Guia Laboratorio de Microbiologia

ANGELA MARIETTA APAZA CONDORI
INGENIERIA SANITARIA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN
GUIA DE LABORATORIO
ALUMNA: ANGELA MARIETTA APAZA CONDORI
CURSO: MICROBIOLOGIA II
TURNO: VIERNES DE 4:30-6:10 PM
JULIO-2017
PRACTICA º 1: NORMAS DE SEGURIDAD, TRABAJO Y MATERIAL DE

LABORATORIO
I. INTRODUCCION:
Bioseguridad es un conjunto de normas preventivas destinadas a proteger la
salud de los funcionarios frente a riesgos por agentes biológicos, físicos o
químicos en el laboratorio. La protección del personal y ambiente del laboratorio
se logra mediante la aplicación de técnicas y normativas de seguridad
establecidas.
Los laboratorios dedicados al trabajo en Microbiología deben cumplir con una

serie de características que aseguren las condiciones de trabajo y la seguridad de
las personas.
El objetivo de la Seguridad Biológica es el de disminuir y prevenir la salida y/o

exposición de agentes que puedan ser peligrosos para las personas que trabajan
tanto dentro como fuera de este tipo de laboratorios y para el medio o ecosistema
donde podrían ir directa o indirectamente estos agentes.
II. OBJETIVO:
• Conocer y aplicar las reglas básicas de seguridad e higiene para el
laboratorio de microbiología
• Conocer los distintos materiales de laboratorio.
III. FUNDAMENTO TEORICO:
Normas generales
• No fumes, comas o bebas en el laboratorio.
• Utiliza una bata y tenla siempre bien abrochada, así protegerás tu
ropa.
• Guarda tus prendas de abrigo y los objetos personales en un armario
o taquilla y no los dejes nunca so-bre la mesa de trabajo.
• No lleves bufandas, pañuelos largos ni prendas u objetos que
dificulten tu movilidad.
• Procura no andar de un lado para otro sin motivo y, sobre todo, no
corras dentro del laboratorio.
• Si tienes el cabello largo, recógetelo.
• Dispón sobre la mesa sólo los libros y cuadernos que sean necesarios.
• Ten siempre tus manos limpias y secas. Si tienes alguna herida,
tápala.
• No pruebes ni ingieras los productos.
• En caso de producirse un accidente, quemadura o lesión, comunícalo
inmediatamente al profesor.
• Recuerda dónde está situado el botiquín.
• Mantén el área de trabajo limpia y ordenada.
Normas para manipular instrumentos y productos
• Antes de manipular un aparato o montaje eléctrico, desconéctalo de

la red eléctrica.
• No pongas en funcionamiento un circuito eléctrico sin que el profesor
haya revisado la instalación.
• No utilices ninguna herramienta o máquina sin conocer su uso,
funcionamiento y normas de seguridad específicas.
• Maneja con especial cuidado el material frágil, por ejemplo, el vidrio.
• Informa al profesor del material roto o averiado.
• Fíjate en los signos de peligrosidad que aparecen en los frascos de los
productos químicos.
• Lávate las manos con jabón después de tocar cualquier producto
químico.
• Al acabar la práctica, limpia y ordena el material utilizado.
• Si te salpicas accidentalmente, lava la zona afectada con agua
abundante. Si salpicas la mesa, límpiala con agua y sécala después
con un paño.
• Evita el contacto con fuentes de calor. No manipules cerca de ellas
sustancias inflamables. Para sujetar el instrumental de vidrio y
retirarlo del fuego, utiliza pinzas de madera. Cuando calientes los
tubos de ensayo con la ayuda de dichas pinzas, procura darles cierta
inclinación. Nunca mires directamente al interior del tubo por su
abertura ni dirijas esta hacia algún compañero. (ver imagen)
IV. MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO:
El ritmo de la investigación biológica en los últimos años ha permitido conocer
mucho mejor la estructura y la función, la homeostasis y la continuidad genética
universalizado el gran principio “si la vida proviene de la vida, la célula es la
unidad básica de la vida, cada célula debe provenir de otra célula”. La biología
al estudiar la vida y las leyes que la rigen se desarrolla y amplia por el esfuerzo
constante del hombre por conocerse a si mismo y al medio que lo rodea por lo
cual ha sido indispensable auxiliarse de materiales y equipos que permitan
disponer de un laboratorio adecuadamente implementado, sin el cual hubiera
sido imposible llegar a identificar elementos orgánicos; conocer la morfología,
estructura y fisiología de la materia viva así como la estructura celular y los
componentes químicos que lo conforman.
MATERIALES Y METODOS
• Tubos de ensayo
• Beaker
• Matraz erlenmeyer
• Matraz de fondo plano
• Matraz de fondo redondo
• Matraz aforado
• Embudo
• Vidrio reloj
• Agitador
• Pipeta volumétrica
• Pipeta graduada
• Bureta
• Probeta
• Placa o caja de petri
• Capsula de porcelana
• Crisol
• Mortero
• Espátula
• Soporte universal
• Rejilla metálica
• Aro metálico
• Pinza para soporte universal
• Rejilla metálica
• Pinza para crisol
• Mechero
Realizar la siguiente lectura, identificar el material simultáneamente y registra lo

observado:
1. Tubo de ensayo. Ahí se observan las reacciones de las sustancias que se

depositan en él. Los hay de diferentes medidas y también sirven para preparar
cultivos de bacterias y hongos.
2. Caja de Petri. En ella se cultivan microorganismos, como hongos o bacterias;

también puede usarse para seleccionar muestras de animales.
3. Embudo. Es útil para separar sustancias por medio de filtración y para evitar
su desperdicio o derramamiento al ser cambiadas de un recipiente a otro.
4. Portaobjetos. Son laminillas de cristal planas pero tambien pueden ser

cóncavas, en ellas se depositan sustancias para su observación.
5. Cubreobjetos. Cubren y protegen las preparaciones u objetos que se

observarán al microscopio e impiden que se desprendan o muevan al ser
observados.
6. Lupas. Son lentes convexos para la observación detallada de objetos

pequeños; como partes de plantas, insectos, etcétera.
7. Lámpara de alcohol. Se emplea como fuente de calor cuando se requiere

calentamiento lento. Al usarla debe cuidarse que la mecha esté limpia y
recortada para que el calor que proporcione sea adecuado
8. Vidrio de reloj. Sobre él se depositan sustancias en pequeña cantidad. Son

útiles para cubrir vasos de precipitados y para colocar en agua cortes
transversales muy delgados, los cuales, serán seleccionados con una aguja de
disección para ser observados al microscopio.
9. Mechero de gas. Se emplea para el calentamiento rápido de sustancias.
10. Microscopio. Hace visibles al ojo humano objetos diminutos. Es de suma

importancia en un laboratorio. Con él se han hecho avances notables en
medicina, química, biología, etcétera.
11. Mortero. Sirve para moler, triturar sólidos o mezclar dos o más sustancias
sólidas.
12. Estuche de disección. Contiene bisturí, agujas de disección, pinzas, tijeras,

etcétera.
13. Beaker: Se usan para preparar, disolver o calentar directamente sobre rejillas
o planchas de calentamiento
14. Matraz Erlenmeyer: Se utiliza para montar sistemas generadores de gases
15. Matraz Aforado: Sirve para preparar volúmenes exactos de concentraciones
16. Bureta: Son tubos de vidrios calibrados que suelen terminar en una llave y
sirven para medir volúmenes de líquidos con mayor preescisión y exactitud.
17. Termómetro. Con él se mide la temperatura a diversas sustancias

reaccionantes (reactivos).
18. Balanza. Con ella se conoce el peso de objetos
19. Baño María. Es un dispositivo que permite calentar sustancias en forma

indirecta, es decir, sustancias que no pueden ser expuestos a fuego directo.
20. Vasos de precipitados. Permite calentar sustancias y obtener precipitados de

ellas.
21. Matraz de fondo plano: Se utiliza para calentar líquido.
22. Matraz de fondo redondo: Se utiliza para poner volúmenes exactos de

soluciones
23. Agitador: Se usa para agitar mezclas reactivas y como accesorio en el

trasvase de líquidos
24. Cápsula de porcelana: Sirve para calentar y evaporar líquidos, fundir

cristalizar sólidos
25. Crisol: Sirve para calcinar sustancias, fundir sólidos.
26. Mortero: Sirve para triturar, pulverizar y mezclar sólidos.
27. Espátula: Sirve para trasegar sólidos y tomar nuestras de sólidos.
28. Soporte universal: Pieza básica en el montaje de los sistemas y aparatos

como pinzas y anillos de metal
29. Rejilla de Metal con Centro de Asbesto: Sirve para calentar indirectamente
ya que la llama del mechero se concentra en el anillo.
30. Trípode: Soporte de vaso de precipitado, matraces, etc
31. Pinza para soporte universal: Sirve para sujetar instrumentos en el montaje
de sistemas
32. Gradilla: Se utiliza para colocar los tubos de ensayo.
En el laboratorio es importante el uso de colorantes y reactivos especiales;

como: El azul de metileno y el verde de metilo acético, útiles para colorear
tejidos y partes específicas de la célula para luego ser observados al
microscopio. Asimismo, existen reactivos químicos para diversos usos; como:
ácido clorhídrico, agua oxigenada, alcohol etílico, cloroformo y éter.
En la presente práctica el desarrollo será teórico, en el cual el alumno deberá

investigar, graficar y describir el fundamento y uso de los materiales y equipos
de laboratorio usados en biología de la facultad y realizara la discusión
pertinente. Reportar los resultados obtenidos y discutir con los datos obtenido en
la revisión bibliográfica.
PRÁCTICA ° 2: MICROSCOPIA, METODOS DE COLORACION

I. INTRODUCCION:
La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial

empleado en bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en
muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram (1853-
1938), que desarrolló la técnica en 18841. Se utiliza tanto para poder referirse a
la morfología celular bacteriana, como para poder realizar una primera
aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose bacterias Gram
positivas a las que se visualizan de color morado, y bacterias gramnegativos a
las que se visualizan de color rosa, rojo o grosella.
II. OBJETIVO:
• Conocer la morfología bacteriana y los métodos de coloración
• Realizar coloraciones de Gram y diferenciar los microorganismos
Gram positivos y Gramnegativos
Las bacterias Gram negativas pierden un colorante (el cristal violeta) con mayor
facilidad que las Gram positivas. La razón es la menor cantidad de mucopéptido
de las paredes de las bacterias Gram negativas-esquema

COLORACION SIMPLE:
REALIZACIÓN DEL FROTIS
1. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es

necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que
en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mínima gota de agua, que
resulta suficiente.
2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña

cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua.
Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que
quede bastante extendida para facilitar su secado.
Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos
primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión
bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos.
3. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el

porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no
calentar demasiado el porta pues las células pueden deformarse o romperse.
FIJACIÓN DE LAS BACTERIAS AL PORTAOBJETOS
4. Por calor: Pasar cinco veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos.
Dejar enfriar el porta entre los pases.
Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser
observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar con el
proceso de tinción.
TINCIÓN DEL FROTIS BACTERIANO
5. Cubrir el frotis con abundante colorante y dejarlos actuar durante el tiempo que
indique el protocolo de cada tinción concreta. Suele oscilar entre 1 y 5 minutos. En
ocasiones el colorante tiñe sólo en caliente, por lo que el tiempo que dure su actuación
se deberá sostener el portaobjetos con unas pinzas sobre la llama del mechero para que
humee el colorante, pero teniendo mucho cuidado de que no llegue a hervir ya que se
produciría la destrucción de las células.
6. Lavar la preparación con agua para eliminar el colorante. Esta operación se

realiza inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de
manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre él,
pues podría arrastrar parte del frotis consigo. Eliminar la máxima cantidad de agua de
los portaobjetos golpeándolos por su canto con cuidado contra la superficie de la mesa
de trabajo.
7. Secar el porta: en ningún caso se debe frotar el porta.
8. Observar la preparación al microscopio llegando hasta el máximo aumento. Si se

quiere montar de forma definitiva no se debe usar ahora el aceite de inmersión.
TINCION DE GRAM:
Tinción 1: durante 1 minuto se cubre la superficie donde están las bacterias con unas
pocas gotas del colorante cristal violeta. Pasado este tiempo se elimina el exceso y se
lava el portaobjetos con agua corriente, con cuidado para que el chorro de agua no caiga
directamente sobre la muestra ni sea un flujo demasiado rápido como para eliminar las
bacterias del porta.
Tinción 2: Aquí es donde se introdujeron las mejoras de Hucker, agregando lugol

durante 30 segundos y decolorando con alcohol: acetona (en proporciones 1:1) 3
segundos y se vuelve a lavar como antes. La modificación de Kopeloff utiliza como
decolorante alcohol-acetona (7:3) segundos y los tiempos de tinción son diferentes.
Tinción 3: Se añade safranina durante 30 segundos y se vuelve a lavar. Que puede
sustituirse por carbol-fucsina, para bacterias anaerobias.
Se deja secar y ya puede verse al microscopio óptico las bacterias teñidas
V. RESULTADOS:
• Se logró realizar los métodos de coloración observando al
microscopio la morfología bacteriana
• Realizaremos la coloración Gram diferenciando los Gram positivos
de los Gramnegativos.
PRÁCTICA ° 3: COLORACIONES ESPECIALES
I. INTRODUCCION:
Algunas bacterias denominadas ácido alcohol resistentes presentan una pared

celular muy rica en ácidos grasos de cadena larga, denominados ácidos
micólicos, que la hacen resistente a la decoloración con alcohol ácido, una vez
que hayan sido teñidos con colorantes básicos.
II. OBJETIVO:
Detectar las bacterias ácido alcohol resistentes mediante la tinción de Ziehl
Nielsen
III. MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO:

• Equipo de tinción
• Mechero Bunsen
• Microscopio
• Portaobjetos
• Asa de siembra de platino
REACTIVOS
• Fucsina fenicada
• Alcohol- ácido
• Azul de metileno
• Agua destilada
IV. PROCEDIMIENTO:
• Extensión, desecación y fijación
• Echar fucsina fenicada durante 1 minuto en frio y 5 minutos a
emisión de vapores.
• Decoloración con alcohol-ácido unos 30 segundos, hasta que se
elimine el rojo.
• Lavar con agua destilada.
• Azul de metileno durante 1-2 minutos
• Lavar, secar y observar.
V. RESULTADOS:
• Logramos determinar la existencia de bacterias acido alcohol
resistentes mediante la tinción de Ziehl Nielsen
VI. RECOMENDACIONES:
• Primero prepara todos los frotis de tus muestras, apaga el mechero y
posteriormente procede a la tinción.
• No pierdas de vista el objetivo de cada tinción diferencial, cuando se
considera una bacteria Grampositiva, cuando una Gramnegativa, en
comparación de una BAAR positiva y de una BAAR negativa.
PRÁCTICA °4: DETERMINACION DE PARAMETROS DE CALIDAD DE

DISTINTOS TIPOS DE AGUA
I. INTRODUCCION:
El agua se constituye en la materia prima más usada por las industrias en

general, especialmente la de alimentos, para lavado, envasado de conservas,
elaboración de productos, como solventes, en aguas de calderos o como
intercambiadores de calor, por lo que la caracterización de ciertos parámetros se
considera de mucha importancia.
Los parámetros de control más comunes son entre otros el pH, la dureza, los
sulfatos, los cloruros, entre otros. En esta práctica se realizará la determinación
de cloruros y del Ion bicarbonato (HCO3), como también de la temperatura y el
pH.
II. OBJETIVO:
 Conocer la calidad del agua que se está consumiendo
 Determinar los parámetros de físicos, químicos, biológicos del agua.
 Identificar que parámetros del agua nos ayudan a determinar su calidad.
 Conocer que microorganismos son los indicadores de contaminación del
agua.
En la corteza terrestre, el agua reacciona con los minerales del suelo y de las
rocas. Los principales componentes disueltos en el agua superficial y
subterránea son los sulfatos, los cloruros, los bicarbonatos de sodio y potasio, y
los óxidos de calcio y magnesio. Las aguas de la superficie suelen contener
también residuos domésticos e industriales.
Parámetros para la determinación de la calidad del agua:
a) Parámetros físicos:
• Olor y sabor
• Color
• Turbidez
• Conductividad
• Resistividad
b) Parámetros químicos:
• PH
• Dureza
• Temperatura
• Alcalinidad
• Coloides
• Solidos disueltos
• Sólidos en suspensión
• Cloruros
• Sulfatos
• Nitratos
• Fosfatos
• Fluoruros
• Sílice
• Metales Tóxicos
• Gases disueltos
c) Parámetros biológicos.
• Demanda Biológico de oxigeno
• Demanda química de oxigeno
• Carbón orgánico Total
d) Parámetros bacteriológicos:
• EScherichia coli
• Estreptococos Fecales
• Clostridios
PARAMETROS FISICOS:
COLOR:
La determinación más general y más usada es la comparación visual de la
muestra con soluciones patrones de concentraciones conocidas, formadas por la
formación de un compuesto cloroplatinato, que es el color que produce 1 mg/l
de Platino. La proporción Pt-Co que se utiliza en este método es normalmente la
adecuada para la mayoría de las muestras.
OLOR:
Se produce por desprendimientos de gases del agua residual. Los olores
característicos de un agua residual urbana son debidos a diferentes sustancias
disueltas y por la actividad biológica que se produce en ella, sobre todo de
carácter orgánico. Las aguas residuales urbanas si son frescas no tienen olores
desagradables ni intensos, pero a medida que pasa el tiempo, el olor aumenta y
cuando hay mucho consumo de oxígeno, pasa a condiciones anaerobias con
desprendimientos de gases, como los compuestos de azufre (sulfhídrico,
mercaptanos, etc.), produciendo mal olor, que es indicativo de sustancias
peligrosas en el agua.
TURBIDEZ:
EQUIPO
 Turbidímetro marca Merck, modelo Turbiquant 3000T, rango de lectura
0,00 – 10.000 NTU.
 Balanza analítica Mettler Toledo, modelo AG204, resolución de 0,1 mg.

7.2
MATERIALES
 Celdas de vidrio con tapa rosca.
 Balones aforados clase “A” de 100 mL, 200 mL, 250 mL, 500 mL y
1000 mL.
 Espátula pequeña.
 Frasco de almacenamiento de estándar de color ámbar.
 Frasco lavador 7.3
REACTIVOS
 Sulfato de hidrazina grado reactivo.
 Hexametilentetramina grado reactivo
 Agua destilada
 Agua ultrapura. Suspensión patrón primario de 4000 NTU. Transferir
suspensión stock para almacenamiento a un frasco de vidrio color ámbar.
 La suspensión stock es estable hasta por un año cuando es almacenada

apropiadamente.
 Suspensiones diluidas de turbiedad. Transfiera las suspensiones de
trabajo a frascos de vidrio ámbar. Reemplácelos cuando su tiempo
exceda la vida útil (aproximadamente 6 meses). No todos los estándares
secundarios tienen que ser descartados cuando un estándar primario
(suspensión stock) muestra que su valor de turbiedad ha cambiado
Procedimiento
 Preparar las soluciones
 Deje que las muestras lleguen a temperatura ambiente.
 Agite las muestras en sus recipientes.
 En una celda perfectamente limpia, adicione muestra y tápela, purgue y
deseche su contenido. Repita la operación.
 Adicione cuidadosamente la muestra en la celda de tal manera que no
forme burbujas.
 Tape la celda, enjuáguela, séquela y límpiela de tal manera que no quede
suciedad, ni motas en sus paredes externas.
 Coloque la celda con muestra en el porta celda, asegúrese que la celda
entra hasta el fondo del porta celda..
 Alinee la celda.
 Espere respuesta después de 6 segundos. TP0349
 Registre el dato en el formato de Captura FT0349
 Retire la celda, deseche la muestra, enjuáguela 3 veces con agua
destilada, sacúdala.
 Al finalizar la lectura de muestras llene la parte inferior del formato de
Captura FT0349 (Firma del analista, Tiempo total de análisis.)
 Diligencie el formato de uso del turbidímetro y ubique el valor

experimental de los estándares leídos como muestras en las cartas de
control correspondientes.
 Entregue el formato para el control de calidad y archivo de la
información analítica.
V. PROCEDIMIENTO:
PARAMETROS QUIMICOS:
Dureza
Materiales
• Piola
• Reactivo E.D.T.A
• Probeta de 25 ml
• Piseta
• Muestra de agua
• Espátula
• Cintas indicadoras de pH
• Bureta
• Pinza porta buretas
• Soporte universal
• Matraz de Erlenmeyer
• Solución buffer pH=10
• Negro de ferrocromo
•
Procedimiento
1. Colocar 25 ml de la muestra de agua se coloca en el matraz de

Erlenmeyer
2. Agregar 10 ml de la solución buffer cuyo pH=10 verificar que su pH sea
igual 10 con la cinta.
3. Agregar una pizca del negro de eriocromo y proceder a mover la
solución, esperar a que se torne color rojizo.
4. Proceder a realizar la titulación con la solución del E.D.T.A de
concentración 0.01 M.
5. Se hace la medición del volumen de gasto de la solución E.D.T.A, hasta
que ocurra el cambio de coloración.
6. Determinar la dureza del agua con la siguiente formula, y compararla en
que rango se encuentra.
Alcalinidad:
Uso de reactivo
Materiales
• Reactivo liquido prueba de pH gotas
• Muestras de agua de 25 ml
• Agua alcalina de pH=9

• Cuadro de comparación
• Matraz de Erlenmeyer (cantidad igual al número de muestras)
Procedimiento:
1. Colocar en cada matraz de Erlenmeyer una muestra diferente de agua,

siendo la muestra alcalina de pH 9 un punto de partida.
2. Colocar tres a cuatro gotas del Reactivo líquido prueba de pH gotas y
agitar suavemente para homogenizar el compuesto.
3. Comparar por medio de los colores con el cuadro dado y determinar el
grado de acides o alcalinidad de las diferentes muestras de agua
Uso de reactivo casero
Materiales
• Col morada antocianinas

• Alcohol
• Mortero
• Colador
• Baso
• Muestras de agua
• Matraz de Erlenmeyer (cantidad igual al número de muestras)
Procedimiento:
1. Cortar trozos de col y colocarlos al mortero para luego triturarlos

totalmente.
2. Añadir alcohol isopropilico para disolver las sustancias de la col, obtener
antocianinas.
3. Depositar en un recipiente el extracto de la col.
4. Llenar el matraz de Erlenmeyer (cantidad igual al número de muestras)
con las diferentes muestras a observar.
5. Colocar el extracto de antocianinas en los matraces y observar los
cambios de colores.
PH:
MATERIAL:
• Muestra de agua para analizar
• Reactivo rojo phenol
• Agua destilada
• Escala de pH
Procedimiento:
• Recolectar las a muestras a utilizar.

• Colocar cada muestra de agua en un tubo de ensayo de manera que

ninguna entre en contacto con la otra.
• Añadir entre 4 a 5 gotas de rojophenol y homogenizar la sustancia para
que pueda cambiar de color.
• Una vez homogenizada, procedemos a comparar el color utilizado con la
escala de pH que se basa en los colores que cambia el agua.
CLORUROS:
MATERIAL:
• Muestras de agua para analizar
• Reactivo rojo phenol
• Agua destilada
• Escala de pH
Procedimiento:
• Recolectar las a muestras a utilizar.

• Colocar cada muestra de agua en un tubo de ensayo de manera que
ninguna entre en contacto con la otra.
• Añadir entre 4 a 5 gotas de Orthotolidina y homogenizar la sustancia para
que pueda cambiar de color.
• Una vez homogenizada, procedemos a comparar el color utilizado con la
escala de cloro para poder determinar la cantidad de cloro que posee nuestra
muestra.
SOLIDOS TOTALES (ST)
Materiales (Para ST, STS Y STD)

• Probeta.
• Capsula de porcelana de 150 ml.
• Filtros de 1.2 µm tamaño del poro.
• Pinzas.
• Recipiente desecador.
• Estufa de desecación ventilada.
• Balanza de 1mg de precisión.
Procedimiento
• Se seca la capsula a 105°C por
• Luego se retira la capsula de la estufa, para hacerla enfriar en el
recipiente desecador.
• Seguidamente se pesa la capsula de porcelana. (peso A).
• Luego se vierte 100 ml del agua muestra en la capsula de porcelana con
la ayuda de la probeta.
• Seguidamente se coloca la capsula con la muestra en la estufa hasta su
total evaporación.
• Luego se aumenta la T° hasta 105°C durante 4 horas.
• Luego se deja enfriar la capsula dentro del recipiente desecador.
• Para hacer la pesada de la capsula con los residuos secos. ( Peso B)

• Para calcular los ST:
SOLIDOS TOTALES EN SUSPENSIÓN
Procedimiento
• Se coloca la capsula con el filtro en la estufa a 105°C durante 1 hora.
• Para luego colocarla en el desecador, para que este se enfrié.
• Luego pasamos a pesar la capsula con el filtro (peso C).
• Seguidamente se vierte 100ml del agua muestra en el filtro.
• Para luego retirar el filtro con cuidado y colocarlo dentro de la capsula de
porcelana.
• Después, lo introducimos en la estufa a 105°C por 2 horas aprox.
• Una vez seco se introduce en el desecador para que enfrie.
• Luego se procede a pesar la capsula con el filtro más el residuo seco
(peso D).
Para calcular los STS:
SOLIDOS TOTALES DISUELTOS
Procedimiento
• Se seca la capsula a 105°C por
• Luego se retira la capsula de la estufa, para hacerla enfriar en el
recipiente desecador.
• Seguidamente se pesa la capsula de porcelana. (Peso E).
• Seguidamente se vierte 100ml del agua muestra en el filtro.
• Luego se utiliza en el agua filtrada y se vierte en la capsula.
• Para luego introducir la capsula con el agua filtrada en la estufa a 180°C,
hasta que se evapore completamente.
• Luego pasamos a pesar la capsula con los residuos secos (peso F)
• Calculo de los STD:
VI. RESULTADOS:
Se logró determinar los parámetros físicos, químicos y biológicos de la calidad
del agua, identificando los parámetros de calidad y reconociendo los principales
microorganismos indicadores de contaminación del agua.
PRÁCTICA °5: DETERMINACION DE LA DEMANDA BIOQUIMICA DE

OXIGENO (DBO) Y QUIMICA DE OXIGENO (DQO)
I. INTRODUCCION:
La DQO es “la cantidad de oxígeno necesario para oxidar la materia orgánica

por medios químicos y convertirla en dióxido de carbono y agua”.
La DQO se utiliza para medir el grado de contaminación y se expresa en
miligramos de oxígeno diatómico por litro (mgO2/l).
Cuanto mayor es la DQO más contaminante es la muestra.
Las concentraciones de DQO en las aguas residuales industriales pueden tener
unos valores entre 50 y 2000 mgO2/l, aunque es frecuente, según el tipo de
industria, valores de 5000, 1000 e incluso más altos.
La D.B.O. es “la cantidad de oxígeno que los microorganismos, especialmente
bacterias (aeróbias o anaerobias facultativas: Pseudomonas, Escherichia,
Aerobacter, Bacillus), hongos y plancton, consumen durante la degradación de
las sustancias orgánicas contenidas en la muestra”.
La DBO se utiliza para medir el grado de contaminación y se expresa en
miligramos de oxígeno diatómico por litro (mgO2/l). Como el proceso de
descomposición varía según la temperatura, este análisis se realiza en forma
estándar durante cinco días a 20 ºC; esto se indica como D.B.O5.
II. OBJETIVO:
 Determinar la concentración de DQO en un cuerpo de agua residual
 Determinar la demanda bioquímica de oxigeno ( DBO) en un cuerpo de
agua residual.
El método empleado se basa en la reacción de una muestra de agua contaminada

(Por ejemplo, un supuesto vertido industrial) con un oxidante enérgico, como es
el dicromato potásico1, en medio ácido sulfúrico con Ag+ como catalizador y la
valoración por colorimetría de la cantidad de dicromato consumida en este
proceso.
Los compuestos orgánicos oxidables actúan reduciendo el dicromato, Cr(VI), a
ion crómico Cr(III). La cantidad de dicromato consumido proporciona una
medida de la concentración de contaminantes en el agua.
La utilización de la colorimetría (absorción visible-ultravioleta) para la
determinación de la DQO en esta práctica se basa en los diferentes espectros de
absorción del Cr (VI) (de color naranja, absorbe en longitudes de onda en torno
a 440 nm) y el Cr (III) (de color verde, absorbe en torno a 600 nm), por lo que
ambas especies se pueden detectar independientemente.
Realizaremos la calibración de la técnica con disoluciones patrón de Ftalato
potásico (sustancia orgánica reductora), cuya DQO es bien conocida
IV. MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO PARA DEMANDA

QUIMICA DE OXIGENO (DQO):
 Pipetas graduadas10 ml
 Tubos de digestión 10 ml (con tapa rosca)
 Bureta
 Matraz Erlenmeyer
 Termorreactor
Reactivos:
 Solución de digestión: dicromato de potasio (contiene HgSO4 para
inhibir haluros)
 Solución catalizadora: Reactivo de ácido sulfúrico(98%) y sulfato de
plata
 Solución indicadora de ferroína.
 Solución titulante de sulfato ferroso amoniacal (FAS) o sal de mohr
0.5N
V. PROCEDIMIENTO:
 Se han dividido las cantidades por 5 y se utiliza un tubo de digestión de

25x300mm, calentado en su parte inferior, en una placa de calefacción
apropiada, la cual produce condensación en las paredes del tubo, no
siendo necesario el uso de refrigerante de reflujo.Esto simplifica
enormemente el procedimiento y permite correr simultáneamente en una
placa normal hasta 56 muestras.
 Se toman 3 ml de muestra que puede ser pura o diluida según el valor

esperado para la DQO. Se colocan en un tubo de digestión, se agregan
5ml de solución de K2Cr2O7 0,25N(equivalentes a 1,25 ml de solución
1N + 3,75 ml de H2O) y acto seguido con mucho cuidado añadimos por
la paredes del tubo 3 ml de H2SO4
 Tapar herméticamente los tubos e invertirlos varias veces para mezclar
completamente el contenido. Usar protector facial, guantes y protección
para el calentamiento de los tubos por reacción exotérmica
 Colocar los tubos en el digestor a 150 °C durante 2 horas.
 Se deja enfriar de un día para otro. Al día siguiente se diluye pasar el
contenido a un Erlenmeyer para su titulación. a 100ml con agua, se
agregan 2 a 3 gotas de indicador ferroina y mezclar rápidamente
 Titulación con FAS(Sulfato ferroso amoniacal) de 0,5N: El punto final
de la titulación es un cambio de color de azul verdoso a café rojizo.
VI. MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO PARA DEMANDA

BIOQUIMICA DE OXIGENO (DBO):
 Incubadora de baja temperatura.

 Botellas de Winkler.
 Pipetas graduadas de 10 ml.

 Matraces Erlenmeyer.
 Bureta de 50 ml.
 Vasos de precipitado.
 Sulfato de Magnesio.
 Cloruro de Calcio.
 Cloruro de Hierro.
 Solución amortiguadora de fosfatos.
 Reactivos para oxígeno disuelto.
VII. PROCEDIMIENTO:
 Sature de 𝑂2 el agua que se usara para la dilución, agitándola en un

frasco parcialmente lleno.
 Ponga el volumen deseado de agua destilada en un frasco apropiado y
añada un ml/litro de cada una de las soluciones siguientes: Sulfato de
Magnesio, Cloruro de Calcio, Cloruro de Hierro y solución
amortiguadora de fosfatos. Se añade la Solución amortiguadora de
fosfatos justamente antes de usar el agua de dilución.
SIEMBRA: DILUCION DE LA MUESTRA:
 Haga varias diluciones de la muestra para obtener las disminuciones de
oxígeno disuelto requerido.
 Sifonee cuidadosamente el agua de dilución a un vaso de precipitado de
1000 Ml. Llénese hasta la mitad procurando no hacer burbujas para evitar
la entrada de aire. Agregar cuidadosamente la cantidad de muestra para la
dilución deseada y dilúyase al nivel apropiado con el agua de dilución.
 Mezcle bien con un agitador de tipo de embolo, evitando la entrada de
aire.
 Sifonee la solución deseada por lo menos en 2 frascos de DBO
procurando que el líquido se derrame; tape herméticamente evitando la
formación de burbujas de aire.
 Incube por lo menos un frasco y en el otro determine el oxígeno disuelto
inicial.
 Prepare diluciones sucesivas de concentración más baja de la misma
manera.
INCUBACION:
 Incúbese el testigo del agua de dilución si es sembrada y las muestras
diluidas a 5 días a 20 °C.
 Selle hidráulicamente los frascos de DBO en la parte superior del cuello
del frasco.
VIII. RESULTADOS PARA DEMANDA QUIMICA DE OXIGENO (DQO):

De acuerdo con el método standard para la determinación del carbón orgánico,

1ml de solución de Dicromato 1N contiene 49,03 mg de K2Cr2O7 y oxida 3mg
de Carbón equivalente a una DQO de 8mg de Oxígeno.
DQO; mg/L = (1,25 - FAS 0,5N/2) x8000/Alícuota
Más genéricamente sería:
DQO; mg/L = (mL de Dicromato x Normalidad – mL de FAS x Normalidad)

x8000/ Alícuota
A lo anterior se le debe restar el resultado de un Blanco, con lo cual la fórmula
queda transformada en lo siguiente:
DQO; mg/L = (mL de FAS x Normalidad en el Blanco – mL de FAS x

Normalidad en la muestra) x8000/ Alícuota
Donde:
Blanco: Tubo de ensayo que contiene agua destilada
Muestra: Tubo de ensayo que contiene el agua residual
8000= Peso equivalente del Oxígeno por 1000 ml
IX. RESULTADOS PARA DEMANDA BIOQUIMICA DE OXIGENO (DBO):
SIN DILUCIÓN
𝐃𝐁𝐎𝟓 𝐞𝐧 𝐦𝐠⁄𝐋 = (𝐃𝐈𝐎𝐃 𝐦𝐠⁄𝐋 − 𝐎𝐃 𝐦𝐠⁄𝐋 )

Dónde:
DIOD = Demanda inmediata de oxígeno disuelto
OD = Oxígeno disuelto después de 5 días
CON DILUCION
𝐃𝐈𝐎𝐃 𝐦𝐠⁄𝐋 − 𝐎𝐃 𝐦𝐠⁄𝐋 𝐚𝐥 𝟓° 𝐝𝐢𝐚
𝐃𝐁𝐎𝟓 𝐞𝐧 𝐦𝐠⁄𝐋 =
% 𝐝𝐞 𝐝𝐢𝐥𝐮𝐜𝐢𝐨𝐧 𝐞𝐱𝐩𝐫𝐞𝐬𝐚𝐝𝐚 𝐞𝐧 𝐝𝐞𝐜𝐢𝐦𝐚𝐥𝐞𝐬
PRÁCTICA ° 6: ANALISIS DE ALIMENTOS CON PRESENCIA DE

INHIBIDORES
I. INTRODUCCION:
En nuestra alimentación diaria, junto a los nutrientes que ingerimos con los
alimentos, encontramos otros elementos que producen un efecto contrario; las
sustancias anti nutrientes, que, al interferir en la utilización o función de los
nutrientes, afectan a su biodisponibilidad o aprovechamiento digestivo. El
término de sustancias anti nutrientes o anti nutrientes fue definido por Gontzea y
Sutzescu en 1968; se trata de compuestos que están presentes de forma natural
en los alimentos y actúan provocando una pérdida de nutrientes esenciales o
interfiriendo en su utilización y función metabólica.
Las sustancias anti nutrientes están ampliamente distribuidas y, aunque en la

mayoría de los casos no constituyen un peligro inmediato para la salud humana,
no puede ignorarse su presencia, especialmente en los países en desarrollo donde
la escasez de alimentos lleva a estados de malnutrición o en los países
desarrollados si la dieta no es equilibrada y se consumen alimentos que
contienen gran cantidad de estas sustancias. La compensación de los nutrientes
deficitarios puede llevar a una mejora rápida del estado general.
Desde el punto de vista nutricional, las sustancias anti nutrientes de origen

natural, se clasifican en función del tipo de nutriente con el que interfieren. Se
distinguen:
- Inhibidores de proteasas: sustancias que interfieren en la utilización

digestiva o metabólica de las proteínas.
- Inhibidores de glucosidasas: inhibidor de alfa amilasa de la soja.
- Lectinas
- Sustancias anti minerales: sustancias que interfieren con la asimilación de

elementos minerales.
- Sustancias anti vitaminas: sustancias que inactivan o aumentan la

necesidad de vitaminas.
- Otros
II. OBJETIVO:
 Mostrar algún método factible para el análisis de alimentos por la
presencia de inhibidores.
 Enseñar los efectos que puede tener un inhibidor en la salud del ser
humano cuando es ingerido de manera involuntaria.
 Determinar la presencia o no de residuos antibacterianos en carne.
III. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO:
Muestras de tejido muscular y renal se colocan sobre un medio de cultivo sólido

que contiene una determinada cantidad de cultivo de una bacteria sensible a
antibióticos. Los inhibidores difunden en el medio y provocan una zona de
inhibición alrededor de las muestras. El tamaño del halo es una medida del
efecto inhibidor.
Reactivos, cepas y sensidiscos.
1.1 Medio de cultivo:
Para preparar el substrato se usa un medio de cultivo deshidratado de la
siguiente composición:
Peptona de carne 3,45 g
Peptona de 3,45 g
caseína
Na Cl 5,10 g
Agar 13,00 g
Agua destilada 1000,00 ml
El medio de cultivo se disuelve en agua destilada y se le agrega 0,1 % de
KH2PO4. El pH se ajusta con HCI o NaOH y su valor debe controlarse
después de autoclavel medio de cultivo.
Para preparar el medio de cultivo para la prueba de inhibidores, se
mezclan 500 ml del medio líquido enfriado a 50ºC con 0,5 ml de una
suspensión de esporas de la cepa, bajo agitación regular. Al medio
ajustado a pH 7,2 se agregan, además, 0,5 ml de una solución de
Trimetoprim que se prepara según 3.2. La mezcla se deposita en placas
de Petri de modo que al solidificar, se obtenga una capa de 2 mm de
altura. Las placas preparadas se guardan en refrigeración hasta el
momento de su uso. Se recomienda usar los medios dentro de 2 días
posteriores a su preparación.
1.2 Solución de Trimetoprim (TMP):
10 mg de TMP se disuelven en 10 ml de etanol bajo agitación y
calentado a 50°C (solución madre). Esta solución almacenada en frío y
oscuridad, dura varios meses. Agregando 190 ml de agua destilada
estéril, la solución se lleva a una concentración de 50 mcg de TMP ml
(solución de uso). Esta solución almacenada en refrigerador dura a lo
menos 15 días.
1.3 Cepa bacteriana:
Como cepa bacteriana debe usarse Bacillus subtilis B.G.A. que se obtiene
en el Instituto de Medicina Veterinaria (Robert von Ostertag) del
'Bundesgesundheitsamt', 1.000 Berlin 33, Alemania Federal, o bien en el

comercio especializado.
1.4. Suspensión de esporas:
Un medio de cultivo con la composición descrita en 3.1 se ajusta a pH
7,0 ± 0,2, se siembra abundantemente con la cepa descrita en 3.3 y se
incuba por 10 días a 30ºC. Luego se cosecha la cepa con solución salina
fisiológica estéril. Este producto se centrifuga por 10 min. a 3.000 RPM,
se desecha el sobrenadante y se agrega nuevamente solución salina estéril
al sedimento, volviendo a centrifugar en las condiciones antes señaladas.
Después de retirar el sobrenadante se agrega solución salina estéril y se
calienta la suspensión por 30 min. a 70ºC. Esta suspensión de esporas se
ajusta a una concentración de 107 esporas/ml y se guarda en refrigeración
pudiendo durar varias semanas. La comprobación de la concentración se
realiza por recuento bacteriano en superficie empleando el mismo medio
de cultivo mencionado.
1.5 Sensidiscos:
Se emplean sensidiscos comerciales de Penicilina G. 0,01 U.I (medio a
pH 6,0); Estreptomicina, 0,5 mcg (medio a pH 8,0) y Sulfadimidina 0,5
mcg (medio a pH 7,2) con un diámetro de 6 mm.
Equipos y accesorios.
 Sacabocados, pinza, tijera.
 Lupa o microscopio estereoscópico con una instalación para determinar el
tamaño del halo.
 Estufa de cultivo, + 30°C.
Toma de muestra:
Para la detección de inhibidores se toman las siguientes muestras:
 De un cuarto anterior o posterior en lo posible un músculo completo recubierto
de fascias o como sustituto un cubo muscular de aproximadamente 6 cm de
lado.
 Un riñón.
Las muestras se toman con material estéril y se someten de inmediato a refrigeración. El
eventual transporte para envío a laboratorio también debe hacerse en ambiente frío.
Examen.
De la musculatura y del riñón se obtienen con sacabocados 3 trozos cilíndricos de tejido
con un diámetro de 8 mm. y una altura de 2 mm. Un trozo de cada tipo de tejido se
coloca sobre el medio de cultivo a pH 6,0; pH 8,0 y pH 7,2 respectivamente (fig. 1). El
material altamente contaminado es inadecuado para la detección de inhibidores.
Los medios de cultivo se incuban por 18-24 horas a 30ºC. Sobre un medio de cultivo de
pH 6,0 se coloca un sensidisco de 0,01 U.I. de Penicilina G; sobre un medio a pH 8,0 un
sensidisco con 0,5 mcg de Estreptomicina y en un medio con pH 7,2 un sensidisco con
0,5 mcg de Sulfadimidina. Estos medios se incuban simultáneamente como controles.
Evaluación.
Se mide el halo entre borde del tejido y límite de crecimiento. En casos dudosos se
recurre a la lupa o a un microscopio.
8. Informe. Una inhibición clara y total del crecimiento de a lo menos 2 mm, se
considera positiva; una de 1-2 mm sospechosa cuando los controles paralelos han
denotado un halo de inhibición perfecto de un tamaño cercano a 6 mm. En el informe
debe señalarse el tipo de tejido y el resultado como positivo, negativo o sospechoso.
IV. CONCLUSIONES
El uso de antimicrobianos en animales de consumo es un asunto de gran interés para los
diversos agentes interesados en los resultados y consecuencias de su aplicación:
veterinarios, médicos, microbiólogos, autoridades sanitarias y de registro, industrias
alimentarias y farmacéuticas, consumidores y la población en general.
Los antibiogramas son muy útiles para ver el efecto que puede tener un determinado
medicamento en un microrganismo, esto permite extender nuevas fronteras en ese
campo pues se pueden probar nuevas sustancias como esencia de eucalipto.
Si no dejamos de usar agentes antimicrobianos nos estamos conduciendo a una época en
la que se puede generar una gran resistencia por parte de los microorganismos.
PRÁCTICA °7: IDENTIFICACION DE SALMONELLA Y SHIGELLA EN

ALIMENTOS
I. INTRODUCCION:
El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Como el

nombre lo indica, Enterobactericeae comprende bacterias que proliferan en el
intestino; varios géneros de esta familia contienen especies patógenas. Además
de Salmonella, se incluyen especies patógenas transmitidas por los alimentos de
los géneros Escherichia, Shigella y Yersinía
Salmonella es una bacteria gram-negativa en forma de bacilo que posee flagelos.
Las bacterias del género Salmonella son microorganismos anaerobios
facultativos. Son oxidasa negativa, fermentan la glucosa y producen ácido y gas.
II. OBJETIVO:
Aplicar adecuadamente la técnica descrita en el presente informe para la

detección del género Salmonella y Shigella.
 Describir la metodología llevada a cabo por el equipo de trabajo a
realizar la detección, aislamiento e identificación de Salmonella spp. y
Shiguella spp. en muestras de alimentos.
La Salmonela corresponde a bacterias Gram negativas que pertenecen a la

familia enterobacteriaceas y están compuestas por una sola especie denominada
Salmonella Entérica. Generalmente son móviles por flagelos a excepción de S.
Gallinarum y S. Pullorum, las cuales causan tifoidea aviar y pullorosis
respectivamente. Podemos encontrar aerobias y anaerobias facultativas y tienen
un amplio rango de temperatura de crecimiento destacando que la mejor
temperatura de crecimiento es de 37⁰C y pueden desarrollarse en un pH entre 4
y 9. Son ubicuas en la naturaleza, son sensibles a la pasteurización, se inactivan
a 64⁰C por un minuto (la S. Gallinarum es inactivada a 60⁰C por 10 minutos).
La gran mayoría de estas bacterias se encuentran en el intestino animal lo cual
nos indica que se diseminan fácilmente en el ambiente. Estas bacterias son
incapaces de fermentar lactosa o sacarosa pero si fermentan glucosa con
producción de ácido y gas. Según su metabolismo estas bacterias para ser
identificadas deben tener los siguientes resultados bioquímicamente. Cabe
mencionar que la S. Gallinarum y S. Pullorum son inmóviles y no producen
H2S.
 Balanza granataria
 1 caja de Petri de vidrio estéril
 Utensilios necesarios para la manipulación de muestras: cucharas,
cuchillos, tenedores, estériles.
 Pipetas de vidrio de 1 mL, estériles con filtro de algodón, Pipetas Pasteur

estériles
 Asa microbiológica
 Mecheros de Bunsen
 Matraz
 Agares y caldos
 Incubadora a 35°C con termostato calibrado que evite variaciones
mayores a 0.1°C
 Tubos de ensayo 16*15
V. PROCEDIMIENTO:
El aislamiento e identificación de salmonella y shiguella en una muestra requiere

de cuatro etapas que se precisan a continuación:
ETAPA DE PRE-ENRIQUECIMIENTO.
Esta etapa es normalizar metabólicamente las células de Salmonella spp que se
encuentren en determinada matriz para su perfecto desarrollo y todos los
microorganismos compiten por los nutrientes. Se realiza a partir de medios de
cultivo no selectivos como agua peptonada, caldo nutritivo, caldo lactosado o
agua destilada estéril adicionada con solución de verde brillante al 0,1% en el
caso de leche en polvo .Es necesario una incubación a 37° Celsius durante 18 a
24 horas.
Siembra
Por inoculación directa del material en estudio.
Como diluyente: realizar las diluciones 1:10 y 1:100, dependiendo del uso que
se le quiera dar.
Incubación
Aeróbica, a 35-37 ºC durante 18-24 horas.
Características del medio:

Medio preparado: ámbar claro.
Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.
ETAPA DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO.
Esta etapa estimula y favorece el crecimiento de Salmonella spp. Inhibiendo el

crecimiento de la flora acompañante; los medios de cultivo utilizados son: Caldo
Tetrationato-Bilis-Verde Brillante según Mueller-Kauffmann, Caldo Rappaport-
Vasiliadis (RV) y Selenito Cistina (SC).
En el medio selectivo caldo tetrationato-Bilis-Verde Brillante: El tetrationato

inhibe el crecimiento de coliformes y otras bacterias intestinales, la bilis
estimula el crecimiento de Salmonella e inhibe la flora competitiva, el verde
brillante impide el desarrollo de la flora gram positiva y el carbonato cálcico
actúa como tampón para mantener el pH.
ETAPA DE AISLAMIENTO EN MEDIOS SELECTIVOS.
Esta etapa permite la diferenciación de colonias de Salmonella de otras

bacterias, esta diferenciación radica en la composición de los distintos medios
que permiten el crecimiento de las colonias con aspectos característicos. Para
aislar y diferenciar las colonias de Salmonella los medios de cultivo contienen
sustancias inhibitorias tales como: antibióticos, sales biliares, desoxicolato,
verde brillante, bismuto de sulfito, los medios más empleados son: Agar
Entérico Hektoen (EH), Agar Xilosa, Lisina, Desoxicolato (XLD) y agar
Bismuto sulfito (BS).
Color del cultivo antes de la inoculación: Claro, color rosa
PRUEBAS BIOQUÍMICAS DIFERENCIALES.
CALDO ROJO MAITOL FENOL (PARA DETECCION DE

SALMONELLA)
USO
Para la identificación bioquímica de microorganismos basándose en su
capacidad para fermentar el manitol.
PRINCIPIO
La peptona de caseína proporciona los nutrientes necesarios para el desarrollo de

los microorganismos. El manitol es el carbohidrato fermentable, se manifiesta
por un cambio de color del indicador el rojo de fenol que vira de rojo a amarillo.
La detección de gas se observa por la formación de vacío o burbuja en la
campana de Durham. Los tubos con el medio de cultivo se inoculan con cultivos
puros de las bacterias a investigar. Incubar 24 – 48 h a 35ºC.
FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA
 Cloruro de sodio 5.0

 D-Manitol 5.0
 Peptona de caseína 10.0
 Rojo de fenol 0.018
 pH 7.4 ± 0.2
PREPARACION
Rehidratar 20 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15

minutos. Calentar agitando frecuentemente hasta completa disolución. Distribuir
en tubos de ensayo con o sin campana de Durham. Esterilizar en autoclave a
121ºC (15 lbs de presión) durante 10 minutos. Conservar en refrigeración de 2º a
8ºC. Antes de utilizarlo verificar que en la campana no existan burbujas.
VI. RESULTADOS:
INTERPRETACION DE RESULTADOS
Al tener parámetros
• ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO (Caldo Tetrationato-Bilis-Verde Brillante según

Mueller-Kauffmann)
• EL TETRATIONATO: Inhibe el crecimiento de coliformes y otras bacterias
intestinales.
• LA BILIS: Estimula el crecimiento de Salmonella e inhibe la flora competitiva.
• EL VERDE BRILLANTE :Impide el desarrollo de la flora Gram positiva
• CARBONATO CALCICO: Actúa como tampón para mantener el pH.
• MEDIO AGAR SELECTIVO (SALMONELLA SIGUELLA)
Tanto la bilis, como el verde brillante inhiben al invasor Proteus spp (Proteus es un género
de bacterias gramnegativos, que incluye patógenos responsables de muchas infecciones
del tracto urinario).
• LA LACTOSA ES EL HIDRATO DE CARBONO FERMENTABLE, quiere decir que si hay

fermentación esta no será provocada por la Shiguella; SHIGUELLA: colonias
trasparentes , SALMONELLA: halo transparente con núcleo negro oscuro.
• Si se observar colonias redondas, planas, negras con presencia de un halo
transparente con presencia de un precipitado negro (H2S) en el centro de éstas.
Podemos decir que estamos frente a una colonia de Salmonella.
SELECTIVIDAD BIOQUIMICA
Dependiendo del medio que se use se obtendrán diferentes resultados mostrados en la

tabla anterior.
Se observa que gracias a las características que presenta un determinado patógeno en este
caso la Salmonella y la Shiguella podemos aislarlos, utilizando diferentes medios que estén
a nuestro alcance, por tal motivo es de vital importancia conocer las características que lo
diferencias de los demás agentes patógenos. Es por ello que se pudo aislar tanto la
Salmonella y la Shiguella de la muestra ensayada.
PRÁCTICA °8: BACTERIAS LACTICAS, HONGOS Y LEVADURAS
I. INTRODUCCION:
La mayoría de los derivados de la leche, como el queso, la mantequilla o el

yogur, son posibles gracias a la presencia de bacterias durante su procesado.
Lactobacillus, Streptococcus o Leuconostoc son imprescindibles para la
transformación de la lactosa en ácido láctico durante la fermentación. En este
proceso, se obtiene el cuajo de la leche con el que después se elaboran otros
alimentos como el queso, el requesón o el yogur. Las levaduras o los hongos
también juegan un papel importante, sobre todo en la elaboración de quesos
como el de cabrales o el roquefort. En estos, mediante una etapa de maduración
en condiciones de humedad determinadas, florecen los hongos y las levaduras.
II. OBJETIVO:
• Determinar Mohos y levaduras en una muestra de yogurt.
• Determinar la muestra patológicas y no patológicas con azul de lacto
fenol y el hidróxido de potasio usados para la evaluación de muestras
micóticas.
Las bacterias del ácido láctico (BAL), bacterias ácido láctico o cultivos lácticos
(cultivo al ser procesadas y multiplicadas para su utilización como grupo)
comprenden un caldo de bacterias fermentadoras y productoras de ácido láctico,
función por la que son empleadas en la industria para darle ciertas cualidades a
los alimentos y protegerlos contra la acción de otros organismos dañinos. Uno
de ellos pueden ser los lactobacilos los cuales aportan al producto un buen
cuidado.
(Levaduras)
• Medio de cultivo PDA selectivo

• Solución de agua peptonada 0,1%
• Espátula
• Erlenmeyer
• Frascos Shott
• Gradillas
• Micropìpeta
• Pipetas
• Probetas
• Muestra
(Hongos)
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Asa de siembra
• Aceite de inmersión
• Mechero
Equipos y utensilios utilizados
• Incubadora
• Balanza analítica
• Mechero de bunsen
• Trípode
• Malla
• Aceite de inmersión
• Mechero
• Medio de cultivo PDA selectivo
• Solución de agua peptonada 0,1%
• Espátula
• Erlenmeyer
• Frascos Shott
• Gradillas
• Micropìpeta
• Pipetas
• Probetas
V. PROCEDIMIENTO:
METODOLOGIA
(Levaduras)
Se realizó la práctica para análisis de Mohos y Levaduras por el método de
siembra por dilución.
Procedimiento
• Se realiza limpieza del área de trabajo y de los materiales a utilizar

durante la misma práctica
• Se preparan 120 ml de medio de cultivo PDA, pesando 4,68 g y se
diluyen en 120 ml de agua en un Frasco shott, seguidamente se lleva
a ebullición con ayuda de un mechero de bunsen, sobre un trípode
con placa.
• Se prepara 108 ml de agua Peptonada, pesando 0,918 g de NaCl y
0,108 g de peptona, se disuelven en un frasco shott. Con ayuda de
una pipeta graduada se transfieren 9 ml de agua Peptonada a 2 tubos
de ensayo los cuales se deben marcar como 10-2 y 10-3, la solución

de peptona se debe identificar como 10-1.
• Después de preparar el medio requerido y el juego de diluciones se
esteriliza el material junto con los tubos de ensayo, las cajas de Petri
envueltas en papel Kraft y las puntas del micro pipeta. Se esteriliza
nuevamente el área de trabajo con una solución de alcohol al 1% y se
enciende el mechero. Después de esterilizar se atempera el juego de
diluciones, el medio PDA y las cajas de Petri se identifican en la tapa
de cada una con la dilución que corresponde 10-1, 10-2 ó 10-3,
teniendo en cuenta que cada dilución se realiza siembra por
duplicado.
• Se pesan 10 g de yogurt y se disuelven muy bien y se transfieren en
el frasco shott identificado como 10-1 se tapa el frasco y se agita
constantemente para que se disuelvan los microorganismos que
contenía.
• Luego se toma con la micro pipeta 1ml de la primera dilucion y se
transfiere al tubo identificado como 10-2, se tapa y agita hasta
homogenizar totalmente la muestra, seguidamente se toma con la
micro pipeta 1 ml de la segunda dilución y se transfiere al tubo
identificado como 10-3, se tapa y agita hasta homogenizar totalmente
la muestra.
• Seguidamente, se toman las cajas Petri previamente marcadas con 10-
1, 10-2 y 10-3 y utilizamos las micro pipeta para agregar 1 ml de
muestra de las diluciones teniendo en cuenta que corresponda la
dilución con la identificación de cada caja Petri, esta operación se
realiza junto al mechero para evitar contaminación cruzada en el
ambiente en el momento de la siembra.
• Después se procede a servir el medio agar PDA más o menos 20 ml
cada caja, se homogeniza suavemente para que la muestra y el medio
se mezclen, se deja gelificar y se tapan. Para finalizar se llevan a
incubar a 22-25ºC durante 3 a 5 días.
(Hongos)
REACTIVOS
• Hidróxido Potasio
• Azul de Lactofenol
COMPOSICIÓN: Reactivo azul de Lactofenol
- Fenol...............0,1gr
- Ácido láctico.......8mL
- Agua destilada.....1mL
- Glicerina.......... 20mL
- Azul de anilina....0,5gr
Se realizó la práctica para análisis de Mohos y Levaduras por el método de

siembra por dilución.
Técnica
Tomar muestra con el asa de siembra y colocarla en un portaobjeto Muestra
Patológica Esterilizar Asa de Siembra (Mechero) Muestra no Patológica
Tomar muestra con el asa de siembra y colocarla en un portaobjeto Colocar
una gota de Hidróxido de Potasio sobre la muestra (portaobjeto) Colocar una
gota de Azul de Lactofenol sobre la muestra (portaobjeto) Cubrir con una
lámina cubreobjetos Observar al microscopio a 40x y 100x
VI. RESULTADOS:
• Muestra: Tomate Hongo: Mucor sp. (Levadura)

• Muestra: Queso Roquefort Hongo: Penicillium Roqueforti (Moho)
• Muestra: Chicha de Jora Hongo: Saccharomyces Cerevisiae
(Levadura).
Discusión
El azul de lacto fenol y el hidróxido de potasio usados para la evaluación de
muestras micóticas no patológicas y patológicas respectivamente, poseen
características (eliminación de células no micóticas, etc) que nos permiten una
observación más clara de la muestra, facilitando así el análisis de los
microorganismo buscados.
PRÁCTICA °9: ANALISIS DE SUPERFICIES QUE ESTAN EN CONTACTO

DIRECTO CON LOS ALIMENTOS
I. INTRODUCCION:
En las industrias alimentarias las superficies de trabajo, o cualquier otra

superficie que este en contacto con el alimento o producto; es de suma
importancia, tomar medidas drásticas de saneamiento. Es un factor de riesgo de
contaminación para el mismo alimento. Se trata de mantener los niveles de
contaminación microbiana dentro de los límites considerados aceptables, desde
el punto de vista teórico-sanitario, en función del riesgo que representa en cada
caso sobre la actividad que se realiza en el lugar concreto. La desinfección es
una medida industrias alimentarias, la desinfección puede realizarse mediante la
utilización de agentes físicos y químicos, y es necesario también probar esos
agentes para que no se vea afectado el producto.
II. OBJETIVO:
• Conocer y experimentar diferentes métodos para el análisis de
superficies en contacto con el alimento.
• Evaluar las condiciones higiénicas sanitarias de las superficies vivas
e inertes que entran en contacto con los alimentos y bebidas
• Determinar qué tipos de bacterias se encuentran en las muestras
dadas.
Conceptos Básicos
• Operaciones en campo
Las operaciones en campo son aquellas que se realizan en el
establecimiento donde se
procesan, elaboran, almacenan, fraccionan o expenden alimentos y
bebidas, sea fábrica,
almacén, servicios de alimentos, quiosco, puesto, comedor, u otro.
Comprende las siguientes operaciones consecutivas, realizadas por
personal capacitado en la
materia:
a) Procedimiento para la selección de la muestra.
b) Selección del método de muestreo.
c)Procedimiento para la toma de muestra.
• Operaciones analíticas
Las operaciones analíticas son aquellas que se realizan en un
laboratorio destinado y
acondicionado para el control de la calidad sanitaria e inocuidad de
los alimentos y bebidas.
Comprende las siguientes operaciones consecutivas, realizadas por

personal capacitado en la
materia:
a. Determinación de los ensayos microbiológicos.
b. Procedimiento de análisis microbiológicos.
c. Cálculo y expresión de resultados.
d. Interpretación de resultados de acuerdo a los límites microbiológicos.
IV. MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO MÉTODO DEL

HISOPO:
• Hisopos de algodón u otro material equivalente, de largo aproximado
de 12 cm.
• Tubo de ensayo con tapa hermética conteniendo 10 mL de solución
diluyente estéril. Se agregará una solución diluyente con
neutralizante como alternativa.
• Plantilla estéril, con un área abierta en el centro de 100 cm2 (10cm x
10cm) o alternativamente, plantilla estéril, con un área abierta en el
centro de 25 cm2 (5 cm x 5 cm).
• Guantes descartables de primer uso.
• Protector de cabello.
• Mascarillas descartables. o Plumón marcador indeleble (para vidrio).
• Caja térmica.
• Refrigerantes.
V. PROCEDIMIENTO:
• Colocar la plantilla (10cm x 10cm) sobre la superficie a muestrear.
• Humedecer el hisopo en la solución diluyente y presionar ligeramente
en la pared del tubo con un movimiento de rotación para quitar el
exceso de solución.
• Con el hisopo inclinado en un ángulo de 30º, frotar 4 veces la
superficie delimitada por la plantilla, cada una en dirección opuesta a
la anterior. Asegurar el hisopado en toda la superficie.
• En el caso de utilizar la plantilla de 5cm x 5cm, repetir esta operación
3 veces más, en lugares diferentes de la misma superficie, para
obtener 100 cm2.
• Colocar el hisopo en el tubo con la solución diluyente, quebrando la
parte del hisopo que estuvo en contacto con los dedos del
muestreador, la cual debe ser eliminada.
• Para superficies irregulares, en el caso de utensilios, se repetirá la
operación con 3 utensilios más (total 4 como máximo), con el mismo
hisopo, considerando el área que está en contacto con el alimento o
con la boca.
• Si no se toman las 4 muestras, se debe anotar en la Ficha de Toma de
Muestra.
VI. MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO MÉTODO DE LA

ESPONJA:
• Esponja estéril de poliuretano o de celulosa, de 5cm x 5 cm.
• Plantilla estéril, con un área en el centro de 100 cm2 (10 cm x 10
cm).
• Frascos con tapa rosca de 250 mL de capacidad, con 100 mL de
solución diluyente estéril.
• Pinzas estériles.
• Bolsas de polietileno de primer uso.
• Guantes descartables de primer uso.
• Protector de cabello.
• Mascarillas descartables.
• Plumón marcador indeleble (para vidrio).
• Caja térmica.
• Refrigerantes.
VII. PROCEDIMIENTO:
• Retirar la esponja de su envoltura con la pinza estéril o con guantes
descartables o bien usar una bolsa de primer uso, invertida a manera
de guante.
• Humedecer la esponja con la solución diluyente estéril
(aproximadamente 10 mL).
• En condiciones asépticas frotar vigorosamente el área a muestrear. En
el caso de superficies regulares, frotar el área delimitada por la
plantilla y en las superficies irregulares (cuchillas, equipos,
utensilios, etc), frotar abarcando la mayor cantidad de superficie.
• Colocar la esponja en el frasco con el resto de la solución diluyente o
alternativamente colocar la esponja con la muestra en una bolsa de
plástico de primer uso.
• Para el caso específico de utensilios se deberá repetir la operación
con 3 utensilios más (total 4 como máximo), con la misma esponja,
considerando el área que está en contacto con el alimento o con la
boca.
• Las tazas, copas o vasos se muestrearán 2 a 3 cm alrededor del borde
por dentro y por fuera.
VIII. RESULTADOS:
Al tener parámetros
• ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO (Caldo Tetrationato-Bilis-
Verde Brillante según Mueller-Kauffmann)
• EL TETRATIONATO: Inhibe el crecimiento de coliformes y otras
bacterias intestinales.
• LA BILIS: Estimula el crecimiento de Salmonella e inhibe la flora
competitiva.
• EL VERDE BRILLANTE :Impide el desarrollo de la flora Gram

positiva
• CARBONATO CALCICO: Actúa como tampón para mantener el
pH.
• MEDIO AGAR SELECTIVO (SALMONELLA SIGUELLA)
Tanto la bilis, como el verde brillante inhiben al invasor Proteus spp
(Proteus es un género de bacterias gramnegativas, que incluye
patógenos responsables de muchas infecciones del tracto urinario).
• LA LACTOSA ES EL HIDRATO DE CARBONO
FERMENTABLE, quiere decir que si hay fermentación esta no será
provocada por la Shiguella; SHIGUELLA: colonias trnasparentes ,
SALMONELLA: halo transparente con nucleo negro oscuro.
• Si se observar colonias redondas, planas, negras con presencia de un
halo transparente con presencia de un precipitado negro (H2S) en el
centro de éstas. Podemos decir que estamos frente a una colonia de
Salmonella.
PRÁCTICA °10: CARACTERIZACION DE ORGANISMOS TERMOFILOS
I. INTRODUCCION:
Debido al crecimiento de la industrialización, la demanda de enzimas

termoestables ha aumentado enormemente, por su alta termo estabilidad y la
viabilidad de los procesos involucrados. Las proteasas constituyen una de las
principales enzimas para la industria, alcanzando más del 60% en el mercado
mundial. Se utiliza especialmente en la industria alimentaria, farmacéutica, textil
y cuero
II. OBJETIVO:
• Aislar, identificar y caracterizar microorganismos termófilos.

Las bacterias termófilas son microorganismos que están adaptados para crecer
óptimamente a temperaturas altas (45 °C a 110 °C)
Como consecuencia, estos poseen propiedades macromoleculares únicas a altas
temperaturas ya que poseen elevadas tasas metabólicas, sus enzimas físicamente
y químicamente estables con altos rendimientos del producto final.
Los termófilos se caracterizan a nivel de membrana porque poseen una
proporción alta de lípidos saturados de cadena larga, lo que hace que tenga la
fluidez adecuada a altas temperaturas. En cuanto a las proteínas, se ha visto que
poseen gran estabilidad debido a enlaces de tipo covalente e interacciones
hidrofóbicas. Las bacterias termófilas son las principies fuentes de enzimas
termoestables, suficientemente ventajosas para la industria.
• Medio de cultivo:
• caldo LB (Luria Bertani), caldo BHI
• Medio salino
• Aguar Platecount ( para alimentos)
• Agar triptona ( para alimentos)
• Tubos de ensayo
• Agua destilada
• Mechero Bunsen
• Balanza
• Matraz
• Probeta
• Baguetas
• Asa de siembra
• Pipetas bacteriológicas estériles de 1, 5 , 10 ml
• Micro pipetas
• Incubadora o estufa
• Autoclave, horno o esterilizador
• Nevera
• Frasco estéril de boca ancha

• Lápiz y papel
• Porta agujas
• Reloj
• Guantes
• Botas
• Termómetro
• Agua peptonada 0.1%
• Cloruro de Sodio
• Cajas Petri
• Cuchillos y cucharas
• Gradillas
• Mechero
• Tipo de muestra solida ( chorizo)
• Tubos de ensayo
• Reloj o cronometro
• Tubos de ensayo con rosca
• Jarra ( ambiente de anaerobiosis)
V. PROCEDIMIENTO:
• Ubicar el lugar de muestreo
• Destapar el frasco
• Coger el frasco por la base e introducir al río, evitando que el agua
entre al frasco
• Ya en el lugar de representatividad, tomar la muestra dirigiendo la
muestra del frasco hacia la corriente de agua
• Se tapa evitando la contaminación
• Se rotula
• Se lleva al laboratorio
Método del número más probable para las diluciones
• Comenzar el examen tan pronto como se disponga la muestra.
• Añadir un volumen de diluyente igual a 9 veces la muestra (90 ml).
Así se obtiene la dilución 10 ¯¹. (pesar, medir 10 gr o ml de muestra).
• Agitar el frasco (dil 10 ¯¹), y pipetear 1 ml. A otro tubo o frasco de
penicilina con 9 ml de diluyente ( agua peptona), obteniéndose la
dilución 10 ¯²
• Mesclar el líquido cuidadosamente aspirando 10 veces con pipeta
estéril.
• Transferir con la misma pipeta 1 ml a otro tubo o frasco de penicilina
conteniendo 9 ml de diluyente y mesclar con nueva pipeta estéril, se
obtendrá la dilución 10 ¯³.
• Repetir los pasos 4 y 5 hasta conseguir el número de diluciones
deseadas
• Pipetear por duplicado a placas tubos Roller (Petri estériles si es que
no se cuenta con el anterior porque los tubos mantienen la
anaerobiosis) alícuotas de 1 ml a partir de la dilución 10 ¯¹, 10 ¯²,

10 ¯³, 10 ¯4, g o ml. De muestra por placa Petri.
• Temperar el agar a 44 - 66° C . Agregar rápidamente a los tubos (
placas en su defecto) 15 ml de agar licuado y temperado.
• Mesclar inmediatamente las alícuotas con el agar mediante los
movimientos de vaivén y de rotación de las placas Petri.
• Para el control de esterilidad, adicionar a los tubos o placas Petri,
agar sin inocular y agar inoculado con el diluyente.
Procedimiento en laboratorio para alimentos
• Preparar el medio de cultivo, en este caso el agar platecount o

triptona, en este caso preparamos 9 cajas Petri de 20 ml c/ u , por
esta razón tomamos en una probeta 120 ml de agua desionizada , la
llevamos a un frasco shott y le agregamos 2,1 g de agar Platecount
• Tomamos 120 ml de agua desionizada en una probeta y la llevamos
a un frasco shott y agregamos 1,059 ml de NaCl y 0,143 gr de
peptona o agua peptona si ya está preparado.
• Luego de seleccionar os implementos de laboratorio , y de preparar el
agar y el agua peptona , autoclavamos junto con las placas Petri , los
tubos de ensayo y las puntas de micropipetas para esterilizarlos
• Después de autoclavar , tomamos las 9 cajas Petri y las marcamos en
su parte exterior con un marcador no borrable , indicando el tipo de
agar ( platecount o triptona) y la dilución correspondiente (10¯¹, 10
¯², …) con un pipeta)
• Nos acercamos al mechero y tomamos el frasco shott con el agua
peptonada y le agregamos 10 gr de la muestra de alimento (chorizo
crudo, conserva, enlatado de maíz, carnes, menestras) previamente
macerado a analizar, lo volvimos a tapar y le agitamos
constantemente para que se disuelvan los microorganismos que
contiene.
• Luego tomamos los tubos de ensayo y en el segundo y tercer tubo
hicimos disoluciones de 9 ml c/u, respectivamente generando así las
disoluciones en base (10¯¹, 10 ¯²,…) con una pipeta.
• Posteriormente tomamos las cajas Petri ya marcadas y utilizamos las
micropipetas para agregar 1 ml de muestra en las placas Petri.
Después de este paso procedimos a agregar el agar, tapamos las cajas
Petri y dejamos gelificar.
• Sellamos las placas Petri con cinta siliconada y las llevamos a
incubación a 45°C para determinar termófilos de 24 a 48 horas.
• Pasado dicho tiempo, se tomará una pequeña muestra del cultivo y se
realizará la tinción de Gram.
• Observar e identificar con ayuda del microscopio.
VI. CONCLUSIONES:
• Se aisló bacterias termófilas, no se ha identificado la especie en las

aguas termales y en los alimentos en medio de disolución agua
peptona y medio solido agar agar, en donde se observó el crecimiento
después de 48 h a temperatura de 40°C.
• Con la coloración de gram se identificó las bacterias gram positivas y
gram negativas para la observación al microscopio.
PRÁCTICA °11: BIOENSAYO DE BIORREMEDIACION DE SUELOS
I. INTRODUCCION:
Mundialmente se ha dado un uso indiscriminado de los plaguicidas, este uso,

anualmente se estima en una cantidad de 5,2 millones de estos compuestos. De
esta manera, el estudio de las fuentes, su distribución, transformación y
acumulación en los ecosistemas ha resultado de gran interés y se ha determinado
que están presentes desde áreas muy pobladas hasta en zonas remotas del
mundo.
En Perú se calcula que se emplean 260 marcas de estos productos siendo asi una
de las principales causas de intoxicación.
II. OBJETIVO:
• Evaluar la capacidad de cepas bacterianas aisladas de un suelo
agrícola para la degradación de los plaguicidas endosulfán y
malatión.
PLAGUICIDAS
Los plaguicidas son cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a

prevenir, destruir o controlar cualquier plaga, incluyendo los vectores de
enfermedades humanas o de los animales, las especies de plantas o animales
indeseables que causan perjuicio o que interfieren de cualquier otra forma en la
producción, elaboración, almacenamiento, transporte o comercialización de
alimentos, productos agrícolas, madera y productos de madera o alimentos para
animales, o que pueden administrarse a los animales para combatir insectos,
arácnidos u otras plagas en o sobre sus cuerpos.
Los plaguicidas de acuerdo a su acción insecticida se dividen en insecticidas

organoclorados, organofosforados, carbamatos y piretroides.

• MEDIO MINERAL
• AGAR SOYA TRIPTICASEINA
• MEDIO LURIA BERTANI
• PLAGICIDAS
• CENTRIFUGADOR
• AGITADOR VORTEX
• INCUBADOR
• ESTERILIZADOR
V. PROCEDIMIENTO:
• Se realizaron dos muestreos: uno preliminar y un muestreo inicial, en
ambos, la muestra de suelo se tomó del lugar a estudiar. El área de
estudio es una zona de cultivos en el cual se han utilizado los
plaguicidas de estudio para mantener sus cultivos.
• Una vez colectado el suelo, se procedió a transportarlo al laboratorio,
donde se secaron las muestras a temperatura ambiente por 120 h para
obtener resultados estandarizados (por kg de suelo seco). Las
muestras se pasaron a través de un tamiz de 2 mm de diámetro,
separando las piedras y eliminando los agregados.
• A partir de la muestra compuesta se tomó 1.5 kg de suelo para el
análisis físico-químico del mismo. Respecto a cada punto de
muestreo se colecto 50 g de suelo de cada muestra y se almaceno en
frascos de vidrio para la detección de los plaguicidas.
• Se colocaron 50 ml de medio mineral en frascos de vidrio
previamente esterilizados, se añadieron 5 g de muestra de suelo y 1
ml del plaguicida de estudio respectivamente, los plaguicidas para
este estudio fueron elegidos en base a la Guía de Plaguicidas
Autorizados de Uso Agrícola.
• Los tratamientos experimentales se realizaron por triplicado y se
incubaron a 36°C. Se evaluó la presencia microbiana sembrando por
estría en placa de agar soya tripticaseina a las 24, 48 y 72 horas de
incubación.
•
• Las colonias se eligieron en función de su morfología, color, bordes,
tamaño, superficie y su capacidad de tolerancia a crecer en presencia
de los plaguicidas de estudio. Una vez aisladas las colonias, se
realizaron resiembras sucesivas para su purificación en placas de agar
soya tripticaseina conteniendo 15 mg ̸ L. Las colonias se incubaron
durante 24 horas a 36°C.
• La determinación de las cepas del consorcio bacteriano aislado se
realizó a partir de una colonia aislada de cada cepa, mediante la
implementación de pruebas bioquímica.
VI. RESULTADOS:
TIPIFICACIÓN BIOQUÍMICA
Se aislaron dos cepas bacterianas, a las que se les asignó una clave
respectivamente, M1 y E1. La cepa M1 con capacidad de crecer en presencia del
plaguicida malatión, y ambas cepas E1 y M1, con capacidad de crecer en
presencia del plaguicida endosulfán. Al aplicar las pruebas bioquímicas
correspondientes, se obtuvo que ambas cepas son morfo típicamente bacilos
gram negativos, facultativos, catalasa positivos y oxidasa negativos. Ambos con
presencia de motilidad.
Taxonómicamente se determinaron dos especies bacterianas: Enterobacter

cloacae cepa PMM16, crece en presencia del insecticida endosulfán y E.
amnigenus cepa XGL214, con capacidad de crecer en presencia de ambos
insecticidas, malatión y endosulfán.
Se mostró la degradación de 80.44 % ± 15.61 de malatión por Enterobacter

amnigenus cepa XGL214. La degradación de endosulfán I fue de 74.39 % ± 8.95
y 87.070 % ± 1.18 de endosulfán II por Enterobacter amnigenus. Y 84.64 % ±
8.95 de endosulfán I y 86.31 % ± 1.18 de endosulfán Il por Enterobacter cloacae.
El experimento 2, mostró la remoción de malatión con Enterobacter amnigenus
de 94.31% ± 7.18 al día dieciocho del experimento, al día 24 no fue detectado.
PRÁCTICA °12: AISLAMIENTO DE BACTERIAS ANAEROBIAS DEL

RUMEN VACUNO
I. INTRODUCCION:
Los rumiantes son animales herbívoros cuyo principal alimento son las plantas
que contienen carbohidratos fibrosos, su principal característica y lo que lo
diferencia de las especies de estómago simple o no rumiantes, es la posibilidad
de degradar el alimento ingerido compuesto principalmente de celulosa,
hemicelulosa y pectina.
Los rumiantes poseen la capacidad de digerir los alimentos en dos etapas,

primero los ingiere y luego realiza la rumia, que es un proceso que consiste en
regurgitar el material semidigerido y volverlo a masticar para deshacerlo,
agregarle saliva y una nueva deglución. Los rumiantes tienen un aparato
digestivo complejo de importancia fundamental en los procesos de digestión y
absorción.
El rumen es el primer pre estómago y el más grande. El rumen o panza es un
saco aplanado, lateralmente dilatado y de gran capacidad. Ocupa la totalidad de
la cavidad abdominal izquierda y con su porción caudoventral atraviesa
parcialmente la línea media y llega a la mitad derecha del abdomen. Este
compartimento, constituye más del 65% del volumen total del estómago y puede
contener hasta 115 litros de material con el 10% al 20% de materia seca.
II. OBJETIVO:
• Aislar las bacterias anaerobias del rumen de bovinos, utilizando
medios de cultivos selectivos (agar sangre).
Las bacterias, representan la fracción de la población ruminal imprescindibles

para la vida del rumiante. En 1 ml de líquido de la panza hay hasta 10 11 células
bacterianas y constituye de un 5 a 10% (peso seco) del contenido de la panza.
Además las bacterias contribuyen de dos formas a la nutrición de los rumiantes;

la primera por medio de los ácidos formados durante la degradación de los
polisacáridos, ya que las bacterias tienen la habilidad bioquímica de producir
celulasas, que son las enzimas que intervienen en el proceso de hidrólisis de la
celulosa, y la segunda por efecto de la sustancia celular de las bacterias, que es
degradada en el intestino y también es reabsorbida.
Las bacterias del rumen, son predominantemente anaerobias estrictas, pero

también coexisten con anaerobias facultativas, adheridas a las paredes del
rumen, éstas usan el O2 que proviene del torrente circulatorio y son muy
importantes en las funciones del rumen

• Materiales de vidrio
• Matraz de 250 ml
• Probeta de 100 ml
Equipos
• Estufa a 37˚C
• Autoclave
• Balanza
Reactivos
• Agar sangre
Otros materiales
• Mechero de Bunsen
• Asa de Kolle
• Anticoagulante
• Papel de aluminio
• Muestra de rumen
• Bicarbonato de sodio
• Agua destilada
• Acido cítrico
• Bolsas ziploc
• Placas Petri
• Deposito con tapa
• Vela
• Encendedor
V. PROCEDIMIENTO:
• El líquido ruminal utilizado para el aislamiento de las bacterias, se lo
obtuvo de la Empresa Municipal de RIO SECO en Cerro Colorado.
• Las muestras de líquido se obtuvieron con la ayuda del encargado del
faena miento durante la mañana. Se obtuvieron muestras del rumen
en envases estériles de 50ml.
• Para el crecimiento de microorganismos se empleó Agar Base Sangre
adicionado con el 1% de aserrín como medio base para el cultivo de
los microorganismos ruminales.
• El aserrín fue utilizado como nutriente para los microorganismos y
permitió el crecimiento y aislamiento de microorganismos que
emplean celulosa como nutriente. El tamaño de partícula del aserrín
empleado fue menor a 2 mm y fue esterilizado en autoclave a 15 PSI
durante 15 minutos, antes de mezclarlo con el agar.
• El líquido ruminal de cada muestreo se filtró para retener los
materiales gruesos flotantes, y obtener únicamente el material líquido
que contiene los microorganismos.
Agar Base Sangre
• Para su preparación pesamos 2.2 g de agar base para 60 ml de agua

destilada
• Se agrega 0.022 g de aserrín en un matraz de 250 ml
• Mezclar perfectamente hasta obtener una suspensión homogénea.
• Calentar con agitación frecuente y hervir 1 minuto.
• Esterilizar 15 minutos a 121°C.
• Enfriar a 45-50°C agregar sangre desfibrinada al 5%.
• Homogeneizar y distribuir en placas o tubos
Siembra
• Por inoculación directa del material en estudio, sobre la superficie del medio
de
•
• cultivo.
• Usamos el método de siembra por estrías
•
• Con el asa de Kolle se distribuye el inoculo por estrías en zig-zag con escasa
separación unas de otras
Incubación
• Incubamos a 37 ˚C por 48 horas en estufa

• Si no contamos con la estufa creamos un ambiente parecido en una caja de
carton colocando un foco de 25 watts por 48 horas
Condiciones de Anaerobiosis
Para crear una atmosfera anaerobia, dentro de una bolsa ziploc se empleó ácido cítrico
(C6H8O7) y bicarbonato de sodio (NaHCO3) combinados con agua, que produce una
reacción que emite dióxido de carbono (CO2), el mismo que desplaza al oxígeno y
permite un ambiente adecuado para el crecimiento de los microorganismos anaerobios.
Condiciones de anaerobiosis en laboratorio.

También podemos crear anaerobiosis colocando las placas en un envase con tapa y
cerrando con una vela prendida adentro.
La vela ser apagara y asi se consumirá el oxígeno creando un ambiente anaerobio
Aislamiento de Bacterias
Permite la separación de los microorganismos al estado de pureza a partir de una

muestra del problema. En nuestro caso .rumen vacuno.
Se requirió medio solido con gran superficie para que los microorganismos al ser
diseminados sobre el medio, generen su propia cepa por formación de colonias
separadas ( el que usamos fue el agar sangre)
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Resultados:
El aislamiento de bacterias anaerobias a partir del rumen vacuno
Conclusiones
 Mediante el uso de medios selectivos para microorganismos y a partir del fluido

ruminal fresco es posible aislar bacterias ruminales
 Los inóculos utilizados para el aislamiento de las bacterias, se obtuvieron de

vacas, con lo que se comprueba la presencia de bacterias degradadoras de aserrín
en bovinos..
 La baja actividad celulolítica de las bacterias, puede estar directamente

relacionada con el tipo de sustrato y los medios de cultivo empleados para los
análisis; ya que éstos no incluyen todas las condiciones fisicoquímicas y
nutritivas presentes en el rumen. Además de la falta de interacciones con otros
microorganismos que estimulan la actividad celulolítica de las bacterias.
VI. RECOMENDACIONES
Las bacterias aisladas corresponden a una pequeña parte de la población

bacteriana del rumen de bovinos, para identificar a una mayor cantidad de
especies bacterianas es necesario, incrementar el número de muestras de líquido
ruminal, así como emplear diferentes medios de cultivo y pruebas de
identificación.
Se debe sembrar con la presencia del mechero de Bunsen prendido para evitar
microorganismos y contaminación
Se debe mejorar las condiciones de laboratorio para este tipo de investigaciones,

ya que es posible, que algunas bacterias aisladas durante la investigación
provinieron de la transmisión de contaminación en laboratorio.
Es necesario experimentar con las bacterias aisladas en esta investigación,

realizando la tincion gram para diferenciar bacterias gram-positivas y gram-
negativas
ANEXO 1
Tinción de Gram.
El principio de la tinción es de acuerdo con la estructura y grosor de la pared bacteriana,
agrupar las bacterias en Gram positas y Gram negativas. Las Gram positivas poseen una
capa gruesa de peptidoglicán y carecen de membrana externa, por lo que fijan el
colorante cristal violeta. Las Gram negativas tienen una capa más delgada de
peptidoglicán y poseen una membrana externa, y no se fija el colorante.
Técnica:
1. Extensión de una fina capa de muestra sobre el porta objetos.
2. Secar de la muestra al aire.
3. Fijación por flameado de la placa
4. Adición del colorante
i. Cubrir la placa con cristal violeta durante 1 a 2 minutos y lavar.
ii. Cubrir la placa con Lugol durante 1 a 2 minutos y lavar.
iii. Se decolora la muestro con alcohol-cetona durante 20 segundos
iv. Cubrir la placa con safranina durante 1 minuto y lavar.
5. Secar la muestra
6. Se coloca una gota de aceite de inmersión y se observa en el microscopio.
Resultados
Según la forma se clasifican en:
 
 Cocos: esféricos.


Bacilos: bastones (algunos bacilos pequeños se denominan cocobacilos)


Espirales: coma, forma S o espiral.

Pleomórficas: adoptando diferentes formas. (aspecto gelatinoso)
Según el color se clasifican en:


Gram negativas (-): estarán teñidas de un color rosáceo.


Gram positivas (+): estarán teñidas de un color violeta.
ANEXO 2: fotos
b
BIBLIOGRAFIA
ALVAREZ, A, y otros. 2009. Fisiología Animal Aplicada. Medellin : Universidad
de Antioquia, 2009.
ARIAS, José Luis. 1982. Monografías Medicina Veterinaria.

http://www.monografiasveterinaria.uchile.cl. [En línea] Junio de 1982. [Citado el: 12 de
04 de 2011.]
http://www.monografiasveterinaria.uchile.cl/CDA/mon_vet_simple/0,1420,SCID%2
53D7679%2526ISID%253D411%2526PRT%253D7669,00.html.
BEYER, Hans, BARLUENGA, José y WOLFGANG, Walter. 1987. Manual de

Química Orgánica. Barcelona : Editorial Reverté, 1987.
BLANCO, Ma. Rosario. 1999. Producción Animal. Bacterias Ruminales. [En línea]
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animal.com.ar/informacion_tecnica/manejo_del_alimento/69-
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BREED, R, MURRAY, E y SMITH, N. 1957. Bergey's Manual of Determinative

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WADE, L. G. 2004. Quimica Orgánica. Quinta. Madrid : Editorial Pearson, 2004.
pág. 547.
WATTIAUX, Michel A y GRUMMER, Ric R. "Metabolismo de lípidos en las vacas

lecheras". Babcock Institute. [En línea] [Citado el: 23 de 02 de 2011.]
http://babcock.wisc.edu/sites/default/files/de/es/de_04.es.pdf.
ZAVALETA, Eglantina. "Los ácidos grasos volátiles, fuente de energía en los

Rumiantes". [En línea] [Citado el: 12 de 04 de 2011.]
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_agronomia/Zootecnia/Nutrici%C
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ANGELA MARIETTA APAZA CONDORI

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN

PRACTICA º 1: NORMAS DE SEGURIDAD, TRABAJO Y MATERIAL DE

Los laboratorios dedicados al trabajo en Microbiología deben cumplir con una

El objetivo de la Seguridad Biológica es el de disminuir y prevenir la salida y/o

Normas para manipular instrumentos y productos

• Antes de manipular un aparato o montaje eléctrico, desconéctalo de

Realizar la siguiente lectura, identificar el material simultáneamente y registra lo

1. Tubo de ensayo. Ahí se observan las reacciones de las sustancias que se

2. Caja de Petri. En ella se cultivan microorganismos, como hongos o bacterias;

4. Portaobjetos. Son laminillas de cristal planas pero tambien pueden ser

5. Cubreobjetos. Cubren y protegen las preparaciones u objetos que se

6. Lupas. Son lentes convexos para la observación detallada de objetos

7. Lámpara de alcohol. Se emplea como fuente de calor cuando se requiere

8. Vidrio de reloj. Sobre él se depositan sustancias en pequeña cantidad. Son

9. Mechero de gas. Se emplea para el calentamiento rápido de sustancias.

10. Microscopio. Hace visibles al ojo humano objetos diminutos. Es de suma

12. Estuche de disección. Contiene bisturí, agujas de disección, pinzas, tijeras,

14. Matraz Erlenmeyer: Se utiliza para montar sistemas generadores de gases

15. Matraz Aforado: Sirve para preparar volúmenes exactos de concentraciones

17. Termómetro. Con él se mide la temperatura a diversas sustancias

18. Balanza. Con ella se conoce el peso de objetos

19. Baño María. Es un dispositivo que permite calentar sustancias en forma

20. Vasos de precipitados. Permite calentar sustancias y obtener precipitados de

21. Matraz de fondo plano: Se utiliza para calentar líquido.

22. Matraz de fondo redondo: Se utiliza para poner volúmenes exactos de

23. Agitador: Se usa para agitar mezclas reactivas y como accesorio en el

24. Cápsula de porcelana: Sirve para calentar y evaporar líquidos, fundir

25. Crisol: Sirve para calcinar sustancias, fundir sólidos.

26. Mortero: Sirve para triturar, pulverizar y mezclar sólidos.

27. Espátula: Sirve para trasegar sólidos y tomar nuestras de sólidos.

28. Soporte universal: Pieza básica en el montaje de los sistemas y aparatos

30. Trípode: Soporte de vaso de precipitado, matraces, etc

32. Gradilla: Se utiliza para colocar los tubos de ensayo.

En el laboratorio es importante el uso de colorantes y reactivos especiales;

En la presente práctica el desarrollo será teórico, en el cual el alumno deberá

PRÁCTICA ° 2: MICROSCOPIA, METODOS DE COLORACION

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial

IV. MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO:

1. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es

2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña

3. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el

FIJACIÓN DE LAS BACTERIAS AL PORTAOBJETOS

TINCIÓN DEL FROTIS BACTERIANO

6. Lavar la preparación con agua para eliminar el colorante. Esta operación se

7. Secar el porta: en ningún caso se debe frotar el porta.

8. Observar la preparación al microscopio llegando hasta el máximo aumento. Si se

Tinción 2: Aquí es donde se introdujeron las mejoras de Hucker, agregando lugol

PRÁCTICA ° 3: COLORACIONES ESPECIALES

Algunas bacterias denominadas ácido alcohol resistentes presentan una pared

III. MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO:

PRÁCTICA °4: DETERMINACION DE PARAMETROS DE CALIDAD DE

El agua se constituye en la materia prima más usada por las industrias en

III. FUNDAMENTO TEORICO:

 Balanza analítica Mettler Toledo, modelo AG204, resolución de 0,1 mg.

 La suspensión stock es estable hasta por un año cuando es almacenada

 Diligencie el formato de uso del turbidímetro y ubique el valor

1. Colocar 25 ml de la muestra de agua se coloca en el matraz de

• Agua alcalina de pH=9

1. Colocar en cada matraz de Erlenmeyer una muestra diferente de agua,

Uso de reactivo casero

• Col morada antocianinas

1. Cortar trozos de col y colocarlos al mortero para luego triturarlos

• Recolectar las a muestras a utilizar.