizilor graşi şi fosfolipidelor din fracţia microzomală (cea mai
relevantă) ar putea oferi informaţii suplimentare legate de efectul protector al
uleiului de Calendula.
BIBLIOGRAFIE

McLean, J., A.H. Clark, 1956, The isolation of octadeca-8:10:12-trienoic acid from marigold seed oil; J. Chem.
Soc., I, 777
Janiszowska, W., J. Rygier, 1985, Changes in the levels of prenylquinones and tocopherols in Calendula
officinalis during vegetation, Physiol. Plant, 63, 425- 430
Isaac, O., 1992, "Die Ringelblume", Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbM, Stuttgart
Shultz, T.D., Chew, B.P., Seaman, W.R.; Differential Stimulatory and Inhibitory Responses of Human MCF-7
Breast Cancer Cells to linoleic Acid and Conjugated Linoleic Acid in Culture; Anticancer Research; 1992, 12,
2143-2146
Iigo, M., Nakagawa, T., Ishikawa, C., Iwahori, Y., Asamoto, M., Yazawa, K., Araki, E., Tsuda, H., Inhibitory
effects of docosahexaenoic acid on colon carcinoma 26 metastasis to the lung; Br. J. Cancer, 1997, 75, 650-655
Belury, M.A., Vanden Heuven, J.P.; Protection against cancer and heart disease by dietary fat, conjugated
linoleic acid: potential mechanisms of action; Nutr. Dis. Update J., 1997, 1, 58-63
Vanden Heuvel, J.P., Peroxisome Proliferator-Activated Receptors: A Critical Link among Fatty Acids, Gene
Expression and carcinogenesis; J. Nutr., 1999, 129, 575S-580S
Della Loggia, R., Sosa, S., Leitner, Zs., Isaac, O., Tubaro, A., Anti-Inflammatory Activity of Calendula Seed
Oil, Rich in ω-6 Fatty Acids; Planta Medica, 1991, 57, Supplement Issue 2, A 49
Nugteren, D.H., Hazelhof, C., Naturally Occuring Conjugated Octadecatrienoic Acids are Strong Inhibitors
of Prostaglandins Biosynthesis; Prostaglandins, 1987, 33(3), 403- 417
Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G.H., A simple method for the isolation and purification of total lipids from
animals tissues, J. Biol. Chem., 1957, 226, 497-509
Heape, A. M., Juguelin, Helene, Boiron, Francoise, Cassagne, C., Improved one – dimensional thin – layer
chromatographic technique for polar lipids, J. of Chromat., 1985, 322, 391 – 395
Bradford, M.M., 1976, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing
the principle of protein-dye-binding, Anal. Biochem., 72, 248-254
Palozza, Paola, Gabriella Calviello, Gianna Maria Bartoli, 1995, Prooxidant activity of β-carotene under 100 %
oxygen pressure in rat liver microsomes, Free Radical Biology & Medicine, 19(6) 887-892
Kai-Wei, L., 1988, A preliminary detection of human cancer by determine the whole blood superoxide dismutase
activity, in Medical, Biochemical and Chemical Aspects of Free Radicals, Proceedings of the 4 th Biennial General
Meeting of the Society for Free Radical Research, Kyoto, Japan, 651-653
Petzhelt, C., P. Wulforth, 1984, Cell Cycle specific variations in transport capacity of an isolated Ca2+ transport
system; Cell Biol. Int. Rep., 8(10), 823-827
Crombie, L., Holloway, S. J., The Biosynthesis of Calendic Acid, Octadeca-(8E, 10E, 12Z)-trienoic Acid,
by Developing Marigold Seeds: Origins of (E,E,Z) and (Z,E,Z) Conjugated triene Acids in Higher Plants ;
J. Chem. Soc. Perkin Trans, 1985, I, 2425-2434
Fritsche, K.,.Hornung, E., Peitzsch, N., Renz, A., Feussner, I., Isolation and characterization of a calendic acid
producing (8, 11)- linoleoyl desaturase, FEBS Letters, 1999, 462, 249-253
Chaudiere, J., Ferrari-Iliou, R., Intracellular Antioxidants: from Chemical to Biochemical Mechanisms; 1999,
37, 949-962
Martin, K.R., Failla, M.L., Smith, J.C., β-carotene and Lutein Protect HepG2 Human Liver Cells against
Oxidant-Induced Damage, J.Nutr., 1996, 126, 2098-2106
Schwartz, J.L., The Dual Roles of Nutrients as Antioxidants and Prooxidants: Their effect on Tumour Cell
Growth; J.Nutr., 1996, 126, 1221S-1227S
Comporti, M., Lipid peroxidation and cellular damage in toxic liver injury; Laboratory investigation, 1985, 53(6),
599-623
Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K., Assay for lipid peroxides in animal tissues; Analytical Biochemistry, 1979, 95,
351-358